ES2344000T3 - Sistemas transgenicos para la fabricacion de poli(3-hidroxi-butirato-co-3-hidroxihexanoato). - Google Patents
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Abstract
Un método para producir copolímeros polihidroxibutirato-co-3-hidroxihexanoato (PHBH) que comprende: sintetizar PHBH en una bacteria transgénica que es capaz de asumir butirato o butanol y convertirlo a butiril-CoA y que se transforma con, y expresa, un transgén que codifica una polimerasa PHA que polimeriza 3-hidroxibutiril-CoA. y 3-hidroxihexanoil-CoA para formar PHBH, donde la bacteria transgénica también expresa (a) un tiolasa que convierte butiril-CoA y acetil-CoA. a 3-CoA ketohexanoil, y (b) una reductasa que convierte la 3-ketohexanoil-CoA a 3-hydroxyhexanoyl-CoA, por fermentación de la bacteria transgénica en presencia de butirato o butanol PHBH de tal manera que se produce, y la recuperación de la PHBH.
Description
Sistemas transgénicos para la fabricación de
poli(3-hidroxi-butirato-co-3-hidroxihexanoato).
La presente invención esta generalmente en el
campo de los materiales polihidroxialcanoatos, y mas concretamente
para mejorar los métodos de producción de los mismos.
Los polihidroxialcanoatos (PHAs) son poliésteres
termoplásticos naturales y pueden ser procesados por técnicas de
polímeros tradicionales para el uso en variedades enormes de
aplicaciones, incluido el envasado de productos de consumo, los
revestimientos de pañales desechables y bolsas de basuras, alimentos
y productos médicos. Los métodos que pueden ser usados para
producir polímeros PHA a partir de microorganismos que producen
naturalmente polihidroxialcanoatos son descritos en la patente U.S.
No. 4,910,145 a Holmes, et al.; Byrom, "Biomateriales
Varios" en Biomateriales (Byrom, ed.) pp. 333-59
(Editores Macmillan, Londres 1991); Hocking y Marchessault,
"Biopoliesteres" en Química y Tecnología de Polímeros
Biodegradables (Griffin, ed.) pp. 48-96 (Chapman
& Hall, Londres 1994); Holmes, "Producido Biológicamente
(R)-3-hidroxialcanoato Polímeros y
Copolímeros" en Desarrollos en Polímeros Cristalinos (Bassett,
ed.) vol. 2, pp. 1-65 (Elsevier, Londres 1988);
Lafferty et al., "La producción microbiana de
Poly-b-hidroxibutírico" en
Biotecnología (Rehm & Reed, eds.) vol. 66, pp.
135-76 (Verlagsgesellschaft, Weinheim 1988); Müller
& Seebach, Angew. Chem. Int. Ed. Engl.
32:477-502 (1993). La ruta de biosíntesis natural
para la producción de polihidroxibutirato (PHB) se muestra en la
Figura 1.
Los métodos para la producción en organismos
PHAs naturales o genéticamente modificados son descritos por
Steinbüchel, "Ácidos Polihidroxialcanoicos" en Biomateriales
(Byrom, ed.) pp. 123-213 (Editores Macmillan,
Londres 1991); Williams & Peoples, CHEMTECH,
26:38-44 (1996); Steinbüchel & Wiese, Appl.
Microbiol. Biotechnol., 37:691-97 (1992); U.S.
Patentes Nos. 5,245,023; 5,250,430; 5,480,794; 5,512,669; 5,534,432
a Peoples y Sinskey (el cual revela y afirma los genes que
codifican reductasa, tiolasa, y la polimerasa PHB); Agostini et
al., Polym. Sci., Part A-1,
9:2775-87 (1997); Gross et al.,
Macromoléculas, 21:2657-68 (1988); Dubois, et
al., Macromoléculas, 26:4407-12 (1993); Le
Borgne & Spassky, Polímero, 30:2312-19 (1989);
Tanahashi & Doi, Macromoléculas, 24:5732-33
(1991); Hori et al, Macromoléculas,
26:4388-90 (1993); Kemnitzer et al.,
Macromoléculas, 26:1221-29 (1993); Hori et
al., Macromoléculas, 26:5533-34 (1993); Hocking
& Marchessault, Polym. Bull., 30:163-70 (1993);
Xie et al., Macromoléculas, 30:6997-98
(1997); y la patente U.S. No. 5,563,239 a Hubbs et al. Una
vía general para la producción de PHAs se muestra en la figura 2.
Los enfoques de síntesis del polímero sintético incluyendo
condensación directa y polimerización de anillo abierto de las
lectonas correspondientes son descritas en Jesudason &
Marchessault, Macromoléculas 27:2595-602 (1994);
Patente U.S. No. 5,286,842 a Kimura; Patente U.S. No. 5,563,239 a
HUbbs et al., Patente U.S. No. 5,516,883 a Hori et
al., Patente U.S. No. 5,461,139 a Gonda et al.; y
Solicitud de Patente Canadiense No. 2,006,508. WO 95/15260 describe
la fabricación de películas
poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato)
(PHBV), y Patentes U.S. Nos. 4,826,493 y 4,880,592 a Martini et
al. describen la fabricación de películas PHB y PHBV. Patente
U.S. No. 5,292,860 a Shiotani et al. describe la fabricación
del copolímero PHA
poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxihexanoato)
(PHBH).
A la fecha, los PHAs han tenido limitada
disponibilidad comercial, siendo solo disponible el copolímero PHBV
en cantidades para desarrollo. Este copolímero ha sido producido por
fermentación de la bacteria Ralstonia eutropha. Procesos de
fermentación para la producción de otros PHAs han sido desarrollado
(Williams & Peoples, CHEMTECH 26:38-44 (1996)).
Los cultivos de plantas también están siendo diseñados genéticamente
para producir estos polímeros, ofreciendo una estructura de costes
en línea con los aceites vegetales y competitividad directa en
precio con los polímeros a base de petróleo (Williams & Peoples,
CHEMTECH 26:38-44 (1996)).
Varios factores son críticos por la producción
biológica económica de PHAs, incluidos los costes de sustratos,
tiempo de fermentación, y la eficiencia de operaciones posteriores
de transformación. Para la fermentación a gran escala de productos
básicos, es generalmente conocido que el sistema basado en plásmido
no es satisfactorio debido a la carga extra de mantenimiento de los
plásmidos y problemas en el mantenimiento de la expresión
estable.
Los sistemas biológicos conocidos para la
producción de PHAs conteniendo
3-hidroxi-co-hidroxihexanoato
(3H-co-HH) son ineficientes. Por
ejemplo, Shimamura, et al., Macromoléculas, 27:878 (1994)
revela que las Aeromonas caviae sintetiza un compuesto PHA
de 3-hidroxibutirato y
3-hidroxihexanoato (3HH) cuando se cultivan en
aceite de oliva o ácidos grasos de C_{12} a C_{18}. Se determinó
que la fracción del monómero 3HH es dependiente de la concentración
de la fuente de carbono y el tiempo de fermentación y puede llegar a
niveles de 25% (Doi, et al., Macromoléculas, 28:4822
(1995)). Como resultado del crecimiento de niveles de sustrato de
3HH, la cristalinidad, temperatura de fusión, y la temperatura de
transición del vidrio de los PHA decrecen. Estos cambios en
propiedades físicas llevan a un aumento de susceptibilidad a la
degradación por depolimerasa PHB de Alcaligenes faecalis.
Otro microorganismo natural que incorpora niveles bajos de 3HH en un
copolímero PHB son Comamonas testosteroni y Bacillus
cereus (Huisman, et al., Appl. Environ. Microbiol.
55:1949 (1989); Caballero, et al., Int. J Biol. Macromol.,
17:86 (1995)). Las cepas de Pseudomonas putida GPp104
recombinante en las que los genes phb de cualquier
Thiocapsia pfenigii o Chromatiun vinosum fueron
introducidos también acumularon PHA con
3-hidroxihexanoato como componente principal.
PHAs están divididos generalmente en dos clases
basados en la composición del polímero: PHAs de cadena lateral
corta y PHAs de cadena lateral larga . La incorporación de
monómeros de un grupo dentro de un PHA perteneciente a otro
usualmente es limitada a niveles bajos. En algunos casos donde los
monómeros son abundantes para ambos PHAs, la bacteria generalmente
produce gránulos de PHA por separado cada uno comprendiendo un tipo
de PHA. Las especificidades de sustrato de las polimerasas PHA
pueden en consecuencia ser generalizadas como optimas para las
cadenas laterales cortas (C_{4} y C_{5}) o cadenas laterales
medias (C_{8}-C_{10}). Basado en la composición
de los PHAs sintetizados por microorganismos individuales, pueden
ser identificadas polimerasas PHA que incorporan
3-hidroxihexanoato. Así, las polimerasas PHA de
A. caviae, C. testosteroni y T. pfenigii son
conocidas por incorporar 3-hidroxihexanoato en la
PHA, considerando que los enzimas de Paracoccus denitrificans,
Sphaerotilus natans y Rhodococcus sp. tienen preferencia
por 3-hidroxivalerato. Las polimerasas PHA de estos
últimos organismos también son útiles para hacer copolímeros
PHB-co-HH, debido a su preferencia
por C_{5} sobre C_{4}. Lamentablemente, sin embargo, estas
bacterias tienen una baja tasa de crecimiento, a veces son
difíciles de romperse, y solo tienen una docilidad limitada a la
ingeniería genética. Es en consecuencia deseable desarrollar formas
de producción de PHAs más rentables y eficientes que contengan
3H-co-HH por sistemas
biológicos.
Es por lo tanto un propósito de la presente
invención el proveer sistemas de ingeniería genética para la
producción de polímeros polihidroxialcanoatos incluyendo
3-hidroxihexanoato monómeros (HHPHA).
Es otro propósito de esta invención el proveer
mutaciones útiles las cuales pueden ser usadas para producir
monómeros 3-hidroxihexanoicos a partir de materias
primas mas económicas, tales como butirato o butanol.
Es además un propósito de esta invención el
proveer genes adecuados para la conversión de metabolitos celulares
derivados de materias primas de carbohidratos para
Butiril-CoA para la producción de comonómeros
3-hidroxiexanoatos.
Es otro propósito de esta invención el proveer
métodos mejorados en la producción de PHAs conteniendo
3-hidroxihexanoato como comonómero.
Es todavía otro propósito de esta invención el
proveer nuevos caminos en sistemas biológicos para la síntesis
endogena del monómero 3-hidroxihenanoato.
Es además un propósito de esta invención el
proveer sistemas biológicos de ingeniería genética para la
producción de PHAs conteniendo 3-hidroxihexanoato
en los que la expresión es suficiente y estable.
Se descubrió que los sistemas biológicos para la
producción de PHAs conteniendo
3-hidroxi-co-hidroxihexanoato
(3H-co-HH) pueden ser mejorados
usando organismos transgénicos con velocidades de crecimiento muy
rápidas y/o por ingeniería genética de estos organismos para
producir el ácido co monómero 3-hidroxihexanoico a
partir de materias primas mas baratas, tales como butirato y
butanol, o directamente de glucosa por la incorporación de motores
codificando codificación de genes que pueden canalizar los
intermediarios celulares a butiril-CoA, mejorando
por ello la economía de producción de PHA usando organismos
transgénicos. Estos procesos están basados en ingeniería genética
de bacterias tales como Escherichia coli o en cultivos de
plantas como sistemas de producción el cual incluye genes
biosinteticos PHA de productores de PHA tales como R.
eurropha y P. putida. En una realización preferida del
método, genes adicionales son introducidos en productores PHB
transgénicos, de este modo creando nuevas sepas que sintetizan
monómeros tales como 3HH los cuales son incorporados en PHAs.
En consecuencia, como un primer aspecto, la
presente invención provee un método para la producción de
copolímeros
polihidroxibutirato-co-3-hidroxihexanoato
(PHBH) comprendiendo:
sintetizar PHBH en una bacteria transgénica que
es capaz de tomar butirato o butanol y convertirlo a
butiral-CoA y que es transformado con, y expresa,
un transgen que codifica una polimerasa PHA que polimeriza
3-hidroxi-butiril-CoA
y 3-hidroxihexanoil-CoA para formar
PHBH, donde la bacteria transgénica también expresa
a) una tiolasa que convierte
butiral-CoA y acetil-CoA a
3-cetohexanoil CoA, y
b) una reductasa que convierte
3-cetohexanoil-CoA a
3-hidroxihexanoil-CoA,
fermentando la bacteria transgénica en presencia
de butirato o butanol de tal manera que se produce PHBH, y la
recuperación de PHBH.
\vskip1.000000\baselineskip
El gen polimerasa PHA usado en el primer aspecto
de la presente invención puede ser incorporado en el cromosoma de
la bacteria.
El gen polimerasa PHA utilizado en el primer
aspecto de la presente invención puede ser de una bacteria
seleccionada de Aeromonas caviae, Comamonas testosteroni,
Thiocapsia pfenigii, Chromatium vinosum, Bacillus cereus, Nocardia
carolina, Nocardia salmonicolor, Rhodococcus ruber, Rhodcoccus
rhodocrous, o Rhodospirilum rubrum.
La bacteria transgénica usada en el primer
aspecto de la presente invención puede ser transformada con un
transgén codificando la tiolasa mencionada en la parte (a) anterior
y/o con un transgén codificando la reductasa mencionada en la parte
(b) anterior.
La bacteria transgénica usada en el primer
aspecto de la presente invención puede ser un E. coli,
Klebsiella, Ralstonia (tal como Ralstonia eutropha),
Alcaligenes (tal como Alcaligenes lactus),
Pseudomonas (tal como Pseudomonas putida) o
Azotobacter.
En una realización, la bacteria transgénica
usada en el primer aspecto de la presente invención puede ser E.
coli que ha sido transformado con un transgén codificando la
tiolasa mencionada en la parte (a) anterior, y un transgén
codificando la reductasa mencionada en la parte (b) anterior.
El método del primer aspecto de la presente
invención puede utilizar una bacteria transgénica que exprese los
tres enzimas de la vía de fermentación de butirato de Clostridium
acetobutylicium que forma butiril-CoA.
Los microorganismos que no producen normalmente
el polímero PHA de almacenamiento pueden ser diseñados genéticamente
para producir PHA por la introducción de un gen sintasa PHA y
transgenes adicionales seleccionados del grupo que comprende los
genes codificados \beta-cetotiolasa,
acetoacetil-CoA reductasa,
\beta-cetoacil-CoA reductasa,
enoil-CoA hidratasa y
\beta-hidroxiacil-PTA-coenzima
A transferasa (PTA es la abreviatura de la proteína transportadora
de acilo). Los genes son preferiblemente seleccionados sobre la base
de que la especificidad de sustrato de sus enzimas codificados sea
beneficiosa para la producción de los polímeros 3HH. Las mutaciones
útiles que pueden ser usados para producir
3-hidroxihexanoico monómeros de materias primas mas
económicas, tales como butirato o butanol, son descritas. Estos
mutantes pueden ser fácilmente generados en las bacterias adecuadas
para la práctica de la invención descrita mediante las técnicas
estándar conocidas por los expertos en la materia.
Los métodos para la ingeniería de los organismos
transgénicos que sintetizan PHAs conteniendo
3-hidroxihexanoato como comonomero son descritos en
este documento. El método puede ser usado para modificar por
ingeniería ya sea (1) una bacteria como la Escherichia coli,
Klebsiella, Ralstonia eutropha, Alcaligenes latus, Pseudomonas
putida u otros microorganismos que puedan sintetizar PHAs, o (2)
una planta superior, como la semilla de un cultivo de aceite (ej.,
col, girasol, soja, maíz, cártamo, lino, palma o coco) o plantas que
acumulan fécula (ej., patata, yuca o mandioca). Estas son
examinadas para identificar actividades de los enzimas convenientes
para la conversión de los intermediarios metabólicos en
R-3-hidroxihexanoil CoA,
específicamente actividad de dehidrogenasa butiril CoA y
actividades de sintasa acil CoA:PTA. Esta ultima conversión es
catalizada o bien por una proteína simple o por una combinación de
actividades de sintasa tiosterasa y acil CoA. El flujo de
metabolitos normales celulares a 3-hidroxihexanoato
es redirigido vía una o mas de las tres diferentes vías. Estas tres
vías generan 3-hidroxihexanoato, bien (1) usando una
vía de fermentación de butirato de Clostridium
acetobutylicium, o (2) usando ácido graso de enzimas de la
biosíntesis de E. coli, o (3) usando el complejo de
oxidación de ácido graso de Pseudomonas putida. Los ejemplos
muestran una bacteria expresando una sintasa funcional PHA de una
transgén están descritos, junto con loa métodos para expresar estos
genes en cultivos de plantas transgénicas.
Los métodos para seleccionar genes que
codifiquen enzimas los cuales convierten cortonil CoA a buturil CoA
son descritos, tanto como los métodos de detección que identifican
las enzimas que acil PTA intermediarios en acil-CoA
o en precursores de acil CoA para biosíntesis de PHA. Cepas
transgénicas E. coli en las que un gen codificando una
polimerasa PHA es integrado en el cromosoma y expresado a niveles de
apoyo de la síntesis son provistas. Tales cepas transgénicas, las
cuales también tienen mutaciones específicas en el cromosoma,
permiten la selección y detección de estas actividades usando
bibliotecas genómicas de diferentes fuentes biológicas.
Se describen los procedimientos para la
ingeniería de nuevas vías en sistemas biológicos para la síntesis
endógena del 3-hidroxihexanoato monómero.
Por ejemplo, E. coli puede ser modificada
para sintetizar PHBH ya sea de materias primas de bajo costo de
carbohidratos tales como glucosa, sacarosa, xilosa y lactosa y
mezclas de tales carbohidratos y ácidos grasos como única fuente de
carbono introduciendo genes que codifican enzimas que convierten los
metabolitos celulares a 3-hidroxihexanoil CoA en el
E. coli. Para la síntesis eficiente de PHA en cepas E.
coli recombinantes, es crucial que la expresión de todos los
genes involucrados en la vía sean adecuados. Con este fin, los
genes de interés pueden ser expresados a partir de moléculas de ADN
extracromosómicos tales como plásmidos, lo que resulta
intrínsicamente en un efecto de número de copias y en consecuencia
niveles de expresión elevados, o pueden ser expresados a partir del
cromosoma. Para fermentaciones en gran escala de productos básicos
es conocido por lo general que sistemas basados en plásmidos no son
satisfactorios debido a la carga extra de mantener los plásmidos y
los problemas de expresión estable. Estos inconvenientes pueden
superarse utilizando enzimas codificados cromosómicamente y/o
mediante la mejora de las señales de transcripción y traslación que
preceden al gen de interés de forma que tal expresión es suficiente
y estable.
Fig. 1 es una esquemática de una vía para la
biosíntesis de PHB.
Fig. 2 es una esquemática de una vía general
para la biosíntesis de PHA.
Fig. 3 es una esquemática de una vía preferida
para la biosíntesis de PHBH usando la vía de fermentación butirato
Clostridium acetbutylicum.
Fig. 4 es una esquemática de una vía preferida
para la biosíntesis de PHBH usando la vía de oxidación de los
ácidos grasos.
Fig. 5 es una esquemática de una vía preferida
para la biosíntesis de PHBH usando la vía de ácidos grasos.
Fig. 6 es una esquemática de construcción de
pMLXp1 C7 gato y pMLXp13C7 gato para la integración del gen
polimerasa PHA de N. salmonicolor en el cromosoma de E.
coli.
Fig. 7 es una esquemática de selección para
genes crotonasa y hidroxibutril CoA dehidrogenosa por
complementación de una mutación E. coli fadB.
Fig. 8 es una esquemática de selección de los
genes de butiril CoA deshidrogenasa por complementación de una cepa
E. coli. que es fenotipicamente defectuosa fadE.
Fig. 9 es una esquemática de selección para una
vía recombinante de PHBH en E. coli usando el gen polimerasa
PHA phaC de P. Putida.
Fig. 10 es una esquemática de un procedimiento
de detección preferido para genes que codifican enzimas que
convierten acil ACP a acil CoA con el uso del sistema Vibrio
fischeri lux.
El metabolismo de cualquier organismo de
producción HA, incluyendo la bacteria y cultivo de plantas, puede
ser redirigido para abastecer metabolitos específicos para síntesis
de PHA por diseño metabólico. Con el fin de hacer que este enfoque
sea efectivo, es necesario desarrollar nuevas vías bioquímicas que
conduzcan al monómero deseado a partir de intermediarios
metabólicos comunes. No es necesario que tal vía exista en un
organismo ya que puedan ser reconstituidos pasos individuales en la
producción del organismo elegido usando técnicas de diseño
genético. Procesos desarrollados para la incorporación de monómeros
alternativos que son derivados de materias primas suplementadas
tienen inconvenientes específicos. En primer lugar, añadir
suministros complementarios en el fermentador es tan costoso como
ampliar la infraestructura e imponer un control de calidad
adicional. En segundo lugar, la adición de monómeros precursores en
los suministros necesita ser muy bien controlada para alcanzar una
composición constante del conjunto de monómeros y la composición de
PHA.
Un enfoque similar en métodos de diseño
metabólico ha sido por lo tanto desarrollado el cual permite la
producción de PHBH en organismos, tales como R. eutropha, C.
Testosteroni, A. vinelandii y P. denitrificans, así como
en los sistemas microbianos transgénicos y cultivo de plantas que
expresa una sintasa PHA de un gen o genes heterologos.
Varios tipos de PHAs son conocidos. Es útil en
general el dividir los PHAs en dos grupos de acuerdo con la
longitud de sus cadenas laterales y de acuerdo con sus vías para la
biosíntesis. Aquellos con cadenas laterales cortas, como el
polihidroxi-butirato (PHB), un homopolímero de
unidades de ácidos de
R-3-hidroxibutirico, son
termoplásticos cristalinos; PHAs con cadenas laterales largas son
mas elastoméricos. Los primeros polímeros se conocen desde hace
aproximadamente setenta años (Lemoigne & Roukhelman 1925),
mientras que los polímeros más modernos son un descubrimiento
relativamente reciente (deSmet, et al., J. Bacteriol.,
154:870-78 (1983)). Antes de esta designación, sin
embargo se identificaron, PHAs de origen microbiano conteniendo a la
vez unidades de ácidos
R-3-hidroxibutirico y unidades de
cadenas laterales mas largas de C_{5} a C_{16} (Wallen &
Rowheder, Environ. Sci. Technol., 8:576-79 (1974)).
Un numero de bacterias que producen polímeros de ácido
D-3-hidroxibutirico y uno o mas
unidades de cadenas laterales largas hidroxiacido conteniendo de
cinco a sesenta átomos de carbono han sido identificados
recientemente (Steinbuchel & Wiese, Appl. Microbiol.
Biotechnol., 37:691-97 (1992)); Valentin et
al., Appl. Microbiol Biotechnol., 36: 507-14
(1992); Valentin et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 40:
710-16 (1994); Abe et al., Int. J. Biol.
Macromol., 16: 115-19 (1994); Lee et al.,
Appl. Microbiol. Biotechnol., 42: 901-09 (1995);
Kato et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 45:
363-70 (1996); Valentin et al., Appl.
Microbiol. Biotechnol., 46: 261-67 (1996); Patente
U.S. No. 4,876,331 to Doi). Ejemplos útiles de copolímeros de dos
componentes específicos incluyen
PHB-co-3-hidroxihexanoato
(Brandl et al., Int. J. Biol. Macromol., 11:
49-55 (1989); Amos & McInerey, Arch.
Microbiol., 155: 103-06 (1991); Patente U.S. No.
5,292,860 to Shiotani et al.). Otros PHAs representativos
son descritos en Steinbüchel & Valentin, FEMS Microbiol. Lett.,
128:219-28 (1995). Los métodos sintéticos químicos
han sido también aplicados para la preparación de copolímeros
racemicos PHB de este tipo para aplicaciones de prueba (PCT WO
95/20614, PCT WO 95/20615, y PCT WO 96/20621).
Pesos moleculares útiles de los polímeros están
entre unos 10,000 y 4 millones Daltons, y de preferencia entre unos
50,000 y 1,5 millones Daltons. Los PHAs de preferencia contienen una
o mas unidades de la siguiente formula:
-OCR^{1}R^{2}(CR^{3}R^{4})_{n}CO-
donde n es 0 o un entero;
y
donde R^{1} R^{2}, R^{3} y R^{4} son
seleccionados independientemente de hidrocarbonos radicales
saturados y no saturados, radicales sustituidos halo- y hidroxi-,
radicales hidroxi, radicales halogen, radicales de nitrógeno
sustituido, radicales de oxigeno sustituidos y átomos de
hidrógeno.
Las unidades monoméricas incluyen generalmente
unidades hidroxibutirato, hidroxivalerato, hidroxihaxanoato,
hidroxiheptanoato, hidroxioctanoato, hidroxinonanoato,
hidroxidecanoato, hidroxiundecanoato, y hidroxidodecanoato. Los
PHAs pueden incluir monómeros y polímeros y derivados de
3-hidroxiacidos, 4-hidroxiacidos y
5-hidroxiacidos.
Los PHAs pueden ser preparados de una fuente
biológica tal como un microorganismo que produzca naturalmente PHAs
y el cual pueda ser inducido a producir los PHAS deseados por
manipulación de condiciones de cultivo y las materias primas, estos
u otros microorganismos diseñados genéticamente como se describe en
este documento, u organismos superiores, como plantas, los cuales
han sido diseñados genéticamente para producir los PHAs.
Fuentes adecuadas de los genes de la sintasa PHA
son identificados fácilmente mediante el análisis de las
composiciones de productos PHA cuando se cultivan en ácidos grasos y
luego aislando los genes de la sintasa de PHA mediante métodos
bien conocidos por los expertos en la materia. Genes útiles de
sintasa PHA han sido aislados de, por ejemplo, Aeromonas
caviae (Fukui & Doi, J. Bacteriol 179:
4821-30 (1997)), Rhodospirillum rubrum
(Patente U.S. No. 5, 849,894), Rhodococcus ruber (Pieper
& Steinbuechel, FEMS Microbiol. Lett. 96 (1):
73-80 (1992)), y Nocardia corallina (Hall
et. al., Can. J Microbiol. 44: 687-91
(1998)).
Estudios in vitro de polimerasas PHB han
mostrado que el enzima de Z. ramigera
I-16-M es estrictamente especifico
para el R-isomero de
3-hidroxibutiril CoA (Fukui, et al., Arch.
Microbiol., 110: 149 (1976)). La polimerasa PHB de R.
eutropha es altamente especifico para el monomero
3-hidroxibutiril CoA y muestran solo un 7.5% de
actividad hacia 3-hidro-valeril CoA.
Sin actividad con 3-hidroxihexanoil CoA o mas
3-hidroxiacil CoAs fueron detectados en los
estudios in vitro (Haywood, et al., FEMS Microbiol.
Lett., 57:1 (1989)).
La reductasa acetoracetil CoA ligada a NADPH de
Z. ramigera es mas activa con acetoacetilo CoA, mientras que
3-cetovaleril CoA (41% de la actividad maxima) y
3-cetohexanoil CoA (0.6%) fueron también sustratos
para el enzima (Ploux, et al., J. Biochem., 174: 177
(1988)). En R. eutropha, las actividades de reductasa para
3-cetovaleril CoA y 3-cetohexanoil
CoA son respectivamente 48% y 3.6% de la actividad que fue
determinada por acetoacetil CoA (Haywood, et al., FEMS
Microbiol. Lett., 52:259 (1988)). En adición, R. eutropha
tiene una actividad dependiente de NADH hacia
S-3-hidroxiacil CoAs que es la más
alta para los sustratos C_{4} y C_{8}.
R. eutropha tiene también dos
3-cetotiolasas (A y B) que tienen la actividad mas
elevada hacia los sustratos acetoacetilo CoA y solo el 3% de la
actividad máxima hacia 3-cetovaleril CoA (Haywood,
et al., FEMS Microbiol. Lett., 52:91 (1988)). Mientras que
el enzima A es 10 veces mas activo y estrictamente especifico para
esos dos sustratos, el enzima B también tiene 1-2%
de actividad para los superiores 3-cetoacil
CoAs.
En resumen, la síntesis de monómeros
3-hidroxihexanoil-CoA con los
enzimas PHB de R. eutropha o Z. ramigera puede ser
mejorada identificando y usando genes tiolasa y/o reductasa con
especificidad ventajosa de sustrato para
3-cetohexanoil-CoA. Es por tanto
necesario identificar y aislar actividades codificadas de genes que
puedan aportar 3-hidroxihaxanoil CoA para
biosíntesis de PHA.
N. salmonicolor es un miembro del genero
Rhodococcus del cual es conocido que incorpora niveles
elevados de 3-hidroxivalerato en PHAs cuando crecen
en azucares simples como fuente de carbono. Esta característica
sugiere que los enzimas biosintéticos PHB de N. salmonicolor
es probable que tengan un rango de sustrato mas amplio que otros
enzimas biosinteticos de PHB, tales como aquellos de R.
eutropha. Los genes codificando polimerasa PHB y reductasa
acetoacetil CoA fueron amplificados por reacción en cadena de
polimerasa usando iniciadores que fueron basados en la secuencia de
nucleótidos del gen phaC de Rhodococcus ruber y
regiones conservadas en los extremos terminales N y C de las
conocidas dehidrogenosas acetoacetil CoA. Fragmentos de ADN
conteniendo los genes phbB y phbC de N.
salmonicolor fueron identificados en compendios genómicos por
transferencia de Southern usando los productos PCR correspondientes
como detectores. Un fragmento de 3.6 kb BamHI (phbC) y de 4.2 kb
PvuII (phbB) fueron clonados en pUC119 e identificados por análisis
de colonias usando los productos PCR correspondientes como
detectores.
Una vía biosintética que resulta en una
formación R-3-hidroxihexanoil CoA
involucra la extensión de butiril CoA a
3-cetohexanoil CoA el cual puede subsecuentemente
ser reducido al monómero precursor, como se muestra en la fig. 3.
Butiril CoA esta formado por la fermentación de organismos butirato
tales como C. acetobutylicum en una vía de cuatro pasos de
acetil CoA. El alargamiento de butiril CoA a
3-cetohexanoil CoA es catalizado por una tiolasa.
La vía completa de este modo implica (1) la tiolasa biosintética
PHB, (2) los tres enzimas de C. acetobutylicum que forman
butiril CoA, (3) una segunda tiolasa, especifica para
3-cetohexanoil CoA, (4) una reductasa especifica
para este substrato, y (5) una polimerasa PHB que acepte ambas
3-hidroxibutiril CoA y
3-hidroxihexanoil CoA.
El C. acetobutylicum locus involucrado en
la fermentación de butirato codifica 5 enzimas/proteínas: crotonasa
(crt), butiril CoA dehidrogenasa (bcd), 2 proteínas
ETF para el transporte de electrones (etfA y etfB), y
3-hidroxibutiril CoA dehidrogenasa (hbd)
(Boynton et al., J. Bacteriol. 178:3015 (1996)). Otro
organismo del cual estos genes han sido aislados es el
Thermoanaerobacterium thermosoccharolyticum (van Rinsum, Gen
Back Acc. No.). Hbd y crt han sido aislados de C.
difficile también (Mullany et al., FEMS Microbiol. Lett.
124:61 (1994)). Ha sido detectada actividad de dehidrogenasa
3-hidroxibutiril CoA en Dastricha ruminatium
(Yarlett et al., Biochem. J. 228:187 (1995)), Butyrivibrio
fibrisolvens (Miller & Jenesel, J. Bacteriol., 138:99
(1979)), Treponema phagedemes (George & Smibert, J.
Bacteriol., 152:1049 (1982)), Acidaminococcus fermentans
(Hartel & Buckel, Arch. Microbiol., 166:350 (1996)),
Clostridium kluyveri (Madan et al., Eur. J. Biochem.,
32:51 (1973)), Syntrophospora bryanti (Dong & Stams,
Antonie van Leeuwenhoek, 67:345 (1995)); la actividad de crotonasa
ha sido detectada en Butyrivibrio fibrisolvens (Miller &
Jenesel, J. Bacteriol., 138:99 (1979)); y butiril CoA actividad de
dehidrogenasa ha sido detectada en Megasphaera elsdenii
(Williamson & Engel, Biochem. J., 218:521 (1984)),
Peptostreptococcus elsdenii (Engel & Massay, Biochem.
J., 1971, 125:879), Syntrophospora bryanti (Dong & Stams,
Antonie van Leeuwenhoek, 67:345 (1995)), y Treponema
phagedemes (George & Smibert, J. Bacteriol., 152:1049
(1982)).
Para todos los CoA que envuelven tiolasas
conocidos hasta ahora la reacción procede principalmente en la
dirección catabólica. También, la tiolasa codificada por
phbA degrada preferiblemente acetoacetil CoA. Así, en una
vía biosintética a 3-cetohexanoil CoA una tiolasa
catabólica puede ser usada si la reacción es retirada en la
dirección anabólica por una reductasa y polimerasa PHA. Además de
las tiolasas PHB conocidas, genes codificando estas enzimas se
pueden obtener de un rango de bacterias, mamíferos y plantas. De
hecho, E. coli tiene cinco tiolasas que han sido caracterizadas
pobremente, a la vez bioquímicos y fisiológicamente. Dos de estas
tiolasas son codificados por genes previamente identificados,
fadA y atoB, mientras que otras tres están codificados
por marcos de lectura abierta que no han sido estudiados. Estas
tiolasas fueron sobreexpresadas y ensayadas con diferentes
sustratos en ensayos in vitro. Los genes de reductasa y
polimerasa son tomados de N. salmonicolor o cualquier otro
productor de PHA que incorpore monómeros C_{6}.
En P. putida monómeros para biosíntesis
PHA son derivados de la vía de oxidación de los ácidos grasos
cuando alcanos o alcanos oxidados son provistos como fuente de
carbono y energía. El intermedio en esta vía que es canalizado a la
biosíntesis de PHA se postula que es
S-3-hidroacil CoA (de preferencia
C_{8} y C_{10}) que sea objeto de epimerizacion por el complejo
FaoAB al isomero-R. La acción combinada de epimerasa
y polimerasa PHA provee monómeros C_{6} a C_{14} para PHA.
Consecuentemente, una combinación de esta epimerasa y un
3-hidroxihexanoil CoA aceptando polimerasa PHA
proveen la capacidad biosintética para sintetizar PHBH de ácidos
grasos en organismos transgénicos, como se muestra en la fig. 5.
Pueden derivarse de acetil CoA mezclas de ácidos grasos y
carbohidratos que son materias primas útiles para la producción
fermentativa como el monómero 3HB mientras que el componente 3HH es
de ácidos grasos. Para cultivo de plantas, la síntesis del monómero
3-hidroxihexanoato procede anabólicamente de
acetil-CoA, o catabolicamente de ácidos grasos.
La actividad epimerasa ha sido detectada en los
complejos de oxidación de los ácidos grasos de E. coli
(FadAB) (Pramanik et al., J. Bateriol. 137:469 (1979)) y P.
frágil FaoAB (Imamura et al., Biochem. 107:184 (1990)). El
complejo FaoAB de P. putida KT2442 fue examinado después que
las subunidades fueran clonadas en el vector sobreexpresion pTrcN y
este complejo demuestra actividad epimerasa hacia
3-hidroxioctanoil CoA, actividad limitada hacia
3-hidroxibutiril CoA y niveles fuertemente
detectables hacia
3-hidroxioctanoil-1 CoA. Estos
resultados sugieren que el complejo FaoAB puede ser un factor
determinante en la especificad del sustrato de la vía PHA en P.
putida. Consecuentemente, complejos FaoAB de otras fuentes
pueden ser usados para generar nuevos conjuntos
3-hidroxiacil CoA en organismos recombinantes,
procarióticos, eucarióticos o archaeic. Genes homólogos son
fácilmente aislados de la bacteria como el R. eutropha, A. latus,
C. testosteroni, P. denitrificans, R. ruber y otros
productores o no productores de PHA usando los mismos métodos para
identificar los genes faoAB en P. putida KT2442.
P. putida y P. aeruginosa
sintetizan PHAs compuestos de ácidos grasos
3-hidroxi de longitud de cadena media cunado crecen
en azucares. El monómero predominante en estos PHAs es
3-hidroxidecanoato. Una vía similar puede ser
diseñada para la síntesis de PHBH ya sea en microorganismos
recombinantes tales como E. coli, R. Eutropha y P.
putida, así como las semillas de aceite de los cultivos
transgénicos, como se muestra en la fig. 5. Además de una
polimerasa que acepte los precursores
3-hidroxibutiril CoA y
3-hidroxihexanoil CoA, es requerida también una
actividad enzimatica que convierte 3-hidroxiacil ACP
en 3-hidroxiacil CoA o 3-cetoacil
ACP en 3-cetoacil CoA. Ya que esta actividad está
presente en P. putida el gen correspondiente puede ser
identificado y aislado por procedimientos de detección.
Desregulación de la biosíntesis de ácidos grasos y el aumento de
actividad de esta vía provee subsecuentemente el sustrato para la
formación de PHBH.
La actividad enzematica crítica en esta vía es
la conversión de 3-hidroxiacil ACP al derivado CoA.
Las tiosterasas y sintasas acil CoA son ampliamente conocidos por
su acción combinada que puede realizar este paso. Alternativamente,
una nueva actividad, transferasa acil ACP:CoA, puede facilitar este
paso en la vía PHA y puede consecuentemente ser identificada en la
bacteria que produce PHA de fuentes de carbono oxidado tales como
los carbohidratos.
Para la producción eficiente de PHA, es
importante que las cepas no pierdan la capacidad de sintetizar el
biopolímero para la duración de la cepa de inoculo y el ciclo de
producción. La perdida de cualquiera de los genes phb resulta en la
perdida del producto considerando que la perdida de cualquiera de
los genes que proveen nuevos monómeros resulta en la formación de
productos heterogéneos. Ambas son indeseables y una propagación
estable de la cepa es por tanto requerida. Se determinó que a
integración de los genes en las cepas descritas en los ejemplos era
estable por lo menos para unas 50 generaciones, suficientes para la
producción en recipientes de fermentación industrial de 250,000
L.
El crecimiento y morfología de estos productores
de PHA recombinante no esta comprometido por la presencia de genes
phb en el cromosoma. Durante los procedimientos de selección son
seleccionados ,integrantes individuales en placas mínimas medias
eludiendo el aislamiento de las cepas auxotroficas. Las velocidades
de crecimiento de los diferentes integrantes phb fueron similares a
las del tipo salvaje de cepas E. coli del cual fueron
derivados los productores PHB. La adición de genes phb al cromosoma
del E. coli no afecto la transformación posterior de estas
cepas, ya que todavía fueron fácilmente lisadas por métodos
convencionales.
PHAs pueden ser usadas en aplicaciones de
moldeo, en particular para productos envasados de consumo tales
como botellas, estuches para cosméticos, hojas de pañales, plumas,
soportes de golf y artículos personales, tales como las Patentes
U.S. Nos. 3,072,538; 3,107,172; y 4,900,299, las cuales describen
aplicadores de tampones moldeados, y en películas de PHA puro o
mezclas o laminados de PHA con otros materiales tales como los
esteres de fécula o polímeros sintéticos. En muchas aplicaciones,
los polímeros son primero formados en fibras y las fibras son luego
usadas para construir materiales tales como telas no tejidas.
Los polímeros pueden también ser usados en
formulaciones adhesivas termoplásticas y adhesivas sensibles a la
presión, y para sustituir a los polímeros petroquímicos utilizados
en toner y composiciones de desarrolladores (Pat. U.S. No.
5,004,664) y como electrolitos de polímero conductor de iones (PAT.
U.S. No. 5,266,422). Una serie de características de los polímeros
de polihidroxialcanoatos los hacen particularmente atractivo como
aglutinantes de polvo de metal, polvo de cerámica o un proceso de
polvo de metal/cerámica.
Una de las características únicas de los PHAs es
que pueden existir en dos formas físicas distintas, ya sea como
gránulos amorfos o como sólidos cristalinos. Los PHAs por tanto
pueden ser usados para formar un látex. PCT WO 91/13207 describe
composiciones de látex PHA para el recubrimiento de papel. GB 2 292
648 A describe el uso de látex PHA en formulaciones de
recubrimiento arquitectónico. PCT WO 96/00263 describe el uso de
látex PHA como recubrimiento de alimentos, en especial
recubrimiento de queso. PCT WO 92/09211 y Pat. U.S. No. 5,229,158
describe el uso de composiciones de gránulos PHA para su utilización
como sustitutos de crema de leche. PCT WO 92/09210 y Pat. U.S. No.
5,225,227 describen el uso de PHAs como saborizantes en los
alimentos.
Como los PHAs se han vuelto cada vez más
disponibles, han sido examinados por su idoneidad en aplicaciones
donde sirven de ayuda para su transformación. Un ejemplo es el uso
de látex PHA en la producción de componentes de tubo CRT como se
describe en PCT WO96/17369. Las principales características de la
utilidad de la PHA en esta aplicación son que el sistema de
recubrimiento no utiliza disolventes orgánicos y que se puedan
extraer fácilmente durante el tratamiento posterior del horno
utilizando menos energía que los sistemas convencionales.
Los PHAs pueden ser producidos en una amplia
variedad de tipos dependiendo en la composición de monómero
hidroxiacido (Steinbüchel & Valentin, FEMS Microbiol. Lett.
128:219-28 (1995)). Este amplio rango de
composiciones de polímeros refleja una gama igualmente amplia de
propiedades físicas de polímero, incluyendo un rango de temperaturas
de fusión de 40 a 180ºC, temperaturas de transición vítrea de -35 a
5ºC, grados de cristalinidad de 0% de 80% emparejado con la
capacidad de controlar la velocidad de cristalización, y
alargamiento a la rotura de 5 a 500%. El
poli(3-hidroxibutirato), por ejemplo, tiene
características similares a aquellos de polipropileno, mientras que
los tipos poli(3-hidroxioctanoato) (un
copolímero de (R)-3-hidroxioctanoato
y (R)-3-hidroxihexanoato) se
comportan mas como elastómeros, y PHAs con cadenas laterales mas
largas se comportan mas como ceras. Los PHAs pueden también se
plastificados y mezclados con otros polímeros o agentes.
\newpage
Este amplio rango de composiciones de polímeros
reflejan un rango igualmente amplio de propiedades físicas de
polímeros, incluyendo solubilidad en solventes orgánicos, los cuales
proveen una elección de un amplio rango de solventes. Por ejemplo,
copolímeros de (R)-3-hidroxibutirato
y otros comonomeros hidroxiacidos tienen características de
solubilidad significativamente diferentes de las del polímero PHB.
La acetona, por ejemplo, no es un buen solvente para PHB, pero es
muy útil para la disolución de copolímeros
(R)-3-hidroxibutirato con
(R)-3-hidroxiacidos conteniendo de 6
a 12 átomos de carbono (Abe, et al., Int. J Biol. Macromol.
16:115-19 (1994); Kato, et al., Appl.
Microbiol. Biotechnol. 45:363-70 (1996)).
Similarmente, Mitomo et al., Informes sobre los Progresos
Realizados en Física de Polímeros en Japón,
37:128-29 (1994) describe la solubilidad de
copoliésteres
poli(3-hidroxibutirato-co4-hidroxibutirato)
conteniendo de 15 a 75 mol % de residuos de
4-hidroxibutirato en acetona. Un numero de
solventes adicionales que son adecuados para un rango de PHAs ha
sido descrito, por ejemplo en la Patente U.S. No. 5,213,976;
Patente U.S. No 4,968,611; JP 95,135,985; JP 95,79,788; PCT WO
93/23554; DE 19533459; PCT WO 97/08931; y Brasil Pedido PI BR 93
02,312.
Las composiciones y métodos de preparación y uso
de las mismas descritos aquí en este documento se describen
adicionalmente en los siguientes ejemplos no limitativos.
Se realizaron manipulaciones de ADN sobre el
ADN plásmido y cromosómico purificado con la preparación de Qiagen
plásmido o los kits de preparación del ADN cromosómico Qiagen de
acuerdo a las recomendaciones de fabricación. El ADN se asimiló
usando enzimas de restricción (New England Biolabs, Beverly, MA) de
acuerdo con las recomendaciones de fabricación. Los fragmentos de
ADN fueron aislados de 0.7% de agarosa-gel
tris/acetato/EDTA usando un kit Qiagen. Los oligonucleótidos fueron
comprados de Biosyntesis o Genesys. La secuencia del ADN fue
determinado por secuencia automática usando una máquina
secuenciadora Perkin-Elmer ABI 373A. El ADN fue
amplificado usando la reacción en cadena polimerasa en 50
microlitros de volumen usando una mezcla de PCR de
Gibco-BRL (Gaithersburg, md) y una máquina
amplificadora de ADN Ericomp. El crecimiento medio y los
procedimientos de clonación estándares fueron como los describió
Sambrook et al., (1992, en Clonación Molecular, un manual de
laboratorio, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Spring Harbor, NY).
El PHA analizado por un análisis cromatografico
de gases (GC), llevado a cabo en el polímero purificado o la masa
de la célula liofilizada. Unos 20 mg de la muestra fue sometido a
extracciones simultaneas y butanolisis a 110ºC por 3 horas en 2 ml.
de una mezcla conteniendo (por volumen) 90%
1-butanol y 10% de acido hidroclórico concentrado,
con 2 mg/ml. de ácido benzoico agregado como un estándar interno.
Los componentes solubles en agua de la mezcla resultante fueron
eliminados por extracción con 3ml. de agua. La fase orgánica (1
\muL en un radio de separación de 1:50 a una tasa de flujo total
de 2 ml./min.) fue analizada en un HP 5890 GC con un detector FID
(Hewlett-Packard Co, Palo Alto, CA) usando un
SPB-1 columna capilar de silice fundida GC (30m;
0.32 mm ID; película 0.25 \mum; Supelco; Bellefonte, Pa.) con el
perfil de temperatura siguiente: 80ºC, 2 min; 10ºC por min. a
250ºC, 2 min. Butilbenzoato se utilizo como estándar interno.
Las cepas transgénicas de E. coli que
expresan una polimerasa PHA cromosómicamente codificada de N.
salmonicolor fueron construidas. El gen polimerasa de PHB de
N. salmonicolor fue aislado y una fusión de este gen se ha
generado con las secuencias de traslación del gen de la polimerasa
PHA de Z. ramigera, que incluye residuos del
N-terminal 10 del enzima de Pseudomonas. Un gen
cloranfenicol transferasa sin iniciador se colocó detrás del gen
híbrido phbC para hacer una fusión phbC-cat. Esta
fusión fue insertada al azar en el cromosoma de E. coli
utilizando el sistema pLOF o pUT (Herrero et al.) y los
clones que expresan la fusión fueron seleccionados en medio de
crecimiento que contiene cloranfenicol. La expresión de la fusión
fue por consiguiente aumentada mediante la selección de los
derivados que son resistentes a mayores niveles de
cloranfenicol.
El PHAC fue amplificado de ADN cromosómico de
N. salmonicolor en la siguiente mezcla de reacción:
45 ml de PCR Supermix (Gibco BRL, Gaithersburg,
MD), 20 pmol de los iniciadores:
- RSCP1 (SEC ID NO: 1)
- (5'GATGCCGGTCGACCCGCGGGACCGCCGCTT CTCC) y
\vskip1.000000\baselineskip
- RSPC2 (SEC ID NO: 2)
- (5'TCAGCTGAAGACGTACGTACCCGGAGC),
en 50 ml de volumen final para 30 ciclos: 60
segundos 95ºC, 60 segundos a 55ºC y 210 segundos a 72ºC, seguido de
un paso de productos de extensión (7 minutos a 68ºC).
El gen de la reductasa N. salmonicolor
fue ampliado en la siguiente reacción:
45 ml de PCR Supermix (Gibco BRL, Gaithersburg,
MD), 1 mM de iniciadores:
- RD-up (SEC ID NO:3)
- (5'CGIGTIGCICTIGTIACIGG) y
\vskip1.000000\baselineskip
- RD-DWN (SEQ ID NO: 4)
- (5'CCCATGTACAGICCICCGTT),
50 ml de volumen final para 30 ciclos: 60
segundos 95ºC, 60 segundos a 60ºC y 210 segundos a 72ºC, seguido de
un paso de producto de extensión (7 minutos a 68ºC). Los productos
de PCR fueron purificados en gel y clonados en pCR2.1 (Invitrogen,
CA). Los fragmentos purificados que codifican la polimerasa y la
reductasa, fueron posteriormente utilizados en experimentos del
método Southern para identificar a un fragmento 3,6 kb phaC y
fragmentos de 4,6 kb BamHI y 4,2 kb PvuII que albergan phaB.
Los fragmentos cromosómicos de las tallas correspondientes fueron
purificados en gel, clonados en la PUC 19, y los clones que
contienen el inserto deseado fueron identificados por hibridación
por el método de colonias utilizando genes purificados phbC y
phbB como sondas.
\vskip1.000000\baselineskip
Dado que la síntesis eficiente de PHBH requiere
una adecuada expresión de los genes que codifican enzimas que
participan en la ruta de biosíntesis, el gen de phaC de N.
salmonicolor fue reconstruido para ingeniar fuertes señales de
traslación en el final 5' del gen, como se muestra en la Figura 6.
PhaC fue amplificado utilizando iniciadores:
- C7-5'(SEC ID NO: 5)
- (5'AAGTCGACCATGCATCCGATCGGCTGGGGT) y
\vskip1.000000\baselineskip
- C7-3'(SEC ID NO: 6)
- (5'ACGCTGTTCAGATCTTCGCAAGATGAATGCTAACG)
en un programa de ciclos térmicos que implica 30
segundos a 95ºC, 30 segundos a 60ºC, y 2 minutos a 72ºC, seguido de
una extensión de 7 minutos a 72ºC. La mezcla de reacción contenía 47
ml de Supermix PCR (Gibco-BRL), 0,1 nmol de cada
iniciador, y de aproximadamente 0,05 mg de pCR2.1 phaC7 como
plantilla. El producto de PCR fue purificado por extracción con
fenol y digerido con NsiI y BglII. El fragmento restringido a
continuación fue clonado en los sitios PstI y BamHI de pMSXC5cat.
pMSXC5cat contiene una fusión de la transcripción del gen de la
polimerasa PHA de Z. ramigera (phaC_{5}) y el gen de
resistencia cloroamfenicol. El plásmido resultante contiene una
fusión de traslación que resulta en un híbrido de la polimerasa del
aminoácido 10 N-terminal de PhaC5 con la polimerasa
N. salmonicolor PHA. El plásmido resultante pMSXC7cat
posteriormente se digirió con AccI, HindIII, y FspI, después de que
el fragmento phaC fuera aislado por detrás de la clonación de los
promotores p11 y p13 en FseI/EcoRI y SmaI digerido pMSXp11AB5kan y
SmaIIEcoRI digerido pMSXp13AB5kan. Los fragmentos que contienen
p11C7cat y p13C7cat fueron aislados como los fragmentos AvrII,
insertados en el sitio de SfiI de pLOFHg, e integrados en el
cromosoma de E. coli MBX427, para producir pMLXp11C7cat y
pMLXp13C7cat.
Genes alternativos de la polimerasa PHA
aceptadora de 3-Hidroxihexanoil CoA se pueden
obtener de los organismos que han sido mostrados para incorporar
este monómero, incluyendo A. caviae, C testosteroni, T.
pfenigii, y, posiblemente, P. denitrificans y S.
natans. Estos genes pueden ser expresados en E. coli de
acuerdo a los mismos procedimientos descritos anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
La síntesis endógena de
R-3-hidroxihexanoil CoA puede
continuar después de la condensación de butiril con
acetil-CoA seguido por un paso de reducción. Esta
vía requiere sólo una amplia gama de sustrato reductasa y una
polimerasa que acepta 3-hidroxihexanoil CoA. El
butirato es tomado por E. coli y se convierte en butiril CoA
por los productos del gen atoDA. La degradación de butiril CoA
depende de atoB y del regulón de nucleótido de adenina flavina que
no es inducida por el butirato.
El plásmido pMBXc12J12 fue construido por el
inserto de 2.4 Kb del fragmento Apol que contiene el gen de la
polimerasa A. caviae PHB (Fukui y Doi, J. Bacteriol. 179:
4821-30 (1997)) en el sitio EcoRI de pUC18. El
plásmido pSU18-AB1 contiene los genes phbAB
eutropha R. bajo el control de un promotor inducible IPTG en
el vector de pSU18 (Martínez et al. al., Gen 66:
1659-20 (1988)). PHBH fue producido a partir de la
glucosa y butirato en MBX1325 E. coli (cepa idéntica a la
DC679, Mel, Fadr, atoC (con) adhC81 (Clark y Rod, J. Mol. Biol.
Evol. 25: 151 (1987)) que contiene plásmidos pMBXC12J12 y
pSU18-AB1 de la siguiente manera. Las células
transformadas (1L) fueron cultivadas en LB con 20 mM butirato en 24
horas a 30ºC y cosechada por centrifugación. El polímero PHA fue
purificado a partir de células liofilizadas por extracción con
cloroformo durante 16 horas y el PHA precipitado en unas
5-10 veces en exceso de metanol. El polímero
precipitado fue analizado por cromatografía de gases e identificado
como copolímero de PHBH que contiene 1,0% comonómero HH.
\vskip1.000000\baselineskip
La vía de la fermentación butirato se muestra en
la Figura 3. Los enzimas necesarios para la síntesis de
3-hidroxihexanoato están codificados por phbAx, HBD,
CRT, BDH, phbAy, phbB y phbC, en la que X e Y indican idénticas o
diferentes tiolasas. Las fuentes de estos genes son Zoogloea
Z. (phbAxy), acetobutylicum C. (HBD, CRT, BDH) y
salmonicolor N. (phbB y phbC).
CRT y HBD fueron aislados por la reacción en
cadena de polimerasa a través de PC 10 (Boynton et al) como
plantilla mediante los siguientes iniciadores:
- 5'crt (SEC ID NO: 7):
- 5'GGGGATCCGAATTCAGGAGGTTTTTATGGAACTAAACAA TGTCATCC;
\vskip1.000000\baselineskip
- 3'crt(SEC ID NO: 8):
- 5'GGAATTCGAGCTCCTATCTATTTTTGAAGCC;
\vskip1.000000\baselineskip
- 5'hbd (SEC ID NO: 9):
- 5'GGAATTCGGTACCAGGAGGTTTTTATGAAAAAGGTATGTGTTATAGG;
\vskip1.000000\baselineskip
- 3'hbd (SEC ID NO: 10):
- 5'GGAATTCCCCGGGTTATTTTGAATAATCGTAGAAACC.
Los productos de PCR fueron purificados,
digeridos con EcoRI/SacI (CRT) o KpnIISmaI (HBD), y posteriormente
clonados en los correspondiente sitios de pUC 18 - SFI, resultando
en pMSXcrt-HBD.
BDH fue aislado por reacción en cadena de
polimerasa utilizando PC10 (Boynton et al.) Como plantilla y
los siguientes iniciadores:
- 5'bcd (SEC ID NO: 11):
- GGAATTCCTGCAGAGGAGGTTTTATGGATTTTAATTTAACAAGAG;
\vskip1.000000\baselineskip
- 3'bcd (SEQ ID NO: 12):
- GGAATTCGCATGCTTATCTAAAAATTTTTCCTG.
El producto PCR fue purificado, digerido con
PstIISphI, y posteriormente clonado en los sitios correspondientes
de pMSXcrthbd, resultando en
pMSXcrt-HBD-BCD.
El operón original de PC10 contenía etfAB que
codifica para una cadena de transferencia de electrones. El operón
crt-hbd-bcd puede no participar
activamente en la ausencia de este operón de manera que los genes
etfA y etfB fueron amplificados a partir de PC10 (Boynton et
al.) con los iniciadores:
- 5'etfBA (SEC ID NO: 13):
- 5'GGAATTCGGATCCAGGAGGTTTTATGAATATAGTTGTTTGTTTAAACAAGTTCC y
\vskip1.000000\baselineskip
- 3'etfBA (SEQ ID NO: 14):
- 5'GGAATTCGTCGACTTAATTATTAGCAGCTTTAACTTGAGC.
El producto PCR fue purificado, digerido con
BamHI y SalI, y posteriormente clonado en los sitios
correspondientes de pUC18-SFII. resultando en
pMSXetfAB. Los genes etfAB pueden ser fácilmente clonados en el
plásmido pMSXcrt-HBD-BCD en los
sitios BamHI/SalI.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
comparativo
La vía de oxidación de los ácidos grasos se
muestra en la Figura 4. R-3 hidroxihexanoil CoA
puede obtenerse de ácidos grasos intermedios por epimerización de
S-3 hidroxihexanoil-CoA, la
reducción de 3-ketohexanoil-CoA o
por la hidratación de la enoil-CoA por
D-especifica hidratasa. La cepa E. coli
MBX240 es un derivado de la cepa XL1-Azul
(Stratagebe, San Diego, CA), construido por la inserción de a. copia
del gen R. eutropha phbC en el cromosoma. Esto cepa no
produce PHA a partir de azúcares o de ácidos grasos debido a la
ausencia de enzimas para la conversión de
acetil-CoA o la oxidación de los ácidos grasos
intermedios en los monómeros
R-3-hidroxiacil. El gen phaJ que
codifica una enoil-hidratasa CoA (Fukui y Doi, J.
Bacteriol. 179: 4821-30 (1997)), fue aislado de ADN
cromosómico preparado a partir de la cepa A. caviae
FA-440 (obtenido de la Colección de Cultura
Japonesa con el número de adhesión FERM BP 3432 (EE.UU. Patente No.
5292860) por la reacción en cadena de la polimerasa utilizando los
iniciadores:
- Ac3-5'(SEQ ID NO: 15):
- AGAATTCAGGAGGACGCCGCATGAGCGCACAATCCCTGG y
\vskip1.000000\baselineskip
- AC3-3'(SEQ ID NO: 16):
- TTCCTGCAGCTCAAGGCAGCTTGACCACG
y una mezcla de reacción de PCR obtenidos a
partir de Life Technologies (Gaithersburg, MD). El programa de PCR
fue de 30 ciclos de (95ºC, 45s, 55ºC, 45s, 72ºC, min.). Tras la PCR,
el fragmento de ADN se digirió a la finalización con EcoRI y PstI,
gel purificado y ligado a la EcoRI/sitios PstI de plásmido pUC18Sfi
(Herrero et. al.) a, obtener plásmido pMTXJ12. Transformantes
de E. coli MBX 240 contienen plásmidos pMTXJ12 fueron
cultivadas en Luria-Bertani medio que contenía 10 mM
de octanoato y 1 mM oleato y la ampicilina en 100\mu g/ml.
Después de un crecimiento a 37ºC durante 48 horas, 50 ml de células
fueron cosechadas por centrifugación y liofilizado. Las células
liofilizadas se extrajeron con 8 ml de cloroformo durante 16 horas
y la PHA precipitada en 10 veces el exceso de etanol a 4ºC. El
polímero precipitado fue analizado por cromatografía de gases e
identificado como copolímero PHBH conteniendo 2,6 HH% de
comonómero.
\vskip1.000000\baselineskip
PHBH fue producido a partir de la glucosa y
butirato en E. coli MBX1326 (cepa idéntica a la DC698, mel,
Fadr atoC (con) adhC81, adhR30 aceX, Clark & Rod, J. Mol. Biol.
Evol. 25: 151 (1987)) que contiene plásmidos PMBXC12J12 y
pSU18-AB1 de la siguiente manera. Las células
transformadas se cultivaron en 1L LB medio que contiene 5 g/L
butanol. Las células fueron cosechadas y analizadas como en el
ejemplo 1. Las células modificadas genéticamente produjeron un
copolímero PHBH que contiene 1,2% HH.
\vskip1.000000\baselineskip
La ruta de biosíntesis de los ácidos grasos se
muestra en la Figura 5.
R-3-hidroxihexanoil CoA también
pueden ser proporcionada por intermedios de la biosíntesis de
ácidos grasos. En P. putida, 3-hidroxiacil
CoA se prestan desde esta vía cuando esta bacteria se cultiva en la
glucosa o de otros hidratos de carbono. Esta vía requiere de una
actividad que convierte acil ACP en acil-CoA, una
reacción catalizada por una transacilasa ACP/CoA o por la acción
combinada de una tioesterasa ACP acil y acil-CoA
sintasa. La introducción de esta vía en la cepa de E. coli
que expresa los genes de biosíntesis de PHB y que tiene un ácido
graso constitutivo regulón biosintético (Fadr +), como MBX689,
resulta en la síntesis de la R-hidroxihexanoil
CoA.
Los genes que codifican las enzimas que
facilitan la ACP a la transacilación CoA están aislados en el
siguiente filtrado el que emplea el sistema de lux de V.
fischeri, como se muestra en la Figura 10. La inducción de los
genes lux depende de la síntesis de la de lactona autoinductora
homoserina 3-ketohexanoil. Los precursores de esta
molécula son S-adenosilmetionina y
3-ketohexanoil ACP. E. coli CGSC5638 tiene
una mutación en el gen fabD que codifica transacilasa malonil
(Bouquin et al. Mol. Gen. Genet. 246: 628 (1995)) y es
incapaz de sintetizar acetoacetil ACP. El hexanoato se proporciona
a estas células para la síntesis de ácidos grasos de cadena lateral
larga. Además, una mutación fadR se introduce para degradar el
hexanoato a 3-ketohexanoil CoA. Para que las
células induzcan la expresión del sistema de lux,
3-ketohexanoil Coa debe convertirse a
3-ketohexanoil ACP. Bibliotecas de genes de
organismos diferentes pueden ser examinadas en esta sede,
seleccionando clones positivos por su capacidad de inducir la
expresión de lux, que se identifica como la emisión de luz debido a
la formación de inductor 3-ketohexanoil homoserina
lactona. Bibliotecas de genes son fácilmente construidas a partir
de organismos de elección mediante el aislamiento de ADN genómico y
de la clonación de una colección representativa de fragmentos de
ADN en vectores del plásmido. Bibliotecas representativas deberían
tener de 5.000 a 100.000 colonias individuales. Las bibliotecas se
hacen bien como biblioteca de un amplio rango de huéspedes en
vectores tales como pLAFR3 o como bibliotecas E. coli en
vectores tales como pUC19 o pBR322. Dependiendo del tipo de
biblioteca y el método de introducción de la biblioteca en
principales huésped de elección, los fragmentos de ADN genómico son
grandes (17-30 kb) o relativamente pequeño
(2-6 kb). Las bibliotecas son introducidas en las
cepas de detección por electroporación, transformación o
conjugación, en función del huésped y el vector utilizado.
<110> Metabolix, Inc.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Transgenic Systems for the
Manufacture of
Poly(3-Hydroxy-Butyrate-Co-3-Hydroxyhexanoate)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> MBX 020 PCT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> Not Yet Assigned
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2000-01-21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 09/235,875
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-01-22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligonucleotido iniciador- RSCP1
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> varias características
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(34)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatgccggtc gacccgcggg accgccgctt ctcc
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligonucleotido iniciador- RSCP2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> varias características
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(27)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcagctgaag acgtacgtac ccggagc
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligonucleotido iniciador- RD-_up
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> varias características
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> varias características
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n representa inosine
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgngtngcnc tngtnacngg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligonucleotido
iniciador-RD-dwn
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> varias características
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1).._(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> varias características
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n representa inosine
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcccatgtaca gnccnccgtt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligonucleotido
iniciador-C7-5'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> varias características
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(30)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaagtcgacca tgcatccgat cggctggggt
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligonucleotido
iniciador-C7-3'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> varias características
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(35)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> prime
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacgctgttca gatcttcgca agatgaatgc taacg
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligonucleotido iniciador-5' crt
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> varias características
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(47)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggggatccga attcaggagg tttttatgga actaaacaat gtcatcc
\hfill47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
<223 Descripción de la Secuencia Artificial:
oligonucleotido iniciador-3' crt
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> varias características
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(31)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggaattcgag ctcctatcta tttttgaagc c
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligonucleotidp iniciador-5' hbd
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> varias características
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(47)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggaattcggt accaggaggt ttttatgaaa aaggtatgtg ttatagg
\hfill47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligonucleotido iniciador-3' hbd
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> varias características
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(37)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> prime
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggaattcccc gggttatttt gaataatcgt agaaacc
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligonucleotido iniciador-5' bcd
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> varias características
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(45)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> iniciador
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggaattcctg cagaggaggt tttatggatt ttaatttaac aagag
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligonucleotido iniciador-3' bcd
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> varias características
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggaattcgca tgcttatcta aaaatttttc ctg
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligonucleotido iniciador-5' eftBA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> varias características
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(54)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggaattcgga tccaggaggt tttatgaata tagttgtttg tttaaacaag ttcc
\hfill54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligonucleotido iniciador-3' eftBA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> varias características
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1).._(40)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> iniciador
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggaattcgtc gacttaatta ttagcagctt taacttgagc
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligonucleotido
iniciador-Ac3-5'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> varias características
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(39)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagaattcagg aggacgccgc atgagcgcac aatccctgg
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligonucleotido
iniciador-Ac3-3'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> varias características
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(29)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttcctgcagc tcaaggcagc ttgaccacg
\hfill29
Claims (9)
1. Un método para producir copolímeros
polihidroxibutirato-co-3-hidroxihexanoato
(PHBH) que comprende: sintetizar PHBH en una bacteria transgénica
que es capaz de asumir butirato o butanol y convertirlo a
butiril-CoA y que se transforma con, y expresa, un
transgén que codifica una polimerasa PHA que polimeriza
3-hidroxibutiril-CoA. y
3-hidroxihexanoil-CoA para formar PHBH, donde la bacteria transgénica también expresa
3-hidroxihexanoil-CoA para formar PHBH, donde la bacteria transgénica también expresa
(a) un tiolasa que convierte
butiril-CoA y acetil-CoA. a
3-CoA ketohexanoil, y
(b) una reductasa que convierte la
3-ketohexanoil-CoA a
3-hydroxyhexanoyl-CoA,
por fermentación de la bacteria transgénica en
presencia de butirato o butanol PHBH de tal manera que se produce,
y la recuperación de la PHBH.
\vskip1.000000\baselineskip
2. El método de la reivindicación 1 donde el gen
de la polimerasa PHA se ha incorporado al cromosoma bacteriano.
3. El método de la reivindicación 1 donde el gen
polimerasa PHA es de una bacteria seleccionada de Aeromonas
caviae, Comamonas testosterona, Thiocapsia pfenigii,
Chromatium vinosum, Bacillus cereus, Nocardia Carolina, Nocardia
salmonicolor, Rhodococcus ruber, Rhodcoccus rhodocrous, o
Rhodospirilum rubrum.
4. El método de cualquier reivindicación
precedente en el que la bacteria transgénica se transforma con un
transgén que codifica la tiolasa definida en la parte (a) de la
reivindicación 1.
5. El método de cualquier reivindicación
precedente donde la bacteria transgénica se transforma con un
transgén que codifica la reductasa, definida en la parte (b) de la
reivindicación 1.
6. El método de cualquier reivindicación
precedente, en el que la bacteria transgénica es una E. coli,
Klebsiella, Ralstonia Alcaligenes, Pseudomonas o
Azotobacter.
7. El método de la reivindicación 6, en la que
la bacteria transgénica es E. coli, Klebsiella, Ralstonia
eutropha, Alcaligenes Lactus, o Pseudomonas putida.
8. El método de la reivindicación 7 donde la
bacteria transgénica es la E. coli que ha sido transformada
con un transgén que codifica la tiolasa definida en la parte (a) de
la reivindicación 1 y un transgén que codifica la reductasa
definida en la parte (b) de la reivindicación 1.
9. El método de cualquier reivindicación
precedente donde la bacteria transgénica expresa las tres enzimas
de la vía de fermentación de Clostridium acetobutylicium
butirato que forma butiril-CoA.
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