CN102197140B - 采用重组微生物的聚乳酸的制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供通过以糖作为原料的微生物发酵来有效生产聚乳酸的方法。聚乳酸的制造方法，包括：在含有碳源的培养基中培养具有催化CoA转移到丙酸和/或乳酸的反应的蛋白质、和下述的a)或b)的氨基酸序列构成的催化多羟基链烷酸的合成反应的蛋白质的重组微生物的工序1)：a)序列号2所示的氨基酸序列的第130位、第325位、第477位和第481位的氨基酸中的至少一个以上被取代为其它氨基酸的氨基酸序列b)a)中规定的蛋白质中，还有第130位、第325位、第477位和第481位以外的一个或多个氨基酸被缺失或取代，或者还插入了一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列，和从工序1)的培养物中回收前述聚乳酸的工序2)。

Description

采用重组微生物的聚乳酸的制造方法
技术领域
本发明涉及使用重组微生物的聚乳酸的制造方法。
背景技术
从地球环境问题的观点来看，作为自然界中容易被分解的生物降解性塑料，以及作为可以由糖或植物油等可再生的碳资源合成的“绿色”塑料，生物来源的聚酯备受关注。这其中，聚乳酸，由于成本较为低廉，融点也具有170℃以上这样充分的耐热性，可以熔融成型，因此可以期待其是实用上优良的生物降解性聚合物。
然而，以往，如特开2004-204464中所示，经过中和微生物生产的乳酸，并进行纯化的工序，在形成二聚物的环状化合物(丙交酯(lactide))之后聚合，从而生产聚乳酸，因此存在成本增高的问题。
迄今为止，报道了许多具有以糖作为碳源来生产聚酯能力的微生物(非专利文献1)。微生物生产的生物降解性塑料的代表例是以3-羟基丁酸(3HB)作为单体的聚-3-羟基丁酸(polyhydoroxybutylate、PHB)。PHB是具有熔解温度为180℃左右的热可塑性高分子，除了生物降解性之外，它还具有熔融加工性优异这样的优点。另一方面，由于PHB的结晶性高，因而又硬又脆，即存在耐冲击性差这种物性上的问题。
作为解决PHB物性上问题的一种方法，人们在开发使用微生物制造由3HB与其它羟基链烷酸构成的共聚酯的方法。
例如，专利文献1中公开了由3HB与3-羟基吉草酸(3HV)构成的共聚物的制造方法。而且，专利文献2中公开了通过使甲基杆菌属(Methylobacterium sp.)、副球菌属(Paracoccus sp.)、产碱菌属(Alcaligenessp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)的微生物与碳原子数为3至7的伯醇接触，生产3HB与3HV的共聚物的方法。
经确认，这种3HB和3HV的共聚物与PHB相比，富有柔软性，而且共聚酯中3HV含有率如果增加，柔软性就提高。在使用上述微生物的3HB和3HV的共聚物的制造法中，例如在前述专利文献1中，通过在培养基中添加丙酸，以及在专利文献3中，通过在培养基中添加丙烷-1-醇，从而控制共聚酯中3HV的含有率。
3HB和3-羟基已酸(以下，简称为3HH)这两种成分的共聚酯P(3HB-co-3HH)及其制造方法也分别记载于例如专利文献4和专利文献5中。这些公报的P(3HB-co-3HH)共聚物的制造方法采用从土壤中分离的豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)，由油酸等脂肪酸或橄榄油等油脂，发酵生产。而且，还有克隆该豚鼠气单胞菌的PHA合酶基因，将该基因导入到富氧产碱菌(Alcaligenes eutrophus)中，使用这种重组菌株，以脂肪酸作为碳源，生产P(3HB-co-3HH)的报道(专利文献6)。
此外，上述的共聚酯的使用微生物的制造法中，无论何种情况下，都需要使用作为具有直接合成聚合物活性的酶蛋白质的多羟基链烷酸合成酶，但人们也在尝试改变这种合成酶，调节单体单元的摩尔分率。例如，专利文献7公开了通过改变被鉴定为假单胞菌属(Pseudomonas sp.)61-3的微生物的多羟基链烷酸合成酶的氨基酸序列，生产3HB含有率高的PHB的变异酶。
另一方面，人们期待以3-羟基链烷酸以外的成分作为单体单元的共聚酯具有与上述共聚酯不同的物性。专利文献8公开了，作为这种含有3-羟基链烷酸以外的单体单元的共聚酯的例子，在培养基中添加乳酸，并同时培养整合了编码丙酸梭菌(Clostridium propionicum)的丙酰CoA转移酶的核酸的富养罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha、旧名富氧产碱菌(Alcaligenes eutrophus))，制造由3HB和乳酸(LA)构成的共聚酯的方法。而且，同篇文献中还公开了通过在培养基中添加乳酸和癸烯酸，同时培养整合了编码丙酸梭菌来源的丙酰CoA转移酶的核酸和编码假单胞菌属61-3来源的多羟基链烷酸合成酶的核酸的大肠杆菌，制造由3-羟基己酸酯、3-羟基辛酸酯、3-羟基癸酸酯和乳酸构成的共聚物的方法。
以上是以3-羟基链烷酸作为单体单元的共聚酯、以3-羟基链烷酸以外的成分作为单体单元的共聚酯，以及使用微生物的它们的制造方法。
但是，没有关于以糖作为原料，通过微生物发酵，有效生产聚乳酸的方法的报道。
非专利文献1：《生物降解性塑料手册》、生物降解性塑料研究会编、1995年、第178-197页、(株)エヌ·テイ一·エス发行)
专利文献1：特开昭57-150393号公报
专利文献2：特开平5-74492号公报
专利文献3：特公平7-79705号公报
专利文献4：特开平5-93049号公报
专利文献5：特开平7-265065号公报
专利文献6：特开平10-108682号公报
专利文献7：国际公开公报WO2003/100055
专利文献8：国际公开公报WO2006/126796
发明内容
本发明的目的在于提供通过以糖作为原料的微生物发酵来有效生产聚乳酸的方法。
本发明人发现，导入了编码前述专利文献7中所述的多羟基链烷酸合成酶的变异体的核酸的重组微生物能够有效地由糖直接制造聚乳酸，从而完成了下述各发明。
(1)聚乳酸的制造方法，包括：在含有碳源的培养基中培养重组微生物的工序1)，和从工序1)的培养物回收所述聚乳酸的工序2)；
所述重组微生物具有对CoA转移到丙酸和/或乳酸的反应进行催化的蛋白质，和由下述的a)或b)的氨基酸序列构成的对多羟基链烷酸的合成反应进行催化的蛋白质：
a)序列号2所示的氨基酸序列的第130位、第325位、第477位和第481位的氨基酸中的至少1个以上被取代为其它氨基酸的氨基酸序列，
b)在a)中规定的蛋白质中，还有第130位、第325位、第477位和第481位以外的1个或多个氨基酸缺失或被取代，或者插入了1个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
(2)根据(1)中所述的制造方法，所述对CoA转移到丙酸和/或乳酸的反应进行催化的蛋白质的氨基酸序列是序列号4所示的氨基酸序列、或序列号4所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列。
(3)根据(1)中所述的制造方法，所述对CoA转移到丙酸和/或乳酸的反应进行催化的蛋白质的氨基酸序列是序列号6所示的氨基酸序列、或序列号6所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列。
(4)根据(1)中所述的制造方法，所述对多羟基链烷酸的合成反应进行催化的蛋白质的氨基酸序列是序列号2所示的氨基酸序列的第325位和第481位的氨基酸分别被取代为其它氨基酸的氨基酸序列。
(5)根据(1)中所述的制造方法，所述对多羟基链烷酸的合成反应进行催化的蛋白质的氨基酸序列是序列号2所示的氨基酸序列的第325位的Ser被取代为Thr、第481位的Gln被取代为Lys的氨基酸序列。
(6)根据(1)中所述的制造方法，前述蛋白质都是由导入到微生物中的重组表达载体编码的蛋白质。
(7)重组微生物，具有对CoA转移到丙酸和/或乳酸的反应进行催化的蛋白质，和由下述的a)或b)的氨基酸序列构成的对多羟基链烷酸的合成反应进行催化的蛋白质的：
a)序列号2所示的氨基酸序列的第130位、第325位、第477位和第481位的氨基酸中的至少1个以上被取代为其它氨基酸的氨基酸序列
b)在a)中规定的蛋白质中，还有第130位、第325位、第477位和第481位以外的1个或多个氨基酸被缺失或取代，或者还插入了1个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
(8)根据(7)中所述的重组微生物，所述对CoA转移到丙酸和/或乳酸的反应进行催化的蛋白质的氨基酸序列是序列号4所示的氨基酸序列、或序列号4所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列。
(9)根据(7)中所述的重组微生物，所述对CoA转移到丙酸和/或乳酸的反应进行催化的蛋白质的氨基酸序列是序列号6所示的氨基酸序列、或序列号6所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列。
(10)根据(7)中所述的重组微生物，所述对多羟基链烷酸的合成反应进行催化的蛋白质的氨基酸序列是序列号2所示的氨基酸序列的第325位和第481位的氨基酸分别被取代为其它氨基酸的氨基酸序列。
(11)根据(7)中所述的重组微生物，所述对多羟基链烷酸的合成反应进行催化的蛋白质的氨基酸序列是序列号2所示的氨基酸序列的第325位的Ser被取代为Thr、第481位的Gln被取代为Lys的氨基酸序列。
(12)根据(7)中所述的重组微生物，其特征在于导入了具有编码前述蛋白质的基因的重组表达载体。
本说明书包括作为本申请的优先权基础的日本专利申请号2008-276185号的说明书和/或附图中记载的内容。
本发明的制造方法能够以便宜的碳源作为原料，有效地制造聚乳酸，可以降低生物降解性塑料的制造成本。
附图说明
[图1]是表示重组质粒pTV118NPCTC1(ST/QK)的构成的概要图。图中phaC1(ST/QK)表示STQK基因，PCT表示埃氏巨球形菌(M.elsdenii)来源的PCT基因，Pre表示富养罗尔斯通氏菌(R.eutropha)来源的启动子，Plac表示大肠杆菌乳糖操纵子启动子。
[图2]实施例中制备的聚合物的分子量分布曲线。
[图3A]是表示使用含有埃氏巨球形菌来源的PCT基因和phaC1(ST/QK)基因的重组质粒pTV118NPCTC1(ST/QK)制备的聚合物的GC/MS分析结果的表图。
[图3B]是表示使用含有埃氏巨球形菌来源的PCT基因和phaC1(WT)基因的重组质粒pTV118NPCTCl(WT)制备的聚合物的GC/MS分析结果的表图。
[图3C]是表示使用PLA标准品(MW20000)制备的聚合物的GC/MS分析结果的表图。
[图3D]是表示使用含有埃氏巨球形菌来源的PCT基因或丙酸梭菌来源的PCT基因和phaC1(ST/QK)基因的重组质粒pTV118NPCTC1(ST/QK)制备的聚合物的GC/MS分析结果的表图。
[图4]是表示实施例中制备的聚合物的1H-NMR光谱分析结果的表图。
[图5]是表示重组质粒pTV118NPCTC1(WT)构成的概要图。图中，phaC1(WT)表示假单胞菌sp.61-3来源的多羟基链烷酸合成酶基因(野生型)，PCT表示埃氏巨球形菌来源的PCT基因，PRe表示富氧产碱菌来源的启动子，Plac表示乳糖操纵子启动子。
[图6]是经时表示由于PCT基因的差异导致的乳酰基CoA产量的差异的图。
[图7]是表示埃氏巨球形菌来源的PCT基因与丙酸梭菌来源的PCT基因的聚乳酸生产性的比较的图。
具体实施方式
本发明是聚乳酸的制造方法，包括：在含有碳源的培养基中培养重组微生物的工序1)，和从工序1)的培养物回收所述聚乳酸的工序2)；
所述重组微生物具有对CoA转移到丙酸和/或乳酸的反应进行催化的蛋白质，和由下述的a)或b)的氨基酸序列构成的对多羟基链烷酸的合成反应进行催化的蛋白质：
a)序列号2所示的氨基酸序列的第130位、第325位、第477位和第481位的氨基酸中的至少1个以上被取代为其它氨基酸的氨基酸序列，
b)在a)中规定的蛋白质中，还有第130位、第325位、第477位和第481位以外的1个或多个氨基酸缺失或被取代，或者插入了1个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
以下，就本发明中使用的蛋白质、重组微生物、和本发明的制造方法的各个条件进行说明。
1)对CoA转移到丙酸和/或乳酸的反应进行催化的蛋白质
本发明中使用的“对CoA转移到丙酸和/或乳酸的反应进行催化的蛋白质”，是具有催化CoA由适当的CoA底物转移到丙酸和/或LA上的反应的活性的蛋白质。具有这种活性的蛋白质一般被称为丙酰CoA转移酶(PropionylCoA Transferase、PCT)。以下，本发明中，将该蛋白质表示为PCT。
表1中示出了迄今为止已报道的PCT来源的(微生物名)的代表例以及编码它们的碱基序列信息的文献信息。
[表1]
  微生物名   文献信息
  丙酸梭菌   Eur.J.Biochem.，2002，Vol.269，pp.372-380
  埃氏巨球形菌   United States Patent 7186541
  金黄色葡萄球菌   Eur.J.Biochem.，2002，Vol.269，pp.372-380
大肠杆菌 Eur.J.Biochem.，2002，Vol.269，pp.372-380
本发明中，除了上述表1之外，还可以利用已经报道的PCT的任意一种。而且，只要是“对CoA转移到丙酸和/或乳酸的反应进行催化的蛋白质”，即使是在已知的PCT氨基酸序列中缺失、取代或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的蛋白质，也可以利用。而且，PCT的氨基酸序列关联使用的用语“多个”是指1～50个、优选1～25个、更优选10个以下。
CoA转移到丙酸和/或LA的反应的催化活性可以按照例如A.E.Hofmeister等人(Eur.J.Biochem.、第206卷、第547-552页)中记载的方法来测定。
本发明中优选的PCT是埃氏巨球形菌(Megasphaera elsdenii)来源的PCT，其氨基酸序列示于序列号4，编码该氨基酸序列的核酸(DNA)的碱基序列的例子示于序列号3。
本发明中其它的优选PCT是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)来源的PCT，其氨基酸序列示于序列号6，编码该氨基酸序列的核酸(DNA)的碱基序列的例子示于序列号5。如下述实施例所示，金黄色葡萄球菌来源的PCT与埃氏巨球形菌来源的PCT相比，在微生物培养初期就显示出高乳酸CoA生产性，由此提示其能够更快速地生产乳酸CoA和聚乳酸。因此，金黄色葡萄球菌来源的PCT的使用具有以下优点，即能够减少聚乳酸生产的成本。
本发明中，可以单独使用上述任意一种PCT，还可以组合使用多种来源的PCT。例如，埃氏巨球形菌来源的PCT，与金黄色葡萄球菌来源的PCT相比，在微生物培养后期显示出高乳酸CoA生产性。我们认为，基于这种埃氏巨球形菌来源的PCT的特性和上述金黄色葡萄球菌来源的PCT的特性，通过联合使用这两种PCT，可以更长期地维持乳酸CoA生产性。
2)对多羟基链烷酸的合成反应进行催化的蛋白质
本发明中催化多羟基链烷酸合成的蛋白质是由a)序列号2所示的氨基酸序列的第130位、第325位、第477位和第481位的氨基酸中的至少1个以上被取代为其它氨基酸的氨基酸序列、或b)在a)中规定的蛋白质中，还有第130位、第325位、第477位和第481位以外的1个或多个氨基酸被缺失或取代，或者还插入了1个或多个氨基酸残基的氨基酸序列构成的蛋白质。a)中规定的蛋白质是前述专利文献7记载的使假单胞菌属(Pseudomonas sp.)61-3来源的多羟基链烷酸合成酶的氨基酸序列的一部分发生变异的蛋白质；b)中规定的蛋白质是在a)中规定的蛋白质中以不丧失其活性的程度再导入追加的变异的蛋白质。而且，与b)中规定的蛋白质关联使用的用语“数个”，是指1～50个、优选1～25个、更优选10个以下。以下，本发明中，将催化多羟基链烷酸合成的蛋白质表示为PhaCm，并且所有专利文献7的内容都整合到本说明书中。
PhaCm的合适的具体例子，可以列举专利文献7的表6和表7中记载的序列号2所示的氨基酸序列的第130位、第325位、第477位和第481位的氨基酸分别被单独取代的单独变异、任意两个氨基酸被取代的二重变异、任意3个氨基酸被取代的三重变异、4个氨基酸都被取代的四重变异。
优选的蛋白质是任意两个氨基酸被取代的二重变异，尤其优选第325位的Ser被取代为Thr，且第481位的Gln被取代为Lys的二重变异(以下，表示为STQK)。
编码PhaCm的DNA，可以基于假单胞菌属(Pseudomonas sp.)61-3来源的多羟基链烷酸合成酶的氨基酸序列(序列号2)和编码其的DNA的碱基序列(序列号1)，通过本领域技术人员公知的定点变异导入法重组制备。此外，按照专利文献7所记载的，PhaCm的催化多羟基链烷酸合成的活性，可以通过获得用可以表达前述PhaCm的核酸转化的宿主细胞，利用该宿主细胞的多羟基链烷酸的蓄积能力来确认。
3)编码蛋白质的核酸
上述1)～2)的各蛋白质，优选将编码这些蛋白质的核酸导入于微生物，使之在该微生物内转录翻译成蛋白质，而使用。导入微生物中的核酸优选处于整合于载体的形态。
用于将前述核酸导入于微生物的载体只要是可以在宿主中自我复制的就可以了，优选处于质粒DNA、噬菌体DNA的形态。作为用于将核酸导入大肠杆菌的载体的例子，分别可以列举pBR322、pUC18、pBLuescriptII等质粒DNA，EMBL3、M13、λgtII等噬菌体DNA等。而且，作为用于导入于酵母的载体的例子，可以列举YEp13、YCp50等。
此外，作为用于将核酸导入于罗尔斯通氏菌(Ralstonia)属细菌或假单胞菌(Pseudomonas)属细菌的载体的例子，可以列举，在广范围的宿主中被复制和保持的具有RK2复制起点的pLA2917(ATCC37355)或具有RSF1010复制起点的pJRD215(ATCC 37533)等。
编码上述1)～2)各蛋白质的核酸的DNA向载体的插入，可以优选用本领域技术人员已知的基因重组技术进行。而且，在重组时，优选在能够调节由插入于载体中的DNA向各蛋白质的转录翻译的启动子下流，连接前述DNA。作为启动子，只要是能够调节宿主中基因转录的启动子，则可以使用任意一种。例如，在使用大肠杆菌作为宿主时，可以使用trp启动子、lac启动子、PL启动子、PR启动子、T7启动子等，在使用酵母作为宿主时，可以使用gal1启动子、gal10启动子等。而且，在使用假单胞菌(Pseudomonas)属细菌作为本发明的微生物时，作为启动子，可以使用被认为含有phaC1Ps基因上游或phbCRe上游的启动子的区域等。
此外，本发明载体中，根据需要，可以连接在要导入核酸的微生物中可以利用的终止子序列、增强子序列、剪切信号序列、多聚A添加信号序列、核糖体结合序列(SD序列)、选择标记基因等。作为选择标记基因的例子，可以列举氨苄西林抗性基因、四环素抗性基因、新霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、氯霉素抗性基因等药物抗性基因，以及与氨基酸或核酸等的营养素的细胞内生物合成相关的基因、或编码荧光素酶的荧光蛋白质的基因等。
上述核酸优选处于载体形态的核酸通过本领域技术人员公知的方法，导入于微生物中。作为载体向微生物中的重组方法，可以列举例如磷酸钙法、电穿孔法、原生质球法、醋酸锂法、接合转移法、使用钙离子的方法等。
4)微生物
作为本发明中的重组微生物，为表达上述1)～2)蛋白质的微生物，优选通过导入可以功能性表达上述1)～2)蛋白质的核酸而被转化的微生物。作为合适的微生物，可以列举假单胞菌属(Pseudomonas sp.)61-3株等假单胞菌(Pseudomonas)属细菌、富养罗尔斯通氏菌等罗尔斯通氏菌(Ralstonia)属细菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等芽孢杆菌(Bacillus)属细菌、大肠杆菌(Escherichia coli)等埃希氏菌(Escherichia)属细菌、棒状杆菌(Corynebacterium)属细菌、酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)等酵母(Saccharomyces)属酵母、麦牙糖念珠菌(Candida maltosa)等念珠菌属(Candida)属酵母等。这其中，优选是大肠杆菌、棒状杆菌属细菌和富养罗尔斯通氏菌，尤为优选是大肠杆菌、棒状杆菌属细菌。
富养罗尔斯通氏菌等其自身具有固有的多羟基链烷酸合成酶的微生物的情况下，优选使用失去了该固有的多羟基链烷酸合成酶的表达能力的微生物。丧失这种表达能力的微生物可以通过以下方式制造，即用亚硝基胍等化学变异源或UV等物理变异源处理微生物，或改变编码多羟基链烷酸合成酶的核酸，在微生物中导入无法进行该酶的功能性表达的变异核酸，进行“同源重组”(homologous recombination)。多羟基链烷酸合成酶基因被破坏的确认可以通过以下方式进行，即，通过使用该基因的一部分作为探针的Southern杂交，检测杂交的条带与野性株来源的条带相比，移动到预想位置。
5)聚乳酸的制造
聚乳酸的制造通过以下方式进行，即，在含有碳源的培养基中培养导入了前述核酸的重组微生物，使培养菌体或培养物中生成并蓄积聚乳酸，从该培养菌体或培养物中回收聚乳酸。
本发明的重组微生物的培养优选，除了培养基组成之外，根据重组微生物的种类，在各个微生物的一般培养条件下进行。
尽管并非特别需要具有特殊组成的培养基，但优选采用除了碳源之外，还对氮源、无机盐类和其它有机营养源任一个都进行了限制的培养基。例如，作为培养在罗尔斯通氏菌(Ralstonia)属细菌或假单胞菌(Pseudomonas)属细菌等中整合了核酸的重组微生物的培养基，例如，可以列举氮源限制在0.01～0.1％的培养基。
作为碳源，可以列举例如葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖等碳水化合物。此外，还可以将碳原子数为4以上的油脂相关物质作为碳源。作为碳原子数为4以上的油脂相关物质，可以例举玉米油、大豆油、红花油、葵花油、橄榄油、椰子油、棕榈油、菜籽油、鱼油、鲸油、猪油或牛油等天然油脂、丁酸、戊酸、已酸、辛酸、癸酸、月桂酸、油酸、软脂酸、亚麻酸、亚油酸或肉豆蔻酸等脂肪酸或这些脂肪酸的酯、辛醇、月桂醇、油醇或棕榈醇等或这些醇的酯等。
作为氮源，可以列举，例如氨、氯化铵、硫酸铵、磷酸铵等铵盐，以及蛋白胨、肉提取物、酵母提取物、玉米浆等。作为无机物，可以列举例如磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠等。
培养优选在通常振荡培养等好气条件下、25～37℃的范围下，在前述1)～2)的蛋白质被转录表达之后进行24小时以上。培养中，还可以在培养基中添加卡那霉素、氨苄西林、四环素等抗生素。在将编码前述1)～2)的蛋白质的DNA中的任一或者全部连接到诱导性启动子控制下时，还可以在培养基中添加诱导该启动子转录的因子。
本发明的优选方式是培养导入了具有编码埃氏巨球形菌(M.elsdenii)来源的PCT的核酸(序列号3)或编码金黄色葡萄球菌(S.aureus)来源的PCT的核酸(序列号5)、和编码STQK的核酸的表达载体的重组大肠杆菌，制造聚乳酸的方法。该方法，即使不在培养基中添加LA等构成目的聚合物的单体成分，也可以用便宜的废糖蜜制造聚乳酸，这在制造成本方面是有利的。
本发明中，聚乳酸的回收可以通过用于从微生物中回收聚乳酸或PHA的本领域的公知的方法进行。例如，通过离心分离从培养液中收集菌体，清洗后，使之干燥，将干燥菌体悬浮于氯仿，加热，从氯仿级分中提取目的聚酯，再在该氯仿溶液中加入甲醇，使聚乳酸沉淀，通过过滤或离心分离除去上清液后，通过干燥，可以获得纯化的聚乳酸。
回收的聚酯是聚乳酸的确认，可以通过通常方法、例如气体色谱法或核磁共振法等进行。
以下，列出非限定的实施例，更详细地说明本发明。而且，实施例中的各实验操作按照以Sambrook等人(分子克隆：实验室手册，第二版1989年、冷泉港实验室出版，冷泉港，纽约)为代表的各种介绍实验操作的手册、或各种试剂和试剂盒中附带的说明书的各种记载进行。
实施例
<实施例1>
1)重组微生物的制备
从埃氏巨球形菌(M.elsdenii、ATCC17753)中，用DNeasy TissueKit(Qiagen社)，提取基因组DNA后，为了通过PCR扩增编码丙酰CoA转移酶(登录号J04987)的核酸，合成含有EcoRI识别序列的正向引物，和含有PstI识别序列的反向引物的引物DNA。
以前述基因组DNA作为模板，使用iCycler(BioRad)，在含有KOD-Plus-DNA聚合酶(1U)、PCR缓冲液、1mM MgSO4、各引物15pmol、0.2mM dNTPs(均为东洋纺株式会社制)反应液中，以94℃2分作为1个循环，以94℃下15秒，55℃下30秒，68℃下2分作为1个循环的PCR反应，进行30个循环后，回收约1500bp的扩增片段，用EcoRI和PstI消化，获得了DNA片段。
此外，从金黄色葡萄球菌(S.aureus、ATCC10832)和丙酸梭菌(C.propionicum、ATCC25522)中，以同样方式获得编码丙酰CoA转移酶的DNA片段。使用的PCR扩增条件如下：PCR反应(酶KOD PLUS)、94℃1分的1个循环，94℃30秒、50℃30秒，和72℃2分的30个循环，和94℃2分。
各基因扩增中使用的引物对的序列如下：
埃氏巨球形菌PCT用：
MePCTN：5’-atgagaaaagtagaaatcattac-3’
MePCTC：5’-ttattttttcagtcccatgggaccgtcctg-3’
丙酸梭菌PCT用：
CpPCTN：5’-gggggccatgggaaaggttcccattattaccgcagatgag-3’
CpPCTC：5’-ggggggctcgagtcaggacttcatttccttcagacccat-3’
金黄色葡萄球菌PCT用：
SpctN：5’-gtgccatggaacaaatcacatggcacgac-3’
SpctC：5’-cacgaattcatactttatgaattgattg-3’
用EcoRI和PstI消化质粒pTV118N(宝酒造)，用碱性磷酸酶脱磷酸化后，加入埃氏巨球形菌来源的前述DNA片段进行连接，制备含有编码丙酰CoA转移酶的DNA的约4.7kbp的重组质粒PTV118N M.E.-PCT。
同样，分别将丙酸梭菌和金黄色葡萄球菌的各PCT基因插入于pTV118N载体(宝酒造)的NcoI-BamHI、NcoI-EcoRI间，制成表达质粒PTV118N C.P.-PCT、PTV118N S.A.-PCT。
按照Takase等人(J.Biochem.、2003年、第133卷、第139-145页)记载的方法，制备含有完整编码STQK的DNA的质粒pGEMC1(ST/QK)AB。
用BamHI消化pGEMC1(ST/QK)AB，回收约6kbp的DNA片段，在含有66mM醋酸钾，10mM醋酸镁，0.5mM DTT，0.1mg/mL BSA，0.1mMdNTP的3mM Tris-醋酸缓冲液(pH7.9)中，使200个单元的T4聚合酶在37℃下作用5分钟，获得了编码STQK的DNA片段。
用PstI消化pTV118N M.E.-PCT，与上述相同条件下，使T4聚合酶作用后，用碱性磷酸酶脱磷酸化后，连接编码前述phaCm的DNA片段，获得了在pTV118N M.E.-PCT的SalI位点导入了编码STQK的DNA的约9.6kbp的质粒pTV118N-PCT-C1(ST/QK)AB。用PCR法扩增pTV118N-PCT-C1AB的除了phaA、phaB部分的区域，自连接其产物，获得pTV118N-PCT-Cl(图1)。用pTV118N-PCT-C1(ST/QK)转化大肠杆菌W3110的感受态细胞。
而且，同样，使用表达质粒PTV118N C.P.-PCT，获得了带有编码前述phaCm的DNA片段的pTV118N-C.P PCT-C1(STQK)，转化大肠杆菌W3110的感受态细胞。
2)聚合物的生产
获得的转化体的培养是如下进行的：将在LB琼脂培养基上形成的活性菌落接种在装入在容积为100ml的三角烧瓶的10ml的LB液体培养基中，于30℃振荡培养(オリエンタル技研工业(株)制IFM型，130rpm)直至OD0.6～1.0，将生长的前培养菌液以1％容量接种于装入于容积为500ml的三角烧瓶中的200ml的本培养用培养基中，进行振荡培养。
通过前述培养法进行200ml培养，用50ml falcon试管对获得的培养液收集菌体(3000×g，5min，RT)后，于-80℃冷冻一晚。用冷冻干燥机(LABCONCO公司制Model 77400型)对该冷冻菌体进行2天干燥。
将干燥菌体移入耐压试验管，每100mg菌体添加1ml的氯仿，在95℃的水浴中回流3小时。回流后的试样恢复到室温，用0.22μm PTFE过滤器过滤到硅制离心管，去除菌体。将提取的试样在室温下干燥直至氯仿完全消失。在该干燥后的团块中加入2ml的己烷，涡旋振动约1分钟，然后离心(6000×g、15分、RT)，去除上清。用该己烷进行2次清洗。干燥后的试样溶解于2ml的氯仿，转移到玻璃制小瓶，干燥，将其作为聚合物分析用试样。
3)聚合物的分析
i)GPC
2)中回收的聚合物约1mg中加入1mL的氯仿，用0.2μmPTFE过滤器(ADVANTEC)对其进行过滤，将过滤的溶液作为试样，在下述条件下进行GPC测定。
系统：Shimadzu Prominence GPC system
柱：TSKgel-Super THZ-M(6.0mm×150mm)
洗提液：CHCl3
流量：0.8mL/分
温度：40°
检测：10A折光率检测器
试样量：10μL
测定的分子量分布曲线示于图2。分子量校正曲线用标准聚苯乙烯制成，用标准聚苯乙烯分子量的换算值表示分子量。其结果是，聚合物的分子量(Mw)是22000。
ii)GC/MS分析
通过前述的培养法进行200ml培养，用50ml falcon试管对获得的培养液收集菌体(3000×g，5min，RT)后，于-80℃冷冻一晚。用冷冻干燥机(LABCONCO公司制Model 77400型)对该冷冻菌体进行2天干燥。将该干燥菌体中的100mg量取到耐压试验管中，添加1.6ml氯仿，室温下静置一晚。在该菌体/氯仿溶液中添加1.6ml甲醇硫酸(甲醇∶硫酸＝17∶3的混合液)、100μl内部标准(苯甲酸10mg/CHCl310ml)，在95℃的水浴中回流3小时，进行甲基化。甲基化结束后的试样恢复到室温，移到Φ18mm的一次性试管中。在其中加入800μl的Mili Q水，搅拌约30秒后，静置直至分离成水层和溶剂层。分离后，用巴斯德吸管分取氯仿层，用0.22μm PTFE过滤器过滤到容量为2ml的小瓶，提供给分析。
聚乳酸的标准品，首先将20mg的PLA-0020(和光纯药工业(株)制、重量平均分子量20,000)溶解于容量为20ml的小瓶中10ml的氯仿，将其中的1ml转移到耐压试验管，添加氯仿0.6ml、甲醇硫酸1.6ml、内部标准100μl，于95℃的水浴中回流3小时，进行甲基化。甲基化结束后的标准试样恢复到室温，转移到Φ18mm的Dispo试验管中。在其中加入800μl的Mili Q水，搅拌约30秒后，静置直至分离成水层和溶剂层。分离后，用巴斯德吸管转移到容量为2ml的小瓶，用于分析。
GC/MS分析在下述条件下进行。
甲基化的生产物，在GC/MS(HP6890 Series GC system/5973 MassSelectiveDetector)中使用Agilent制柱的DB-1(122-10G3：150meters×0.25mm×1mm)或DB-1(122-1063：60meters×0.25mm×1mm)进行分析。各柱使用时的分析方法如下所示。
122-10G3：在150℃下保持2分钟，以5℃/1分升温、300℃下保持10分钟
122-1063：在120℃下保持5分钟、以5℃/1分升温、300℃下保持10分钟
上述条件下的分析结果和乳酸甲酯的MS光谱示于图3A～D。而且，只有图3D的结果是从没有去除氯仿的试样中获得的。根据GC/MS的结果，确认了2)回收的聚合物含有LA作为单体单元。
iii)NMR分析
将2)中回收的聚合物溶解于氘化氯仿中，作为试样，于300MHz测定1H-NMR(图4)。其结果表明2)中回收的聚合物含有乳酸作为单体单元。
4)微生物内的PCT表达和乳酰基CoA合成
使用1)中制成的重组质粒PTV118N M.E.-PCT、PTV118N C.P.-PCT、和PTV118N S.A.-PCT，转化大肠杆菌W3110的感受态细胞。
在前培养后，将各菌株以2％接种在200ml LB/2L烧瓶中，于37℃、180rpm培养3小时。在OD600＝0.5附近，用10mM IPTG诱导表达，于30℃、80rpm下培养6小时。然后用离心回收菌体，在M9(+1.5％葡萄糖、10mM MgSO4、10mM泛酸Ca)中，于37℃培养(OD＝20,3ml)，进行适当取样。
回收菌体(相当于1×105细胞)，进行试样制备(n＝3)。上样到吸滤系统中，用MiliQ水清洗2次。在装入了2ml的MeOH溶液的浅底盘中加入过滤器(翻过来)，在室温下放置10分钟后，将1.6ml的MeOH溶液移送到离心沉淀管，混合1.6ml的氯仿和640ul的MiliQ水，悬浮。4600g、4℃、5min离心后，对1.5ml的水+MeOH层，用5k超滤膜(Millopore社制)进行约2小时的离心过滤。回收滤液，冷冻干燥后，用含有二次内部标准物的MiliQ水浓缩溶解200倍，提供给CE-MS分析。CE-MS分析条件按照Anal.Chem 2002，74，6224-6229“Pressure-Assisted CapillaryElectrophoresis Electrospray Ionization Mass Spectrometry for Analysis ofMultivalent Anions”。其结果示于图6。
根据图6，表明金黄色葡萄球菌来源的PCT基因，与埃氏巨球形菌来源的PCT基因相比，在培养初期显示出高乳酸CoA生产性。
5)PCT基因对聚乳酸生产性的影响
图7显示由上述ii)GC/MS分析得到的乳酸诱导体的定量结果。
根据图7的结果，表明埃氏巨球形菌来源的PCT，与丙酸梭菌来源的PCT相比，对聚乳酸的生产性有更好的贡献。
<比较例>
制备将实施例1中制作的质粒pTV118N-PCT-C1(ST/QK)中所含的编码STQK的碱基序列取代为编码下述蛋白质的碱基序列的表达载体。该表达载体的构成汇总示于图5。
pTV118N-PCT-C1(WT)：假单胞菌sp.61-3的多羟基链烷酸合成酶(野性型、序列号1)
用pTV118N-PCT-C1转化大肠杆菌W3110的感受态细胞，获得的转化体的培养是如下进行的：将在LB琼脂培养基上形成的活性菌落接种在装入在容积为100ml的三角烧瓶的10ml的LB液体培养基中，于30℃振荡培养(オリエンタル技研工业(株)制IFM型，130rpm)直至OD 0.6～1.0，将生长的前培养菌液以1％容量接种于装入于容积为500ml的三角烧瓶中的200ml的本培养用培养基中，进行振荡培养。
通过前述培养法进行200ml培养，用50ml falcon试管对获得的培养液收集菌体(3000×g，5min，RT)后，于-80℃冷冻一晚。用冷冻干燥机(LABCONCO公司制Model 77400型)对该冷冻菌体进行2天干燥。将该干燥菌体中的100mg取量到耐压试验管，添加氯仿1.6ml，室温下静置1晚。在该菌体/氯仿溶液中添加1.6ml甲醇硫酸、100μl内部标准(苯甲酸10mg/CHCl310ml)，在95℃的水浴中回流3小时，进行甲基化。甲基化结束后的试样恢复到室温，移到Φ18mm的一次性试管中。在其中加入800μl的Mili Q水，搅拌约30秒后，静置直至分离成水层和溶剂层。分离后，用巴斯德吸管分取氯仿层，用0.22μm PTFE过滤器过滤到容量为2ml的小瓶，提供给GS/MS分析。
GS/MS分析按与上述实施例1所述一样的方式进行。根据图3B所示的结果，确认了使用pTV118NPCTCl(WT)时，基本没有生产含有乳酸的聚合物。
本说明书中引用的所有的刊物、专利和专利申请直接作为参考引入本说明书。
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Claims (4)

1.聚乳酸的制造方法，包括：在含有碳源的培养基中培养重组微生物的工序1)，和从工序1)的培养物回收所述聚乳酸的工序2)；
所述重组微生物具有由序列号4或6所示的氨基酸序列构成的对CoA转移到丙酸和/或乳酸的反应进行催化的蛋白质，和由下述的a)的氨基酸序列构成的对多羟基链烷酸的合成反应进行催化的蛋白质：a)序列号2所示的氨基酸序列的第325位的Ser被取代为Thr、第481位的Gln被取代为Lys的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的制造方法，所述蛋白质都是由导入到微生物的重组表达载体所编码的蛋白质。
3.用于制造聚乳酸的重组微生物，具有由序列号4或6所示的氨基酸序列构成的对CoA转移到丙酸和/或乳酸的反应进行催化的蛋白质，和由下述的a)的氨基酸序列构成的对多羟基链烷酸的合成反应进行催化的蛋白质：a)序列号2所示的氨基酸序列的第325位的Ser被取代为Thr、第481位的Gln被取代为Lys的氨基酸序列。
4.根据权利要求3所述的用于制造聚乳酸的重组微生物，其特征在于，导入了具有编码所述蛋白质的基因的重组表达载体。
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