KR20230128168A

KR20230128168A - 폴리하이드록시알카노에이트를 생산하는 해양 유래 신규 균주 마리노박터 해운파 ibtm02

Info

Publication number: KR20230128168A
Application number: KR1020220025101A
Authority: KR
Inventors: 박경문; 박시형; 공유정
Original assignee: 홍익대학교세종캠퍼스산학협력단
Priority date: 2022-02-25
Filing date: 2022-02-25
Publication date: 2023-09-04

Abstract

본 발명의 신규 균주는 폴리하이드록시알카노에이트(polyhydroxyalkanoate, PHA)를 생산할 수 있는 해양 유래의 균주로, 균주명은 마리노박터 해운파(Marinobacter haeunpha) IBTM02이며, 수탁번호 KCTC 14718BP로 기탁되어 있다.

Description

폴리하이드록시알카노에이트를 생산하는 해양 유래 신규 균주 마리노박터 해운파 IBTM02{Novel strain Marinobacter haeunpha IBTM02 isolated from marine sample producing polyhydroxyalkanoate}

본 발명은 폴리하이드록시알카노에이트를 생산하는 해양 유래 신규 균주 마리노박터 해운파 IBTM02에 관한 것으로, 구체적으로 높은 염 농도에서도 우수한 생장을 나타내며 폴리하이드록시알카노에이트를 효과적으로 생산할 수 있는 신규 균주 및 이를 이용하는 기술에 관한 것이다.

석유 기반 플라스틱은 식품, 음료, 화장품 및 의약품의 포장용으로 전 세계적 으로 광범위하게 사용되고 있다. 그러나 분해 속도가 느려 환경에 축적되고, 육상 및 해양 야생 생물에 생태학적 위협을 발생시킨다. 이러한 이유로 사용 중에는 내구성 및 우수한 성능을 제공하고 사용 수명이 다했을 때 생분해 특성을 가진 생분해성 플라스틱이 대안 방안으로 제시되고 있다.

생분해성 플라스틱이란 박테리아나 살아있는 유기체에 의해 분해될 수 있는 플라스틱으로, 오염물질을 남기지 않고 분해되기 때문에 해양의 미세 플라스틱 및 석유 기반 플라스틱의 이산화탄소 배출과 같은 고형 폐기물을 줄이는데 잠재적으로 기여할 것으로 기대되면서 생명 공학 분야에서 많은 관심을 받고 있다. 바이오 기반의 생분해가 가능한 플라스틱을 생분해성 바이오 플라스틱이라고 하며, 대표적으로는 PLA(poly lactic acid), PHA(polyhydroxyalkanoate) 등이 있다. 생분해성 바이오 플라스틱은 매립 시 물과 이산화탄소로 6개월에서 5년 안에 분해가 가능하다. 그러나 물성 한계로 물리적 재활용은 아직까지 어려움을 보이고 있다. 다만, 재활용이 어려운 식재료 용기, 어망, 어구 등 환경 유출 가능성이 높은 품목 중심으로 생분해성 바이오 플라스틱을 사용한다면 친환경성을 극대화할 수 있을 것이라 기대하고 있다.

현재 바이오 플라스틱은 연간 생산되는 3억 6천만 톤 이상의 플라스틱 중 약 1%인 2백만 톤이며, 그 중 생분해성 플라스틱은 약 120만 톤 정도 생산되고 있다. 그러나 2025년에는 180만 톤으로 증가할 것으로 예상되고 있으며, 특히 PHA의 시장 성장률은 10배 가량 증가할 것으로 예상된다. 수요가 증가하고 성능이 발전된 바이오 폴리머 및 제품이 늘어남에 따라 바이오 플라스틱 시장은 지속적으로 성장하고 다양해질 것으로 전망된다.

PHA는 탄소 및 에너지 저장소 역할을 하는 물질로, 박테리아 및 고세균에 의해 축적된다. PHA는 과량의 탄소 공급원이 존재하고, 필수 영양소인 산소, 인 또는 질소가 제한될 때 세포 내에 고농도로 저장될 수 있다. PHA는 기계적·기술적 특성에서 합성 석유화학 기반 중합체와 유사하다. 또한 생체 적합성, 생분해성 및 재생 가능한 자원에서 생산이 가능하다는 특성으로 인해 많은 관심을 받고 있다. 지금까지 PHA 생산을 위해 E. coli, R. eutropha, P. putida 등의 균주가 사용되었으나, 최근에 호염성 균주를 활용하여 69 ~ 82중량%의 PHA를 생산한 연구 결과가 발표되었다.

PHA는 R그룹의 탄소 개수에 따라 명칭이 달라진다. 가장 일반적인 PHA 중 하나인 PHB(polyhydroxybutyrate)는 3-hydroxybutyrate의 단일 중합체로, 구조가 단순하다.

당으로부터 PHA를 생산하기 위해서는 PhaA(β-ketothiolase), PhaB(acetoacetyl-CoA-reductase) 및 PhaC(PHA synthase) 효소가 필요하다. 가장 마지막 단계에 작동하는 PhaC 효소가 PHA 생산을 위한 핵심 효소로, 3-hydroxybutyryl-CoA의 아실 부분을 PHA로 중합하고 동시에 조효소 A를 방출한다.

PHA 합성 효소는 1차 서열, 기질 특이성 및 소단위 구성에 따라 4가지로 분류된다. Class I 및 II 합성 효소는 분자량이 61 ~ 73kDa인 한 가지 유형의 서브 유닛으로 구성된다. Class I 합성 효소는 단 한 가지 유형의 PhaC로 구성되어 있으며, Class II 합성 효소는 두 가지 유형의 PhaC1 및 PhaC2로 구성된다. Class III 및 IV 합성 효소는 두 가지 다른 유형의 서브 유닛으로 구성된다. Class III 합성 효소는 Class I 및 II와 유사한 40kDa의 PhaC와 이들과 유사하지 않은 40kDa의 PhaE로 구성된다. Class IV 합성 효소는 주로 바실러스(Bacillus) 속에서 발견되는데, Class III와 다르게 40kDa의 PhaC와 20kDa의 PhaR로 구성된다. Class I, III 및 IV 합성 효소는 C3 내지 C5 길이의 탄소 사슬을 포함하는 짧은 사슬 길이(short-chain-length, scl) 단량체를 선호하며, 대표적으로는 C4 탄소 사슬을 가지고 있는 3HB(3-hydroxybutyrate)가 있다. Class II 합성 효소는 C6 내지 C14 길이의 탄소 사슬을 포함하는 중간 사슬 길이(medium-chain-length, mcl) 단량체를 선호하며, C6 탄소 사슬을 가지고 있는 3HHx를 예로 들 수 있다.

호염성 세균은 성장하기 위해 NaCl을 필요로 하는 미생물이다. 최근 기준에 따르면, 호염성체는 5%(w/v) 이상의 NaCl 농도에서 최적으로 성장해야 하며, 10%(w/v) 이상의 염을 견뎌야 한다. 일반적인 세균과 비교하여 호염성 세균은 PHA 생산자로서 몇 가지 이점이 있다. 먼저 높은 염분 농도를 사용하기 때문에 일반적인 세균은 성장할 수 없어 오염의 위험을 감소시킬 수 있다. 또한 오염의 위험이 적기 때문에 연속적인 공정이 가능하다. 두 번째로는 증류수를 사용하여 분리가 가능하기 때문에 분리 공정 비용을 줄일 수 있다. 마지막으로는 커피 찌꺼기, 사탕수수 그리고 옥수수와 같은 저렴한 재생 자원을 사용하여 생산이 가능하여 탄소 기질의 비용을 줄일 있다. 또한, 바이오매스를 탄소 기질로 사용하기 위해 전처리 및 가수분해를 진행하는 과정에서 HCl과 NaOH에 의해 NaCl이 합성되기 때문에 추가적인 NaCl의 공급이 필요하지 않아 생산 비용을 절감할 수 있다. 이러한 장점으로 인해 호염성 세균 및 호염성 고세균에 대한 연구가 많은 관심을 받고 있다.

전 세계적으로 생분해성 플라스틱 및 바이오 플라스틱에 관심이 증가하고 있으며, 미생물로부터 PHA 생산은 이전부터 많은 연구가 진행되고 있다. 그러나 높은 생산 비용으로 인해 산업화는 아직 활성화되지 못하고 있다. 이에 본 발명자들은 PHA의 효율적인 생산 및 비용 절감을 위해 새로운 호염성 세균을 발굴하고자 하였다. 탄소 기질의 비용이 총 PHA 생산 비용의 40 내지 50%를 차지하는데, 호염성 세균으로부터의 PHA 생산은 저렴한 탄소원을 사용하여 생산이 가능하기 때문에 탄소 기질 비용을 절감할 수 있다. 또한 높은 염 농도로 인해 오염의 위험이 낮아 멸균 공정 비용이 감소하며, PHA 분리가 비교적 쉬워 분리 공정 비용 또한 낮출 수 있다.

Dan Kucera, Iva Pernicov, Adriana Kovalcik, Martin Koller, Lucie Mullerova, Petr Sedlacek, Filip Mravec, Jana Nebesarova, Michal Kalina, Ivana Marova, Vladislav Krzyzanek and Stanislav Obruca (2018) Characterization of the promising poly(3-hydroxybutyrate) producing halophilic bacterium Halomonas halophila. Bioresource Technology 256, 552-556.

따라서 본 발명의 주된 목적은 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)를 생산할 수 있는 새로운 호염성 균주를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 균주를 이용한 폴리하이드록시알카노에이트 생산 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주를 이용한 폴리하이드록시알카노에이트 생산용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 일 양상에 따르면, 본 발명은 수탁번호 KCTC 14718BP로 기탁된 균주인 마리노박터 해운파(Marinobacter haeunpha) IBTM02를 제공한다.

본 발명의 다른 양상에 따르면, 본 발명은 본 발명의 균주를 배양하는 단계를 포함하는 폴리하이드록시알카노에이트 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 폴리하이드록시알카노에이트 생산 방법에 있어서, 상기 균주를 배양하는 단계는 상기 균주를 30 내지 40℃의 온도 조건에서 배양하는 단계인 것이 바람직하다.

본 발명의 폴리하이드록시알카노에이트 생산 방법에 있어서, 상기 균주를 배양하는 단계는 상기 균주를 LB 배지, 마린 배지 또는 미네랄 배지 기반의 배지에서 배양하는 단계인 것이 바람직하다.

본 발명의 폴리하이드록시알카노에이트 생산 방법에 있어서, 상기 균주를 배양하는 단계는 상기 균주를 NaCl이 2%(w/v) 이상으로 포함된 배지에서 배양하는 단계인 것이 바람직하다.

본 발명의 폴리하이드록시알카노에이트 생산 방법에 있어서, 상기 균주를 배양하는 단계는 상기 균주를 글루코스, 글리세롤, 프룩토스 및 갈락토스로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 탄소원이 포함된 배지에서 배양하는 단계인 것이 바람직하다.

본 발명의 폴리하이드록시알카노에이트 생산 방법에 있어서, 상기 균주를 배양하는 단계는 상기 균주를 상기 탄소원이 2%(w/v) 이상으로 포함된 배지에서 배양하는 단계인 것이 바람직하다.

본 발명의 폴리하이드록시알카노에이트 생산 방법에 있어서, 상기 폴리하이드록시알카노에이트는 폴리하이드록시부티레이트인 것이 바람직하다.

본 발명의 또 다른 양상에 따르면, 본 발명은 본 발명의 균주를 포함하는 폴리하이드록시알카노에이트 생산용 조성물을 제공한다.

본 발명의 폴리하이드록시알카노에이트 생산용 조성물에 있어서, 상기 폴리하이드록시알카노에이트는 폴리하이드록시부티레이트인 것이 바람직하다.

본 발명의 균주는 높은 염 농도에서도 우수한 생장을 나타내며 폴리하이드록시알카노에이트를 효과적으로 생산할 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리하이드록시알카노에이트 생산 방법 및 폴리하이드록시알카노에이트 생산용 조성물은 상기와 같은 본 발명의 균주를 이용하는 것으로서, 이에 따르면 염도가 높은 환경에서도 효과적으로 폴리하이드록시알카노에이트를 생산할 수 있다. 상기와 같은 본 발명의 새로운 균주, 폴리하이드록시알카노에이트 생산 방법 및/또는 폴리하이드록시알카노에이트 생산용 조성물의 사용은 폴리하이드록시알카노에이트의 효율적인 생산 및 생산 비용 절감을 가능하게 하여 바이오 플라스틱 분야의 발전에 기여할 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 균주인 마리노박터 해운파(Marinobacter haeunpha) IBTM02의 미생물 수탁증을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명 균주의 16S rRNA 유전자 부분 서열을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 균주를 선별하기 위한 과정에서 해운대 해변 시료를 배양한 사진을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 균주를 선별하기 위한 과정에서 후보 균주의 phaC 유전자 보유 여부를 확인하기 위한 PCR 결과를 나타낸 것이다. M: 분자량 마커, 1: 대조 균주(Halomonas halophila), 2: 마리노박터 해운파(Marinobacter haeunpha) IBTM02.
도 5는 16s rRNA 유전자 서열을 바탕으로 한 본 발명 균주의 계통수 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 표준 물질로 사용한 PHBV의 GC 분석 결과 그래프를 나타낸 것이다. A: PHBV 20㎎ 분석 결과, B: PHBV 40㎎ 분석 결과, C: PHBV 60㎎ 분석 결과.
도 7은 본 발명 균주의 GC 분석 결과 그래프를 나타낸 것이다.
도 8은 표준 물질로 사용한 PHBV의 NMR 피크를 나타낸 것이다.
도 9는 표준 물질로 사용한 PHB의 NMR 피크를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명 균주의 NMR 피크를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명 균주의 배양 온도에 따른 성장 곡선을 나타낸 것이다. 원형점 곡선: 30℃ 배양, 삼각점 곡선: 37℃ 배양.
도 12는 본 발명 균주의 배양 온도에 따른 PHB 생산량을 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명 균주의 배양 배지에 따른 PHB 생산량을 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명 균주의 배양 시 NaCl 농도에 따른 PHB 생산량을 나타낸 것이다.
도 15는 본 발명 균주의 배양 시 탄소원의 종류에 따른 PHB 생산량을 나타낸 것이다.
도 16은 본 발명 균주의 배양 시 글루코스 농도에 따른 PHB 생산량을 나타낸 것이다.

본 발명의 신규 균주 마리노박터 해운파(Marinobacter haeunpha) IBTM02는 해운대 해변에서 분리되어 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 수탁번호 KCTC 14718BP로 기탁되어 있다(도 1).

본 발명의 균주는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 16S rRNA 유전자 서열을 갖는다(도 2).

본 발명의 균주는 예를 들어 마린(marine) 배지, LB 배지 또는 미네랄(mineral) 배지에서 배양할 수 있다. 배양 온도는 예를 들어 30 내지 40℃를 사용할 수 있다. 배양 시 배지의 탄소원으로는 예를 들어 글루코스(glucose), 수크로스(sucrose), 글리세롤(glycerol), 프룩토스(fructose), 갈락토스(galactose) 및 자일로스(xylose)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 탄소원을 사용할 수 있다.

연구 결과에 따르면, 본 발명의 균주는 10%(w/v) NaCl 수준의 높은 염도에서도 우수한 생장력을 보이는 호염성 균주로 확인되었으며 이러한 높은 염도에서 우수한 PHA 생산력 또한 보였다. 따라서 높은 염도 조건에서 배양 및 PHA 생산이 가능하므로, 다른 일반적인 세균의 오염을 줄이면서 배양 및 PHA를 생산할 수 있다는 장점이 있다.

연구 결과에 따르면, 본 발명 균주는 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)의 생산에 중요한 phaC 유전자를 보유한다. 따라서 이 유전자의 발현을 통한 PhaC의 작용으로 인해 PHA를 생산할 수 있는 것으로 판단된다.

본 발명 균주는 PHA 중에서도 폴리하이드록시부티레이트(polyhydroxybutyrate, PHB), 그 중에서도 폴리(3-하이드록시부티레이트)[Poly(3-hydroxybutyrate), P3HB]를 효과적으로 생산할 수 있다.

본 발명은 상기와 같은 본 발명의 균주를 이용하여 PHA를 효과적으로 생산하는 방법으로서, 본 발명의 균주를 배양하는 단계를 포함하는 PHA 생산 방법을 제공한다.

상기 배양하는 단계의 배양 온도 조건은 예를 들어 28 내지 40℃일 수 있으나, 바람직하게는 30 내지 40℃, 보다 바람직하게는 35 내지 39℃, 보다 바람직하게는 36 내지 38℃이다. 이에 따르면 보다 효율적으로, 예를 들어 동일한 시간 내에 보다 많은 양으로, PHA를 생산할 수 있다.

상기 배양하는 단계의 배양 배지는 예를 들어 LB 배지, 마린(marine) 배지 또는 미네랄(mineral) 배지를 기반으로 하는 배지일 수 있으나, 바람직하게는 LB 배지 또는 마린 배지를 기반으로 하는 배지, 보다 바람직하게는 LB 배지를 기반으로 하는 배지이다. 이에 따르면 보다 효율적으로, 예를 들어 동일한 시간 내에 보다 많은 양으로, PHA를 생산할 수 있다. 이때 기반으로 하는 배지는 기반이 되는 배지의 조성과 동일하거나 염 및/또는 탄소원의 종류 및/또는 함량을 변경한 배지일 수 있다.

상기 배양하는 단계의 배양 염도는 예를 들어 NaCl이 1%(w/v) 이상인 수준일 수 있다. 바람직하게는 NaCl이 2%(w/v) 이상인 수준, 보다 구체적으로 2 내지 10%(w/v)인 수준, 보다 바람직하게는 NaCl이 4 내지 10%(w/v)인 수준, 보다 바람직하게는 NaCl이 3 내지 5%(w/v)인 수준 또는 7 내지 10%(w/v)인 수준이다. 이에 따르면 보다 효율적으로, 예를 들어 동일한 시간 내에 보다 많은 양으로, PHA를 생산할 수 있다. 상기와 같은 수준의 염도는 배지에 해당 수준의 염, 예를 들어 NaCl을 첨가하는 방식으로 달성할 수 있다.

상기 배양하는 단계의 배양 배지는 탄소원으로서 예를 들어 글루코스, 글리세롤, 프룩토스 및 갈락토스로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 배지일 수 있다. 바람직하게는 글루코스, 글리세롤 및 갈락토스로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 탄소원으로 포함하는 배지, 보다 바람직하게는 글루코스를 탄소원으로 포함하는 배지이다. 이에 따르면 보다 효율적으로, 예를 들어 동일한 시간 내에 보다 많은 양으로, PHA를 생산할 수 있다.

또한, 상기 배양하는 단계의 배양 배지는 상기와 같은 탄소원이 0.5%(w/v) 이상으로 포함된 배지, 보다 구체적으로 상기 탄소원이 0.5 내지 4%(w/v)로 포함된 배지일 수 있다. 바람직하게는 상기 탄소원이 1%(w/v) 이상으로 포함된 배지, 보다 구체적으로 상기 탄소원이 1 내지 4%(w/v)로 포함된 배지, 보다 바람직하게는 상기 탄소원이 2%(w/v) 이상으로 포함된 배지, 보다 구체적으로 상기 탄소원이 2 내지 4%(w/v)로 포함된 배지이다. 이에 따르면 보다 효율적으로, 예를 들어 동일한 시간 내에 보다 많은 양으로, PHA를 생산할 수 있다.

상기와 같은 본 발명의 PHA 생산 방법은 특히 PHB(폴리하이드록시부티레이트, polyhydroxybutyrate), 특히 P3HB[폴리(3-하이드록시부티레이트), Poly(3-hydroxybutyrate)]의 생산에 바람직하다.

본 발명은 또한 상기와 같은 본 발명의 균주를 이용하여 PHA를 효과적으로 생산하는데 사용하기 위한 조성물로서, 본 발명의 균주를 포함하는 PHA 생산용 조성물을 제공한다.

본 발명의 PHA 생산용 조성물은 예를 들어 미생물 배양을 통해 PHA를 생산하는데 사용되는 미생물 제제일 수 있다.

본 발명의 PHA 생산용 조성물은 예를 들어 PHA 생산을 위한 배지에 본 발명의 조성물을 첨가하는 방식으로 사용될 수 있다. 위에서 PHA 생산 방법과 관련하여 설명된 적절한 배지, 예를 들어 약 8%(w/v)의 NaCl 및 약 2%(w/v)의 글루코스를 함유하는 LB 기반 배지에 본 발명의 PHA 생산용 조성물을 첨가한 다음 적절한 기간 동안, 예를 들어 약 72시간 동안 적절한 온도, 예를 들어 약 37℃로 유지시켜 배양하면 세포 내에 PHA가 생성될 수 있다. 이렇게 PHA가 생성된 세포로부터 기존에 사용되는 통상의 PHA 정제 방법을 적용하면 PHA를 정제할 수 있다.

본 발명의 PHA 생산용 조성물은 사용 시까지 조성물 중의 본 발명의 균주가 생존해있도록 유지할 필요가 있다. 따라서 균주의 생존 유지에 필요한 첨가제를 더 포함할 수 있다. 상기 첨가제는 통상의 생균제에 사용되는 첨가제, 예를 들어 동결건조 보호제를 포함한다.

본 발명의 PHA 생산용 조성물은 본 발명의 균주를 예를 들어 동결건조된 형태로 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 PHA 생산용 조성물은 본 발명의 균주를 예를 들어 0.01 내지 100중량%로 포함할 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다.

상기와 같은 본 발명의 PHA 생산용 조성물은 특히 PHB(폴리하이드록시부티레이트, polyhydroxybutyrate), 특히 P3HB[폴리(3-하이드록시부티레이트), Poly(3-hydroxybutyrate)]의 생산용 조성물인 것이 바람직하다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

[실시예]

실시예 1. 균주 선별

1-1. 방법

1-1-1. 시료 준비 및 후보 균주 확보

부산광역시 해운대 해변에서 해양 토양 및 물을 수집하였다. 확보된 시료는 4℃에서 보관하였다. 해양 토양과 물을 볼텍싱하여 섞어준 뒤 액체만을 플레이트 배양에 사용하였다. 시료 원액을 증류수로 희석(10^-1, 10^-2)한 시료를 각각 마린(marine) 8% 아가(agar) 플레이트에서 배양(37℃, 24시간)하고 콜로니의 형태와 색상을 비교하여 후보 균주를 확보하였다.

1-1-2. phaC 유전자 보유 균주의 선별

중합효소 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 이용하여 phaC 유전자를 보유한 균주를 선별하였다.

확보된 후보 균주의 게놈 DNA는 Solg^TM Genomic DNA Prep Kit(Solgent, 한국 소재)를 사용하여 정제하였다. 표 1의 프라이머를 사용하였으며, PCR 조건은 [95℃ 5분] × 1, [95℃ 1분, 60℃ 90초, 72℃ 2분] × 30, [70℃ 5분] × 1로 진행하였다. Halomonas halophila를 대조군 균주로 사용하였다. PCR 반응 완료 후 1% 아가로스 겔을 사용한 전기영동으로 증폭 여부를 확인하였다.

프라이머	서열
정방향	5'-CCN CCN TGG ATC AAY AAG TAY TAC-3'
역방향	5'-CCA RTG NGG CCA CCA GGA RCC YTC-3'

1-1-3. PHA 생산 확인

배양 배지로 LB, 마린(Marine) 및 미네랄(Mineral) 배지를 사용하여 후보 균주를 배양하였다. 각 배지의 조성은 표 2에 나열하였다. 배양은 크게 2단계로 진행하였다. 세포 수를 늘려주기 위해 전 배양을 먼저 실시하였다. 균주를 37℃, 200rpm에서 20시간 동안 50㎖의 배지에서 배양하였다. 배양물을 본 배양에 3부피%로 접종하여 37℃, 200rpm에서 72시간 동안 100㎖의 배지에서 배양하였다. 본 배양에서는 NaCl(2 ~ 6%) 및 글루코스(2%)를 추가로 첨가하였다.

배지 조성
LB 배지	증류수 1ℓ 중 5g Yeast extract, 10g Tryptone, 10g NaCl
마린 배지	증류수 1ℓ 중 19.45g NaCl, 5.9g MgCl₂, 5g Peptone, 3.24g MgSO₄, 1g Yeast extract, 1.8g CaCl₂, 0.55g KCl, 0.16g NaHCO₃, 0.1g Ferric citrate, 0.08g KBr, 34㎎ SrCl₂, 22㎎ H₃BO₃, 4㎎ Na-silicate, 2.4㎎ NaF, 1.6㎎ NH₄NO₃, 8㎎ Na₂HPO₄
미네랄 배지	증류수 1ℓ 중 3g (NH₄)₂SO₄, 1g KH₂PO₄, 11.1g Na₂HPO₄·12H₂O, 0.2g MgSO₄·7H₂O, 1㎖ 미량영양소 용액(미량영양소 용액: 0.1M HCl 중 9.7g FeCl₃, 7.8g CaCl₂, 0.156g CuSO₄·5H₂O, 0.119g CoCl₂, 0.118g NiCl₂, 0.062g CrCl₂)

72시간 동안 배양한 후 4000rpm, 30분 동안 원심분리하여 세포를 수확하였다. 이후 증류수로 세척한 다음 다시 원심분리하여 깨끗한 세포만 얻었다. 세포를 고온에서 1 ~ 2일 동안 건조한 다음 건조된 시료 약 40㎎에 클로로포름 2㎖, PHA 용액(Methanol 970㎖, H₂SO₄ 30㎖, Benzoic acid 8g) 1㎖를 첨가하여 고온에서 밤새 항온처리하였다. 이후 실온에서 서서히 식힌 후 증류수를 1㎖ 첨가하고 층 분리가 될 때까지 방치하였다. 층 분리가 깨끗하게 되면 바닥 층만 1㎖ 분취하여 GC 분석에 사용하였다.

PHA 정량 분석은 GC(shimadzu GC-2014, 일본)를 사용하였다. 컬럼은 DB-WAX(length 30m, diameter 0.25mm, film 0.25㎕, J&W scientific, 미국 소재)를 사용하였다. 분석 초기 온도는 오븐 100℃, 인젝터 250℃, 검출기 250℃로 설정하였다. 운반 가스는 헬륨(He)을 사용하고, 보조 가스로 수소(H₂)를 사용하였다. 표준 물질은 PHBV[Poly(3-hydroxybutyric acid-co-3-hydroxyvaleric acid)](Sigma Aldrich)를 사용하였다.

1-1-4. 균주 동정 및 계통수 분석

선발된 균주의 동정을 위해 16s rRNA 분석을 진행하였다. 분석은 Cosmogenetech(http://www.cosmogenetech.com/main.jsp)에 의뢰하였다. 유니버셜 프라이머인 정방향 프라이머 27F(5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3') 및 역방향 프라이머 1492R(5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT TC-3')을 16s rRNA 유전자 증폭에 사용하였다.

서열 분석을 위해 NCBI BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)를 사용하였다. 서열 분석에는 blastn을 사용하였고, rRNA/ITS 데이터베이스 중 16s 리보솜 RNA 서열(Bacteria and Archaea)로 검색 범위를 지정하였다. 16s rRNA 분석 결과를 NCBI BLAST에 입력하고 유사성을 비교하였다. 계통수 분석에는 Fast Minimum Evolution을 사용하였으며, max sequence difference는 0.05로 설정하였다.

1-2. 결과

1-2-1. 시료에서 균주 분리

시료를 마린 8% 아가 플레이트에서 24시간 동안 배양한 결과, 도 3과 같은 콜로니가 나타났다. 이들 콜로니의 모습을 비교하였을 때, 연한 노란색, 진한 노란색, 살짝 투명한 흰색 등 다양한 색상이 있으며, 크기의 차이도 확인할 수 있다. 각각의 플레이트에서 콜로니의 형태와 색상을 비교하여 후보 균주를 확보하였다.

1-2-2. phaC 유전자 보유 균주의 선별

후보 균주로부터 PCR을 통해 phaC 유전자 보유 균주, 즉 phaC 증폭 밴드를 나타낸 균주를 확보하였다(도 4).

1-2-3. PHA 생산 확인

상기 실시예 1-2-2에서 확보된 균주가 PHA를 생산할 수 있는지 확인하기 위해 배양을 진행하였다. 마린 및 미네랄 두 가지 배지를 사용하였으며, NaCl(2 ~ 6%) 및 글루코스(2%)를 추가로 첨가하였다. 배양은 30℃에서 200rpm으로 72시간 진행하였다. Halomoans halophila를 대조 균주로 사용하여 생산량을 비교하였다.

GC 분석 결과 확보된 균주는 PHA 중 PHB(polyhydroxybutyrate)를 생산하는 것으로 확인되었다.

1-2-4. 균주 동정 및 계통수 분석

상기 실시예 1-2-2 및 1-2-3에서 phaC 유전자 보유 및 PHA 생산이 확인된 균주에 대해 미생물 동정 및 계통수 분석을 수행하였다.

미생물 동정은 16s rRNA 분석으로 확인하였으며, 16s rRNA 결과를 바탕으로 NCBI BLAST를 사용하여 분류학적 식별 및 계통수 분석을 진행하였다. 16s rRNA의 부분 서열은 서열번호 1과 같으며, 계통수 분석 결과는 도 5에 나타내었다. 또한, 확보된 균주의 16s rRNA 서열을 NCBI 16s rRNA 데이터베이스에 등록하였다(NCBI 등록번호 : MW479459).

해운대 해변에서 분리된 IBTM02 균주는 Alteromonadaceae과의 Marinobacter 속으로 확인되었다. Marinobacter litoralis와 98%, Marinobacter excellens와 98%, Marinobacter salexigens와 96% 일치하였다. 새로운 종으로 등록하였으며, 이름은 마리노박터 해운파(Marinobacter haeunpha) IBTM02로 명명하였다.

실시예 2. 균주의 PHA 생산 특성 규명

2-1. 생산하는 PHA의 유형 구분

IBTM02의 PHA 생산을 확인하기 위해 GC 분석을 진행하였다. 표준 물질로는 PHBV[poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate)] 및 PHB[poly(3-hydroxybutyrate)]를 사용하였다. 약 40㎎의 IBTM02 세포 건조 시료를 사용하여 분석을 진행하였다. 표준 물질의 결과값으로 그래프를 그렸을 때, R²값이 0.9992로 신뢰성 있는 결과임을 확인하였다.

표준 물질 분석 결과 3HB는 5.8분대에 검출되었고, 3HV는 6.7분대에 검출되었다(도 6). 클로로포름 및 벤조산은 각각 2.2분 및 7.7분대에 검출되었다.

IBTM02의 분석 결과 3HB 시간대인 5.8분대에는 피크가 검출되었지만, 3HV 시간대인 6.7분대에는 검출된 것이 없었다(도 7). 따라서 IBTM02는 PHB를 생산하는 것으로 확인되었다.

PHB 생산을 재확인하기 위해 NMR(Jeol, 일본) 분석을 추가로 진행하였다. 분석 용매는 클로로포름-d(CDCl₃)(Sigma Aldrich)를 사용하였고, 표준 물질로 PHBV(Sigma Aldrich)와 PHB(Sigma Aldrich)를 사용하였다. 건조 샘플 10㎎/㎖을 분석 용매와 혼합한 후 액체만 NMR 분석에 사용하였다.

PHBV 및 PHB의 NMR 분석 결과를 도 8 및 도 9에 나타내었다. 분석 결과 IBTM02의 피크 양상이 PHB와 일치함을 확인하였다(도 10).

2-2. PHB 생산에 온도가 미치는 영향 확인

IBTM02의 성장 온도 설정을 위해 30℃ 및 37℃의 2가지 온도 조건으로 실험하였다. IBTM02는 37℃에서는 48시간 이후 세포 성장이 감소하였고, 30℃에서는 48시간 이후 약 3배 정도 증가하는 모습을 보였다(도 11). PHB 생산량은 37℃에서 약 2배정도 높았다(도 12).

2-3. PHB 생산에 배지가 미치는 영향 확인

IBTM02가 PHB를 생산함에 있어서 배지가 미치는 영향을 확인하였다. LB, 마린 및 미네랄 배지 총 3가지를 실험하였으며, 6% NaCl 및 2% 글루코스를 동일하게 투입하였다. 배양은 37℃에서 200rpm으로 72시간 동안 진행하였다.

IBTM02는 LB 배지에서 6.09±0.07g/ℓ DCW(dry cell weight) 중 2.81±0.39g/ℓ PHB로 약 46%의 생산량을 보여주었으며, 마린 배지에서는 3.24±0.19g/ℓ DCW 중 2.09±0.07g/ℓ PHB로 약 64%의 생산량을 보여주었다(도 13). 미네랄 배지에서도 생산을 확인할 수 있었는데, 1.12±0.10g/ℓ DCW 중 0.59±0.05g/ℓ PHB로 약 52%의 생산량을 보여주었다(도 13). 3가지 배지에서 실험한 결과, LB 배지에서 균주 성장 및 PHB 생산 모두 가장 높은 것을 확인하였고 이후 실험은 LB 배지에서 진행하였다.

2-4. 다양한 NaCl 농도에서 PHB 생산 비교

배지의 영향을 확인한 뒤, NaCl의 농도가 PHB 생산에 미치는 영향을 확인하였다. 배지는 LB를 사용하였으며, NaCl은 2 ~ 10%를 추가로 첨가하였다. 탄소원으로는 2% 글루코스를 사용하였다. 배양은 37℃에서 200rpm으로 72시간 동안 진행하였다.

IBTM02의 균주 성장과 PHB 생산량은 NaCl의 농도에 따라 약간의 변화가 발생하였다. 6% NaCl에서 가장 낮은 값을, 8% NaCl에서 가장 높은 값을 보였으며, DCW 및 PHB는 각각 1.6g/ℓ 및 1.4g/ℓ 정도의 차이가 발생하였다. 8%의 NaCl에서 7.67±0.10g/ℓ DCW 중 4.25±0.01g/ℓ PHB로 약 55% PHB 생산을 보여주었다(도 14).

2-5. 다양한 탄소 기질에서 PHB 생산 비교

탄소 기질이 PHB 생산에 미치는 영향을 확인하기 위해 다양한 탄소 기질을 사용하여 실험을 진행하였다. 글루코스(glucose), 수크로스(sucrose), 글리세롤(glycerol), 프룩토스(fructose), 갈락토스(galactose) 및 자일로스(xylose)를 사용하였다. LB 배지에 6% NaCl과 2% 탄소 기질을 동일하게 첨가하였다. 배양은 37℃에서 200rpm으로 72시간 동안 진행하였다.

IBTM02는 글루코스, 글리세롤, 프룩토스 및 갈락토스에서는 PHB 축적을 확인할 수 있었고, 수크로스 및 자일로스에서는 축적을 확인하기 어려웠다(도 15). 글루코스에서 46%로 가장 높은 PHB 생산을 보여주었으며, 균주 성장 또한 글루코스 >> 글리세롤 > 프룩토스 > 갈락토스로 글루코스가 가장 높은 성장을 보였다(도 15).

글리세롤에서의 균주 성장은 꽤 관심 가질만한 결과를 보여주었다. 4.90±0.15g/ℓ의 바이오매스를 생산하였는데, 이는 글루코스 대비 약 80%의 바이오매스 생산으로 꽤 가치 있는 결과를 보여주었다(도 15). 그러나 PHB 생산은 큰 차이를 보였는데, 총 DCW 대비 약 24% 밖에 생산하지 못했으며, 글루코스 대비 약 43%로 매우 감소하는 것을 보였다(도 15).

결론적으로 IBTM02의 성장 및 PHB 생산에는 글루코스가 가장 접합함을 확인하였고, PHB 생산 없이 균주 성장만을 필요로 할 경우에는 글리세롤도 꽤 유용함을 확인하였다.

2-6. 다양한 글루코스 농도에서 PHB 생산 비교

PHB 생산에 글루코스가 가장 접합함을 확인한 뒤, 다양한 농도를 사용하여 균주 성장 및 PHB 생산을 비교하였다. 6% NaCl이 첨가된 LB 배지에 0 ~ 4% 글루코스를 추가하였다. 배양은 37℃에서 200rpm으로 72시간 동안 진행하였다.

IBTM02는 글루코스가 들어있지 않은 배지에서는 PHB를 생산하지 않았으며, 0.5% 및 1% 또한 생산이 되었다고 하기에는 부족한 수치였다(도 16). 2% 글루코스를 투입하였을 때부터 PHB 생산을 확인할 수 있었다(도 16). 3% 글루코스를 투입하였을 경우 가장 높은 생산량을 보였다(도 16).

글루코스의 농도에 따른 PHB 생산은 2% 이상부터는 극명한 차이를 보이지는 않았으며, 3%가 조금 더 높은 축적을 보였다(도 16). 그러나 탄소 기질의 비용이 PHB 생산에 가장 큰 문제인 만큼 큰 차이가 없다면 2%의 글루코스를 사용하는 것이 경제적인 면에서 더 효과적일 것이다.

한국생명공학연구원

KCTC14718BP

20210929

<110> Sejong Industry-Academia Cooperation Foundation Hongik University <120> Novel strain Marinobacter haeunpha IBTM02 isolated from marine sample producing polyhydroxyalkanoate <130> ALP22002 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1242 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Marinobacter haeunpha IBTM02 <400> 1 ctaatggcct gccagtcatt cacacatgca gtcgagcgga acgatgatag cttgctatca 60 ggcgtcgagc ggcggacggg tgagtaatgc ttaggaatct gcccagtagt gggggacaac 120 agtcggaaac ggctgctaat accgcatacg ccctacgggg gaaagcaggg gatcttcgga 180 ccttgcgcta ttggatgagc ctaagtcgga ttagctagtt ggtgaggtaa aggctcacca 240 aggccacgat ccgtagctgg tttgagagga tgatcagcca catcgggact gagacacggc 300 ccgaactcct acgggaggca gcagtgggga atattggaca atgggggcaa ccctgatcca 360 gccatgccgc gtgtgtgaag aaggctttcg ggttgtaaag cactttcagc gaggaggaag 420 gctctaaagc taataccttt agggattgac gttactcgca gaagaagcac cggctaactc 480 cgtgccagca gccgcggtaa tacggagggt gcaagcgtta atcggaatta ctgggcgtaa 540 agcgcgcgta ggtggttgag taagcgagat gtgaaagccc cgggcttaac ctgggaacgg 600 catttcgaac tgctcggcta gagtgtggta gagggtagtg gaatttcctg tgtagcggtg 660 aaatgcgtag atataggaag gaacaccagt ggcgaaggcg gctacctgga ccaacactga 720 cactgaggtg cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat accctggtag tccacgccgt 780 aaacgatgtc aactagccgt tggggatctt gaatccttag tggcgcagct aacgcactaa 840 gttgaccgcc tggggagtac ggccgcaagg ttaaaactca aatgaattga cgggggcccg 900 cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg acgcaacgcg aagaacctta cctggccttg 960 acatgcagag aactttccag agatggattg gtgccttcgg gaactctgac acaggtgctg 1020 catggccgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgtaac gagcgcaccc 1080 ctatccttgg ttgctagcag gtaatgctga gaactccagg agactgccgt gacaaccgga 1140 ggaagggggg atgacgtcag gcatcatggc cttacggcag ggctaccccg tgctacatgg 1200 cgtaacagag gctgccactc gcaaatgacc atccttaaag gc 1242

Claims

수탁번호 KCTC 14718BP로 기탁된 균주인 마리노박터 해운파(Marinobacter haeunpha) IBTM02.
제1항의 균주를 배양하는 단계를 포함하는 폴리하이드록시알카노에이트 생산 방법.
제2항에 있어서,
상기 균주를 배양하는 단계는 상기 균주를 30 내지 40℃의 온도 조건에서 배양하는 단계인, 폴리하이드록시알카노에이트 생산 방법.
제2항에 있어서,
상기 균주를 배양하는 단계는 상기 균주를 LB 배지, 마린 배지 또는 미네랄 배지 기반의 배지에서 배양하는 단계인, 폴리하이드록시알카노에이트 생산 방법.
제2항에 있어서,
상기 균주를 배양하는 단계는 상기 균주를 NaCl이 2%(w/v) 이상으로 포함된 배지에서 배양하는 단계인, 폴리하이드록시알카노에이트 생산 방법.
제2항에 있어서,
상기 균주를 배양하는 단계는 상기 균주를 글루코스, 글리세롤, 프룩토스 및 갈락토스로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 탄소원이 포함된 배지에서 배양하는 단계인, 폴리하이드록시알카노에이트 생산 방법.
제6항에 있어서,
상기 균주를 배양하는 단계는 상기 균주를 상기 탄소원이 2%(w/v) 이상으로 포함된 배지에서 배양하는 단계인, 폴리하이드록시알카노에이트 생산 방법.
제2항에 있어서,
상기 폴리하이드록시알카노에이트는 폴리하이드록시부티레이트인, 폴리하이드록시알카노에이트 생산 방법.
제1항의 균주를 포함하는 폴리하이드록시알카노에이트 생산용 조성물.
제9항에 있어서,
상기 폴리하이드록시알카노에이트는 폴리하이드록시부티레이트인, 폴리하이드록시알카노에이트 생산용 조성물.