JP2002534981A

JP2002534981A - ポリ（３−ヒドロキシ−ブチレート−コ−３−ヒドロキシヘキサノエートの製造のためのトランスジェニック系

Info

Publication number: JP2002534981A
Application number: JP2000594931A
Authority: JP
Inventors: ララマディソン，; グジャルトダブリュー．ヒューズマン，; オリバーピー．ピープルズ，
Original assignee: メタボリックス，インコーポレイテッド
Priority date: 1999-01-22
Filing date: 2000-01-21
Publication date: 2002-10-22
Anticipated expiration: 2020-01-21
Also published as: DE60042413D1; AU2623100A; US20100311131A1; US20040172675A1; US20020040485A1; US7504556B2; JP4986325B2; AU778497B2; ES2344000T3; WO2000043523A3; EP1208208B1; CA2360801A1; US8049065B2; EP2088198A2; CA2360801C; EP1208208A2; WO2000043523A2; ATE434045T1; EP2088198A3; US7455999B2

Abstract

(57)【要約】コモノマーとして３−ヒドロキシヘキサノエートを含むポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）を合成するトランスジェニック生物を操作するための方法が、開発された。これらのプロセスは、遺伝子操作された細菌に基づくか、またはＰＨＡ生産者由来のＰＨＡ生合成遺伝子を含む生成系としての植物作物における。この方法の好ましい実施形態において、更なる遺伝子が、野生型またはトランスジェニックポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）生産者に導入され、それによって、ＰＨＡに組み込まれる３ＨＨモノマーを合成する新しい株を作製する。３ＨＨモノマーは、好ましくは、３−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡの前駆体である、ブタノールまたはブチレートを供給材料として使用する微生物系において誘導される。ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性を特異的に含む、ブチロイル−ＣｏＡのインビボ生産のための経路を、提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の背景）本発明は、概して、ポリヒドロキシアルカノエート材料の分野に関し、そして
より詳細には、その生産の改善された方法に関する。

【０００２】ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）は、天然の熱可塑性のポリエステル
であり、そして莫大な種々の適用（消費者向け包装、使い捨てのダイヤパー（ｄ
ｉａｐｅｒ）裏打ち、ゴミ袋、食品向け製品および医療向け製品を含む）におい
て使用するための従来のポリマー技術によって処理され得る。ポリヒドロキシア
ルカノエートを天然で産生する微生物からＰＨＡポリマーを産生するために使用
され得る方法は、米国特許第４，９１０，１４５（Ｈｏｌｍｅｓら）；Ｂｙｒｏ
ｍ、「ＭｉｓｃｅｌｌａｎｅｏｕｓＢｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ」、Ｂｉｏｍａ
ｔｅｒｉａｌｓ（Ｂｙｒｏｍ編）３３３−５９頁（ＭａｃＭｉｌｌａｎＰｕｂ
ｌｉｓｈｅｒｓ、Ｌｏｎｄｏｎ１９９１）；ＨｏｃｋｉｎｇおよびＭａｒｃｈｅ
ｓｓａｕｌｔ、「Ｂｉｏｐｏｌｙｅｓｔｅｒｓ」、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄ
ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆＢｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅＰｏｌｙｍｅｒ
ｓ（Ｇｒｉｆｆｉｎ編）４８−９６頁（Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ、Ｌｏｎ
ｄｏｎ１９９４）；Ｈｏｌｍｅｓ、「ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙＰｒｏｄｕ
ｃｅｄ（Ｒ）−３−ｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅＰｏｌｙｍｅｒｓａ
ｎｄＣｏｐｏｌｙｍｅｒｓ」、ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓｉｎＣｒｙｓｔ
ａｌｌｉｎｅＰｏｌｙｍｅｒｓ（Ｂａｓｓｅｔｔ編）第２巻、１−６５頁（Ｅ
ｌｓｅｖｉｅｒ、Ｌｏｎｄｏｎ１９８８）；Ｌａｆｆｅｒｔｙら、「Ｍｉｃｒ
ｏｂｉａｌＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆＰｏｌｙ−ｂ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕ
ｔｙｒｉｃａｃｉｄ」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＲｅｈｍおよびＲｅｅ
ｄ編）第６６巻、１３５−７６頁（Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ、
Ｗｅｉｎｈｅｉｍ１９８８）；ＭｕｅｌｌｅｒおよびＳｅｅｂａｃｈ、Ａｎｇ
ｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３２．４７７−５０２（１９９３）
に記載されている。ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）の産生のための天然の
生合成経路を図１に示す。

【０００３】天然または遺伝子操作された生物においてＰＨＡを産生するための方法は、Ｓ
ｔｅｉｎｂｕｅｃｈｅｌ、「ＰｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏｉｃＡｃｉ
ｄ」、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ（Ｂｙｒｏｍ編）１２３−２１３頁（ＭａｃＭ
ｉｌｌａｎＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｌｏｎｄｏｎ１９９１）；Ｗｉｌｌｉａ
ｍｓおよびＰｅｏｐｌｅｓ、ＣＨＥＭＴＥＣＨ、２６：３８−４４（１９９６）
；ＳｔｅｉｎｂｕｅｃｈｅｌおよびＷｉｅｓｅ、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３７：６９１−９７（１９９２）；米国特許第５，
２４５，０２３号；同第５，２５０，４３０号；同第５，４８０，７９４号；同
第５，５１２，６６９号；同第５，５３４，４３２号（ＰｅｏｐｌｅｓおよびＳ
ｉｎｓｋｅｙ）（これらはまた、レダクターゼ、チオラーゼ、およびＰＨＢポリ
メラーゼをコードする遺伝子を開示および請求している）；Ａｇｏｓｔｉｎｉら
、Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．、ＰａｒｔＡ−１、９：２７７５−８７（１９７１）
；Ｇｒｏｓｓら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、２１：２６５７−６８（１９
８８）；Ｄｕｂｏｉｓら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、２６：４４０７−１
２（１９９３）；ＬｅＢｏｒｇｎｅおよびＳｐａｓｓｋｙ、Ｐｏｌｙｍｅｒ、
３０：２３１２−１９（１９８９）；ＴａｎａｈａｓｈｉおよびＤｏｉ、Ｍａｃ
ｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、２４：５７３２−３３（１９９１）；Ｈｏｒｉら、Ｍ
ａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、２６：４３８８−９０（１９９３）；Ｋｅｍｎｉ
ｔｚｅｒら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、２６：１２２１−２９（１９９３
）；Ｈｏｒｉら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、２６：５５３３−３４（１９
９３）；ＨｏｃｋｉｎｇおよびＭａｒｃｈｅｓｓａｕｌｔ、Ｐｏｌｙｍ．Ｂｕｌ
ｌ．、３０：１６３−７０（１９９３）；Ｘｉｅら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌ
ｅｓ、３０：６９９７−９８（１９９７）；ならびに米国特許第５，５６３，２
３９号（Ｈｕｂｂｓら）によって記載されている。ＰＨＡの産生のための一般的
な経路を図２に示す。対応するラクトンの直接縮合および開環重合を含む合成ポ
リマーの合成アプローチは、ＪｅｓｕｄａｓｏｎおよびＭａｒｃｈｅｓｓａｕｌ
ｔ、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ２７：２５９５−６０２（１９９４）；米
国特許第５，２８６，８４２号（Ｋｉｍｕｒａ）；米国特許第５，５６３，２３
９号（Ｈｕｂｂｓら）；米国特許第５，５１６，８８３号（Ｈｏｒｉら）；米国
特許第５，４６１，１３９号（Ｇｏｎｄａら）；およびカナダ国特許出願第２、
００６、５０８号において記載されている。ＷＯ９５／１５２６０は、ポリ（３
−ヒドロキシブチレート−コ−３−ヒドロキシバレレートｐｏｌｙ（３−ヒドロ
キシブチレート−ｃｏヒドロキシバレレート）（ＰＨＢＶ）フィルムの製造を記
載し、そして米国特許第４，８２６，４９３号および同第４，８８０，５９２号
（Ｍａｒｔｉｎｉら）は、ＰＨＢおよびＰＨＢＶのフィルムの製造を記載する。
米国特許第５，２９２，８６０号（Ｓｈｉｏｔａｎｉら）は、ＰＨＡコポリマー
であるポリ（３−ヒドロキシブチレート−コ−３−ヒドロキシヘキサノエート）
（ＰＨＢＨＨ）の製造を記載する。

【０００４】今日まで、ＰＨＡは、限定されて市販されており、コポリマーＰＨＢＶのみが
進展された量で利用可能である。このコポリマーは、細菌Ｒａｌｓｔｏｎｉａ
ｅｕｔｒｏｐｈａの醗酵によって生産されている。他のＰＨＡの生産のための醗
酵プロセスが開発されている（ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＰｅｏｐｌｅｓ、ＣＨＥ
ＭＴＥＣＨ２６：３８−４４（１９９６））。植物の作物もまた、これらのポ
リマーを生産するために遺伝子操作されており、植物油とも遜色ない費用構造お
よび石油ベースのポリマーに対する直接の費用競争力を提供する（Ｗｉｌｌｉａ
ｍｓおよびＰｅｏｐｌｅｓ、ＣＨＥＭＴＥＣＨ２６：３８−４４（１９９６）
）。

【０００５】いくつかの因子が、ＰＨＡの経済的な生物学的生産に重要である。これは、基
質の費用、醗酵時間、および下流の処理の効率を含む。日用品の大規模発酵につ
いて、一般に、プラスミドベースの系では、プラスミドを維持する過剰な負担お
よび安定な発現を維持する際の問題に起因して、満足行かないものであることが
知られている。

【０００６】３−ヒドロキシ−コ−ヒドロキシアルカノエート（３Ｈ−コ−ＨＨ）を含むＰ
ＨＡの産生のための公知の生物学的系では非効率的である。例えば、Ｓｈｉｍａ
ｍｕｒａら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、２７：８７８（１９９４）は、Ａ
ｅｒｏｍｏｎａｓｃａｖｉａｅが、オリーブ油またはＣ１２〜Ｃ１８の脂肪酸
上で増殖させる場合に３−ヒドロキシブチレートおよび３−ヒドロキシヘキサノ
エート（３ＨＨ）から構成されるＰＨＡを合成することを開示する。３ＨＨモノ
マーの部分は、炭素源の濃度および醗酵時間に依存して決定され、そして２５％
のレベルの量であり得る（Ｄｏｉら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、２８：４
８２２（１９９５））。３ＨＨ基質レベルの増加の結果として、そのＰＨＡの結
晶性、融点およびガラス転移温度が減少する。物理的特性におけるこれらの変化
は、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｆａｅｃａｌｉｓ由来のＰＨＢデポリメラーゼに
よる分解に対する感受性の増加をもたらす。ＰＨＢコポリマーにおける低レベル
の３ＨＨを取り込む他の天然の微生物は、Ｃｏｍａｍｏｎａｓｔｅｓｔｏｓｔ
ｅｒｏｎｉおよびＢａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓである（Ｈｕｉｓｍａｎら、
Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５５：１９４９（１９８９）
；Ｃａｂａｌｌｅｒｏら、Ｉｎｔ．ＪＢｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．、１７：
８６（１９９５））。ＴｈｉｏｃａｐｓｉａｐｆｅｎｉｇｉｉまたはＣｈｒｏ
ｍａｔｉｕｍｖｉｎｏｓｕｍのいずれか由来のｐｈｂ遺伝子が導入された組換
えＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａＧＰｐ１０４株もまた、主要成分と
して、３−ヒドロキシヘキサノエートを有するＰＨＡを蓄積した。

【０００７】ＰＨＡは、一般に、以下のポリマー組成物に基づいて２つのクラスに分類され
る：短い側鎖のＰＨＡおよび長い側鎖のＰＨＡ。一方の群由来のモノマーの他方
に属するＰＨＡの組込みは、通常、低レベルに限定される。モノマーが両方のＰ
ＨＡについて豊富にあるいくつかの場合において、その細菌は、一般に、別個の
ＰＨＡ顆粒を産生する。この顆粒は各々、１つの型のＰＨＡを含む。従って、Ｐ
ＨＡポリメラーゼの基質特異性は、短い側鎖（Ｃ₄およびＣ₅）について、または
中程度の側鎖（Ｃ₈〜Ｃ₁₀）について、最適であるように一般化され得る。個々
の微生物によって合成されるＰＨＡの組成物に基づいて、３−ヒドロキシヘキサ
ノエートを取り込むＰＨＡポリメラーゼが同定され得る。従って、Ａ．ｃａｖｉ
ａｅ、Ｃ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉおよびＴ．ｐｆｅｎｉｇｉｉ由来のＰＨＡ
ポリメラーゼは、ＰＨＡへ３−ヒドロキシヘキサノエートを取り込むことについ
て公知であるが、他方、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、
ＳｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓｎａｔａｎｓおよびＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｓｐ
．由来の酵素は、３−ヒドロキシバレレートについて優先性を有する。後者の生
物由来のＰＨＡポリメラーゼはまた、Ｃ₄を超えるＣ₅についてのそれらの優先性
に起因して、ＰＨＢ−コ−ＨＨコポリマーを作製するにおいて有用である。しか
し、不幸にも、これらの細菌は、一般に、低増殖速度を有し、しばしば、破壊し
て開口することが困難で、そして遺伝子操作に対して限定された受容性のみを有
する。従って、効率よく、より費用効果のある、生物学的系による３Ｈ−コ−Ｈ
Ｈを含むＰＨＡの産生方法を開発することが所望される。

【０００８】従って、本発明の課題は、３−ヒドロキシヘキサノエートモノマー（ＨＨＰＨ
Ａ）を含むポリヒドロキシアルカノエートポリマーの産生のための遺伝子操作さ
れた系を提供することである。

【０００９】本発明の別の課題は、ブチレートもしくはブタノールのようなより経済的な原
料からの３−ヒドロキシヘキサンモノマーを産生するために使用され得る有意な
変異を提供することである。

【００１０】本発明のさらなる課題は、炭化水素の原料に由来する細胞性代謝物を、３−ヒ
ドロキシヘキサノエートコモノマーの産生のためのブチリル−ＣｏＡへと変換す
るために適切な遺伝子を提供することである。

【００１１】本発明の別の課題は、３−ヒドロキシヘキサノエートをコモノマーとして含有
するＰＨＡを産生するための改善された方法を提供することである。

【００１２】本発明のなお別の課題は、３−ヒドロキシヘキサノエートモノマーの内因生合
成のための生物学的系における新たな経路を提供することである。

【００１３】本発明のさらなる課題は、発現が充分かつ安定である、３−ヒドロキシヘキサ
ノエートを含むＰＨＡの産生のための、遺伝子操作された生物学的系を提供する
ことである。

【００１４】（発明の要旨）３−ヒドロキシ−コ−ヒドロキシヘキサノエート（３Ｈ−コ−ＨＨ）を含むＰ
ＨＡの産生のための生物学的系が、より速い増殖速度を有するトランスジェニッ
ク生物を用いること、および／またはこれらの生物を遺伝子操作して、より安価
な原料（例えば、ブチレートまたはブタノール）から、あるいは、その細胞性中
間体をブチルル−ＣｏＡへと変換し、それによってトランスジェニック生物を使
用してＰＨＡ産生の費用を改善し得る酵素をコードする遺伝子を取り込むことに
よってグルコースから直接、コモノマー３−ヒドロキシヘキサン酸を生成するこ
とによって改善され得ることが発見された。これらの過程は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａｃｏｌｉのような遺伝子操作された細菌に基づくか、またはＲ．ｅｕｔ
ｒｏｐｈａおよびＰ．ｐｕｔｉｄａのようなＰＨＡ産生体由来のＰＨＡ生合成遺
伝子を含む産生系のような植物作物に基づく。この方法の好ましい実施形態にお
いて、さらなる遺伝子は、トランスジェニックＰＨＢプロデューサーに導入され
、それによって、ＰＨＡに取り込まれる３ＨＨのようなモノマーを合成する新た
な株を作製する。

【００１５】この方法の好ましい実施形態において、貯蔵ポリマーＰＨＡを通常産生しない
微生物を遺伝子操作して、ＰＨＡシンターゼ遺伝子および以下をコードする遺伝
子からなる群より選択されるさらなる導入遺伝子を導入することによってＰＨＡ
を生成する：β−ケトチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ、β−
ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼおよびβ−ヒ
ドロキシアシル−ＡＣＰ−補酵素Ａトランスフェラーゼ。これらの遺伝子は、好
ましくは、３ＨＨポリマーの産生のために有利である、コードされる酵素の基質
特性に基づいて選択される。より経済的な原料（例えば、ブチレートまたはブタ
ノール）から３−ヒドロキシヘキサンモノマーを産生するために使用され得る有
用な変異が記載される。これらの変異は、当業者に公知の標準的な技術によって
記載される本発明を実施するために適切な細菌において容易に生成され得る。

【００１６】３−ヒドロキシヘキサノエートをコモノマーとして含むＰＨＡを合成するトラ
ンスジェニック生物を操作するための方法が開発された。これらの系の好ましい
実施形態において、この方法を使用して、以下のいずれかを操作する：（１）Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ
ｅｕｔｒｏｐｈａ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｌａｔｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓｐｕｔｉｄａまたはＰＨＡを合成し得る他の微生物のような細菌、ある
いは（２）油作物の種（例えば、Ｂｒａｓｓｉｃａ、ヒマワリ、ダイズ、トウモ
ロコシ、ベニバナ、アマ、パームまたはココヤシ）またはデンプン蓄積植物（例
えば、ポテト、タピオカ、またはキャッサバ）のような、高等植物。これらをス
クリーニングして、代謝中間体を、Ｒ−３−ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡへの
変化のために所望される酵素活性（特にブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性お
よびアシルＣｏＡ：ＡＣＰトランスフェラーゼ活性）を同定する。後者の変換は
、単一のタンパク質によるか、またはチオエステラーゼおよびアシルＣｏＡシン
ターゼ活性の組合せによるかのいずれかで触媒される。通常の細胞代謝物の、３
−ヒドロキシヘキサノエートへのフラックスは、３つの異なる経路の１つ以上を
介して再配向される。これらの３つの経路は、３−ヒドロキシヘキサノエートを
、以下のいずれかにより生成する：（１）Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍａｃｅｔｏ
ｂｕｔｙｌｉｃｉｕｍ由来のブチレート醗酵経路を用いる、（２）Ｅ．ｃｏｌｉ
由来の脂肪酸生合成経路を用いる、または（３）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕ
ｔｉｄａ由来の脂肪酸酸化複合体を用いること。導入遺伝子由来の機能的ＰＨＡ
シンターゼを発現する細菌、およびトランスジェニック植物作物におけるこれら
の遺伝子を発現するための方法が記載されることを実施例が実証する。

【００１７】クロトニルＣｏＡをブチリルＣｏＡへと変換する酵素をコードする遺伝子を選
択する方法、ならびにＰＨＡ生合成のために、アシルＡＣＰ中間体をアシルＣｏ
Ａへ、またはアシルＣｏＡ前駆体へと変換する酵素を同定するスクリーニング方
法が提供される。ＰＨＡポリメラーゼをコードする遺伝子が染色体に組み込まれ
、そしてＰＨＡ合成を支持するレベルにまで発現されるトランスジェニックＥ．
ｃｏｌｉ株が提供される。そのようなトランスジェニック株（これはまた、染色
体における特異的な変異を有する）は、異なる生物学的供給源からゲノムライブ
ラリーを用いてこれらの活性の選択およびスクリーニングを可能にする。

【００１８】３−ヒドロキシヘキサノエートモノマーの内因生合成のための生物学的系にお
ける新たな経路を操作するための方法が記載される。好ましい実施形態において
、Ｅ．ｃｏｌｉは、細胞代謝物を、３−ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡへと変換
する酵素をコードする遺伝子をＥ．ｃｏｌｉに導入することによって、唯一の炭
素源として、安価な炭化水素供給源（例えば、グルコース、スクロース、キシロ
ース、およびラクトース）またはそのような炭化水素および脂肪酸の混合物のい
ずれかからＰＨＢＨを合成するように操作される。組換えＥ．ｃｏｌｉ株におけ
る効率よいＰＨＡ合成のために、その経路に関与する遺伝子のすべての発現が適
切であることが重要である。この目的のために、目的の遺伝子がプラスミドのよ
うな、内因的にコピー数効果および結果的に高発現レベルを生じる染色体外ＤＮ
Ａ分子から発現され得るか、またはそれらの遺伝子は、染色体から発現され得る
。日用品の大規模醗酵のために、一般に、プラスミドベースの系は、そのプラス
ミドを維持することの過度の負担および安定な発現の問題に起因して、満足行か
ないことが知られている。これらの欠点は、染色体にコードされた酵素を用いる
か、ならびに／または目的の遺伝子に先行する転写シグナルおよび翻訳シグナル
を、改善して、発現を充分かつ安定にすることによって、克服され得る。

【００１９】（発明の詳細な説明）任意のＨＡ産生生物の代謝（細菌および植物作物を含む）は、代謝操作によっ
てＰＨＡ合成についての特異的代謝物を供給するように再配向され得る。このア
プローチを有効にするために、共通の代謝中間体から所望のモノマーへと導く新
たな生物学的経路を開発することが必要である。そのような経路は、１つの生物
に存在することは必要ではない。なぜなら、個々の工程は、遺伝子操作技術を用
いて選択された産生生物において再構成され得るからである。補完された原料に
由来する代替のモノマーを取り込むように開発されたプロセスは、特定の欠点を
有する。第一に、醗酵槽に補完的原料を加えることは費用が高い。なぜなら、そ
れらは、インフラストラクチャを拡張し、そしてさらなる品質管理を課すからで
ある。第二に、原料におけるモノマー前駆体の添加は厳密に管理されて、モノマ
ープールおよびＰＨＡ組成物の安定な組成を達成する必要があるからである。

【００２０】従って、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ、Ｃ．Ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ、Ａ．ｌａｔ
ｕｓ、Ａ．ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉおよびＰ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓのよう
な生物、ならびに異種遺伝子（単数または複数）からのＰＨＡシンターゼを発現
するトランスジェニックの微生物および植物作物の系においてＰＨＢＨを産生さ
せることを可能にする、代謝操作方法における類似のアプローチが開発されてき
た。

【００２１】（Ｉ．ポリヒドロキシアルカノエート）いくつかの型のＰＨＡが公知である。それらの側鎖の長さおよび生合成のため
のそれらの経路に従って、２つのグループへとＰＨＡを大まかに分けることが有
用である。短い側鎖を有するもの（例えば、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ
）、Ｒ−３−ヒドロキシ酪酸単位のホモポリマー）は、結晶性で熱可塑性であり
；長い側鎖を有するＰＨＡは、よりエラストマー性である。前者のポリマーは、
約７０年間知られている（ＬｅｍｏｉｇｎｅおよびＲｏｕｋｈｅｌｍａｎ１９
２５）が、後者のポリマーは、比較的最近の発見である（ｄｅＳｍｅｔら、Ｊ．
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１５４：８７０−７８（１９８３））。しかし、この命
名の前に、Ｒ−３−ヒドロキシ酪酸単位およびＣ５〜Ｃ１６のより長い側鎖の両
方を含む単位微生物起源のＰＨＡが同定されていた（ＷａｌｌｅｎおよびＲｏｗ
ｈｅｄｅｒ、Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．、８：５７６−７９（
１９７４））。Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸、および１つ以上の、５〜１６炭素原子
を含む長い側鎖のヒドロキシ酸単位のコポリマーを産生する多数の細菌がより最
近になって同定された（ＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌおよびＷｉｅｓｅ、Ａｐｐｌ．
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３７：６９１−９７（１９９２
）；Ｖａｌｅｎｔｉｎら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌ．、３６：５０７−１４（１９９２）；Ｖａｌｅｎｔｉｎら、Ａｐｐｌ．Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、４０：７１０−１６（１９９４）；
Ａｂｅら、Ｉｎｔ．ＪＢｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．、１６：１１５−１９（
１９９４）；Ｌｅｅら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
．、４２：９０１−０９（１９９５）；Ｋａｔｏら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、４５：３６３−７０（１９９６）；Ｖａｌｅｎ
ｔｉｎら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、４６：２
６１−６７（１９９６）；米国特許第４，８７６，３３１号（Ｄｏｉ））。特異
的な２成分コポリマーの有用な例は、ＰＨＢ−コ−３−ヒドロキシヘキサノエー
トが挙げられる（Ｂｒａｎｄｌら、Ｉｎｔ．ＪＢｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．
、１１：４９−５５（１９８９）；ＡｍｏｓおよびＭｃＩｎｅｒｅｙ、Ａｒｃｈ
．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１５５：１０３−０６（１９９１）；米国特許第５，
２９２，８６０号（Ｓｈｉｏｔａｎｉら））。他の代表的なＰＨＡは、Ｓｔｅｉ
ｎｂｕｅｃｈｅｌおよびＶａｌｅｎｔｉｎ、ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌ
ｅｔｔ．、１２８：２１９−２８（１９９５）に記載されている。化学合成方法
もまた適用されて、適用試験のために、この型のラセミＰＨＢコポリマーが調製
されている（ＰＣＴＷＯ９５／２０６１４、ＰＣＴＷＯ９５／２０６１
５、およびＰＣＴＷＯ９６／２０６２１）。

【００２２】このポリマーの有用な分子量は、約１０、０００ダルトンと４、０００、００
０ダルトンとの間であり、そして好ましくは、約５０、０００ダルトンと１、５
００、０００ダルトンとの間である。ＰＨＡは、好ましくは、以下の式の１つ以
上の単位を含む： −ＯＣＲ¹Ｒ²（ＣＲ³Ｒ⁴）_nＣＯ− ここで、ｎは０であるか整数であり；そしてＲ¹、Ｒ²、Ｒ³およびＲ⁴は、独立して、飽和および不飽和の、炭化水素ラジカ
ル、ハロ置換ラジカルおよびヒドロキシ置換ラジカル、ヒドロキシラジカル、ハ
ロゲンラジカル、窒素置換ラジカル、酸素置換ラジカルおよび水素原子から選択
される。

【００２３】モノマー単位は、一般に、ヒドロキシブチレート、ヒドロキシバレレート、ヒ
ドロキシヘキサノエート、ヒドロキシヘプタノエート、ヒドロキシオクタノエー
ト、ヒドロキシノナノエート、ヒドロキシデカノエート、ヒドロキシウンデカノ
エート、およびヒドロキシドデカノエートの単位を包含する。ＰＨＡは、モノマ
ーおよびポリマーならびに３−ヒドロキシ酸、４−ヒドロキシ酸および５−ヒド
ロキシ酸の誘導体を包含し得る。

【００２４】（ＩＩ．ポリヒドロキシアルカノエートの調製の方法）ＰＨＡは、生物学的供給源（例えば、天然にＰＨＡを産生し、そして培養条件
および原料の操作によって所望のＰＨＡを産生するように誘導され得る微生物、
本明細書において記載されるように遺伝子操作されたこれらまたは他の微生物、
あるいはＰＨＡを産生するように遺伝子操作された植物のような高等生物）から
調製され得る。

【００２５】（ＰＨＡ合成のために必要とされる酵素の基質特異性）ＰＨＡシンターゼ遺伝子の適切な供給源は、当業者に周知な方法によって脂肪
酸で増殖される場合に産生されるＰＨＡの組成を分析すること、次いでＰＨＡシ
ンターゼ遺伝子を単離することによって容易に同定される。有用なＰＨＡシンタ
ーゼ遺伝子は、例えば、以下から単離されている：Ａｅｒｏｍｏｎａｓｃａｖ
ｉａｅ（ＦｕｋｕｉおよびＤｏｉ、ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：４８２１
−３０（１９９７））、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍｒｕｂｒｕｍ（米国特
許第５，８４９，８９４号）、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｒｕｂｅｒ（Ｐｉｅｐ
ｅｒおよびＳｔｅｉｎｂｕｅｃｈｅｌ、ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅ
ｔｔ．９６（ｌ）：７３−８０（１９９２））、ならびにＮｏｃａｒｄｉａｃ
ｏｒａｌｌｉｎａ（Ｈａｌｌら、Ｃａｎ．ＪＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４：６
８７−９１（１９９８））。

【００２６】ＰＨＢポリメラーゼについてのインビトロ研究は、Ｚ．ｒａｍｉｇｅｒａＩ
−１６−Ｍ由来の酵素が、３−ヒドロキシ−ブチリルＣｏＡのＲ異性体に対して
厳密に特異的であることが示されている（Ｆｕｋｕｉら、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ．、１１０：１４９（１９７６））。Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ由来のＰＨ
Ｂポリメラーゼは、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡモノマーについて高度に特異
的であり、そして３−ヒドロキシバレリルＣｏＡに対して７．５％のみの活性を
示す。３−ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡまたはより長い３−ヒドロキシアシル
ＣｏＡでは、インビトロ研究において、活性は検出されなかった（Ｈａｙｗｏｏ
ｄら、ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．、５７：１（１９８９））。

【００２７】Ｚ．ｒａｍｉｇｅｒａ由来のＮＡＤＰＨ結合アセトアセチルＣｏＡ還元酵素は
、アセトアセチルＣｏＡで最も活性であるが、一方、３−ケトバレリルＣｏＡ（
最大活性の４１％）および３−ケトヘキサノイルＣｏＡ（０．６％）もまた、こ
の酵素に対する基質であった（Ｐｌｏｕｘら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、
１７４：１７７（１９８８））。Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａにおいて、３−ケトバレ
リルＣｏＡおよび３−ケトヘキサノイルＣｏＡについての還元酵素活性は、アセ
トアセチルＣｏＡについて決定された活性のそれぞれ４８％および３．６％であ
る（Ｈａｙｗｏｏｄら、ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．、５２：２
５９（１９８８））。さらに、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａは、Ｃ₄基質およびＣ₈基質
について最も高いＳ−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡ活性に対してＮＡＤＨ依存
性の活性を有する。

【００２８】Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａはまた、アセトアセチルＣｏＡ基質に対して最も高い活
性および３−ケトバレリルＣｏＡ基質に対して最大の活性の３％のみを有する、
２つの３−ケトチオラーゼ（ＡおよびＢ）を有する（Ｈａｙｗｏｏｄら、ＦＥＭ
ＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．、５２：９１（１９８８））。酵素Ａは、
これら２つの基質に対して１０倍活性であり、そして厳密に特異的であるが、酵
素Ｂもまた、より高い３−ケトアシルＣｏＡの活性に対して１〜２％の活性を有
する。

【００２９】要約すると、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａまたはＺ．ｒａｍｉｇｅｒａ由来のＰＨＢ
酵素による３−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡモノマーの合成は、３−ケトヘ
キサノイル−ＣｏＡに対して有利な基質特異性を有するチオラーゼ遺伝子および
／または還元酵素遺伝子を同定し、そして使用することによって改善され得る。
従って、ＰＨＡ生合成のために、３−ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを提供し得
る活性をコードする遺伝子を同定し、そして単離することが必要である。

【００３０】（Ｎｏｃａｒｄｉａｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ由来のｐｈｂ遺伝子の同定お
よび単離）Ｎ．ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒは、炭素供給源として単糖上で増殖する場合、
高レベルの３−ヒドロキシバレレートを、ＰＨＡに組み入れることが公知である
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属の１つのメンバーである。この特性は、Ｎ．ｓａｌｍ
ｏｎｉｃｏｌｏｒ由来のＰＨＢ生合成酵素は、おそらく他のＰＨＢ合成酵素（例
えば、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ由来のＰＨＢ生合成酵素）より広い基質範囲を有す
るだろうことを示唆する。ＰＨＢポリメラーゼおよびアセトアセチルＣｏＡ還元
酵素をコードする遺伝子は、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｒｕｂｅｒ由来のｐｈａ
Ｃ遺伝子のヌクレオチド配列ならびに公知のアセチルＣｏＡデヒドロゲナーゼの
Ｎ末端部分およびＣ末端部分の領域において保存された領域に基づいたプライマ
ーを使用した、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅された。Ｎ．ｓａｌｍｏｎｉ
ｃｏｌｏｒ由来のｐｈｂＢ遺伝子およびｐｈｂＣ遺伝子を含むＤＮＡフラグメン
トが、プローブとして、対応するＰＣＲ産物を用いたサザンブロットによるゲノ
ム消化において同定された。３．６ｋｂＢａｍＨＩ（ｐｈｂＣ）および４．２
ｋｂＰｖｕＩＩ（ｐｈｂＢ）フラグメントが、ｐＵＣ１１９にクローン化され
、そしてプローブとして、対応するＰＣＲ産物を使用したコロニーブロッティン
グにより同定された。

【００３１】（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ由来のブチラート
発酵経路を用いたＲ−３−ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡの内因性形成）Ｒ−３−ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ形成を生じる生合成経路は、図４に示
されるようなモノマー前駆体へ後に縮小され得る３−ケトヘキサノイルＣｏＡへ
のブチリルＣｏＡの伸長を含む。ブチリルＣｏＡは、ブチラート発酵生物（例え
ば、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）により、アセチルＣｏＡから４工程経
路で形成される。３−ケトヘキサノイルＣｏＡへのブチリルＣｏＡの伸長は、チ
オラーゼによって触媒される。従って、完全な経路は、（１）ＰＨＢ生合成チオ
ラーゼ、（２）ブチリルＣｏＡを形成するＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ由
来の３つの酵素、（３）３−ケトヘキサノイルＣｏＡに特異的な第２のチオラー
ゼ、（４）この基質に特異的な還元酵素、および（５）３−ヒドロキシブチリル
ＣｏＡおよび３−ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡの両方を受容するＰＨＢポリメ
ラーゼを含む。

【００３２】ブチラート発酵に関与するＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ遺伝子座は、５
つの酵素／タンパク質（クロトナーゼ（ｃｒｔ）、ブチリルＣｏＡデヒドロゲナ
ーゼ（ｂｃｄ）、電子伝達のための２ＥＴＦタンパク質（ｅｔｆＡおよびｅｔｆ
Ｂ）、および３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ｈｂｄ））をコ
ードする（Ｂｏｙｎｔｏｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：３０１５（１
９９６））。これらの遺伝子が単離された別の微生物は、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍである
（ｖａｎＲｉｎｓｕｍ、ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃ．ｎｏ．）。Ｈｂｄおよびｃ
ｒｔは、同様にＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅから単離された（Ｍｕｌｌａｎｙら、Ｆ
ＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１２４：６１（１９９４））。３−ヒ
ドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性は、Ｄａｓｔｒｉｃｈａｒｕｍ
ｉｎａｔｉｕｍ（Ｙａｒｌｅｔｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２２８：１８７（１
９９５））、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓ（Ｍｉｌｌ
ｅｒおよびＪｅｎｅｓｅｌ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１３８：９９（１９７
９））、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｐｈａｇｅｄｅｍｅｓ（ＧｅｏｒｇｅおよびＳｍ
ｉｂｅｒｔ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１５２：１０４９（１９８２））、Ａ
ｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ（ＨａｒｔｅｌおよびＢ
ｕｃｋｅｌ、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１６６：３５０（１９９６））
、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｋｌｕｙｖｅｒｉ（Ｍａｄａｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．、３２：５１（１９７３））、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｓｐｏｒａ
ｂｒｙａｎｔｉ（ＤｏｎｇおよびＳａｔａｍｓ、ＡｎｔｏｎｉｅｖａｎＬｅ
ｅｕｗｅｎｈｏｅｋ、６７：３４５（１９９５））において検出され；クロトナ
ーゼ活性は、Ｂｕｒｙｒｉｖｉｂｒｉｏｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓ（Ｍｉｌｌ
ｅｒおよびＪｅｎｅｓｅｌ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１３８：９９（１９７
９））において検出され；そしてブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性は、Ｍｅ
ｇａｓｐｈａｅｒａｅｌｓｄｅｎｉｉ（ＷｉｌｌｉａｍｓｏｎおよびＥｎｇｅ
ｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、２１８：５２１（１９８４））、Ｐｅｐｔｏｓｔｒ
ｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｅｌｓｄｅｎｉｉ（ＥｎｇｅｌおよびＭａｓｓａｙ、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、１９７１、１２５：８７９）、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｓｐｏ
ｒａｂｒｙａｎｔｉ（ＤｏｎｇおよびＳｔａｍｓ、Ａｎｔｏｎｉｅｖａｎ
Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ、６７：３４５（１９９５））、およびＴｒｅｐｏｎｅ
ｍａｐｈａｇｅｄｅｍｅｓ（ＧｅｏｒｇｅおよびＳｍｉｂｅｒｔ、Ｊ．Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ．、１５２：１０４９（１９８２））において検出された。

【００３３】今までのところ公知である全てのＣｏＡ関連チオラーゼについて、この反応は
、主に異化方向に進行する。また、ｐｈｂＡによってコードされるチオラーゼは
、好ましくはアセトアセチルＣｏＡを分解する。従って、３−ケトヘキサノイル
ＣｏＡへの生合成経路において、異化チオラーゼは、この反応が還元酵素および
ＰＨＡポリメラーゼによって異化方向へと向かわされている場合、使用され得る
。公知のチオラーゼに加え、これらの酵素をコードする遺伝子は、細菌、哺乳動
物および植物の範囲から得られ得る。実際、Ｅ．ｃｏｌｉは、生化学的および生
理学的の両方であまり特徴付けられていない５つのチオラーゼを有する。これら
のチオラーゼの２つは、以前同定された遺伝子（ｆａｄＡおよびａｔｏＢ）によ
ってコードされるが、一方他の３つは、研究されていないオープンリーディング
フレームによってコードされる。これらのチオラーゼは過剰発現され、そしてイ
ンビトロアッセイにおいて異なる基質を用いてアッセイされた。還元酵素遺伝子
およびポリメラーゼ遺伝子は、Ｎ．ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒまたはＣ₆モノマ
ーを取り込む任意の他のＰＨＡプロデューサーから取られる。

【００３４】（脂肪酸酸化経路によるＲ−３−ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡの内因性形成
）Ｐ．ｐｕｔｉｄａにおいて、ＰＨＡ生合成についてのモノマーは、アルカンま
たは酸化されたアルカンが、炭素供給源およびエネルギー供給源として提供され
る場合、脂肪酸酸化経路から誘導される。ＰＨＡ生合成に導かれるこの経路にお
ける中間体は、Ｓ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡ（好ましくはＣ₈〜Ｃ₁₀）であ
ると推定され、これは、ＦａｏＡＢ複合体によるＲ異性体へのエピマー化を受け
る。エピメラーゼおよびＰＨＡポリメラーゼの組み合わせた作用は、ＰＨＡに対
してＣ₆〜Ｃ₁₄のモノマーを提供する。結果として、このエピメラーゼおよびＰ
ＨＡポリメラーゼを受容する３−ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡの組み合わせは
、図５によって示されるように、トランスジェニック生物体において脂肪酸から
ＰＨＢＨを合成するための生合成能力を提供する。３ＨＢモノマーとしての発酵
産生に有用な供給原料である脂肪酸および炭水化物の混合物は、アセチルＣｏＡ
から誘導され得るが、一方、３ＨＨ成分は脂肪酸からである。植物作物について
、３−ヒドロキシヘキサノエートモノマーの合成は、アセチルＣｏＡから同化的
に進行するか、または脂肪酸から異化的に進行する。

【００３５】エピメラーゼ活性は、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＦａｄＡＢ）（Ｐｒａｍａｎｉｋら、Ｊ
．Ｂａｔｅｒｉｏｌ．１３７：４６９（１９７９））およびＰ．ｆｒａｇｉＦ
ａｏＡＢ（Ｉｍａｍｕｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７：１８４（１９９０
））由来の脂肪酸酸化複合体において検出されている。Ｐ．ｐｕｔｉｄａＫＴ
２４４２由来のＦａｏＡＢ複合体を、サブユニットを過剰発現ベクターｐＴｒｃ
Ｎにおいてクローニングした後に試験し、そしてこの複合体が３−ヒドロキシオ
クタノイルＣｏＡに対してエピメラーゼ活性を示し、３−ヒドロキシブチリルＣ
ｏＡに対して限定された活性を示し、そして３−ヒドロキシオクタノイルＣｏＡ
に対してほとんど検出可能でないレベルを示した。これらの結果は、ＦａｏＡＢ
複合体がＰ．ｐｕｔｉｄａにおけるＰＨＡ経路の基質特異性の決定因子であり得
ることを示唆する。結果として、他の供給源からのＦａｏＡＢ複合体は、組換え
生物、原核生物または原始生物における新規３−ヒドロキシアシルＣｏＡプール
を生成するために使用され得る。相同な遺伝子は、Ｐ．ｐｕｔｉｄａＫＴ２４
４２においてｆａｏＡＢ遺伝子を同定するための同じ方法を使用して、Ｒ．ｅｕ
ｔｒｏｐｈａ、Ａ．ｌａｔｕｓ、Ｃ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ、Ｐ．ｄｅｎｉ
ｔｒｉｆｉｃａｎｓ、Ｒ．ｒｕｂｅｒならびに他のＰＨＡおよび非ＰＨＡプロデ
ューサーのような細菌から容易に単離される。

【００３６】（脂肪酸生合成経路を介したＲ−３−ヒドロキシオクタノイルＣｏＡの内因性
形成）Ｐ．ｐｕｔｉｄａおよびＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａは、糖上で増殖する場合、
中程度の鎖長の３−ヒドロキシ脂肪酸から構成されるＰＨＡを合成する。これら
のＰＨＡにおいて優勢なモノマーは、３−ヒドロキシデカノエートである。類似
の経路は、図６によって示されるように、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｒ．Ｅｕｔｒｏｐｈａ
およびＰ．ｐｕｔｉｄａのような組換え微生物ならびにトランスジェニック脂肪
種子作物のいずれかにおいてＰＨＢＨの合成について操作され得る。３−ヒドロ
キシブチリルＣｏＡおよび３−ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡの前駆体を受容す
るポリメラーゼに加えて、３−ヒドロキシアシルＡＣＰを３−ヒドロキアシルＣ
ｏＡに変換するか、または３−ケトアシルＡＣＰを３−ケトアシルＣｏＡに変換
する酵素活性もまた、必要である。この活性がＰ．ｐｕｔｉｄａに存在すること
から、対応する遺伝子がスクリーニング手順により同定および単離され得る。脂
肪酸生合成の調節解除およびこの経路における活性の増加は、引き続いて、ＰＨ
ＢＨ形成のための基質を提供する。

【００３７】この経路における重要な酵素活性は、３−ヒドロキシアシルＡＣＰのＣｏＡ誘
導体への変換である。チオエステラーゼおよびアシルＣｏＡシンターゼは周知で
あり、その組み合わせ作用が、この工程を達成し得る。あるいは、新規活性、ア
シルＡＣＰ：ＣｏＡトランスフェラーゼは、ＰＨＡ経路におけるこの工程を容易
にし得、そして結果として、炭水化物のような酸化された炭素供給源からＰＨＡ
を産生する細菌において同定され得る。

【００３８】（増殖特徴）効率的なＰＨＡ産生のために、菌株が、接種の作業および産生の行為の期間の
間、そのバイオポリマーを合成するための能力を失わないことが重要である。ｐ
ｈｂ遺伝子のいずれかの損失が、産生物の損失を生じるが、他方、新規モノマー
を提供する遺伝子のいずれかの損失が、異種の産生物の形成を生じる。これらは
共に望ましくなく、従って菌株の安定な増殖が必要である。実施例に記載される
菌株の遺伝子の組込みは、２５０，０００Ｌの工業用発酵容器における産生に十
分な、少なくとも５０世代にわたり安定であるように決定される。

【００３９】これらの組換えＰＨＡプロデューサーの増殖および形態は、染色体上のｐｈｂ
遺伝子の存在によって損なわれない。この選択手順の間、個々の構成要素は、栄
養要求性菌株の単離を迂回して、最小の培地プレート上で選択される。異なるｐ
ｈｂ構成要素の増殖速度は、ＰＨＢ産生株を誘導する野生型Ｅ．ｃｏｌｉの増殖
速度と類似した。Ｅ．ｃｏｌｉ染色体へのｐｈｂ遺伝子の追加は、これらの菌株
の下流プロセッシングに影響しなかった。なぜなら、これらが依然として従来の
方法によって容易に溶解したからである。

【００４０】（ＩＩＩ．組成物のための適用）ＰＨＡは、成形適用、特に、消費パッケージングアイテム（例えば、瓶、化粧
用容器、オムツシート、ペン、ゴルフのティー、および個人用アイテム（例えば
、米国特許第３，０７２，５３８号；同第３，１０７，１７２号；および同第４
，９００，２９９号（これらは、成形されたタンポンアプリケーターを記載する
）））のための成形適用において、ならびに純粋なＰＨＡもしくはブレンドのフ
ィルムまたは他の材料（例えば、デンプンエステルもしくは合成ポリマー）との
ＰＨＡのラミネートにおいて、使用され得る。多くの適用において、このポリマ
ーは、まず繊維に形成され、次いで、この繊維を使用して、不織布のような材料
が構築される。

【００４１】このポリマーはまた、熱融解接着調合物および圧力感受性接着調合物において
、ならびにトナーにおいて使用される石油化学ポリマーおよび顕色剤組成物（米
国特許第５，００４，６６４号）に代わるために、ならびにイオン電導性ポリマ
ー電解質（米国特許第５，２６６，４２２号）として、使用され得る。ポリヒド
ロキシアルカノエートポリマーの多くの特徴は、このポリヒドロキシアルカノエ
ートポリマーを、金属粉末、セラミック粉末または金属／セラミック粉末の加工
のための結合剤として、特に魅力的にする。

【００４２】ＰＨＡの独特な特徴の１つは、それらが、２つの別個の物理的形態（アモルフ
ァス顆粒としてか、または結晶固体としてのいずれか）において存在し得ること
である。従って、ＰＨＡは、ラテックスを形成するために使用され得る。ＰＣＴ
ＷＯ９１／１３２０７は、コーティング紙のためのＰＨＡラテックス組成物
を記載する。ＧＢ２２９２６４８Ａは、建築用コーティング調合物にお
けるＰＨＡラテックスの使用を記載する。ＰＣＴＷＯ９６／００２６３は、
食物コーティング（特に、チーズコーティング）としてのＰＨＡラテックスの使
用を記載する。ＰＣＴＷＯ９２／０９２１１および米国特許第５，２２９，
１５８号は、生クリーム代用物としての使用のためのＰＨＡ顆粒組成物の使用を
記載する。ＰＣＴＷＯ９２／０９２１０および米国特許第５，２２５，２２
７号は、食物における風味送達剤としてのＰＨＡの使用を記載する。

【００４３】ＰＨＡは、ますます利用可能になってきているので、ＰＨＡはまた、加工補助
剤として作用する適用における、それらの適合性について試験されている。１つ
の例は、ＰＣＴＷＯ９６／１７３６９に記載されるようなＣＲＴチューブ成
分の生成におけるＰＨＡラテックスの使用である。この適用におけるＰＨＡの有
用性の重要な特徴は、そのコーティング系が有機溶媒を使用しないこと、および
そのコーティング系が、引き続くオーブン処理の間に、従来の系よりも低いエネ
ルギーを使用して、容易に除去され得ることである。

【００４４】ＰＨＡは、ヒドロキシ酸モノマー組成物に依存して、広範な種々の型において
生成され得る（ＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌおよびＶａｌｅｎｔｉｎ，ＦＥＭＳＭ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１２８：２１９−２８（１９９５））。この広範
なポリマー組成物は、等しく広範なポリマー物理特性（４０〜１８０℃の範囲の
融点、−３５〜５℃の範囲のガラス転移温度、結晶化の速度を制御する能力と合
わせられる０％〜８０％の範囲の結晶化度、および５〜５００％の範囲の破断伸
び（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎｔｏｂｒｅａｋ）を含む）を反映する。例えば、
ポリ（３−ヒドロキシブチレート）は、ポリプロピレンの特徴と類似の特徴を有
し、一方、ポリ（３−ヒドロキシオクタノエート）（（Ｒ）−３−ヒドロキシオ
クタノエートと（Ｒ）−３−ヒドロキシヘキサノエートとのコポリマー）型は、
むしろエラストマーと類似に挙動し、そしてより長い側鎖を有するＰＨＡは、む
しろワックスと類似に挙動する。ＰＨＡはまた、可塑化され得、そして他のポリ
マーまたは薬剤とともにブレンドされ得る。

【００４５】広範なポリマー組成物は、等しく広範なポリマー物理特性（有機溶媒中の溶解
度（これは、選り抜きの広範な溶媒を提供する）を含む）を反映する。例えば、
（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレートと他のヒドロキシ酸コモノマーとのコポリマ
ーは、ＰＨＢホモポリマーの溶解度特徴と有意に異なる溶解度特徴を有する。例
えば、アセトンは、ＰＨＢに対して良溶媒ではないが、６〜１２個の炭素原子を
含有する（Ｒ）−３−ヒドロキシ酸との（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレートコポ
リマーを溶解するためには非常に有用である（Ａｂｅら、Ｉｎｔ．ＪＢｉｏｌ
．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．１６：１１５−１９（１９９４）；Ｋａｔｏら、Ａｐｐｌ
．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４５：３６３−７０（１９９６
））。同様に、Ｍｉｔｏｍｏら、ＲｅｐｏｒｔｓｏｎＰｒｏｇｒｅｓｓｉ
ｎＰｏｌｙｍｅｒＰｈｙｓｉｃｓｉｎＪａｐａｎ，３７：１２８−２９
（１９９４）は、アセトン中に１５〜７５ｍｏｌ％の４−ヒドロキシブチレート
残基を含むコポリエステルであるポリ（３−ヒドロキシブチレート−コ−４−ヒ
ドロキシブチレート）の溶解度を記載する。一定範囲のＰＨＡのために適切な多
くのさらなる溶媒は、例えば、米国特許第５，２１３，９７６号；米国特許第４
，９６８，６１１号；ＪＰ９５，１３５，９８５；ＪＰ９５，７９，７８８
；ＰＣＴＷＯ９３／２３５５４；ＤＥ１９５３３４５９；ＰＣＴＷＯ
９７／０８９３１；およびＢｒａｚｉｌＰｅｄｉｄｏＰＩＢＲ９３０
２，３１２に記載されている。

【００４６】本明細書中に記載される組成物ならびにその調製の方法およびその使用は、以
下の限定しない実施例によってさらに記載される。

【００４７】（実施例において使用される材料および方法）ＤＮＡの操作を、Ｑｉａｇｅｎプラスミド調製キットまたはＱｉａｇｅｎ染色
体ＤＮＡ調製キットを製造業者の推奨に従って用いて精製した、プラスミドおよ
び染色体ＤＮＡで実施した。ＤＮＡを、制限酵素（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢ
ｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を製造業者の推奨に従って使用して、消
化した。ＤＮＡフラグメントを、Ｑｉａｇｅｎキットを使用して０．７％アガロ
ース−Ｔｒｉｓ／酢酸／ＥＤＴＡゲルから単離した。オリゴヌクレオチドは、Ｂ
ｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓまたはＧｅｎｅｓｙｓから購入した。ＤＮＡ配列を、Ｐ
ｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＡＢＩ３７３Ａ配列決定装置を使用して、自動配列
決定によって決定した。ＤＮＡを、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕ
ｒｇ，Ｍｄ）のＰＣＲ−ｍｉｘおよびＥｒｉｃｏｍｐＤＮＡ増幅装置を使用し
て、５０μｌの容量でのポリメラーゼ連鎖反応を用いて、増幅した。増殖培地お
よび標準的なクローニング手順は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９９２、Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ、第２版
、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ
，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ）によって記載される通りであ
った。

【００４８】精製したポリマーまたは凍結乾燥した細胞塊上で実施するガスクロマトグラフ
ィー（ＧＣ）分析によって、ＰＨＡを分析した。約２０ｍｇのサンプルを、内部
標準として添加した２ｍｇ／ｍＬの安息香酸と共に、（容量で）９０％の１−ブ
タノールおよび１０％の濃塩酸を含む混合物２ｍＬ中で、1１０℃、３時間の抽
出およびブタノール分解（ｂｕｔａｎｏｌｙｓｉｓ）に同時に供した。生じた混
合物の水溶性の成分は、３ｍＬの水で抽出して除去した。有機相（全体の流速が
２ｍＬ／分で分離比が１：５０の１μＬ）を、ＦＩＤ検出器を備えるＨＰ５８
９０ＧＣ（Ｈｅｗｌｅｔｔ−ＰａｃｋａｒｄＣｏ、ＰａｌｏＡｌｔｏ、Ｃ
Ａ）で、ＳＰＢ−１融合シリカキャピラリーＧＣカラム（３０ｍ、内径０．３２
ｍｍ、０．２５μｍの膜、Ｓｕｐｅｌｃｏ、Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ、Ｐａ．）を
用いて、次のような温度プロファイルで分析した。８０℃で２分間、１分間あた
り１０℃づつ２５０℃まで上昇、２５０℃で２分。内部標準として、安息香酸ブ
チルを使用した。

【００４９】（実施例１：ＰＨＢＨの産生を改良するのに適したＮ．ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌ
ｏｒ由来の遺伝子の単離）染色体にコードされたＮ．ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ由来のＰＨＡポリメラー
ゼを発現するトランスジェニックＥ．ｃｏｌｉ株を、構築した。Ｎ．ｓａｌｍｏ
ｎｉｃｏｌｏｒ由来のＰＨＢポリメラーゼ遺伝子を単離し、そしてこの遺伝子の
融合体を、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ酵素の末端の１０個の残基を含む、Ｚ．ｒａ
ｍｉｇｅｒａ由来のＰＨＡポリメラーゼ遺伝子の翻訳配列を用いて産生した。次
いで、プロモーターのないクロラムフェニコールトランスフェラーゼ遺伝子を、
ｐｈｂＣ−ｃａｔ融合体を作製するためにそのハイブリットｐｈｂＣ遺伝子の後
に配置した。この融合体を、ｐＬＯＦシステムまたはｐＵＴシステム（Ｈｅｒｒ
ｅｒｏら）を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉの染色体にランダムに挿入し、この融合体
を発現するクローンを、クロラムフェニコール含有増殖培地上で選択した。この
融合体の発現を、より高いレベルのクロラムフェニコールに耐性で誘導体を選択
することによって、結果的に増加させた。

【００５０】ＰｈａＣを、以下の反応混合物：５０ｍｌの最終容量中の４５ｍｌのＰＣＲ
Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）、
２０ｐｍｏｌのプライマーＲＳＣＰ１（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）（５’ＧＡＴＧＣＣＧＧＴＣＧＡＣＣＣＧＣＧＧＧＡＣＣＧＣＣＧＣＴＴＣＴ
ＣＣ）およびＲＳＰＣ２（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）（５’ＴＣＡＧＣＴＧＡＡＧＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＣＣＧＧＡＧＣ）中で、９５℃で６０秒、５５℃で６０秒、および７２℃で２１０秒の３０サイク
ル、その後の生成物伸長工程（６８℃で７分）によって、Ｎ．ｓａｌｍｏｎｉｃ
ｏｌｏｒ染色体ＤＮＡから増幅した。Ｎ．ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒレダクター
ゼ遺伝子を、以下の反応：５０ｍｌの最終容量中の４５ｍｌのＰＣＲＳｕｐｅ
ｒｍｉｘ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）、１ｍＭの
プライマーＲＤ−ｕｐ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）（５’ＣＧＩＧＴＩＧＣＩＣＴＩＧＴＩＡＣＩＧＧ）およびＲＤ−ｄｗｎ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）（５’ＣＣＣＡＴＧＴＡＣＡＧＩＣＣＩＣＣＧＴＴ）中で、９５℃で６０秒、６０℃で６０秒、および７２℃で２１０秒の３０サイク
ル、その後の生成物伸長工程（６８℃で７分）によって増幅した。ＰＣＲ生成物
をゲル精製し、そしてｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）にクローン
化した。引き続いて、ポリメラーゼおよびレダクターゼをコードする精製したフ
ラグメントを、サザンブロット実験に使用し、３．６ｋｂｐｈａＣフラグメン
トならびにｐｈａＢを含む４．６ｋｂＢａｍＨＩフラグメントおよび４．２ｋ
ｂＰｖｕｌｌフラグメントを同定した。対応するサイズの染色体フラグメント
を、ゲル精製し、ｐＵＣ１９にクローン化し、そして所望の挿入物を含むクロー
ンを、プローブとして精製したｐｈｂＣ遺伝子およびｐｈｂＢ遺伝子を使用する
、コロニーブロットハイブリダイゼーションによって同定した。

【００５１】ＰＨＢＨの効率的な合成は、生合成の経路に含まれる酵素をコードする遺伝子
の適切な発現を必要とするので、Ｎ．ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ由来のｐｈａＣ
遺伝子を、図６に示されるように、この遺伝子の５’末端に強力な翻訳シグナル
を操作するために再構築した。ＰｈａＣを、プライマーＣ７−５’（ＳＥＱＩ
ＤＮＯ：５）（５’ＡＡＧＴＣＧＡＣＣＡＴＧＣＡＴＣＣＧＡＴＣＧＧＣＴＧＧＧＧＴ）およびＣ７−３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）（５’ＡＣＧＣＴＧＴＴＣＡＧＡＴＣＴＴＣＧＣＡＡＧＡＴＧＡＡＴＧＣＴＡ
ＡＣＧ）を使用して、９５℃で３０秒、６０℃で３０秒、および７２℃で２分を伴う熱サ
イクルプログラム、その後の伸長工程（７２℃で７分）によって増幅した。この
反応混合物は、４７ｍｌのＰＣＲＳｕｐｅｒｍｉｘ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）、
各々０．１ｎｍｏｌのプライマー、およびテンプレートとして約０．０５ｍｇの
ｐＣＲ２．１−ｐｈａＣ７を含んでいた。このＰＣＲ生成物を、フェノール抽出
により精製し、そしてＮｓｉｌおよびＢｇｌＩＩを用いて消化した。次いで、こ
の制限フラグメントを、ｐＭＳＸＣ５ｃａｔのＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩ部位に
クローン化した。ｐＭＳＸＣ５ｃａｔは、Ｚ．ｒａｍｉｇｅｒａ（ｐｈａＣ５）
由来のＰＨＡポリメラーゼ遺伝子およびクロラムフェニコール耐性遺伝子の転写
融合体を含む。得られたプラスミドは、翻訳融合体を含み、これは、ＰｈａＣ５
由来の１０個のＮ末端アミノ酸の、Ｎ．ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒＰＨＡポリ
メラーゼとのハイブリッドポリメラーゼを生じる。引き続いて、得られたプラス
ミドｐＭＳＸＣ７ｃａｔをＡｃｃＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、およびＦｓｐＩで消化し
、その後、ｐｈａＣフラグメントを、ＦｓｅＩ／ＥｃｏＲＩ消化したｐＭＳＸｐ ₁₁ ＡＢ５ｋａｎおよびＳｍａＩ／ＥｃｏＲＩ消化したｐＭＳＸｐ₁₃ＡＢ５ｋａｎ
中のｐ₁₁およびｐ₁₃プロモーターの後にクローニングするために単離した。ｐ₁₁ Ｃ７ｃａｔおよびｐ₁₃Ｃ７ｃａｔを含むフラグメントを、ＡｖｒＩＩフラグメン
トとして単離し、ｐＬＯＦＨｇのＳｆｉＩ部位に挿入し、そしてＥ．ｃｏｌｉ
ＭＢＸ４２７の染色体に組み込み、ｐＭＬＸｐ１１Ｃ７ｃａｔおよびｐＭＬＸｐ
１３Ｃ７ｃａｔを得た。

【００５２】代替的３−ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ受容ＰＨＡポリメラーゼ遺伝子は、
このモノマーを取り込むことが示されている生物から得られ得、この生物として
は、Ａ．ｃａｖｉａｅ、Ｃ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ、Ｔ．ｐｆｅｎｉｇｉｉ
、ならびにおそらくＰ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓおよびＳ．ｎａｔａｎｓが
挙げられる。これらの遺伝子は、上記と同じ手順に従って、Ｅ．ｃｏｌｉにおい
て発現され得る。

【００５３】（実施例２：ブチレートからの、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＰＨＢＨ合成）Ｒ−３−ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡの内因性合成は、アセチルＣｏＡとの
ブチリルＣｏＡの縮合、それに続く還元工程の後に、進行し得る。この経路は、
広範な基質範囲のレダクターゼおよび３−ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを受容
するポリメラーゼのみを必要とする。ブチレートは、Ｅ．ｃｏｌｉによって取り
こまれ、そしてａｔｏＤＡ遺伝子産物によってブチリルＣｏＡに変換される。ブ
チリルＣｏＡの分解は、ブチレートによって誘導されないａｔｏＢおよびｆａｄ
レギュロンに依存する。

【００５４】プラスミドｐＭＢＸｃ１２Ｊ１２を、Ａ．ｃａｖｉａｅＰＨＢポリメラーゼ
遺伝子（Ｆｕｋｕｉ＆Ｄｏｉ、Ｊ．Ｂａｃｔｉｒｉｏｌ．１７９：４８２１−３
０（１９９７））を含む２．４ＫｂのＡｐｏＩフラグメントをｐＵＣ１８のＥｃ
ｏＲＩ部位に挿入することによって構築した。プラスミドｐＳＵ１８−ＡＢＩは
、ベクターｐＳＵ１８（Ｍａｒｔｉｎｅｚら、Ｇｅｎｅ６６：１６５９−２０（
１９８８））において、ＩＰＴＧ誘導性プロモーター制御下のＲ．ｅｕｔｒｏｐ
ｈａｐｈｂＡＢ遺伝子を含む。ＰＨＢＨは、以下のように、プラスミドｐＭＢ
ＸＣ１２Ｊ１２およびｐＳＵ１８−ＡＢＩを含む、Ｅ．ｃｏｌｉＭＢＸ１３２
５（株ＤＣ６７９（ｍｅｌ、ｆａｄＲ、ａｔｏＣ（ｃｏｎ）ａｄｈＣ８１）（Ｃ
ｌａｒｋ＆Ｒｏｄ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．２５：１５１（１９８７
）と同一である）において、グルコースおよびブチレートから産生された。この
形質転換細胞（１Ｌ）を、２０ｍＭブチレートを含むＬＢ中で２４時間３０℃に
て増殖させ、そして遠心分離によって収集した。ＰＨＡポリマーを、１６時間の
クロロホルム抽出によって、凍結乾燥細胞から精製し、そして５〜１０倍過剰の
メタノ−ル中でＰＨＡを沈殿させた。沈殿したポリマーを、ガスクロマトグラフ
ィーによって分析し、そして１．０％ＨＨコモノマーを含むＰＨＢＨコポリマー
として同定した。

【００５５】（実施例３：ブチレート発酵経路を使用する、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＰＨＢＨ
合成）ブチレート発酵経路を、図３に示す。３−ヒドロキシヘキサノエート合成に必
要な酵素は、ｐｈｂＡ_X、ｈｂｄ、ｃｒｔ、ｂｄｈ、ｐｈｂＡ_y、ｐｈｂＢおよび
ｐｈｂＣによってコードされ、ここでｘおよびｙは、同一のチオラーゼか、また
は異なるチオラーゼを示す。これらの遺伝子の供給源は、Ｚ．ｒａｍｉｇｅｒａ
（ｐｈｂＡ_xy）、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ（ｈｂｄ、ｃｒｔ、ｂｄ
ｈ）およびＮ．ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ（ｐｈｂＢおよびｐｈｂＣ）である。

【００５６】Ｃｒｔおよびｈｂｄを、テンプレートとしてｐＣ１０（Ｂｏｙｎｔｏｎら）を
使用して、以下のプライマー：

【００５７】

【化１】

【００５８】を使用するポリメラーゼ連鎖反応によって単離した。ＰＣＲ産物を精製し、ＥｃｏＲＩ／ＳａｃＩ（ｃｒｔ）またはＫｐｎＩ／Ｓｍａ
Ｉ（ｈｂｄ）を用いて消化し、そして引き続いてｐＵＣ１８−Ｓｆｉの対応部位
にクローン化し、ｐＭＳＸｃｒｔ−ｈｂｄを得た。

【００５９】Ｂｄｈを、テンプレートとしてｐＣ１０（Ｂｏｙｎｔｏｎら）を使用しそして
以下のプライマー：

【００６０】

【化２】

【００６１】を使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、単離した。ＰＣＲ産物を精製し、ＰｓｔＩ／ＳｐｈＩを用いて消化し、そして引き続いてｐ
ＭＳＸｃｒｔ−ｈｂｄの対応部位にクローン化し、ｐＭＳＸｃｒｔ−ｈｂｄ−ｂ
ｃｄを得た。

【００６２】ｐＣ１０に由来するもとのオペロンは、推定電子伝達鎖をコードするｅｔｆＡ
Ｂを含んでいた。ｃｒｔ−ｈｂｄ−ｂｃｄオペロンは、このオペロンの非存在下
において活性でないかもしれないので、ｅｔｆＡ遺伝子およびｅｔｆＢ遺伝子を
、以下のプライマー：

【００６３】

【化３】

【００６４】を用いてｐＣ１０（Ｂｏｙｎｔｏｎら）から増幅した。ＰＣＲ産物を精製し、Ｂ
ａｍＨＩおよびＳａｌＩを用いて消化し、そして引き続いてｐＵＣ１８−Ｓｆｉ
Ｉの対応部位にクローン化し、ｐＭＳＸｅｔｆＡＢを得た。このｅｔｆＡＢ遺伝
子は、ｐＭＳＸｃｒｔ−ｈｂｄ−ｂｃｄプラスミド内に、ＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ
部位において容易にクローン化され得る。

【００６５】（実施例４：脂肪酸酸化経路を使用した、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＰＨＢＨ合成
）脂肪酸酸化経路を、図４に示す。Ｒ−３ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡは、Ｓ
−３−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡのエピマー化、３−ケトヘキサノイル−
ＣｏＡの還元、またはＤ特異的ヒドラターゼによるエノイル−ＣｏＡの水和によ
って脂肪酸酸化中間体から得られ得る。Ｅ．ｃｏｌｉ株ＭＢＸ２４０は、１コピ
ーのＲ．ｅｕｔｒｏｐｈａｐｈｂＣ遺伝子を、染色体へ挿入することによって
構築された、株ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＳａｎＤｉｅｇｏ
，ＣＡ）の誘導株である。この株は、糖または脂肪酸からＰＨＡを生成しない。
なぜなら、アセチル−ＣｏＡまたは脂肪酸酸化中間体を、Ｒ−３−ヒドロキシア
シル−ＣｏＡモノマーに変換するための酵素が存在しないからである。エノイル
−ＣｏＡヒドラターゼをコードするｐｈａＪ遺伝子（ＦｕｋｕｉおよびＤｏｉ，
Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：４８２１−３０（１９９７））を、以下の
プライマー：

【００６６】

【化４】

【００６７】およびＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ
）から得られたＰＣＲ反応混合物を使用して、ポリメラーゼ連鎖反応によって、
Ａ．ｃａｖｉａｅ株ＦＡ−４４０（受託番号ＦＥＲＭＢＰ３４３２（米国特
許第５，２９２，８６０号）のもとでＪａｐａｎｅｓｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏ
ｌｌｅｃｔｉｏｎから得た）から調製した染色体ＤＮＡから単離した。このＰＣ
Ｒプログラムは、（９５℃、４５秒；５５℃、４５秒；７２℃、１分）の３０サ
イクルであった。ＰＣＲの後に、このＤＮＡフラグメントを、ＥｃｏＲＩおよび
ＰｓｔＩを用いて完了するまで消化し、ゲル精製し、そしてプラスミドｐＵＣ１
８Ｓｆｉ（Ｈｅｒｒｅｒｏら）のＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ部位へ連結し、プラスミ
ドｐＭＴＸＪ１２を得た。プラスミドｐＭＴＸＪ１２を含むＥ．ｃｏｌｉＭＢ
Ｘ２４０の形質転換体を、１０ｍＭオクタノエートおよび１ｍＭオレアート
ならびに１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ
培地中で増殖させた。３７℃で４８時間の増殖後、５０ｍｌの細胞を、遠心分離
によって収集し、そして凍結乾燥した。凍結乾燥した細胞を、８ｍｌのクロロホ
ルムで１６時間抽出し、そしてＰＨＡを１０倍過剰のエタノール中で、４℃で沈
殿させた。この沈殿したポリマーを、ガスクロマトグラフィによって分析し、そ
して２．６％ＨＨコモノマーを含むＰＨＢＨコポリマーとして同定した。

【００６８】（実施例５：Ａ．ｃａｖｉａｅＰＨＢポリメラーゼ遺伝子ならびにＲ．ｅｕ
ｔｒｏｐｈのチオラーゼ遺伝子およびレダクターゼ遺伝子を発現するＥ．ｃｏｌ
ｉにおける、ブタノールからのＰＨＢＨコポリマーの生成）ＰＨＢＨを、以下の通りに、プラスミドｐＭＢＸＣ１２Ｊ１２およびｐＳＵ１
８−ＡＢ１を含むＥ．ｃｏｌｉＭＢＸ１３２６（株ＤＣ６９８（ｍｅｌ、ｆａ
ｄＲａｔｏＣ（ｃｏｎ）ａｄｈＣ８１、ａｄｈＲ３０ａｃｅＸ）、Ｃｌａｒ
ｋおよびＲｏｄ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．２５：１５１（１９８７）
と同一）において、グルコースおよびブチラートから生成した。この形質転換細
胞を、１Ｌ当たり５ｇのブタノールを含む１ＬのＬＢ培地で増殖させた。細胞を
、実施例１の通りに収集し、そして分析した。遺伝子操作された細胞は、１．２
％ＨＨを含むＰＨＢＨコポリマーを生成した。

【００６９】（実施例６：脂肪酸生合成経路を使用した、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＰＨＢＨ合
成）脂肪酸生合成経路を、図５に示す。Ｒ−３−ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡも
また、脂肪酸生合成由来の中間体から提供され得る。Ｐ．Ｐｕｔｉｄａにおいて
、３−ヒドロキシアシルＣｏＡは、この細菌がグルコースまたは他の炭水化物上
で増殖する場合に、この経路から提供される。この経路は、アシルＡＣＰをアシ
ルＣｏＡに変換する活性、ＡＣＰ／ＣｏＡトランスアシラーゼによって触媒され
る反応、またはアシルＡＣＰチオエステラーゼおよびアシルＣｏＡシンターゼの
組み合わせ作用によって触媒される反応を必要とする。ＰＨＢ生合成遺伝子を発
現し、そして構成的脂肪酸生合成レギュロン（ｆａｄＲ⁺）を有するＥ．ｃｏｌ
ｉ株（例えば、ＭＢＸ６８９）へのこの経路の導入は、Ｒ−３−ヒドロキシヘキ
サノイルＣｏＡの合成を生じる。

【００７０】ＡＣＰからＣｏＡへのトランスアシル化を容易にする酵素をコードする遺伝子
を、以下のスクリーニングにおいて単離する。このスクリーニングは、図１０に
示されるようなＶ．ｆｉｓｃｈｅｒｉ由来のｌｕｘ系を使用する。ｌｕｘ遺伝子
の誘導は、自己誘導物質である３−ケトヘキサノイルホモセリンラクトンの合成
に依存する。この分子の前駆物質は、Ｓ−アデノシルメチオニンおよび３−ケト
ヘキサノイルＡＣＰである。Ｅ．ｃｏｌｉＣＧＳＣ５６３８は、マロニルトラ
ンスアシラーゼをコードするｆａｂＤ遺伝子において変異を有し（Ｂｏｕｑｕｉ
ｎら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４６：６２８（１９９５））、そしてア
セトアセチルＡＣＰを合成できない。ヘキサノエートを、長側鎖脂肪酸の合成の
ためにこれらの細胞に提供する。さらに、ｆａｄＲ変異を導入して、ヘキサノエ
ートを３−ケトヘキサノイルＣｏＡへ分解する。細胞が、ｌｕｘ系の発現を誘導
するために、３−ケトヘキサノイルＣｏＡを、３−ケトヘキサノイルＡＣＰに変
換しなければならない。次いで、種々の生物の遺伝子ライブラリーを、この宿主
においてスクリーニングし得、ｌｕｘ発現を誘導する能力について陽性のクロー
ンを選択し得る。このｌｕｘ発現は、誘導物質である３−ケトヘキサノイルホモ
セリンラクトンの形成に起因する、光の放射として同定する。遺伝子ライブラリ
ーを、ゲノムＤＮＡを単離し、そしてプラスミドベクターにＤＮＡフラグメント
の代表的な収集物をクローニングすることによって、選り抜きの生物から容易に
構築する。代表的なライブラリーは、５，０００〜１００，０００の個々のコロ
ニーを有するべきである。ライブラリーは、ｐＬＡＦＲ３のようなベクター中に
ある広範な宿主範囲のライブラリーか、またはｐＵＣ１９もしくはｐＢＲ３２２
のようなベクター中にあるＥ．ｃｏｌｉライブラリーのいずれかとして作製する
。ライブラリーの型および選り抜きの宿主にそのライブラリーを導入する方法に
依存して、そのゲノムＤＮＡフラグメントは、大きい（１７〜３０ｋｂ）か、ま
たは比較的小さい（２〜６ｋｂ）かのいずれかである。ライブラリーを、使用す
る宿主およびベクターに依存して、エレクトロポレーション、形質転換または接
合によってスクリーニング株に導入する。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ＰＨＢの生合成のための経路の模式図である。

【図２】図２は、ＰＨＡの生合成のための一般的な経路の模式図である。

【図３】図３は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍａｃｅｔｂｕｔｙｌｉｃｕｍのブチレート
醗酵経路を用いたＰＨＢＨの生合成のための好ましい経路の模式図である。

【図４】図４は、脂肪酸酸化経路を用いたＰＨＢＨの生合成のための好ましい経路の模
式図である。

【図５】図５は、脂肪酸経路を用いたＰＨＢＨの生合成のための好ましい経路の模式図
である。

【図６】図６は、Ｎ．ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒからのＰＨＡポリメラーゼのＥ．ｃｏ
ｌｉの染色体上への組込みのための、ｐＭＬＸｐＩＩＣ７ｃａｔおよびｐＭＬＸ
ｐ１３Ｃ７ｃａｔの構築の模式図である。

【図７】図７は、Ｅ．ｃｏｌｉｆａｄＢ変異の補完による、クロトナーゼおよびヒド
ロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子についての選択の模式図である。

【図８】図８は、表現型的にはｆａｄＥ欠損である、Ｅ．ｃｏｌｉ株の補完による、ブ
チリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子についての選択の模式図である。

【図９】図９は、Ｐ．ｐｕｔｉｄａからのＰＨＡポリメラーゼ遺伝子ｐｈａＣを用いて
Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＰＨＢＨ組換え経路についての選択の模式図である。

【図１０】図１０は、Ｖｉｂｒｉｏｆｉｓｃｈｅｒｉｌｕｘ系の使用による、アシル
ＡＣＰからアシルＣｏＡへと変換する酵素をコードする遺伝子についての好まし
いスクリーニング手順の模式図である。

【手続補正書】

【提出日】平成１３年９月１４日（２００１．９．１４）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００３

【補正方法】変更

【補正の内容】

【０００３】天然または遺伝子操作された生物においてＰＨＡを産生するための方法は、Ｓ
ｔｅｉｎｂｕｅｃｈｅｌ、「ＰｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏｉｃＡｃｉ
ｄ」、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ（Ｂｙｒｏｍ編）１２３−２１３頁（ＭａｃＭ
ｉｌｌａｎＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｌｏｎｄｏｎ１９９１）；Ｗｉｌｌｉａ
ｍｓおよびＰｅｏｐｌｅｓ、ＣＨＥＭＴＥＣＨ、２６：３８−４４（１９９６）
；ＳｔｅｉｎｂｕｅｃｈｅｌおよびＷｉｅｓｅ、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３７：６９１−９７（１９９２）；米国特許第５，
２４５，０２３号；同第５，２５０，４３０号；同第５，４８０，７９４号；同
第５，５１２，６６９号；同第５，５３４，４３２号（ＰｅｏｐｌｅｓおよびＳ
ｉｎｓｋｅｙ）（これらはまた、レダクターゼ、チオラーゼ、およびＰＨＢポリ
メラーゼをコードする遺伝子を開示および請求している）；Ａｇｏｓｔｉｎｉら
、Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．、ＰａｒｔＡ−１、９：２７７５−８７（１９７１）
；Ｇｒｏｓｓら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、２１：２６５７−６８（１９
８８）；Ｄｕｂｏｉｓら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、２６：４４０７−１
２（１９９３）；ＬｅＢｏｒｇｎｅおよびＳｐａｓｓｋｙ、Ｐｏｌｙｍｅｒ、
３０：２３１２−１９（１９８９）；ＴａｎａｈａｓｈｉおよびＤｏｉ、Ｍａｃ
ｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、２４：５７３２−３３（１９９１）；Ｈｏｒｉら、Ｍ
ａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、２６：４３８８−９０（１９９３）；Ｋｅｍｎｉ
ｔｚｅｒら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、２６：１２２１−２９（１９９３
）；Ｈｏｒｉら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、２６：５５３３−３４（１９
９３）；ＨｏｃｋｉｎｇおよびＭａｒｃｈｅｓｓａｕｌｔ、Ｐｏｌｙｍ．Ｂｕｌ
ｌ．、３０：１６３−７０（１９９３）；Ｘｉｅら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌ
ｅｓ、３０：６９９７−９８（１９９７）；ならびに米国特許第５，５６３，２
３９号（Ｈｕｂｂｓら）によって記載されている。ＰＨＡの産生のための一般的
な経路を図２に示す。対応するラクトンの直接縮合および開環重合を含む合成ポ
リマーの合成アプローチは、ＪｅｓｕｄａｓｏｎおよびＭａｒｃｈｅｓｓａｕｌ
ｔ、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ２７：２５９５−６０２（１９９４）；米
国特許第５，２８６，８４２号（Ｋｉｍｕｒａ）；米国特許第５，５６３，２３
９号（Ｈｕｂｂｓら）；米国特許第５，５１６，８８３号（Ｈｏｒｉら）；米国
特許第５，４６１，１３９号（Ｇｏｎｄａら）；およびカナダ国特許出願第２，
００６，５０８号において記載されている。ＷＯ９５／１５２６０は、ポリ（３
−ヒドロキシブチレート−コ−３−ヒドロキシバレレートｐｏｌｙ（３−ヒドロ
キシブチレート−ｃｏヒドロキシバレレート）（ＰＨＢＶ）フィルムの製造を記
載し、そして米国特許第４，８２６，４９３号および同第４，８８０，５９２号
（Ｍａｒｔｉｎｉら）は、ＰＨＢおよびＰＨＢＶのフィルムの製造を記載する。
米国特許第５，２９２，８６０号（Ｓｈｉｏｔａｎｉら）は、ＰＨＡコポリマー
であるポリ（３−ヒドロキシブチレート−コ−３−ヒドロキシヘキサノエート）
（ＰＨＢＨ）の製造を記載する。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１５

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００１５】この方法の好ましい実施形態において、貯蔵ポリマーＰＨＡを通常産生しない
微生物を遺伝子操作して、ＰＨＡシンターゼ遺伝子および以下をコードする遺伝
子からなる群より選択されるさらなる導入遺伝子を導入することによってＰＨＡ
を生成する：β−ケトチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ、β−
ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼおよびβ−ヒ
ドロキシアシル−ＡＣＰ−補酵素Ａトランスフェラーゼ（ＡＣＰはアシルキャリヤータンパク質の省略形である）。これらの遺伝子は、好ましくは、３ＨＨポリ
マーの産生のために有利である、コードされる酵素の基質特性に基づいて選択さ
れる。より経済的な原料（例えば、ブチレートまたはブタノール）から３−ヒド
ロキシヘキサンモノマーを産生するために使用され得る有用な変異が記載される
。これらの変異は、当業者に公知の標準的な技術によって記載される本発明を実
施するために適切な細菌において容易に生成され得る。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００４４

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００４４】ＰＨＡは、ヒドロキシ酸モノマー組成物に依存して、広範な種々の型において
生成され得る（ＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌおよびＶａｌｅｎｔｉｎ，ＦＥＭＳＭ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１２８：２１９−２８（１９９５））。ポリメラーゼ酵素がプラスミドにコードされる生物中で合成されたＰＨＡは、ポリメラーゼ酵素が染色体にコードされる生物中で合成されたＰＨＡと比較して、より低い分子量を有する傾向がある（Ｈｕｉｓｍａｎら、「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｐｏｌｙ（３−ｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅｓ）ｂｙｍｕｔａｎｔａｎｄｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｔｒａｉｎｓ」Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３８：１−５（１９９２））。この広
範なポリマー組成物は、等しく広範なポリマー物理特性（４０〜１８０℃の範囲
の融点、−３５〜５℃の範囲のガラス転移温度、結晶化の速度を制御する能力と
合わせられる０％〜８０％の範囲の結晶化度、および５〜５００％の範囲の破断
伸び（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎｔｏｂｒｅａｋ）を含む）を反映する。例えば
、ポリ（３−ヒドロキシブチレート）は、ポリプロピレンの特徴と類似の特徴を
有し、一方、ポリ（３−ヒドロキシオクタノエート）（（Ｒ）−３−ヒドロキシ
オクタノエートと（Ｒ）−３−ヒドロキシヘキサノエートとのコポリマー）型は
、むしろエラストマーと類似に挙動し、そしてより長い側鎖を有するＰＨＡは、
むしろワックスと類似に挙動する。ＰＨＡはまた、可塑化され得、そして他のポ
リマーまたは薬剤とともにブレンドされ得る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:38 Ｃ１２Ｒ 1:22） 1:05 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:065 Ｃ１２Ｒ 1:01）Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 1/21 5/00 ＣＣ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:05） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:065） (72)発明者ヒューズマン，グジャルトダブリュー．アメリカ合衆国カリフォルニア 94070，サンカルロス，ナンバー18，ブリッタンアベニュー 3370 (72)発明者ピープルズ，オリバーピー．アメリカ合衆国マサチューセッツ 02474，アーリントン，ラッドクリフェロード 27 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD08 CA06 CA17 CA19 CB03 CD07 CD09 4B024 AA03 BA80 CA03 DA01 DA05 EA04 GA11 4B064 AD83 CA19 CC24 DA16 4B065 AA01X AA10Y AA12X AA14X AA16Y AA23Y AA26X AA29X AA38Y AA41X AA45Y AB01 AC14 BA02 BB06 BB15 BB16 CA12

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】３−ヒドロキシヘキサノエートを含むポリヒドロキシアルカ
ノエートの生物学的生成のための方法であって、ポリ（３−ヒドロキシブチレー
ト）［ＰＨＢ］ポリメラーゼ、ポリ（ヒドロキシアルカノエート）［ＰＨＡ］ポ
リメラーゼ、β−ケトチオラーゼ、β−ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ、Ｄ−
特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ、クロトナーゼ、ブチリル−ＣｏＡデヒド
ロゲナーゼおよび３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼからなる群
より選択される酵素をコードする少なくとも１つの導入遺伝子を染色体内に組み
込んだトランスジェニック非ヒト生物において、ポリヒドロキシアルカノエート
を合成する工程を包含する、方法。
【請求項２】前記生物が、細菌または植物である、請求項１に記載の方法
。
【請求項３】前記生物が、油料作物植物およびデンプン貯留植物からなる
群より選択される植物である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】前記植物が、アブラナ、ヒマワリ、ダイズ、トウモロコシ、
ベニバナ、アマ、ヤシ、ココヤシ、ジャガイモ、タピオカ、キャッサバ、アルフ
ァルファ、イネ科植物およびタバコからなる群より選択される、請求項３に記載
の方法。
【請求項５】前記生物が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌ
ａ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓお
よびＡｚｏｔｏｂａｃｔｅｒからなる群より選択される細菌である、請求項２に
記載の方法。
【請求項６】前記生物が、Ｃ₆基質を取り込むポリ（ヒドロキシアルカノ
エート）［ＰＨＡ］ポリメラーゼを発現または過剰発現するように遺伝子操作さ
れる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】前記酵素が、Ａｅｒｏｍｏｎａｓｃａｖｉａｅ、Ｃｏｍａ
ｍｏｎａｓｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ、Ｔｈｉｏｃａｐｓｉａｐｆｅｎｉｇ
ｉｉ、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍｖｉｎｏｓｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕ
ｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａｃａｒｏｌｉｎａ、Ｎｏｃａｒｄｉａｓａｌｍｏｎｉ
ｃｏｌｏｒ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｒｕｂｅｒ、Ｒｈｏｄｃｏｃｃｕｓｒ
ｈｏｄｏｃｒｏｕｓおよびＲｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｕｍｒｕｂｒｕｍから得ら
れる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】前記生物が、代謝物を３−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ
の生成へと方向付け変えるように遺伝子操作される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】前記生物が、Ｄ−特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝
子を染色体内に組み込むことによって遺伝子操作される、請求項８に記載の方法
。
【請求項１０】前記ヒドラターゼ遺伝子が、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ、Ｋｌ
ｅｂｓｉｅｌｌａａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｐ．ｐｕｔｉｄａおよびＡｅｒｏｍｏ
ｎａｓｃａｖｉａｅからなる群より選択される細菌から単離される、請求項９
に記載の方法。
【請求項１１】前記生物が、酪酸発酵経路を使用して遺伝子操作される、
請求項８に記載の方法。
【請求項１２】前記酪酸発酵経路が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍａｃｅｔ
ｏｂｕｔｙｌｉｃｉｕｍまたはＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ由来である、請求項１１に記載の
方法。
【請求項１３】前記生物が、ブチレートをブチリルＣｏＡに、またはブチ
リルＣｏＡをクロトニルＣｏＡに変換するように遺伝子操作される、請求項１１
に記載の方法。
【請求項１４】前記生物が、Ｃ₆基質に対して活性である広範なレダクタ
ーゼを発現するように遺伝子操作される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】前記生物が、３−ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを受容す
るポリメラーゼを発現するように遺伝子操作される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】前記生物が、アセトアセチルＣｏＡを受容するチオラーゼ
を発現するように遺伝子操作される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】前記生物が、３−ケトヘキサノイルＣｏＡに特異的なチオ
ラーゼ、３−ケトヘキサノイルＣｏＡに対して活性なレダクターゼ、３−ヒドロ
キシブチリルＣｏＡおよび３−ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを受容するポリ（
ヒドロキシアルカノエート）［ＰＨＡ］ポリメラーゼからなる群より選択される
酵素を発現するように遺伝子操作される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】前記生物が、脂肪酸生合成経路酵素を染色体内に組み込む
ことによって遺伝子操作される、請求項８に記載の方法。
【請求項１９】前記脂肪酸生合成経路酵素が、アシルキャリアタンパク質
［ＡＣＰ］をアシルＣｏＡに変換する酵素である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】前記酵素が、アシルキャリアタンパク質［ＡＣＰ］−Ｃｏ
Ａトランスアシラーゼ、アシルキャリアタンパク質［ＡＣＰ］チオエステラーゼ
およびアシルＣｏＡシンターゼからなる群より選択される、請求項１９に記載の
方法。
【請求項２１】前記酵素が、アシルキャリアタンパク質［ＡＣＰ］チオエ
ステラーゼおよびアシルＣｏＡシンターゼである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】前記酵素が、Ｅ．ｃｏｌｉから得られる、請求項１８に記
載の方法。
【請求項２３】前記生物が、脂肪酸酸化複合体を染色体内に組み込むこと
によって遺伝子操作される、請求項８に記載の方法。
【請求項２４】前記脂肪酸酸化複合体が、Ｓ−３ヒドロキシヘキサノイル
ＣｏＡをエピマー化する酵素および３−ケトヘキサノイルＣｏＡを還元する酵素
からなる群より選択される酵素を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】前記酵素が、Ｎｏｃａｒｄｉａｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏ
ｒから得られる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】前記エピマー化のための酵素が、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａＦａｏＡＢ複合体から得られる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】遺伝子操作される前記生物が、チオラーゼの欠失に起因し
て３−ケトヘキサノイルＣｏＡを蓄積する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】ポリヒドロキシブチレート−コ−３−ヒドロキシヘキサノ
エートを生成するための方法であって、以下：ブチレートまたはブタノール、およびグルコース、スクロース、ラクトース、キシロース、メタノールおよびそれら
の組み合わせからなる群より選択される別の供給材料、をトランスジェニック非ヒト生物に供給する工程を包含する、方法。
【請求項２９】３−ヒドロキシヘキサノエートコポリマーを生成するため
の方法であって、以下：ブチレートを取り込み得、そして該ブチレートをブチリル−ＣｏＡに変換し得
るトランスジェニック非ヒト生物を同定する工程、ブチレートの存在下で該生物を発酵し、その結果、ポリ（３−ヒドロキシブチ
レート−コ−３−ヒドロキシヘキサノエート）［ＰＨＢＨ］が生成される、工程
、および該ポリ（３−ヒドロキシブチレート−コ−３−ヒドロキシヘキサノエート）［
ＰＨＢＨ］を回収する工程、を包含する、方法。
【請求項３０】３−ヒドロキシヘキサノエートコポリマーを生成するため
の方法であって、以下：ブタノールを取り込み得、そして該ブタノールをブチリル−ＣｏＡに変換し得
るトランスジェニック細菌を同定する工程、ブタノールの存在下で該生物を発酵し、その結果、ポリ（アルカノエート）［
ＰＨＡ］が生成される、工程、および該ポリ（アルカノエート）［ＰＨＡ］を回収する工程、を包含する、方法。
【請求項３１】請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法における使用
のための、遺伝子操作された生物。
【請求項３２】細菌である、請求項３１に記載の生物。
【請求項３３】高等植物である、請求項３１に記載の生物。
【請求項３４】遺伝子操作されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＫ
１２において生成される、ポリヒドロキシブチレート−コ−３−ヒドロキシヘキ
サノエート。