CN102459601A - 聚合酶的编码基因和制备聚合物的方法 - Google Patents

Abstract

聚羟基脂肪酸酯(PHA)合酶基因(SEQ ID NO：2)从淡水色杆菌属分离得到，它的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)以及制备以C3和C7为单体聚合而成的多聚体，包括聚(3-羟基丁酸酯-CO-3-羟基)随机共聚物(聚(3HB-co-3HV))和聚(3-羟基丁酸酯-CO-3-羟基丁酸)随机共聚物[P(3HB-co-3HHx)]以及P(3HB-co-3HHx)共聚物。通过在例如贪铜菌属以及假单孢菌等微生物的重组宿主中表达SEQ ID NO：2的序列来制备多聚体。

Description

聚合酶的编码基因和制备聚合物的方法

技术领域

这本发明涉及一种聚合酶以及编码这种酶的基因。特别是，本发明提供了一种编码这种聚合酶的功能性基因，一种含有这种基因的重组载体，一类通过载体进行转换的转化子，以及一个制备聚合酶的过程，这个过程涉及到用转化子来合成塑状高分子聚合物。

背景技术

聚羟基脂肪酸酯(PHA)是存在于微生物体内的聚合物，它具有与主要商用塑料材料十分接近的性质。大多数PHA是具有人工添加生物降级附加优势的热塑性塑料，并且可以通过类似于从石油化工产品中提取制成的合成塑料的方法热加工得到。PHA本质上也是可再生的，因为他们可以由糖类、植物油和二氧化碳这些可再生资源制备得到。聚3-羟基丁酸是最早被发现的PHA类型，也是自然界中最为普遍存在的PHA。

PHA可以通过调控次级单位结构的合成或构成来修饰其性质以应用于广泛的领域当中。用于聚合物合成的微生物可以被分成两组，一组是利用3个到5个碳单位进行聚合物合成的微生物，另一组是利用6个到14个碳单位进行聚合物合成的微生物。这些具有特征性的微生物体内具有底物特异性聚合酶。这些至少由6个碳单位组成的聚合物是具有弹性的软性聚合材料。

以往通过研究PHA所获得的以及仍在不断增长的利益价值，驱使着人们向新的细菌菌株领域展开研究攻势，以从中获得优良新颖的聚合体产品。通过对革兰氏阳性和革兰氏阴性微生物的调查研究所获得的PHA产品则是一个良好的证明。有关于PHA生物合成的基因，包括其关键酶，即从这些微生物中提取得到的PHA合酶，已经被鉴定和定性了。

目前有一些专利技术要比先前涉及聚合酶和基因编码的研究更好的技术，如美国专利No.US6812013是对在一些制备过程中一种有用的PHA合酶的相关研究，其中有的制备过程是对一个PHA，一个编码这种酶的基因，一个包含有这种基因的聚合载体，以及一个通过这种载体进行转换的转化子的准备事项，有的制备过程与利用转化子制备PHA合酶有关，还有的制备过程与利用转化子准备PHA有关。通过把从恶臭假单胞菌中提取得到的一种PHA合酶引入到另一种用于制备PHA合酶或者PHA的宿主微生物中，而得到的转化子，使这门技术得到了证实和描述。

另一项美国专利No.US2004146998对于转化子和使用同样方法制备聚合酶的过程也有相关涉及。这门技术揭示了一种用于编码共聚体合成酶的基因，一种微生物以及以这种微生物为研究目标而进行聚合体制备的一个途径。其中该种微生物利用聚合体的基因进行发酵合成。这门技术着重于对这种转化子的结构组成的研究。这种转化子含有一个聚酯合成交联合酶的基因，一个启动子和一个终止子，并且已被引入用于酵母的制备。

一个优良的转化子和使用相同方法制备聚合体的过程已在美国专利No.EP1626087中被揭示出来。这门技术提供了一个由一类编码由PHA合酶中推断得到的豚鼠气单胞菌的基因组成的基因表达盒。酵母也被用作为一种宿主和一种已经被引入启动子和终止子的突变体，因此这种基因盒可以在酵母上发挥作用。

有些专利技术揭示了聚合酶的编码基因与其他基因之间的联系。美国专利No.US2008233620中涉及到一种转化子和一个在酵母上制备基因表达产品的过程的研究。这种转化子是通过引入几个酶基因获得的，这些酶基因是从PHA合酶中分离的，例如PHA合酶和乙酰乙酰辅酶A还原酶基因的组合体。在另一项美国专利No.US2003146703中揭示了一种表达PHA合酶和细胞内的PHA解聚酶的重组微生物。这门技术使PHA的合成与降解能同步进行。

大多数的专利技术涉及到一类转化子和一个制备聚合物或通过使用已被发现的转化子来制备PHA的制备过程。但是，这些专利技术都与从不同种类微生物的不同基因区中提取得到的PHA合酶基因有关。迄今为止，还没有任何一项专利技术是揭示了在某一聚合酶的合成过程中用3个碳到7个碳单位进行聚合。因此，就提供一个聚合酶基因的改良DNA片段来制造一个重组载体和一类在活力水平增长的情况下，对于聚合酶的供给有较大帮助的转化子来说，这门技术的相关应用是十分理想的。

发明内容

本发明的首要目标是要提供一种从不同种类细菌中提取的聚合酶基因和一个聚合酶合成的制备方法，且这种被基因标记过的聚合酶是由有效的单体单位组合得到的。

另一个研究目标是要提供一个聚合酶的新型DNA结晶片段，然后把这种DNA结晶片段能够连接到一个合适的载体上，从而得到一个重组载体，最终提供一个含有聚合酶的转化子。

本发明的另一个目标是提供一种具有不断增长的酶活性的聚合酶。

此外还有一个目标是创造发展一个制备聚合物更有效率的途径，利用转化子来制备聚合物，包括聚合酶。

通过本发明，上述所说的目标中，至少已有一个目标或多或少得以实现。其中某一技术实施例是描述了一个有酶活的分离的多核苷酸用于形成一个由氨基酸序列组成的多肽的编码过程，且这个氨基酸序列源于SEQ ID NO：1排列得到。

另一技术的实施例也是在一个分离的多核苷酸用于合成一个含有一个氨基酸序列的多肽的编码过程中，且这个氨基酸序列也是源于SEQ ID NO：1排列得到，但是其中一个或几个氨基酸被替换，删除，取代或者添加，因而这个多肽具有聚合酶活性。

根据本发明的最佳实施例，分离的多核苷酸由一个通过SEQ ID NO：2排列得到的核苷酸序列或其中的补充序列组成。

本发明另一个最佳实施例是一个分离的多核苷酸，它是由通过SEQ ID NO：2排列得到的核苷酸序列或其中的补充序列组成的，但其中T被U或其补充序列所替代。

还有一个实施例是一个由一种分离的多核苷酸组成的重组载体，但是这个分离的多核苷酸是用于编码另一种具有酶活性的多肽，此多肽是由源于SEQ IDNO：1排列得到的氨基酸序列组成的，或是由一个或多个氨基酸被取代、删除、替换或添加的并源于SEQ ID NO：1排列得到的氨基酸序列组成的具有聚合酶活性的多肽。此外，这个重组载体是质粒。

本发明深层体现的实施例，如前所述实施例，是对于一个通过载体进行转化的转化子的发现。

本发明的另一个深层体现实施例，是一种用于制备聚合物组成的过程：在一个含有聚合材料的介质中，培养一个由以上所述的任何一种实施例中分离的转化子，然后从培养过的介质中使聚合物复原。最佳情况下的聚合物是PHA。

对于这项技术十分熟悉的人来说，不难看出，本发明已经很好地实现了发明目的，获得上述所提及的以及其本身拥有的结果与优点。此处所述的实施例，并不是为了局限发明的范围。

附图说明

为了帮助理解该发明，有说明所附的绘图的首选实施例，其中考虑与下面的介绍和发明的检查的相关联，其构成与操作以及其他一些优点会很容易被懂得和欣赏。

图1是氨基酸序列的多肽聚合物合成酶，如在本发明的最佳实施方案之一中所述。

图2是标有聚合物合成酶编码的多聚核苷酸，如在本发明的最佳实施方案之一所述。

图3是用于PCR扩增的聚合物合成酶的扩增核苷酸序列，如在本发明的最佳实施方案之一中所述。

图4是H-NMR谱(3-羟基丁酸酯-CO-3-羟基-CO-3-羟基丁酸)，是所述的首选实施例之一转化子合成的共聚物的例子。

具体实施方式

本发明涉及一种高分子合成酶和编码这种酶的基因。更详细的说，本发明提供了一个编码聚合酶的功能性基因，一个含有这种基因的重组载体，一个通过载体进行转化的转化子，一个为了制备聚合酶的过程，该过程与运用转化子制备塑状聚合物有关。

以下简述发明应根据本发明的最佳实施方案和所附的说明书和附图描述。然而，可以理解的是，限制发明的首选实施方案和图纸的说明，仅仅是为了方便讨论本发明设想，可以想象本领域技术人员作出的各种修改均不偏离权利要求所保护的范围。

本发明公开了一个分离的一种编码多肽的多聚核苷酸，它是由从SEQ IDNO：1中排列得到的氨基酸序列组成的，具有聚合酶的活性。SEQ ID NO：1如图1所示。

根据本发明的首选实施例，分离的多聚核苷酸是一种高分子合成酶基因。此外，这种聚合物合成酶基因可以编码一个含有SEQ ID NO：1氨基酸序列的多肽，或是一个经过先SEQ ID NO：1中得到，后进行删除、替换或添加的氨基酸序列。即使一个或多个氨基酸序列SEQ ID NO：1，可能已经发生了突变，如删除，更换或添加，用于编码含有的氨基酸序列的多肽的多聚核苷酸是包含在本发明的基因范围内的，如果多肽具有聚合酶的活性。例如，编码含有从SEQID NO：1中排列得到的氨基酸序列的多聚核苷酸，其中在第一个位置上的蛋氨酸被删除，它也属于本发明的基因。换句话说，本发明的基因不仅包括编码从SEQ ID NO：2排列得到的氨基酸序列的核苷酸序列，而且它的退化，除了简并密码子，也编码相同的多肽。上述的突变如删除，更换或增补可以由已知的定点突变引起。

在本发明的首选实施例中，揭示了一个由SEQ ID NO：2核苷酸序列或其互补序列组成的分离的多核苷酸。SEQ ID NO：2如图2所示。尽管如此，本发明的另一实施例是一个由SEQ ID NO：2的核苷酸序列组成的分离的多聚核苷酸，但其中T是由U或其互补序列取代。这些多核苷酸用来编码具有高分子合成酶活性的多肽的。

这种聚合物合成酶基因最好是从一个合适的微生物中克隆得到。在按照本发明的首选实施例，高分子合成酶基因是从一个由淡水中分离出的属于色素细菌属的微生物中分离出来的。本发明的基因可通过化学合成或聚合酶链反应(PCR)技术，使用基因组DNA为模板，或使用DNA片段的核苷酸序列作为探针进行杂交。本发明的基因可通过化学合成或聚合酶链反应(PCR)技术，使用基因组DNA为模板，或使用DNA片段的核苷酸序列作为探针杂交。

在按照本发明的首选实施例，应用PCR检测方法是为了获得聚合物合成酶基因的DNA片段，使用色素细菌属SP基因组的DNA为模板。最初，基因组DNA由色素细菌属SP链所分离。在工艺中应该知道，任何合适的介质，例如，一种营养丰富的培养基，可用于基因组DNA的制备。要获得含有色素细菌属SP的聚合物合成酶基因的DNA片段，最好准备一个探针。聚合酶基因的保守区域从已知的氨基酸序列，或为他们进行编码的核苷酸序列中挑选得到，这些核苷酸序列可被估计用来设计寡核苷酸。这个目的是要通过一对引物扩增核苷酸来达到。扩增核苷酸的一个例子是如图3所示，其中SEQ ID NO：3为正向引物，SEQ ID NO：4为反向引物。

扩增的DNA片段，可以用合适的限制性内切酶消化，例如氨基青霉烷酸-I和沙丁胺醇-I。然后DNA片段由碱性磷酸酶去磷酸化。它被连接在一个事前用限制性内切酶切割过的载体上，载体可以是氨基青霉烷酸-I和沙丁胺醇-I。

本发明的另一实施例是一个由分离的多聚核苷酸组成的重组载体，其中分离出的分离的多聚核苷酸是用来编码由SEQ ID NO：1排列得到的氨基酸序列组成的具有高分子合成酶活性多肽，或是用来编码由SEQ ID NO：1排列得到的氨基酸序列组成，但其中的一个或多个氨基酸被替换、删除、更换或添加，且具有高分子合成酶活性的多肽。

根据本发明的最佳实施例，能够在宿主微生物中进行自主复制的质粒或噬菌体可以用来作为载体。可应用的质粒载体包括pBR322，pUC18，pBluescriptII，而可应用的噬菌体载体包括EMBL3，M13，λgt11。这些载体可以在商业上获得。拥有在2个或多个宿主细胞例如大肠杆菌和短芽孢杆菌中自我复制能力的载体，就像是各种穿梭载体也可被应用。这种载体使他们也可以被限制性内切酶切割为片段。

因此，传统的DNA连接酶是作用于将DNA片段连接到载体片段上。DNA片段和载体片段退火后，连接产生一种重组载体。

本发明的进一步实施例是通过将本发明的重组载体引入到一个具有表达性的，用于结构组成的，宿主兼容性载体上，也被称为重组载体，从而产生得到的转化子。本发明的目的不是要限制特定宿主的使用，只要它具有表达目的基因的能力。比较恰当的例子是对属于菌属的微生物的利用，如假单胞菌和芽孢杆菌；或者是来源于酵母属或念珠菌属的酵母；或者如COS或者胆固醇细胞系的动物细胞。

如果是像属于菌属或是假单细胞菌属的微生物的细菌被用作宿主的话，那么本发明的重组DNA最好是由像是含有启动子的，本发明的DNA碎片的，以及序列转录终止所构成的。这是为了保证宿主中自发复制的产生。最好是含有但没有限制pGEM-T和pBBR1MCS-2衍生物的表达载体。同样地，启动子可以是任何可以在宿主中表达的类型。启动子的例子是像来源于大肠杆菌或者噬菌体的包括色氨酸启动子，乳酸启动子，pL启动子，pR启动子和T7启动子。

为了将重组载体引入宿主微生物中，任何已知的方法都可以利用。例如，如果宿主微生物是大肠杆菌，钙离子法和电穿孔法可以使用。如果使用了噬菌体DNA，那么体外包装方法就可以被采纳。

如果将酵母作为宿主，那么像Yep13或者YCp50这样的表达载体会被使用。因此，启动子可以是1加仑的启动子或是10加仑的启动子；并且将重组DNA引入酵母中的方法包括电穿孔法，原生质球法和醋酸锂法。如果将动物细胞作为宿主，那么像pcDNAI或者pcDNAI/Amp这样的表达载体会被使用。因此，将重组DNA引入至动物细胞的方法可以是电穿孔法或者磷酸钾法。

若要将引入主机微生物载体，可以使用任何已知的方法。例如，如果主机微生物是大肠杆菌，钙法与电穿孔法可以使用。如果使用噬菌体DNA，则可以通过体外的包装方法。

如果酵母用作主机采用表达载体(例如，Yep13或YCp50。因此，发起人可以是gal 1启动子或启动子gal 10；和重组DNA导入酵母的方法包括电穿孔法、原生质球法及醋酸锂方法。如果动物细胞用作主机，则使用(例如，pcDNAI或pcDNAI/Amp表达载体。因此，引入动物细胞的基因重组的方法可以是电穿孔法或磷酸钾方法。

本发明还公开了一种含有培养包括如之前所述的，在包含可聚物质媒介的任何先前的实施例中所述的，在含有聚合原料的介质中，分离的聚核苷酸组成的转化子，以及从培养介质中复原为聚合体的各个步骤。此聚合体可以在转化子中形成与累积。

用于培养宿主的传统的方法也被用来培养本发明的转化子。用于先从一种作为宿主的属于菌属或假单胞菌属的微生物中准备得到转化子的介质包括一种含有可被微生物吸收利用的碳源的介质，该介质中的氮源、无机盐或者其他的有机氮源是被限制了的，例如，某一介质中的氮源重量被限制在介质重量的0.01％到0.1％以内。

碳源是微生物生长的必须原料，同时也是聚合物的起始材料。使用的碳源可源自碳氢化合物如葡萄糖、果糖、蔗糖和麦芽糖。此外，有两个或多个碳原子的脂肪和油相关物质也可以用作碳源。这些脂肪和油相关的物质包括天然脂肪和油，如玉米油、豆油、红花油、葵花籽油、橄榄油、椰子油、棕榈油、菜籽油、深海鱼油、鲸油、猪油和牛油；脂肪酸如醋酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、油酸、棕榈酸、亚麻酸、亚油酸和肉豆蔻酸以及酯如乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、乙酯、丁辛醇、月桂醇、油醇酯酒精和棕榈醇以及其酯醇。与此同时，氮源可以从氨、铵盐、蛋白胨、肉提取物、酵母提取物或玉米浆中提取。无机物质包括磷酸二氢钾、磷酸、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠。

培养最好是在有氧条件下，在30℃至34℃左右，培养超过24小时，最好1到3天之后诱导表达，。在培养中，抗生素如氨苄青霉素、卡那霉素、庆大霉素、安替比林或四环素可添加到培养中。因此，聚合物可在微生物中积累，然后复原。

若要培养使用诱导催化剂，即诱导物例如异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)或吲哚-3-乙酸(IAA)所诱导的表达载体而转化的微生物，也可以添加到介质中。若要培养来自于动物细胞作为宿主的转化子，则像RPMI-1640或是DMEM由牛胎血清补充的介质也可以使用。根据本发明的首选实施例，通常的培养是在30℃至37℃的含有5％CO₂存在的情况下14至28天。在培养过程中，卡那霉素或青霉素等抗生素可添加到介质。

根据本发明的最佳实施例，聚合物分离纯化也是可以进行。转化株最好通过离心分离从培养中重新获得，然后用蒸馏水和己烷清洗，并干燥。此后，干燥的转化株悬浮法在氯仿中，并加热从中提取聚合物。残留物可以在过滤中清除。最好在氯仿中加入甲醇使聚合物沉淀。通过过滤和离心分离上清液后，干燥的沉淀便可以得到聚合物了。按常规手段，例如，通过气相色谱分析，核磁共振或其他方法，可以证明生成的聚合物便是希望得到的产物。

这聚合物合酶可以合成由单体单位3-羟基烃酸，见结构式一，所组成的共聚物(聚合物)，其中R代表氢原子或C1到C4烷基组。

最好是聚羟基烷酸酯聚合物。聚合物可以是一种共聚物包括聚(3-羟基丁酸酯-CO-3-羟基)随机共聚物(P(3HB-co-3HV))或聚(3-羟基丁酸酯-CO-3-羟基丁酸)随机共聚物[P(3HB-co-3HHx)]。携带有聚合酶基因的转化子有能力制备P(3HB-co-3HHx)且效率很高。

传统制备[P(3HB)]的方法会造成其不易抵受冲击这种物理性质的缺陷，这是由于这种聚合物是一种高度晶体状聚合物。结晶度会因为将含5个或6个碳原子的3-羟基丁酸引入聚合物链而降低。这种聚合物作为一种有弹性的聚合材料，在热稳定性和成形性方面也都很出色。

在本发明中，P(3HB-co-3HHx)共聚物能通过色素细菌激酶的使用而大量制备。由于P(3HB-co-3HHx)可以通过以上方法大量获得，进而可以作为纱线、胶片、多种容器的材料，因为它是可以进行生物降解的。此外，本发明的这种基因可以被用作一系列高产P(3HB-co-3HHx)共聚体的制备。

如同之前描述的那样，目前所揭示出的内容包含在附加申明上。虽然以首选的方式特别描述了这项发明，我们只能通过例子和构建细节的许多变化来了解它。并且部分的组合和安排离不开本发明内容的范畴。

实施例

以下所提供的例子用来说明发明的不同方面和其实施例之处。这些例子不是用来限制这项发明，它只被权利要求本身所限制。

实施例1

从色素细菌中克隆聚合物合酶基因。

首先，基因组DNA信息库不包含色素细菌sp.USM2。我们将色素细菌sp.USM2放在50毫升富营养培养基(1％蛋白胨，1％肉膏，0.5％酵母膏，PH7.0)中以30度培养，然后可以用标准法从微生物中得到染色体DNA。

我们准备了一个探针来从色素细菌sp.USM2中得到含有聚合物合酶的DNA片段。用NCBI数据库作为参照设计两个区域特异的寡核苷酸，合成3号和4号SEQ ID。

我们以这些寡核苷酸作为引物，色素细菌染色体DNA作为模板，通过PCR的方法扩增聚合物合酶的基因。PCR进行30次循环，每次循环包括在95度反应20秒，60反应180秒，60度再反应180秒。

通过桑格式法确定片段中的一段1.7kbp ApaI-SalI核酸序列。我们得到了包含有(1704)SEQ ID NO：1聚合酶基因的核酸序列。

实施例2

钩虫转化株的准备

将ApaI和SalI聚合物合酶基因片段写入克隆载体pGEM-T(琼脂糖)，这种克隆载体先前用相同的限制性内切酶切开。然后这个片段由ApaI和SalI限制性内切酶降解消化。终产物ApaI-SalI聚合酶基因片段写入到重组载体pBBR1MCS-2(这种载体能在贪铜菌属微生物中表达)，并且重组质体通过结合转录法被转录成钩虫菌属PHB-4(DSM 541)(无法合成聚合物的品系)。

首先，我们通过氯化钙法，用质粒重组体转化大肠杆菌S17-1。由此我们获得大肠杆菌重组体并重组钩虫贪铜菌PHB-4。我们先将重组的大肠杆菌和钩虫贪铜菌PHB-4分别在含1.5毫升LB的培养基和富营养培养基中过夜培养，然后各取1毫升这两种培养基混合在振荡器上培养1小时，温度为室温，之后停止振荡，培养30分钟，最后再振荡培养30分钟。我们将这些微生物混合物倒入含有50mg/L卡那霉素的西蒙氏柠檬酸盐琼脂，30度下培养2天。

由于将重组大肠杆菌的质粒转入钩虫贪铜菌PHB-4，钩虫贪铜菌PHB-4对卡那霉素有抗药性，所以在西蒙氏柠檬酸盐琼脂生长的菌落是钩虫贪铜菌转化株。

实施例3

用钩虫贪铜菌转化株合成聚合物。

我们将每个钩虫贪铜菌H16，钩虫贪铜菌转化株接种到50毫升矿物培养基(3.32g/L磷酸氢二钠，2.8g/L磷酸二氢钾、0.54g/L尿素)中，这种培养基含1ml/L微量元素。将所有这些物质放入烧瓶在30度下培养。我们为钩虫贪铜菌转化株加入50mg/L卡那霉素，将这些微生物培养48-72小时。

我们将H16种，钩虫贪铜菌转化株和PHB-4的每个菌株接种到含有5g/L果糖和棕榈仁油的上述矿物培养基中，每株菌在250ml烧瓶中30度培养72小时。

我们加入戊酸钠(2.5g/L)用作3-羟基戊酸(3HV)的产生。给钩虫贪铜菌转化株加入50mg/L卡那霉素。再加入不同浓度的戊酸钠和丙酸钠(混着12g/LCPKO)用作[P(3HB-co-3HV-co-3HHx)]的合成。

我们用离心法重新获得微生物，经蒸馏水洗涤，含CPKO的己烷冻干，干燥微生物的质量被确定。向10-30毫克干燥微生物加入2毫升硫酸甲醇混合物(15：：85)和3毫升氯仿，并将这个样品密封加热至100度，维持140分钟，在此期间微生物中的聚合物降解成甲酯。另向其中加入1毫升蒸馏水并用力搅拌。静置，它被分为2层，移除较低的有机层，用Neutra BOND-1毛细管柱(长25米，直径0.25毫米液膜厚度0.4微米，GL Science生产)和毛细管气相色谱法(岛津公司生产)测定其成分。以100度为初始温度，每分钟提高8度。实验结果在表1、2、3中显示。

表一显示了c生物合成PHA.钩虫转化株来源于果糖、戊酸钠和CPKO的混合物。

表一

a聚羟基脂肪酸酯合成培养基中，培养时间：48小时，温度：30摄氏度，起始pH值：7.0，200转每分钟戊酸盐在培养的24小时后添加

b聚羟基脂肪酸酯在干冻细咆中测定

3HB，3-羟基丁酸酯；3HV，3-羟基戊酸甲酯；3HHx，3-羟基己酸酯

ND-没有被检测出

根据表一的结果，转化株可以利用果糖来制备P(3HB)同聚物。细胞干重3.1±0.2g/L、聚物物量64±2％，这与H16(称重微生物为3.3±0.1g/Land 56±1％)很相似。如同预计的那样，没有在PHB-4中观测到积聚。当CPKO作为唯一碳源，我们可以获得更高的细胞干重。转化子的细胞生物量为4.0±0.2g/L而聚合物量为63±2％。

有趣的是，含有CPKO时，我们观察到具有4mol％3HHx的P(3HB-co-3HHx)聚合物积累。这在野生品种的色素细菌(USM2 or H16)并不明显。

为了研究P(3HB-co-3HV)共聚物的产生，我们向补有果糖的培养中加入了戊酸钠。和H16比较起来，通过转化株产生的3HV量是前者的两倍。通过测定微生物质量，由重组体产生的聚合物量为57±2％，高于野生品种的38±2％。

克隆聚合酶从低浓度前体积聚大量3HV的功能显示出它对于吸收3HV的高亲和力。

表二是通过C积累P(3HB-co-3HHx)的时间表。

表二

PHA，聚羟基脂肪酸酯；P(3HB)，聚-3-羟基丁酸酯；P(3HHx)，聚-3-羟基己酸酯

a聚羟基脂肪酸酯合成培养基中，培养时间：72小时，温度：30摄氏度，起始pH值：7.0，200转每分钟

CPKO在接种时即被添加(0小时)

b聚羟基脂肪酸酯在干冻细咆中的含量由气相色谱法测定

根据表二的结果，3HHx的摩尔浓度可以通过培养持续时间来控制，培养出3-11摩尔的3HHx mol。通过72小时的培养可以获得高细胞生物量和聚合物量，共获得细胞干重8.8±0.5g/L、聚合物量83±4％。我们发现残油的浓度急剧下降，经历了72小时后已无法测出，所以推断细胞可以高效利用提供的碳源。

表三显示了通过C来进行P(3HB-co-3HV-co-3HHx)三元共聚物的生物合成的过程。

钩虫转化株来自于CPKO与不同浓度前体的混合物。

表三

a聚羟基脂肪酸酯合成培养基中，培养时间：72小时，温度：30摄氏度，起始pH值：7.0，200转每分钟

前体在培养的6个小时后添加

CPKO在接种时即被添加(0小时)

b聚羟基脂肪酸酯在干冻细咆中的含量由气相色谱法测定

在表三中可以看到，3HV mol％可以通过不同的前体浓度来调控。一般来说，前体浓度越大，3HV mol％数据越大。控制戊酸钠浓度可以使数据在24-91mol％间变动，而丙酸钠则是1-51mol％。

而较低的前体浓度却能使3HHx mol％获得较高的数据。1g/L戊酸钠或丙酸钠对应7mol％或8mol％，9g/L戊酸钠则能产生最高的聚合度69±1倍微生物质量。总的来说，前体浓度越低，细胞质量越大。

此后，将干的C.钩虫转化细胞在氯仿中制成悬浮液，在60℃的温度下加热4个小时，用过滤方式除去滤渣，然后用甲醇从溶液中提取聚合物。过滤或离心除去上清液，干燥沉淀后得到纯化的聚合物。

用核磁共振检验聚合物。取样品25毫克溶于1毫升氘代氯仿(氘代氯仿)中，Bruker AVANCE 300；NC，USA光谱仪在30℃条件下测定30℃的1H核磁共振谱图，并用四甲基硅烷(Me4Si)作为参照。结果如图4。

Claims (14)

1.编码由氨基酸序列组成的多肽链的分离的且具有聚合物合成酶活性的多核苷酸，在SEQ ID NO：1中提出。

2.根据权利要求1，包含核苷酸序列的分离的多核苷酸，在SEQ ID NO：2或其互补序列提出。

3.核苷酸序列组成的权利要求1中的分离的多核苷酸，在SEQ ID NO：2中提出，即T被U或它的互补序列替代。

4.权利要求1中的分离的多核苷酸组成重组载体。

5.权利要求4中的重组载体是质粒或噬菌体。

6.转化子被权利要求5中的载体转化。

7.制备聚合物的方法包括：在包含聚合原料的培养基中，根据权利要求6培养出转化子；从培养基中获得聚合物。

8.根据权利要求7的制备方法，制备的聚合物是聚羟基脂肪酸酯。

9.在SEQ ID NO：1中提出，包含核苷酸序列的分离的多核苷酸，替换、删除或添加其中的一个或多个氨基酸时，多肽表现出聚合物合成酶活性。

10.权利要求9中的分离的多核苷酸组成重组载体。

11.权利要求10中的重组载体是质粒或噬菌体。

12.转化子被权利要求11中的载体转化。

13.制备聚合物的方法包括：在包含聚合原料的培养基中，根据权利要求12培养出转化子；从培养基中获得聚合物。

14.根据权利要求13的制备方法，制备的聚合物是聚羟基脂肪酸酯。

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