CN102066560B

CN102066560B - 使用重组微生物制造共聚聚酯的方法

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Publication number: CN102066560B
Application number: CN200980123682.2A
Authority: CN
Inventors: 田口精一; 田岛健次; 佐藤康治; 松本谦一郎; 山田美和; 小畑充生; 神户浩美; 幸田胜典; 大野克博; 嶋村隆
Original assignee: Toyota Motor Corp
Current assignee: Toyota Motor Corp
Priority date: 2008-04-23
Filing date: 2009-04-23
Publication date: 2013-12-18
Anticipated expiration: 2029-04-23
Also published as: EP2284261A8; CN102066560A; JP5625905B2; KR20110014993A; US8563281B2; JPWO2009131186A1; US20110104768A1; EP2284261A4; WO2009131186A1; KR101578959B1; EP2284261A1; EP2284261B1

Abstract

本发明的目的是提供以糖为原料通过微生物发酵来高效地生产包含3HB和LA的共聚聚酯的方法。本发明提供由3-羟基丁酸和乳酸形成的共聚聚酯的制造方法，其包括下述工序(1)和工序(2)，工序(1)：在含碳源的培养基中培养具有催化向丙酸和/或乳酸转移CoA的反应的蛋白质、催化由2分子乙酰CoA形成乙酰乙酰CoA的反应的蛋白质、催化乙酰乙酰CoA的还原反应的蛋白质、以及包含下述(a)或(b)的氨基酸序列的催化聚羟基脂肪酸酯的合成反应的蛋白质的重组微生物，(a)序列号2所示氨基酸序列的第130位、第325位、第477位和第481位氨基酸的至少1个以上被置换成了其它氨基酸的氨基酸序列，(b)在(a)所定义的蛋白质中，进而除第130位、第325位、第477位和第481位以外的至少1个以上氨基酸缺失或被置换，或者插入了1个以上氨基酸残基的氨基酸序列；工序(2)：从工序(1)的培养物中回收上述共聚聚酯。本发明的制造方法能够以廉价的碳源为原料有效地制造由3HB和LA形成的共聚聚酯，从而能够降低生物降解性塑料的制造成本。

Description

使用重组微生物制造共聚聚酯的方法

技术领域

本发明涉及使用重组微生物制造共聚聚酯的方法。

背景技术

到目前为止，已经报道了大量具有以糖为碳源生产聚酯的能力的微生物(非专利文献1)。由微生物生产的聚酯作为容易在自然界被分解的生物降解性塑料、以及能够从糖和/或植物油等可再生碳资源合成的“绿色”塑料而受到关注。

由微生物生产的生物降解性塑料的代表例是以3-羟基丁酸(3HB)为单体的聚-3-羟基丁酸(polyhydoroxybutylate、PHB)。PHB是具有180℃左右的熔解温度的热塑性高分子，除了生物降解性之外还具有熔融加工性优异这样的优点。另一方面，PHB由于结晶性高，因而存在硬且脆、即耐冲击性差这样的物性上的问题。

作为消除PHB的物性上的问题的一种方法，开发了使用微生物来制造包含3HB和其它羟基脂肪酸的共聚聚酯的方法。

例如，专利文献1公开了由3HB和3-羟基戊酸(3HV)形成的共聚物的制造方法。另外专利文献2公开了使甲基杆菌属(Methylobacterium sp.)、副球菌属(Paracoccus sp.)、产碱杆菌属(Alcaligenes sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)的微生物与碳原子数3～7的伯醇接触，从而生产3HB与3HV的共聚物的方法。

该3HB与3HV的共聚物比PHB富于柔软性，并且确认了如果共聚聚酯中3HV的含有率增加则柔软性提高。在上述使用微生物的3HB与3HV的共聚物的制造法中，例如在上述专利文献1中通过在培养基中添加丙酸来控制共聚聚酯中3HV的含有率，另外在专利文献3中通过在培养基中添加1-丙醇来控制共聚聚酯中3HV的含有率。

例如，专利文献4和专利文献5中也分别记载了作为3HB与3-羟基己酸(以下简称为3HH)2种成分的共聚聚酯的P(3HB-co-3HH)及其制造方法。这些公报的P(3HB-co-3HH)共聚物的制造方法是使用由土壤分离出的猪鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)，由油酸等脂肪酸和/或橄榄油等油脂进行发酵生产的方法。另外，还有克隆该猪鼠气单胞菌的PHA合酶基因，使用将该基因导入真养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus)而得的重组株，以脂肪酸为碳源来生产P(3HB-co-3HH)的报告(专利文献6)。

另外，在上述使用微生物的共聚聚酯的制造法中，任何情况下均需要使用作为具有直接合成聚合物的活性的酶蛋白质的聚羟基脂肪酸酯合成酶，也进行了改变该合成酶、并调节单体单元的摩尔比率的尝试。例如专利文献7公开了一种突变酶，是被鉴定为假单胞菌种(Pseudomonas sp.)61-3的微生物的聚羟基脂肪酸酯合成酶的氨基酸序列发生变换而得的，可生产3HB的含有率高的PHB。

以上是以3-羟基脂肪酸为单体单元的共聚聚酯、及其使用微生物的制造法。另一方面，人们期待以除3-羟基脂肪酸以外的成分为单体单元的共聚聚酯具有与上述共聚聚酯不同的物性。作为含有这样的除3-羟基脂肪酸以外的单体单元的共聚聚酯的例子，专利文献8公开了将整合有编码丙酸梭菌(Clostridium propionicum)的丙酰CoA转移酶的核酸的真养产碱杆菌(Ralstonia eutropha，又称罗尔斯通氏菌，旧名Alcaligenes eutrophus)在培养基中添加乳酸的条件下进行培养，从而制造由3HB和乳酸(LA)形成的共聚聚酯的方法。另外，同一文献中还公开了将整合有编码来源于丙酸梭菌的丙酰CoA转移酶的核酸、和编码来源于假单胞菌种61-3的聚羟基脂肪酸酯合成酶的核酸的大肠杆菌在培养基中添加乳酸和癸烯酸的条件下进行培养，从而制造由3-羟基己酸酯、3-羟基辛酸酯、3-羟基癸酸酯和乳酸形成的共聚物。

但是，在培养基中添加乳酸和/或癸烯酸等单体成分来合成聚羟基脂肪酸酯的方法在原料成本方面是不利的。另外，因为一般通过微生物制造共聚聚酯的聚合物生产性和碳源收率低，所以即使在利用廉价的天然物等作为碳源的情况下，提高生产性乃至收率对于减少制造成本来说也是重要的课题。

非专利文献1：《生分解性プラスチツクハンドブツク(生物降解性塑料手册)》，生分解性プラスチツク研究会编，1995年，第178-197页，(株)エヌ·テイ一·エス出版)

专利文献1：日本特开昭57-150393号公报

专利文献2：日本特开平5-74492号公报

专利文献3：日本特公平7-79705号公报

专利文献4：日本特开平5-93049号公报

专利文献5：日本特开平7-265065号公报

专利文献6：日本特开平10-108682号公报

专利文献7：国际公开公报WO2003/100055

专利文献8：国际公开公报WO2006/126796

发明内容

发明要解决的课题

本发明的目的是提供以糖为原料通过微生物发酵来高效地生产包含3HB和作为除3-羟基脂肪酸以外的单体单元的LA的共聚聚酯的方法。另外，本发明的目的是提供根据所使用的酶的特性来控制聚酯中3HB的摩尔比率，或者通过选择特定的宿主、调节培养条件，来制造具有各种摩尔比率的LA的共聚聚酯的方法。另外本发明的目的是提供以糖为原料通过微生物发酵来高效地生产进一步含有除LA和3HB以外的单体单元的共聚聚酯的方法。

用于解决课题的方法

本发明者们发现，导入了编码上述非专利文献7所记载的聚羟基脂肪酸酯合成酶的突变体的核酸的重组微生物，能够由糖直接地有效制造由3HB和LA形成的共聚聚酯，并且发现，能够调节共聚中LA的摩尔比率，而且通过进一步向培养基中供给除3HB和LA以外的单体成分的前体能够有效地制造进一步包含除LA和3HB以外的单体单元的共聚聚酯，从而完成了下述各发明。

(1)一种由3-羟基丁酸和乳酸形成的共聚聚酯的制造方法，其包括下述工序(1)和工序(2)，

工序(1)：在含碳源的培养基中培养具有催化向丙酸和/或乳酸转移CoA的反应的蛋白质、催化由2分子乙酰CoA形成乙酰乙酰CoA的反应的蛋白质、催化乙酰乙酰CoA的还原反应的蛋白质、以及包含下述(a)或(b)的氨基酸序列的催化聚羟基脂肪酸酯的合成反应的蛋白质的重组微生物，

(a)序列号2所示氨基酸序列的第130位、第325位、第477位和第481位氨基酸的至少1个以上被置换成了其它氨基酸的氨基酸序列，

(b)在(a)所定义的蛋白质中，进而除第130位、第325位、第477位和第481位以外的至少1个以上氨基酸缺失或被置换，或者插入了1个以上氨基酸残基的氨基酸序列；

工序(2)：从工序(1)的培养物中回收上述共聚聚酯。

(2)根据(1)所述的制造方法，其中，催化向丙酸和/或乳酸转移CoA的反应的蛋白质的氨基酸序列，是序列号4所示氨基酸序列，或者在序列号4所示氨基酸序列中缺失、置换或添加了1个或几个氨基酸的氨基酸序列。

(3)根据(1)所述的制造方法，其中，催化由2分子乙酰CoA形成乙酰乙酰CoA的反应的蛋白质的氨基酸序列，是序列号6所示氨基酸序列，或者在序列号6所示氨基酸序列中缺失、置换或添加了1个或几个氨基酸的氨基酸序列。

(4)根据(1)所述的制造方法，其中，催化乙酰乙酰CoA的还原反应的蛋白质的氨基酸序列，是序列号8所示氨基酸序列，或者在序列号8所示氨基酸序列中缺失、置换或添加了1个或几个氨基酸的氨基酸序列。

(5)根据(1)所述的制造方法，其中，催化聚羟基脂肪酸酯的合成反应的蛋白质的氨基酸序列，是序列号2所示氨基酸序列的第325位和第481位的氨基酸分别被置换成了其它氨基酸的氨基酸序列。

(6)根据(5)所述的制造方法，其中，催化聚羟基脂肪酸酯的合成反应的蛋白质的氨基酸序列，是序列号2所示氨基酸序列的第325位和第481位的氨基酸同时被置换了的氨基酸序列。

(7)根据(6)所述的制造方法，其中，催化聚羟基脂肪酸酯的合成反应的蛋白质的氨基酸序列，是序列号2所示氨基酸序列的第325位的Ser被置换成了Thr、第481位的Gln被置换成了Lys的氨基酸序列。

(8)根据(1)所述的制造方法，其中，所述蛋白质都是由被导入微生物中的重组表达载体所编码的蛋白质。

(9)根据(1)～(8)的任一项所述的制造方法，其中，重组微生物的培养在厌氧条件下进行。

(10)根据(1)～(9)的任一项所述的制造方法，其中，微生物是具有乳酸蓄积能力的微生物。

(11)根据(10)所述的制造方法，其中，具有高乳酸蓄积能力的微生物是大肠杆菌Jw2293菌株、Jw0885菌株或Jw0886菌株。

(12)一种包含3-羟基丁酸和乳酸的共聚聚酯的制造方法，其包括下述工序(1)和工序(2)，

工序(1)：在含有除3-羟基丁酸和乳酸以外的羟基脂肪酸和碳源的培养基中培养具有催化向丙酸和/或乳酸转移CoA的反应的蛋白质、催化由2分子乙酰CoA形成乙酰乙酰CoA的反应的蛋白质、催化乙酰乙酰CoA的还原反应的蛋白质、和包含下述(a)或(b)的氨基酸序列的催化聚羟基脂肪酸酯的合成反应的蛋白质的重组微生物，

(a)序列号2所示氨基酸序列的第130位、第325位、第477位和第481位的氨基酸的至少1个以上被置换成了其它氨基酸的氨基酸序列，

工序(2)：从工序(1)的培养物中回收上述共聚聚酯。

(13)根据(12)所述的制造方法，其中，催化向丙酸和/或乳酸转移CoA的反应的蛋白质的氨基酸序列，是序列号4所示氨基酸序列，或者在序列号4所示氨基酸序列中缺失、置换或添加了1个或几个氨基酸的氨基酸序列。

(14)根据(12)所述的制造方法，其中，催化由2分子乙酰CoA形成乙酰乙酰CoA的反应的蛋白质的氨基酸序列，是序列号6所示氨基酸序列，或者在序列号6所示氨基酸序列中缺失、置换或添加了1个或几个氨基酸的氨基酸序列。

(15)根据(12)所述的制造方法，其中，催化乙酰乙酰CoA的还原反应的蛋白质的氨基酸序列，是序列号8所示氨基酸序列，或者在序列号8所示氨基酸序列中缺失、置换或添加了1个或几个氨基酸的氨基酸序列。

(16)根据(12)所述的制造方法，其中，催化聚羟基脂肪酸酯的合成反应的蛋白质的氨基酸序列，是序列号2所示氨基酸序列的第325位和第481位的氨基酸分别被置换成了其它氨基酸的氨基酸序列。

(17)根据(12)所述的制造方法，其中，催化聚羟基脂肪酸酯的合成反应的蛋白质的氨基酸序列，是序列号2所示氨基酸序列的第325位和第481位的氨基酸同时被置换了的氨基酸序列。

(18)根据(16)或(17)所述的制造方法，其中，催化聚羟基脂肪酸酯的合成反应的蛋白质的氨基酸序列，是序列号2所示氨基酸序列的第325位的Ser被置换成了Thr、第481位的Gln被置换成了Lys的氨基酸序列。

(19)根据(12)所述的制造方法，其中，所述蛋白质都是由被导入微生物中的重组表达载体所编码的蛋白质。

(20)根据(12)～(19)的任一项所述的制造方法，其中，除3-羟基丁酸和乳酸以外的羟基脂肪酸的前体，是选自丙酸、戊酸、十二烷酸、4-羟基丁酸和4-羟基戊酸中的一种以上前体。

(21)根据(12)～(20)的任一项所述的制造方法，其中，重组微生物的培养在厌氧条件下进行。

(22)根据(12)～(21)的任一项所述的制造方法，其中，微生物是具有乳酸蓄积能力的微生物。

(23)根据(22)所述的制造方法，其中，具有高乳酸蓄积能力的微生物是大肠杆菌Jw2293菌株、Jw0885菌株或Jw0886菌株。

(24)一种重组微生物，其表达催化向丙酸和/或乳酸转移CoA的反应的蛋白质、催化由2分子乙酰CoA形成乙酰乙酰CoA的反应的蛋白质、催化乙酰乙酰CoA的还原反应的蛋白质、以及包含下述(a)或(b)的氨基酸序列的催化聚羟基脂肪酸酯的合成反应的蛋白质，

(b)在(a)所定义的蛋白质中，进而除第130位、第325位、第477位和第481位以外的至少1个以上氨基酸缺失或被置换，或者插入了1个以上氨基酸残基的氨基酸序列。

(25)根据(24)所述的重组微生物，其中，催化向丙酸和/或乳酸转移CoA的反应的蛋白质的氨基酸序列，是序列号4所示氨基酸序列，或者在序列号4所示氨基酸序列中缺失、置换或添加了1个或几个氨基酸的氨基酸序列。

(26)根据(24)所述的重组微生物，其中，催化由2分子乙酰CoA形成乙酰乙酰CoA的反应的蛋白质的氨基酸序列，是序列号6所示氨基酸序列，或者在序列号6所示氨基酸序列中缺失、置换或添加了1个或几个氨基酸的氨基酸序列。

(27)根据(24)所述的重组微生物，其中，催化乙酰乙酰CoA的还原反应的蛋白质的氨基酸序列，是序列号8所示氨基酸序列，或者在序列号8所示氨基酸序列中缺失、置换或添加了1个或几个氨基酸的氨基酸序列。

(28)根据(24)所述的重组微生物，其中，催化聚羟基脂肪酸酯的合成反应的蛋白质的氨基酸序列，是序列号2所示氨基酸序列的第325位和第481位的氨基酸分别被置换成了其它氨基酸的氨基酸序列。

(29)根据(24)所述的重组微生物，其中，催化聚羟基脂肪酸酯的合成反应的蛋白质的氨基酸序列，是序列号2所示氨基酸序列的第325位和第481位的氨基酸同时被置换了的氨基酸序列。

(30)根据(28)或(29)所述的重组微生物，其中，催化聚羟基脂肪酸酯的合成反应的蛋白质的氨基酸序列，是序列号2所示氨基酸序列的第325位的Ser被置换成了Thr、第481位的Gln被置换成了Lys的氨基酸序列。

(31)根据(24)所述的重组微生物，其中，所述蛋白质都是由被导入微生物中的重组表达载体所编码的蛋白质。

(32)根据(24)～(31)的任一项所述的重组微生物，其中，微生物是具有乳酸蓄积能力的微生物。

(33)根据(32)所述的重组微生物，其中，具有高乳酸蓄积能力的微生物是大肠杆菌Jw2293菌株、Jw0885菌株或Jw0886菌株。

发明的效果

本发明的制造方法能够以廉价的碳源为原料有效地制造由3HB和LA形成的共聚聚酯，从而能够降低生物降解性塑料的制造成本。另外，通过选择所使用的酶、以LA的高生产性微生物作为宿主、在厌氧条件下进行微生物的培养，能够调节由3HB和LA形成的共聚聚酯中的单体单元的含有率。另外，通过在培养基中加入除3HB和LA以外的羟基脂肪酸，能够制造进一步含有除3HB和LA以外的单体单元的共聚聚酯。

本说明书包括作为本申请的优先权基础的日本专利申请2008-113127号、2008-298765号的说明书和/或附图所记载的内容。

附图说明

图1是显示重组质粒pTV118NPCTC1(ST/QK)AB的构成的概略图。图中，phaA表示来源于真养产碱杆菌(R.eutropha)的βKT基因，phaB表示来源于真养产碱杆菌(R.eutropha)的AACoA-R基因，phaC1(ST/QK)表示STQK基因，PCT表示来源于埃氏巨球形菌(M.elsdenii)的Pct基因，Pre表示来源于真养产碱杆菌(R.eutropha)的启动子，并且Plac表示大肠杆菌乳糖操纵子启动子。

图2是实施例1所制备的聚合物的分子量分布曲线。

图3是表示实施例1所制备的聚合物的热分析的测定结果的图。

图4是表示实施例1所制备的聚合物的GC/MS分析的结果的图。

图5是表示实施例1所制备的聚合物的¹H-NMR光谱分析的结果的图。

图6是表示实施例1所制备的聚合物的¹³C-NMR光谱分析的结果的图。

图7是表示实施例1所制备的聚合物的¹H¹H-NMR光谱分析的结果的图。

图8是表示实施例1所制备的聚合物的¹³C¹H-NMR光谱分析的结果的图。

图9是显示重组质粒pTV118NPCTC(Re)AB、pTV118NPCTC(Bc)AB、pTV118NPCTC1(WT)AB、pTV118NPCTC2AB的构成的概略图。

图10是表示比较例所制备的pTV118NPCTC(Re)AB和pTV118NPCTC(Bc)的各聚合物的GC/MS分析的结果的图。画面A是pTV118NPCTC(Re)AB的图，画面B是pTV118NPCTC(Bc)的图，画面C是pTV118NPCTC2AB的图。

图11a是实施例2所制备的来源于LA高蓄积性大肠杆菌Jw2293菌株的聚合物的分子量分布曲线。

图11b是实施例2所制备的来源于LA高蓄积性大肠杆菌Jw0885菌株的聚合物的分子量分布曲线。

图11c是实施例2所制备的来源于LA高蓄积性大肠杆菌Jw0886菌株的聚合物的分子量分布曲线。

图12a是表示实施例2所制备的来源于LA高蓄积性大肠杆菌Jw2293菌株的聚合物的热分析的测定结果的图。

图12b是表示实施例2所制备的来源于LA高蓄积性大肠杆菌Jw0885菌株的聚合物的热分析的测定结果的图。

图12c是表示实施例2所制备的来源于LA高蓄积性大肠杆菌Jw0886菌株的聚合物的热分析的测定结果的图。

图13a是表示实施例2所制备的来源于LA高蓄积性大肠杆菌Jw2293菌株的聚合物的GC/MS分析的结果的图。

图13b是表示实施例2所制备的来源于LA高蓄积性大肠杆菌Jw0885菌株的聚合物的GC/MS分析的结果的图。

图13c是表示实施例2所制备的来源于LA高蓄积性大肠杆菌Jw0886菌株的聚合物的GC/MS分析的结果的图。

图14a是表示实施例2所制备的来源于LA高蓄积性大肠杆菌Jw2293菌株的聚合物的¹H-NMR光谱分析的结果的图。

图14b是表示实施例2所制备的来源于LA高蓄积性大肠杆菌Jw0885菌株的聚合物的¹H-NMR光谱分析的结果的图。

图14c是表示实施例2所制备的来源于LA高蓄积性大肠杆菌Jw0886菌株的聚合物的¹H-NMR光谱分析的结果的图。

图15a是表示实施例2所制备的来源于LA高蓄积性大肠杆菌Jw2293菌株的聚合物的¹³C-NMR光谱分析的结果的图。

图15b是表示实施例2所制备的来源于LA高蓄积性大肠杆菌Jw0886菌株的聚合物的¹³C-NMR光谱分析的结果的图。

图15c是表示实施例2所制备的来源于LA高蓄积性大肠杆菌Jw0886菌株的聚合物的¹³C-NMR光谱分析的结果的图。

图16是显示重组质粒pACYC117AB的构成的概略图。

图17是实施例3所制备的聚合物的分子量分布曲线。

图18是表示实施例3所制备的聚合物的热分析的测定结果的图。

图19是表示实施例3所制备的聚合物的GC/MS分析的结果的图。

图20是表示实施例3所制备的聚合物的¹H-NMR光谱分析的结果的图。

图21是表示实施例3所制备的聚合物的¹³C-NMR光谱分析的结果的图。

图22是表示实施例3所制备的聚合物的¹H¹³C-NMR光谱分析的结果的图。

图23是作为标准物质的聚乳酸的HPLC图。

图24是作为标准物质的聚[羟基丁酸(HB)-co-羟基戊酸(HV)-co-羟基己酸(HHx)](HB：70mol％、HV：23mol％、HHx：7mol％)的HPLC图。

图25是实施例4所得的聚合物的HPLC图。

符号说明

phaA：来源于真养产碱杆菌的βKT基因

phaB：来源于真养产碱杆菌的AACoA-R基因

phaC(Re)：来源于真养产碱杆菌的聚羟基脂肪酸酯合成酶基因

phaC(Bc)：来源于蜡状芽孢杆菌的聚羟基脂肪酸酯合成酶基因

phaC1(WT)：来源于假单胞菌种61-3的聚羟基脂肪酸酯合成酶基因(野生型)

phaC2：来源于假单胞菌种61-3的聚羟基脂肪酸酯合成酶2基因

PCT：来源于埃氏巨球形菌的Pct基因

PRe：来源于真养产碱杆菌的启动子

Plac：乳糖操纵子启动子

具体实施方式

本发明涉及一种由3HB和LA形成的共聚聚酯的制造方法，其包括下述工序(1)和工序(2)，

工序(2)：从上述工序(1)的培养物中回收上述共聚聚酯。

以下，对于本发明中使用的蛋白质、重组微生物和本发明的制造方法的诸条件进行说明。

(1)催化向丙酸和/或乳酸(LA)转移CoA的反应的蛋白质

本发明中使用的“催化向丙酸和/或LA转移CoA的反应的蛋白质”是具有催化由适当的CoA底物向丙酸和/或LA转移CoA的反应的活性的蛋白质。具有该活性的蛋白质一般被称为丙酰CoA转移酶(丙酰辅酶A转移酶，Propionyl CoA Transferase，Pct)。以下，在本发明中，将该蛋白质表示为Pct。

表1显示到目前位置报告的Pct的来源(微生物名)的代表例、以及公开了编码它们的碱基序列信息的文献信息。

[表1]

微生物名	文献信息
		Clostridium propionicum	Eur.J.Biochem.，2002，Vol.269，pp.372-380
Megasphaera elsdenii	United States Patent 7186541
		Staphylococcus aureus	Eur.J.Biochem.，2002，Vol.269，pp.372-380
Esherichia coli	Eur.J.Biochem.，2002，Vol.269，pp.372-380

在本发明中，还可以利用除了上述表1之外的到目前为止报告的任意Pct。另外，只要是“催化向丙酸和/或LA转移CoA的反应的蛋白质”即可，也可以利用包含在已知的Pct的氨基酸序列中缺失、置换或添加了1个或几个、例如1～几十个、优选为1～十几个、更优选为10个以下的氨基酸的氨基酸序列的蛋白质。

向丙酸和/或LA转移CoA的反应的催化活性，按照例如A.E.Hofmeister等(Eur.J.Biochem.，第206卷，第547-552页)所记载的方法来测定。

本发明中优选的Pct是来源于埃氏巨球形菌(Megasphaera elsdenii)的Pct，其氨基酸序列示于序列号4，编码该氨基酸序列的核酸(DNA)的碱基序列的例子示于序列号3。

(2)催化由2分子乙酰CoA形成乙酰乙酰CoA的反应的蛋白质

本发明中使用的“催化由2分子乙酰CoA形成乙酰乙酰CoA的反应的蛋白质”是催化2分子乙酰CoA缩合而形成乙酰乙酰CoA的反应的蛋白质，一般称为β酮硫解酶或乙酰-CoA-CoA-C-乙酰转移酶。以下，在本发明中，将“催化由2分子乙酰CoA形成乙酰乙酰CoA的反应的蛋白质”表示为βKT。

表2显示到目前为止报告的βKT的来源(微生物名)的代表例、以及公开了编码这些βKT的碱基序列信息的文献信息。

[表2]

微生物名文献信息

Alkaligenes beijerinckii Biochem.J.、1973，Vol.134、pp.225-238

R.eutropha Biochem.J.、1973，Vol.134、pp.239-248

Clostridium pasteurianum Arch.Microbiol.、1975，Vol.103、pp.21-30

Z.ramigera United States Patent No.067，695

在本发明中，还可以利用除了上述表2以外的到目前为止已报告的任意βKT。另外，只要是“催化由2分子乙酰CoA形成乙酰乙酰CoA的反应的蛋白质”即可，也可以使用包含在已知的βKT的氨基酸序列中缺失、置换或添加了1个或几个、例如1～几十个、优选为1～十几个、更优选为10个以下的氨基酸的氨基酸序列的蛋白质。

由2分子乙酰CoA形成乙酰乙酰CoA的反应的催化活性可以通过例如Slater等(J.Bacteriology，1998年，第180卷，第1979-1987页)所记载的方法来测定。

本发明中优选的βKT是来源于真养产碱杆菌(R.eutropha)的βKT，其氨基酸序列示于序列号6，编码该氨基酸序列的核酸(DNA)的碱基序列的例子示于序列号5。

(3)催化乙酰乙酰CoA的还原反应的蛋白质

本发明中使用的“催化乙酰乙酰CoA的还原反应的蛋白质”，是催化乙酰乙酰CoA通过在NADP等辅酶存在下发生的还原反应而形成D(-)-β-羟基丁酰-CoA的反应的蛋白质，一般称为乙酰乙酰CoA还原酶。以下，在本发明中，将“催化乙酰乙酰CoA的还原反应的蛋白质”表示为AACoA-R。

表3显示到目前为止报告的AACoA-R的来源(微生物名)的例子、以及公开了编码该AACoA-R的碱基序列信息的文献或数据库登录号。

[表3]

微生物名文献信息或数据库登录号

Zoogloea Arch.Microbiol.、1977，Vol.114，pp.211-217

R.eutropha Accession No.J04987

Z.ramigera United States Patent No.067，695

在本发明中，还可以使用除上述表3之外的到目前为止报告的任意AACoA-R。另外，只要是“催化乙酰乙酰CoA的还原反应的蛋白质”即可，可以使用包含在已知的AACoA-R的氨基酸序列中缺失、置换或添加了1个或几个、例如1～几十个、优选为1～十几个、更优选为10个以下的氨基酸的氨基酸序列的蛋白质。

乙酰乙酰CoA的还原反应的催化活性可以通过例如G.W.Haywood等(FEMS Mierobiology Letters，1988年，第52卷，第259-264页)所记载的方法来测定。

本发明中优选的AACoA-R是来源于真养产碱杆菌(R.eutropha)的AACoA-R，其氨基酸序列示于序列号8，编码该氨基酸序列的核酸(DNA)的碱基序列的例子示于序列号7。

此外，到目前为止已知的βKT、AACo-R及其登录号示于表4。

[表4]

(4)催化聚羟基脂肪酸酯的合成反应的蛋白质

本发明中的催化聚羟基脂肪酸酯的合成的蛋白质是包含下述(a)或(b)的氨基酸序列的蛋白质，(a)是序列号2所示氨基酸序列的第130位、第325位、第477位和第481位的氨基酸的至少1个以上被置换成了其它氨基酸的氨基酸序列；(b)是在(a)所定义的蛋白质中，进而除第130位、第325位、第477位和第481位以外的至少1个以上氨基酸缺失或被置换，或者插入了1个以上氨基酸残基的氨基酸序列。该蛋白质是使上述专利文献7所记载的、来源于假单胞菌种(Pseudomonas sp.)61-3的聚羟基脂肪酸酯合成酶的氨基酸序列的一部分突变而得的蛋白质。以下，将本发明中催化聚羟基脂肪酸酯的合成的蛋白质表示为PhaCm，另外本说明书包括专利文献7的所记载的全部内容。

PhaCm的优选具体例，可列举专利文献7的表6和表7所记载的、序列号2所示氨基酸序列的第130位、第325位、第477位和第481位的氨基酸分别单独被置换了的单突变蛋白质，任意2个氨基酸被置换了的双重突变蛋白质，任意3个氨基酸被置换了的三重突变蛋白质，4个氨基酸全部被置换了的四重突变蛋白质。优选任意2个氨基酸被置换了的双重突变蛋白质，特别优选第325位的Ser被置换成了Thr、且第481位的Gln被置换成了Lys的双重突变蛋白质(以下，表示为STQK)。

编码PhaCm的DNA可以以来源于假单胞菌种(Pseudomonas sp.)61-3的聚羟基脂肪酸酯合成酶的氨基酸序列(序列号2)和编码该氨基酸序列的DNA的碱基序列(序列号1)为基础，通过本领域技术人员已知的位点特异性突变引入法以重组的方式来制作。另外，如专利文献7所记载，PhaCm的催化聚羟基脂肪酸酯的合成的活性可以通过用能够表达上述PhaCm的核酸转化宿主细胞，根据该转化所得的细胞的聚羟基脂肪酸酯的蓄积能力来确认。

通过选择使用各种PhaCm，可以调节所制造的共聚聚酯中的3HB的含有率。例如，在使用上述STQK的情况下，可制造出3HB∶乳酸＝94∶6的、无规地掺入了乳酸的无规共聚物。

另外，除了选择PhaCm以外，可以通过使用例如大肠杆菌菌株Jw2293、Jw0885、Jw0886等乳酸高蓄积性微生物作为宿主，来提高所制造的共聚聚酯中的LA的摩尔比率。例如，可以通过以上述乳酸高蓄积性大肠杆菌菌株为宿主进行需氧培养，来将共聚物聚酯中的LA的摩尔比率提高30％左右。

进而，可以通过想办法提高微生物的LA的产生量，来进一步提高共聚物聚酯中的LA的摩尔比率。例如，将用编码上述蛋白质的基因转化后的宿主微生物在厌氧条件下培养，可以通过增加宿主微生物自身的LA产生量来提高所制造的共聚聚酯中的LA的摩尔比率。通过以大肠杆菌为宿主在厌氧条件下培养，可以将共聚物聚酯中的LA的摩尔比率提高50％左右。

(5)编码蛋白质的核酸

对于上述(1)～(4)的各蛋白质，优选通过将编码它们的核酸导入微生物，使其在该微生物内转录翻译成蛋白质来使用。被导入微生物的核酸优选为整合在载体中的形态。

用于将上述核酸导入微生物的载体只要是能够在宿主中自主复制的载体即可，优选为质粒DNA、噬菌体DNA的形态。作为用于将核酸导入大肠杆菌的载体的例子，可分别列举pBR322、pUC18、pBLuescriptII等质粒DNA，EMBL3、M13、λgtII等噬菌体DNA等。另外，作为用于导入酵母的载体的例子，可列举YEp13、YCp50等。

另外，作为用于将核酸导入产碱杆菌属(Ralstonia，又称罗尔斯通氏菌属)细菌和/或假单胞菌属(Pseudomonas)细菌的载体的例子，可以列举能够在大范围的宿主中复制、保持的具有RK2复制起点的pLA2917(ATCC37355)和/或具有RSF1010复制起点的pJRD215(ATCC 37533)等。

可以使用本领域技术人员已知的基因重组技术来将编码上述(1)～(4)的各蛋白质的核酸、优选为DNA插入到载体中。另外在进行重组时，优选在启动子的下游连接上述DNA，所述启动子能够调节被插入到载体中的DNA所编码的各蛋白质的转录翻译。作为启动子，只要是能够在宿主中调节基因的转录的启动子就可以任意使用。例如，在使用大肠杆菌作为宿主时，可以使用trp启动子、lac启动子、PL启动子、PR启动子、T7启动子等；在使用酵母作为宿主时，可以使用gal1启动子、gal1o启动子等。另外，在使用假单胞菌属(Pseudomonas)细菌作为本发明的微生物时，作为启动子，可以使用被认为包含phaC1Ps基因上游和/或phbCABRe操纵子上游的启动子的区域等。

另外，在本发明的载体中，可以根据需要连接能够在需导入核酸的微生物中利用的终止子序列、内含子序列、剪接信号序列、加A信号(多聚腺苷酸添加信号，poly A addition signal)序列、核糖体结合序列(SD序列)、选择标记基因等。作为选择标记基因的例子，可以列举氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因、新霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、氯霉素抗性基因等抗药性基因，以及与氨基酸和/或核酸等营养素的细胞内生物合成相关的基因，或者编码萤光素酶等荧光蛋白质的基因等。

上述核酸、优选为载体形态的核酸可通过本领域技术人员已知的方法被导入微生物。作为向微生物导入重组载体的方法，可列举例如，磷酸钙法、电穿孔法、原生质球法、乙酸锂法、接合转移法、使用钙离子的方法等。

(6)微生物

作为本发明中的重组微生物，是表达上述(1)～(4)的蛋白质的微生物，优选为通过导入能够功能性地表达上述(1)～(4)的蛋白质的核酸而转化所得的微生物。作为优选微生物，可列举假单胞菌种(Pseudomonas sp.)61-3株等假单胞菌属(Pseudomonas)细菌、真养产碱杆菌等产碱杆菌属(Ralstonia)细菌、枯草杆菌(Bacillus subtilis)等芽孢杆菌属(Bacillus)细菌、大肠杆菌(Escherichia coli)等埃希氏菌属(Escherichia)细菌、棒状杆菌属(Corynebacterium)细菌、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等酵母菌属(Saccharomyces)酵母，麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)等假丝酵母属(Candida)酵母等。其中优选大肠杆菌、棒状杆菌属细菌和真养产碱杆菌，特别优选为大肠杆菌、棒状杆菌属细菌。

在使用真养产碱杆菌等其自身具有固有的聚羟基脂肪酸酯合成酶的微生物的情况下，优选使用丧失了该固有的聚羟基脂肪酸酯合成酶的表达能力的微生物。该丧失了表达能力的微生物可以如下制作：用亚硝酸胍等化学诱变剂和/或UV等物理诱变剂处理微生物；和/或将编码聚羟基脂肪酸酯合成酶的核酸进行改变而使该酶不能进行功能性表达，将由此获得的突变核酸导入微生物进行“同源重组”(homologous recombination)。可以如下确认聚羟基脂肪酸酯合成酶基因被破坏：通过使用该基因的一部分作为探针的DNA印迹(Southern杂交)，研究杂交的条带与来源于野性株的条带相比位移到了预想的位置。

(6)由羟基丁酸和乳酸形成的共聚聚酯的制造

由羟基丁酸和乳酸形成的共聚聚酯如下制造：将导入了上述核酸的重组微生物在含碳源的培养基中进行培养，使培养菌体或培养物中生成蓄积共聚聚酯，再从该培养菌体或培养物中回收该共聚聚酯。

关于本发明的重组微生物的培养，除了培养基组成之外，优选根据重组微生物的种类不同，在各个微生物的一般培养条件下进行。特别是从提高共聚物聚酯中的LA的摩尔比率的方面考虑，将重组微生物在厌氧条件下培养是有利的。

对具有特殊组成的培养基而言，虽不是特别必须的，但优选利用限制了除碳源以外的氮源、无机盐类、其它有机营养源的任一者的培养基。例如，作为用于培养在产碱杆菌属(Ralstonia)细菌和/或假单胞菌属(Pseudomonas)细菌等中整合有核酸的重组微生物的培养基，可列举例如，将氮源限制为0.01～0.1％的培养基。

作为碳源，可列举例如，葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖等碳水化合物。另外，也可以以碳原子数4以上的油脂类物质作为碳源。作为碳原子数4以上的油脂类物质，可列举玉米油、大豆油、红花油、向日葵油、橄榄油、椰子油、棕榈油、菜籽油、鱼油、鲸油、猪油或牛油等天然油脂，丁酸、戊酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、油酸、棕榈酸、亚麻酸、亚油酸或肉豆蔻酸等脂肪酸或这些脂肪酸的酯，辛醇、月桂醇、油醇或棕榈醇等或这些醇的酯等。

作为氮源，可列举例如，氨、氯化铵、硫酸铵、磷酸铵等铵盐，以及胨、肉提取物、酵母提取物、玉米浆等。作为无机物，可列举例如，磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠等。

培养优选在通常震荡培养等需氧条件下，在25～37℃的范围内，在上述(1)～(4)的蛋白质转录表达之后进行24小时以上。在厌氧条件下进行培养时，上述时间优选为48小时以上。培养中，可以在培养基中添加卡那霉素、氨苄青霉素、四环素等抗生素。在将编码上述(1)～(4)的蛋白质的DNA的任一者或全部连接到诱导性启动子的控制下的情况下，只要在培养基中添加诱导该启动子转录的因子即可。

本发明的优选方式，是将导入了具有编码来源于埃氏巨球形菌(M.elsdenii)的Pct的核酸(序列号3)、编码真养产碱杆菌(R.eutropha)的βKT的核酸(序列号5)、编码真养产碱杆菌(R.eutropha)的AACoA-R的核酸(序列号7)和编码STQK的核酸的表达载体的重组大肠杆菌进行培养，从而制造由3HB和LA形成的共聚聚酯的方法。特别是通过使用大肠杆菌菌株Jw2293、Jw0885、Jw0886等乳酸高蓄积性微生物作为宿主，可以进一步提高共聚物聚酯中的LA的摩尔比率。另外，通过以大肠杆菌作为宿主在厌氧条件下进行培养，可以进一步提高共聚物聚酯中的LA的摩尔比率。

本发明的方法即使不在培养基中添加LA、3HB等构成目的聚合物的单体成分，也可以由廉价的废糖蜜制造由3HB和LA形成的共聚聚酯，从制造成本的方面考虑是有利的。

在本发明中，聚酯的回收只要通过用于从微生物中回收共聚聚酯或者PHA的本领域技术人员公知的方法来进行即可。例如，从培养液中通过离心分离来收集菌体、洗涤，然后使其干燥，将干燥菌体悬浮在氯仿中，进行加热，从而将作为目标的共聚聚酯提取到氯仿级分中，再在该氯仿溶液中加入甲醇使聚酯沉淀，通过过滤和/或离心分离除去上清液，然后干燥，从而获得经纯化的共聚聚酯。

通过通常的方法、例如气相色谱图法和/或核磁共振法等来确认所回收的聚酯是由3HB和LA形成的共聚聚酯即可。

本发明还提供包含3HB和LA的共聚聚酯的制造方法，其包括下述工序(1)和工序(2)，

工序(1)：在含有除3HB和LA以外的羟基脂肪酸和碳源的培养基中培养具有催化向丙酸和/或乳酸转移CoA的反应的蛋白质、催化由2分子乙酰CoA形成乙酰乙酰CoA的反应的蛋白质、催化乙酰乙酰CoA的还原反应的蛋白质、和包含下述(a)或(b)的氨基酸序列的催化聚羟基脂肪酸酯的合成反应的蛋白质的重组微生物，

工序(2)：从工序(1)的培养物中回收上述共聚聚酯。

在该方法中，关于催化向丙酸和/或乳酸转移CoA的反应的蛋白质、催化由2分子乙酰CoA形成乙酰乙酰CoA的反应的蛋白质、催化乙酰乙酰CoA的还原反应的蛋白质、由包含上述(a)或(b)的氨基酸序列的催化聚羟基脂肪酸酯的合成反应的蛋白质、以及表达这些蛋白质的重组微生物，均如上述所说明的那样。

本发明的包含3HB和LA的共聚聚酯的制造方法的特征在于，将具有这样的蛋白质的重组微生物在含有除3HB和LA以外的羟基脂肪酸和碳源的培养基中培养。重组微生物本身产生3HB和LA，通过在培养基中加入除3HB和LA以外的能够转换成共聚聚酯的单体单元的前体，来制造含有3HB、LA和除它们以外的单体单元的共聚聚酯。

作为上述前体和上述所转换出的单体单元的例子，可列举丙酸(3-羟基丙酸)、戊酸(3-羟基戊酸)、十二烷酸(3-羟基己酸、3-羟基辛酸、3-羟基十二烷酸、3-羟基十二烷酸)、4-羟基丁酸(4-羟基丁酸)、4-羟基戊酸(4-羟基戊酸)等。在本发明中可以任意利用它们，既可以预先加入培养基中，也可以经时地添加到培养基中。另外，通过将用于制造含有3HB、LA和除它们以外的单体单元的共聚聚酯的培养在厌氧条件下进行，可以调节LA的摩尔比率。

以下，显示非限定性的实施例来更详细地说明本发明。此外，实施例中的各实验操作按照以Sambrook等(Molecular cloning：a laboratorymanual(分子克隆实验指南)，2nd ed.1989年、Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)为代表的各种介绍实验操作的手册、或各种试剂和试剂盒所附带的说明书的各记载来进行。

实施例

<实施例1>使用LA高蓄积性大肠杆菌来制造共聚聚酯

(1)重组微生物的制作

使用DNeasy Tissue Kit(Qiagen社)从埃氏巨球形菌(M.elsdenii、ATCC17753)提取基因组DNA，然后为了通过PCR扩增编码丙酰CoA转移酶(登录号J04987)的核酸，合成包含EcoRI识别序列的正向引物和包含PstI识别序列的反向引物的引物DNA。以上述基因组DNA为模板，使用iCycler(BioRad)，在包含KOD-Plus-DNA聚合酶(1U)、PCR缓冲液、1mMMgSO₄、各引物15pmol、0.2mM dNTPs(皆为东洋纺株式会社制)的反应液中，将94℃2分钟进行1个循环，再将以94℃15秒、55℃30秒、68℃2分钟为1个循环的PCR反应进行30个循环，然后回收约1,500bp的扩增片段，用EcoRI和PstI消化，得到DNA片段。

将质粒pTV118N(宝酒造)使用EcoRI和PstI进行消化，使用碱性磷酸酶进行去磷酸化，然后加入上述DNA片段进行连接，从而制备出包含编码丙酰CoA转移酶的DNA的、约4.7kbp的重组质粒PTV118NM.E.-PCT。

按照Takase等(J.Biochem.，2003年，第133卷，第139-145页)所记载的方法，制备出质粒pGEMC1(ST/QK)AB，该质粒包含以下所有DNA：编码来源于真养产碱杆菌(R.eutropha)的β-酮硫解酶的DNA(序列号5)、编码来源于真养产碱杆菌(R.eutropha)的乙酰乙酰CoA还原酶的DNA(序列号7)、和编码STQK的DNA。

将pGEMC1(ST/QK)AB用BamHI消化，回收约6kbp的DNA片段，在包含66mM乙酸钾、10mM乙酸镁、0.5mM DTT、0.1mg/mL BSA、0.1mMdNTP的3mM Tris-乙酸缓冲液(pH值7.9)中，使其与200单位的T4聚合酶在37℃作用5分钟，获得编码STQK的DNA片段。

将pTV118N M.E.-PCT用PstI消化，在与上述同样的条件使其与T4聚合酶作用，然后使用碱性磷酸酶进行去磷酸化，与上述编码phaCm的DNA片段连接，从而获得在pTV118N M.E.-PCT的SalI位点导入了编码STQK的DNA的、约9.6kbp的质粒pTV118NPCTC1(ST/QK)AB(图1)。用pTV118NPCTC1(ST/QK)AB转化大肠杆菌JM109的感受态细胞。

(2)聚合物的生产

将得到的转化体接种在包含氨苄青霉素100μg/mL、2％葡萄糖、10mM泛酸的LB培养基100mL中，在37℃培养72小时。培养之后，在4℃、3,100rpm、15分钟的条件下离心并回收菌体，使其悬浮在10mM Tris-盐酸缓冲液(pH值7.5)中，再次在同样条件下离心分离，然后冻结干燥2天。

将干燥菌体移入玻璃制耐压反应管中，加入氯仿3mL制成悬浮液，然后在100℃的微量恒温仪中保持3小时，然后冷却至室温，再用0.2μm PTFE过滤器(ADVANTEC)过滤，将氯仿溶液与菌体分离。将滤液移至离心用玻璃试管中，在60℃干燥而蒸馏除去氯仿。将残留在试管内的膜状聚合物使用己烷进行洗涤，并干燥，再加入氯仿3mL，从而获得包含聚合物的氯仿溶液。用0.2μm PTFE过滤器(ADVANTEC)过滤，使用分离用GPC(LC-9201)分离聚合物级分，然后蒸馏除去氯仿，回收到聚合物48.62mg。聚合物的菌体内含有率(回收得到的聚合物重量相对于培养后的干燥菌体总重量的比例)为16.65％。

(3)聚合物的分析

(i)GPC

在(2)所回收的聚合物约1mg中加入氯仿1mL，将其用0.2μm PTFE过滤器(ADVANTEC)过滤，以过滤所得的溶液为样品，在下述条件下进行GPC测定。

系统：Shimadzu Prominence GPC system

柱：TSKgel-Super THZ-M(6.0mm×150mm)

洗脱液：CHCl₃

流量：0.8mL/分钟

温度：40℃

检测：10A refractive index detector

进样量：10μL

将测得的分子量分布曲线示于图2。分子量校正曲线使用标准聚苯乙烯制成，用标准聚苯乙烯分子量的换算值表示分子量。其结果是，聚合物的分子量(Mw)为32万，平均分子量(Mn)为23万，Mw/Mn为1.3。

(ii)热分析(DSC)

对(2)所回收得到的聚合物约1mg，使用差示扫描量热计(DSC3100、マツクサイエンス)，在-50℃～210℃：以20℃/分钟上升、210℃～-90℃：以40℃/分钟下降、-90℃：保持5分钟、-90℃～210℃：以20℃/分钟上升的条件下进行分析(图3)。

其结果是，玻璃化转变温度为0℃左右，结晶化度为86.8℃，聚合物的Tm为157.3～157.5℃。

(iii)GC/MS

将(2)所回收的聚合物约50μg溶解于1mL的氯仿中得到溶液，将所得溶液250μL、乙醇850μL、盐酸100μL在玻璃制耐压反应管中混合，在100℃的微量恒温仪中乙醇解处理3小时。冷却至室温，然后加入含0.65M磷酸和0.9M NaCl的溶液1ml和250mM磷酸溶液500μL并混合，将pH值调节为中性，然后在室温、1,200rpm、5分钟的条件下离心，分离水层和氯仿层。取氯仿层，通过分子筛进行脱水，作为GC分析用样品。

GC/MS分析在下述条件下进行。

GC系统：Shimadzu GC 2010

MS系统：GC/MS-QP2010

柱：NEUTRA-BOND-1(0.25mm×3000mm)

载气：He

气体流量：30.0mL/分钟

检测器温度：310℃

进样器温度：250℃

柱温箱温度：100℃

柱升温速度：8℃/分钟

进样量：1μL

上述条件下的分析结果和乳酸乙酯的MS光谱示于图4。根据GC/MS的结果，来确认(2)所回收的聚合物含有3HB和LA作为单体单元。

(iv)NMR分析

将(2)所回收的聚合物溶解在氘代氯仿中作为样品，在300MHz下测定¹H-NMR(图5)、¹³C-NMR(图6)、¹H¹H-NMR(图7)和¹³C1H-NMR(图8)。其结果判明了，(2)所回收的聚合物含有3HB和LA作为单体单元，且3HB与LA的比约为94∶6。

<比较例>

分别制作将实施例1所制作的质粒pTV118NPCTC1(ST/QK)AB所含的编码STQK的碱基序列置换成编码下述蛋白质的碱基序列的表达载体。该表达载体的构成汇总示于图9。

pTV118NPCTC(Re)AB：真养产碱杆菌的聚羟基脂肪酸酯合成酶(登录号J05003)

pTV118NPCTC(Bc)AB：蜡状芽孢杆菌的聚羟基脂肪酸酯合成酶(登录号DQ486135)

pTV118NPCTC1(WT)AB：假单胞菌种61-3的聚羟基脂肪酸酯合成酶(野性型、序列号1)

pTV118NPCTC2AB：假单胞菌种61-3的聚羟基脂肪酸酯合成酶2(登录号AB014758)

将使用上述各表达载体转化而得的大肠杆菌JM109接种到包含氨苄青霉素100μg/ml、2％葡萄糖、10mM泛酸的LB培养基100ml中，在37℃培养72小时。收集菌体，使其悬浮到10mM Tris-HCl(pH值7.5)中，再次收集菌体，然后冻结干燥2天。将干燥菌体移入耐压反应管(玻璃制)中，加入氯仿3ml制成悬浮液，在100℃的微量恒温仪中保持3小时，然后冷却至室温，再用0.2μm PTFE过滤器(ADVANTEC)过滤，将氯仿溶液与菌体分离。将滤液移至离心用玻璃试管中，在60℃干燥并蒸馏除去氯仿。将试管内所残留的膜状的聚合物使用己烷洗涤，然后干燥，再溶解到氯仿3ml中，得到聚合物的氯仿溶液。

将所得溶液用0.2μm PTFE过滤器(ADVANTEC社)过滤，通过分离用GPC(制备色谱：LC-9201)分离聚合物级分，蒸馏除去氯仿，获得聚合物。各聚合物的量如下，pTV118NPCTC(Re)AB：131.41mg、pTV118NPCTC(Bc)AB：160.61mg、pTV118NPCTC1(WT)AB：检测不到、pTV118NPCTC2AB：由于极微量而不能定量。

另外，对于pTV118NPCTC(Re)AB和pTV118NPCTC(Bc)的聚合物50μg、以及聚合物总量与实施例1的(3)的(iii)同样的pTV118NPCTC2AB进行GC/MS分析，结果确认了，得到的聚合物均为仅以3HB为构成单体单元的均聚物PHB(图10)。

<实施例2>使用高LA蓄积性微生物进行制造

(1)聚合物的生产

使用实施例1的(1)所制作的pTV118NPCTC1(ST/QK)AB1转化乳酸高蓄积大肠杆菌Jw2293菌株、Jw0885菌株、Jw0886菌株。

将得到的转化体接种到含氨苄青霉素100μg/ml、2％葡萄糖、10mM泛酸的LB培养基1000ml中，在37℃培养72小时。培养之后，在4℃、3,100rpm、15分钟的条件下离心回收菌体，使其悬浮在10mM Tris-盐酸缓冲液(pH值7.5)中，然后再次在同样条件下离心分离，然后冻结干燥2天。

将干燥菌体移至玻璃制耐压反应管中，加入氯仿40ml制成悬浮液，然后在100℃的微量恒温仪中保持3小时，然后冷却至室温，再用0.2μmPTFE过滤器(ADVANTEC)过滤，将氯仿溶液和菌体分离。将滤液移至离心用玻璃试管中，在60℃干燥而蒸馏除去氯仿。将试管内所残留的膜状的聚合物用己烷进行洗涤，并干燥，再溶解于氯仿40ml中得到氯仿溶液。用0.2μm PTFE过滤器(ADVANTEC)过滤，通过分离用GPC(LC-9201)分离聚合物级分。蒸馏除去氯仿而得到聚合物。

回收得到的聚合物的量为802mg(Jw2293)、804mg(Jw0885)、806mg(Jw0886)。另外，聚合物的菌体内含有率(回收得到的聚合物重量相对于培养后的干燥菌体重量的比例)为41％(Jw2293)、50％(Jw0885)、54％(Jw0886)。

(2)聚合物的分析

(i)GPC

在(1)所回收的聚合物约1mg中加入氯仿1mL，将其用0.2μm PTFE过滤器(ADVANTEC)过滤，以过滤得到的溶液为样品，在下述条件下进行GPC测定。

系统：PU-2080Plus system(JASCO)

柱：GPC K-806L(8.0mm inneramete×300mm)

(Shodex)

洗脱液：CHCl₃

流量：0.8mL/分钟

温度：40℃

检测：10A refractive index detector

(JASCO)

进样量：10μL

测得的分子量分布曲线示于图11a～c。分子量校正曲线使用标准聚苯乙烯制成，用标准聚苯乙烯分子量的换算值表示分子量。其结果是，聚合物的分子量(mW)为：来源于Jw2293菌株的聚合物的分子量(Mw)＝28万、Mn＝58,000，来源于Jw0885菌株的聚合物的Mw ＝28万、Mn＝66,000，来源于Jw0886菌株的聚合物的Mw＝28万、Mn＝64,000。另外，Mw/Mn都是4。

(ii)热分析(DSC)

对(2)所回收的聚合物约1mg，使用差示扫描量热计(DSC3100、マツクサイエンス)，在-50℃～210℃：以20℃/分钟上升、210℃～-90℃：以40℃/分钟下降、-90℃：保持5分钟、-90℃～210℃：以20℃/分钟上升的条件下进行分析(图12a～c)。

其结果是，聚合物的Tm为111～163℃。

(iii)GC/MS

将(2)所回收的聚合物约50μg溶解于1mL的氯仿中制成溶液，将该溶液250μL、乙醇850μL、盐酸100μL在玻璃制耐压反应管中混合，在100℃的微量恒温仪中进行乙醇解处理3小时。在冷却至室温之后，加入含0.65M磷酸和0.9M NaCl的溶液1ml和250mM磷酸溶液500μL并混合，将pH值调节至中性，然后在室温、1,200rpm、5分钟的条件下离心，将水层与氯仿层分离。取氯仿层，用分子筛进行脱水，作为GC分析用样品。

GC/MS分析在下述条件下进行。

GC系统：Shimadzu GC 2010

MS系统：GC/MS-QP2010

柱：NEUTRA-BOND-1(0.25mm×3000mm)

载气：He

气体流量：30.0mL/分钟

检测器温度：310℃

进样器温度：250℃

柱温箱温度：100℃

柱升温速度：8℃/分钟

进样量：1μL

将上述条件下的分析结果和乳酸乙酯的MS光谱示于图13a～c。根据GC/MS的结果，确认了(2)所回收的聚合物包含3HB和LA作为单体单元。

(iv)NMR分析

将(2)所回收的聚合物溶解于氘代氯仿中作为样品，在300MHz下测定¹H-NMR(图14a～c)和¹³C-NMR(图15a～c)。其结果判明了，(2)所回收的聚合物包含3HB和LA作为单体单元，3HB与LA的比为约32∶68(Jw2293)、约30∶70(Jw0885)、约32∶68(Jw0886)。

<实施例3>通过在厌氧条件下培养来制造共聚聚酯

(1)载体的构建

以实施例1的(1)所制作的pTV118NPCTC1(ST/QK)AB为模板，进行PCR以获得除去了编码βKT的基因和编码AACoA-R的基因的直链状质粒，使得到的扩增片段环化，从而制成在pTV118N中具有编码Pct的基因和编码PhaCm的基因的质粒pTV118NpctC1(ST/QK)(图16左)。

将实施例1的(1)所制作的pGEMC1AB用限制性酶BamHI消化，将所得的约3,200碱基对的DNA片段、与将作为低拷贝质粒的pACYC177DNA用限制性酶BamHI消化而得的直链状载体质粒连接，从而获得在pACYC177DNA的BamHI位点导入了编码βKT的基因和编码AACoA-R的基因的质粒pACYC177AB，示于(图16右)。

(2)聚合物的制造

使用pTV118NPCTC1(ST/QK)和pACYC177AB转化大肠杆菌W3110株。

将得到的转化体接种到含氨苄青霉素100μg/ml、2％葡萄糖、10mM泛酸的LB培养基100ml中，在37℃培养72小时。培养之后，在4℃、3,100rpm、15分钟的条件下离心并回收菌体，使其悬浮在10mM Tris-盐酸缓冲液(pH值7.5)中，然后再次在同样条件下离心分离，然后冻结干燥2天。

将干燥菌体移至玻璃制耐压反应管中，加入氯仿60ml制成悬浮液，然后在100℃的微量恒温仪中保持3小时，然后冷却至室温，再用0.2μmPTFE过滤器(ADVANTEC)过滤，将氯仿溶液和菌体分离。将滤液移入离心用玻璃试管中，在60℃干燥而蒸馏除去氯仿。将试管内所残留的膜状的聚合物使用己烷进行洗涤，并干燥，再溶解于氯仿60ml中得到氯仿溶液。将该溶液用0.2μm PTFE过滤器(ADVANTEC)过滤，通过分离用GPC(LC-9201)来分离聚合物级分。蒸馏除去氯仿而得到聚合物。

回收得到的聚合物的量为1228mg。另外，聚合物的菌体内含有率(回收得到的聚合物重量相对于培养后的干燥菌体重量的比例)为2.3％。

(3)聚合物的分析

(i)GPC

在(2)所回收的聚合物约1mg中加入氯仿1mL，将其用0.2μm PTFE过滤器(ADVANTEC)过滤得到溶液，以所得溶液为样品，在下述条件下进行GPC测定。

系统：PU-2080Plus system(JASCO)

柱：GPC K-806L(8.0mm inneramete×300mm)

(Shodex)

洗脱液：CHCl₃

流量：0.8mL/分钟

温度：40℃

检测：10A refractive index detector

(JASCO)

进样量：10μL

测得的分子量分布曲线示于图17。分子量校正曲线使用标准聚苯乙烯制成，用标准聚苯乙烯分子量的换算值表示分子量。其结果是，聚合物的分子量(Mw)为28,000，Mn为22,000，Mw/Mn为1.5。

(ii)热分析(DSC)

对(2)所回收的聚合物约1mg，使用差示扫描量热计(DSC3100、マツクサイエンス)，在-50℃～210℃：以20℃/分钟上升、210℃～-90℃：以40℃/分钟下降、-90℃：保持5分钟、-90℃～210℃：以20℃/分钟上升的条件下进行分析(图18)。

其结果是，聚合物的熔点(Tm)为157.0～161.4℃。

(iii)GC/MS

将(2)所回收的聚合物约50μg溶解于1mL的氯仿中得到溶液，将该溶液250μL、乙醇850μL、盐酸100μL在玻璃制耐压反应管中混合，在100℃的微量恒温仪中进行乙醇解处理3小时。在冷却至室温之后，加入含0.65M磷酸和0.9M NaCl的溶液1ml和250mM磷酸溶液500μL并混合，将pH值调节至中性，然后在室温、1,200rpm、5分钟的条件下离心，将水层和氯仿层分离。取氯仿层，用分子筛进行脱水，制成GC分析用样品。

GC/MS分析在下述条件下进行。

GC系统：Shimadzu GC 2010

MS系统：GC/MS-QP2010

柱：NEUTRA-BOND-1(0.25mm×3000mm)

载气：He

气体流量：30.0mL/分钟

检测器温度：310℃

进样器温度：250℃

柱温箱温度：100℃

柱升温速度：8℃/分钟

进样量：1μL

上述条件下的分析结果和乳酸乙酯的MS光谱示于图19。根据GC/MS的结果确认了，(2)所回收的聚合物包含3HB和LA作为单体单元。

(iv)NMR分析

将(2)所回收的聚合物溶解于氘代氯仿中作为样品，在300MHz下测定¹H-NMR(图20)、¹³C-NMR(图21)和¹H¹³C-NMR(图22)。其结果判明了，(2)所回收的聚合物包含3HB和LA作为单体单元，3HB与LA的比为约53∶47。

<实施例4>以3HB、LA和3HV为单体单元制造共聚聚酯

(1)聚合物的生产

使用实施例1所制作的pTV118NPCTC1(ST/QK)AB转化乳酸高蓄积大肠杆菌菌株Jw0885。将得到的转化体接种在含氨苄青霉素100μg/ml、2％葡萄糖、10mM泛酸、0.5％丙酸钠的LB培养基(示于表1)100ml中，在30℃培养72小时。将该培养物在4℃、3,100rpm、15分钟的条件下离心并回收菌体，使其悬浮在10mM Tris-盐酸缓冲液(pH值7.5)中，然后再次在同样条件下离心分离，然后冻结干燥2天。

将干燥菌体移至玻璃制耐压反应管中，加入氯仿5ml制成悬浮液，然后在60℃的微量恒温仪中保持48小时，然后冷却至室温，再用0.2μm PTFE过滤器(ADVANTEC)过滤，将氯仿溶液和菌体分离。接着在滤液中加入100ml甲醇，使聚合物析出。将析出的聚合物用0.2μm PTFE过滤器(ADVANTEC)过滤，得到聚合物。

回收得到的聚合物的量为12mg。另外，聚合物的菌体内含有率(回收得到的聚合物重量相对于培养后的干燥菌体重量的比例)为8.5％。

(2)聚合物的分析

(i)HPLC分析

在回收得到的聚合物约10mg中加入1N氢氧化钠500μl，在100℃加热3小时进行水解。反应之后加入1N盐酸500μl中和，用0.2μm PTFE过滤器(ADVANTEC)过滤，将过滤得到的滤液作为检测液，在下述条件下进行HPLC分析。

系统：PU-2089Plus system(JASCO)

柱：Aminex HPX-87H(7.8mm inneramete×300mm)

(Shodex)

洗脱液：0.014N硫酸-20％乙腈

流量：0.5mL/分钟

温度：60℃

检测：AS-2055(JASCO)

进样量：10μL

标准曲线使用单体组成已知的聚乳酸(LA 100mol％)和聚[羟基丁酸(HB)-co-羟基戊酸(HV)-co-羟基己酸(HHx)](HB：70mol％、HV：23mol％、HHx：7mol％)制成。

其结果(图23～25)确认了，得到的聚合物包含40mol％左右的乳酸、48mol％左右的3-羟基丁酸、11mol％左右的3-羟基戊酸。

本说明书中所引用的所有出版物、专利和专利申请均直接作为参考而包含在本说明书中。