JP4623829B2 - トランスジェニック微生物のポリヒドロキシアルカノエート産生 - Google Patents

Description

【０００１】
（発明の背景）
本発明は、一般的に、ポリ（３−ヒドロキシアルカノエート）の生合成の分野にあり、そしてより詳細には、ポリヒドロキシアルカノエートの商業的生産に有用な、改良された微生物株に関する。
【０００２】
ポリ（３−ヒドロキシアルカノエート）（ＰＨＡ）は、広範な範囲の細菌によって合成される生物学的ポリエステルである。これらのポリマーは生分解性であり、そして生体適合性熱可塑性物質であり、再生可能資源から産生され、広範な範囲の産業的適用および生物医学的適用を有する（ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＰｅｏｐｌｅｓ，ＣＨＥＭＴＥＣＨ ２６：３８−４４（１９９６）。ＰＨＡ生体高分子は、本来、単一のホモポリマーであると考えられているもの（ポリ−３−ヒドロキシブチレート（ＰＨＢ））から、異なるモノマー組成および広範な範囲の物理的特徴を有する広範なポリエステルが現れている。約１００の異なるモノマーが、ＰＨＡポリマーへと組み込まれている（ＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌおよびＶａｌｅｔｉｎ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１２８：２１９−２８（１９９５））。
【０００３】
ＰＨＡを、その側鎖の長さおよびその生合成経路に従って、２つの群へと分割することが有用であった。短い側鎖を有するもの（例えば、ＰＨＢ：Ｒ−３−ヒドロキシ酪酸単位のホモポリマー）は、結晶性熱可塑性であり、一方、長い側鎖を有するＰＨＡは、よりエラストマー性である。前者は、約７０年間知られてきた（ＬｅｍｏｉｇｎｅおよびＲｏｕｋｈｅｌｍａｎ、１９２５）が、後者の物質は、比較的最近発見された（ｄｅＳｍｅｔら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５４：８７０−７８（１９８３））。しかし、この指摘の前に、（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸単位およびより長い側鎖の（Ｒ）−３−ヒドロキシ酸単位（Ｃ₅〜Ｃ₁₆）の両方を含む微生物起源のＰＨＡが同定されている（ＷａｌｌｅｎおよびＲｏｈｗｅｄｅｒ，Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．８：５７６−７９（１９７４））。（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸および５〜１６の炭素原子を含む１つ以上の長い側鎖のヒドロキシ酸単位のコポリマーを産生する多数の細菌が同定されている（ＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌおよびＷｉｅｓｅ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３７：６９１−９７（１９９２）；Ｖａｌｅｎｔｉｎら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６：５０７−１４（１９９２）；Ｖａｌｅｎｔｉｎら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４０：７１０−１６（１９９４）；Ａｂｅら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．１６：１１５−１９（１９９４）；Ｌｅｅら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４２：９０１−０９（１９９５）；Ｋａｔｏら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４５：３６３−７０（１９９６）；Ｖａｌｅｎｔｉｎら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４６：２６１−６７（１９９６）；Ｄｏｉらに対する米国特許第４，８７６，３３１号）。上記に概説される２つの生合成経路の組み合わせは、ヒドロキシ酸モノマーを提供する。これらのコポリマーは、ＰＨＢ−ｃｏ−ＨＸ（ここでＸは、６以上の炭素の３−ヒドロキシアルカノエートまたはアルカノエートまたはアルケノエートである）と言及され得る。特定の２成分のコポリマーの有用な例は、ＰＨＢ−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサノエート（ＰＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）である（Ｂｒａｎｄｌら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．１１：４９−５５（１９８９）；ＡｍｏｓおよびＭａＩｎｅｒｅｙ，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５５：１０３−０６（１９９１）；Ｓｈｉｏｔａｎｉらに対する米国特許第５，２９２，８６０号）。
【０００４】
これらの参考文献における微生物の多くによるＰＨＡ産生は、増殖培地の複雑性、冗長な発酵プロセス、または特定の細菌株の下流プロセシングの困難性のために、商業的に有用ではない。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのような早く増殖する生物を用いる遺伝子操作されたＰＨＡ産生系が開発されてきた。遺伝子操作はまた、野生型ＰＨＡ産生微生物の改良を可能にして、特定のコポリマーの産生を改良するか、または異なる基質特異性もしくは天然の系に対する速度論特性さえ有するＰＨＡ生合成酵素を添加することによって異なるＰＨＡポリマーを産生する能力を誘導する。これらの型の系の例は、ＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌおよびＶａｌｅｎｔｉｎ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１２８：２１９−２８（１９９５）に記載される。ＰＣＴ ＷＯ９８／０４７１３は、遺伝子操作を用いて分子量を制御して、ＰＨＡシンターゼ酵素のレベルを制御するための方法を記載する。ＰＨＡを産生するために商業的に有用な株（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ（Ｒａｌｓｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａとして再命名された）、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｓ ｌａｔｕｓ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｎｌａｎｄｉｉ、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓを含む）は、Ｌｅｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ＆Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ４９：１−１４（１９９６）およびＢｒａｕｎｅｇｇら、（１９９８）、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６５：１２７−１６１に開示される。
【０００５】
組換えＰＨＡ産生株の開発は、２つの平行経路に従った。１つの場合では、その株は、コポリマーを産生するように開発され、その多くが、組換えＥ．ｃｏｌｉにおいて産生された。これらのコポリマーとしては、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシバレレート）（ＰＨＢＶ）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−４−ヒドロキシブチレート）（Ｐ３ＨＢ−ｃｏ−４ＨＢ）、ポリ（４−ヒドロキシブチレート）（Ｐ４ＨＢ）、および３−ヒドロキシポリオクタノエート単位を含む長い側鎖のＰＨＡが挙げられる（ＭａｄｉｓｏｎおよびＨｕｉｓｍａｎ，１９９９）。プラスミド上にｐｈｂ遺伝子を含有するＥ．ｃｏｌｉの株は、Ｐ（３ＨＢ−３ＨＶ）を産生するように開発されてきた（Ｓｌａｔｅｒら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５８．１０８９−９４（１９９２）；ＦｉｄｌｅｒおよびＤｅｎｎｉｓ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１０３：２３１−３６（１９９２）；ＲｈｉｅおよびＤｅｎｎｉｓ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６１：２４８７−９２（１９９５）；Ｚｈａｎｇ，Ｈ．ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６０：１１９８−２０５（１９９４））。Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＰ（４ＨＢ）およびＰ（３ＨＢ−４ＨＢ）の産生は、代謝には関連しない経路由来の遺伝子をＰ（３ＨＢ）プロデューサーに導入することによって達成される（Ｈｅｉｎら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１５３：４１１−１８（１９９７）；ＶａｌｅｎｔｉｎおよびＤｅｎｎｉｓ，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５８：３３−３８（１９９７））。Ｅ．ｃｏｌｉはまた、ｆａｄＢ：：ｋａｎ変異体におけるＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのｐｈａＣ１遺伝子およびｐｈａＣ２遺伝子を導入することによって、中間の短い鎖のポロヒドロキシアルカノエート（ｍｓｃ−ＰＨＡ）を産生するために操作された（Ｌａｎｇｅｎｂａｃｈら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１５０：３０３−０９（１９９７）；Ｑｉら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１５７：１５５−６２（１９９７））。
【０００６】
研究は、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＰＨＢポリメラーゼ、ケトチオラーゼ、およびアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼをコードするＡ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ ＰＨＢ生合成遺伝子の発現がＰＨＢの産生を生じたこことを実証した（Ｓｌａｔｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：４４３１−３６（１９８８）；ＰｅｏｐｌｅｓおよびＳｉｎｓｋｅｙ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１５２９８−３０３（１９８９）；Ｓｃｈｕｂｅｒｔら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：５８３７−４７（１９８８））が、これらの結果は、基本的なクローニングプラスミドベクターを使用して得られた。そしてその系は、商業的な生産に適切ではない。なぜなら、これらの株は、工業用培地における天然のプロデューサーと等しいレベルを蓄積する能力を欠けていたからである。
【０００７】
商業的生産のために、これらの株は、低コストの工業用培地における大規模な発酵に適切に作製されなければならない。流加培養法における組換えＰ（３ＨＢ）産生実験の最初の報告は、高価な複合培地を使用して、ｐＨ一定（ｐＨ−ｓｔａｔ）制御系を使用して４２時間でＰ（３ＨＢ）を９０ｇ／Ｌまで産生した（Ｋｉｍら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１４：８１１−１６（１９９２））。中間コピー数プラスミドまたは高コピー数プラスミドのいずれか由来の安定化プラスミドを使用して、後者の型のプラスミドを有するＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅは実質的なｐ（３ＨＢ）蓄積を必要とすることが示された（Ｌｅｅら、Ａｎｎ，Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７２１：４３−５３（１９９４））。２％グルコース／ＬＢ培地における流加発酵において、この株は、２．１ｇ／Ｌ−時間の生産性で８１％のＰ（３ＨＢ）を産生した（Ｌｅｅら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３２：２０３−１１（１９９４））。Ｐ（３ＨＢ）生産性は、最小培地において０．４６ｇ／Ｌ−時間まで減少したが、複合窒素源（例えば、酵母抽出物、トリプトン、カザミノ酸、およびコラーゲン加水分解物）の添加によって回復し得る（ＬｅｅおよびＣｈａｎｇ，Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５２：２７−５８（１９９５）；Ｌｅｅら、Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．７９：１７７−８０（１９９５））。
【０００８】
組換えＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ１−ｂｌｕｅは実質的なレベルのＰ（３ＨＢ）を合成し得るが、増殖は、特に、規定された培地における細胞の劇的なフィラメント化（ｆｉｌａｍｅｎｔａｔｉｏｎ）によって損なわれる（Ｌｅｅら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．４４：１３３７−４７（１９９４）；Ｌｅｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１６：１２４７−５２（１９９４）；ＷａｎｇおよびＬｅｅ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：４７６５−６９（１９９７））。この株におけるＦｔｓＺの過剰発現により、バイオマス産生は２０％改良され、そしてＰ（３ＨＢ）レベルは２倍になった（ＬｅｅおよびＬｅｅ，Ｊ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｄｅｇｒａｄ．４：１３１−３４（１９９６））。この組換え株は、規定された培地において、細胞乾燥重量の７０％に対応する１０４ｇ／Ｌ Ｐ（３ＨＢ）を産生した。しかし、２ｇ／Ｌ−時間の容積生産性は、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａを用いて達成可能なものより低かった。さらに、細胞の約１５％は、発酵の終了までに、ＰＨＢを産生する能力を損失した（ＷａｎｇおよびＬｅｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．５８：３２５−２８（１９９８））。
【０００９】
組換えＥ．ｃｏｌｉ Ｐ（３ＨＢ−３ＨＶ）プロデューサーは、報告によれば、高密度で増殖し得ず、それゆえ、商業的プロセスに適していない（Ｙｉｍら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．４９：４９５−５０３（１９９６））。組換え株におけるＰ（３ＨＢ−３ＨＶ）産生を改良する試みにおいて、４つのＥ．ｃｏｌｉ株（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、ＪＭ１０９、ＨＢ１０１、およびＤＨ５α）が、Ｙｉｍらによって試験された。全ての４つの組換えＥ．ｃｏｌｉ株は、７％のＨＶ画分とともに、グルコースおよびプロピオネートで増殖させた場合に、Ｐ（３ＨＢ−３ＨＶ）を合成した（Ｙｉｍら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．４９：４９５−５０３（１９９６））。研究されたほかの株（Ｓｌａｔｅｒら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５８：１０８９−９４（１９９２））とは異なり、組換えＸＬ１−Ｂｌｕｅは、プロピオン酸濃度が０ｍＭと８０ｍＭとの間で変化する場合に、１０％未満のＨＶを取り込む。ＨＶの取り込みおよびＰＨＡの形成は、アセテートにおいて細胞を前増殖（ｐｒｅ−ｇｒｏｗｉｎｇ）させ、続いて１ｍｌあたり１０⁸細胞付近の細胞密度でグルコール／プロピオネートを添加することによって増加した。オレアート補充もまた、ＨＶ取り込みを刺激した。この組換えＸＬ１−Ｂｌｕｅは、アセテート上およびオレアート補充とともに前増殖させた場合、８ｇ／Ｌの細胞密度に達し、その７５％は、０．１６のＨＶ画分を有するＰ（３ＨＢ−３ＨＶ）であった（Ｙｉｍら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．４９：４９５−５０３（１９９６））。
【００１０】
組換え生物においてＰ（３ＨＢ）を産生するチャレンジの１つは、発酵の間のｐｈｂ遺伝子の安定かつ一定の発現である。しばしば、組換え生物によるＰ（３ＨＢ）の産生は、細菌集団の大部分からのプラスミドの損失によって妨害される。このような安定性の問題は、プラスミドの複製およびＰ（３ＨＢ）の合成に対する必要性によって発揮される代謝負荷に起因し得、これは、アセチル−ＣｏＡをバイオマスよりもむしろＰ（３ＨＢ）へと転換する。さらに、プラスミドのコピー数は、しばしば、連続発酵の際に減少する。なぜなら、わずか数コピー数が、必要な構成物質耐性を提供するか、またはｐａｒＢを維持することによって細胞死を防止するからである。これらの理由のために、ランナウェイプラスミドが設計されて、３０℃でのプラスミドのコピー数を抑制し、そして３８℃まで温度をシフトすることによってプラスミド複製を誘導した（Ｋｉｄｗｅｌｌら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６１：１３９１−９８（１９９５））。この系を使用して、Ｐ（３ＨＢ）は、１グラムＰ（３ＨＢ）／リットル／時間の容積産生を用いて誘導した後１５時間以内に、細胞乾燥重量の約４３％まで産生された。この生産性は、天然のＰ（３ＨＢ）プロデューサーと同じ程度であるが、これらのｐａｒＢ安定化ランナウェイレプリコンを保有する株は、なお、延長した発酵の間にＰ（３ＨＢ）を蓄積する能力を損失する。
【００１１】
高細胞密度発酵におけるｐｈｂ遺伝子の不安定性は、細胞性Ｐ（３ＨＢ）収率を減少させることによりＰＨＡの費用に影響を及ぼし、一方、供給材料のコストもまた、ＰＨＡの比較的高い価格に寄与する。Ｐ（３ＨＢ）産生に使用される最も一般的な基質は、グルコースである。結果として、Ｅ．ｃｏｌｉ株およびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ株は、糖蜜（これは、グルコースより３３〜５０％低い費用である）におけるＰ（３ＨＢ）発酵について試験された（Ｚｈａｎｇら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６０：１１９８−１２０５（１９９４））。糖蜜における主な炭素源は、スクロースである。６％サトウキビ糖蜜を含む最小培地において増殖させた、プラスミド上にｐｈｂ遺伝子座を保有する組換えＥ．ｃｏｌｉおよびＫ．ａｅｒｏｇｅｎｅｓ株は、細胞乾燥重量の４５％に相当する約３ｇ／ＬまでＰ（３ＨＢ）を蓄積した。Ｋ．ａｅｒｏｇｅｎｅｓを単一炭素源として糖蜜において１０Ｌファーメンターにおいて流加増殖させた場合、Ｐ（３ＨＢ）は、その細胞乾燥重量の７０％（これは、２４ｇ／Ｌに相当する）まで蓄積した。Ｋ．ａｅｒｏｇｅｎｅｓにおけるｐｈｂプラスミドは不安定であるが、この株は、糖蜜においてＰ（３ＨＢ）プロデューサーとしての見込みを示す。なぜなら、特に、ｆａｄＲ変異体は、プロピオネートの存在下で、５５％までの３ＨＶを取り込むからである（Ｚｈａｎｇら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６０：１１９８−１２０５（１９９４））。
【００１２】
Ｄｅｎｎｉｓに対する米国特許第５，３３４，５２０号は、ｐｈｂＣＡＢ遺伝子を含有するプラスミドで形質転換したＥ．ｃｏｌｉにおけるＰＨＢの産生を開示する。ｒｅｃ−ｌａｃ＋Ｅ．ｃｏｌｉ株は、ホエーにおいて増殖し、そして報告されるように、その細胞乾燥重量の８５％までＰＨＢを蓄積した。Ｄｅｎｎｉｓらに対する米国特許第５，３７１，００２号は、宿主（構成的に誘導することによってかまたはプラスミドからのいずれかでアセテート遺伝子を発現する）においてｐｈｂ遺伝子を有する高コピー数プラスミドベクターを用いて、組換えＥ．ｃｏｌｉにおいてＰＨＡを産生する方法を開示する。Ｄｅｎｎｉｓに対する米国特許第５，５１２，４５６号は、形質転換したＥ．ｃｏｌｉ株からのＰＨＢの産生および回収のための方法を開示する。これらのＥ．ｃｏｌｉ株は、ｐｈｂ遺伝子を含有するベクターおよびリゾチーム遺伝子を含有するベクターを備えている。高コピー数プラスミドまたはランナウェイレプリコンを使用して、生産性を改良する。このベクターは、ｐａｒＢまたはｓｕｐＦ／ｄｎａＢ（ａｍ）によって安定化される。このような株を使用して、１．７ｇ／Ｌ−時間の生産性が得られ、これは２５時間における４６ｇ／ＬのＰＨＢに相当し、その後、このプラスミドは、微生物集団によって漸増的に損失された。ＰＣＴ ＷＯ９４／２１８１０は、炭素源としてスクロースを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ａｅｒｏｇｅｎｅｓの組換え株におけるＰＨＢの産生を開示する。ＰＣＴ ＷＯ９５／２１２５７は、形質転換した原核生物宿主におけるＰＨＢの産生の改良を開示する。転写調節配列およびリボソーム結合部位における改良は、プラスミドに基づくｐｈｂ遺伝子によるＰＨＢ形成を改良する。このプラスミドは、ｐａｒＢ遺伝子座によって安定化される。この構築物によるＰＨＢの産生は、７８ヌクレオチドのみの代わりにＲ．ｅｕｔｒｏｐｈａにおいてｐｈｂＣの上流に見出された３６１ヌクレオチドを含むことによって２倍になる。組換え微生物によるＰＨＢの産生は、安定化プラスミドを用いる高レベルの発現を必要とすると、一般的に考えられている。プラスミドは、複数コピー（１から数百に及ぶ）において、細胞において利用可能であるので、プラスミドの使用は、目的の遺伝子の複数コピーの存在を確実にした。プラスミドは損失され得るので、安定化機能が導入される。上記に記載されるこのような系は、ＰＨＢの産生について試験され、そして産業用発酵プロセスにおけるこれらの系の有用性が研究されてきた。しかし、全体のＰＨＢの収率は、なお、ｐｈｂ遺伝子の損失に影響される。
【００１３】
それゆえ、本発明の目的は、産業用発酵プロセスにおいて有用な組換え微生物株を提供することであり、この微生物は、発酵の間にｐｈｂ遺伝子の安定かつ一定した発現を提供しながら、商業的に有用なレベルのＰＨＢを蓄積し得る。
【００１４】
本発明の別の目的は、ポリ（３−ヒドロキシアルカノエート）の増強した産生のためのトランスジェニック微生物株を提供することである。
【００１５】
本発明の別の目的は、発酵の間にｐｈｂ遺伝子の安定かつ一定した発現を生じ、かつ商業的に有意なレベルのＰＨＢを蓄積するトランスジェニック微生物株、およびその使用方法を提供することである。
【００１６】
（発明の要旨）
その染色体上に組み込まれた、ＰＨＡ形成に必要な遺伝子を含む、トランスジェニック微生物株が提供される。この株は、ＰＨＡ産生プロセスにおいて有利である。なぜなら、（１）プラスミドを維持する必要性がなく、抗生物質および他の安定化圧を使用する必要性がほぼ排除されており、そして（２）プラスミドの損失が生じず、それにより発酵プロセスを通じて細胞あたりの遺伝子コピー数を安定化し、産生プロセスを通じて均一なＰＨＡ産物形成を生じるからである。複数の遺伝子は、標準的な技術、好ましくは、トランスポゾン変異誘発を用いて組み込まれる。遺伝子が組み込まれる好ましい実施態様において、この遺伝子は、オペロンとして組み込まれる。配列は、ｍＲＮＡを安定化するため、培養条件（例えば、リン酸濃度）、温度、およびストレスの関数として発現を誘導するため、ならびに抗生物質耐性を付与するような選択マーカー組み込みを通して選択を補助するために使用される。
【００１７】
（発明の詳細な説明）
ＰＨＡ生合成酵素をコードする遺伝子をＥ．ｃｏｌｉの染色体にランダムに挿入することにより、産業用培地に基づく発酵における宿主の増殖に必須ではない部位で、強力な内因性プロモーターからの高レベルの発現を直接達成するための手段が同定された。実施例によって実証されるように、Ｅ．ｃｏｌｉ株は、これらの技術を使用して得られており、その染色体上の単一コピー遺伝子から、細胞乾燥重量の８５％を超えるレベルでＰＨＡを産生する。これらの株におけるｐｈｂ遺伝子の発現は、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａにおけるｐｈｂＣの上流配列に依存せず、高コピー数構築物にも依存しない。これらの株によるｐｈｂ遺伝子の維持は、構成物質の補充、ｐａｒＢもしくはｈｏｋ／ｓｏｋのような安定化遺伝子座の存在、または他のいかなる選択圧にも依存しない。プラスミドに基づく系に必要な超高レベルの発現は、完全には必須でないことが見出されている。さらに、組換えプラスミドに基づくＥ．ｃｏｌｉについて、今日までに報告されている最も首尾良い発酵（ＷａｎｇおよびＬｅｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．５８：３２５−２８（１９９８））とは異なり、これらの株を用いる発酵は、発酵の終了時に、実質的に全ての細胞がＰＨＢを含むことを提供する。
【００１８】
低コピー数にもかかわらず、これらのトランスジェニック細菌は、野生型生物について観察されたレベルまでＰＨＢを蓄積する。組換えＰＨＢ産生に使用される宿主もまた、プラスミドに基づくＥ．ｃｏｌｉ系を設計する際に、重要なパラメーターである。例えば、Ｗ３１１０株は、プラスミドに基づく系を使用する場合、乏しいＰＨＡプロデューサーであるが、この同じ宿主の染色体にｐｈｂ遺伝子を組み込むことによって、この宿主が、商業的に有意なレベルのＰＨＢを蓄積しながら、優れた増殖特徴を維持することが見出された。
【００１９】
（微生物株を産生するための方法および材料）
（改変されるべき細菌株）
多数の細菌は、ポリヒドロキシアルカノエートを産生するように遺伝的に操作され得る。これらは、すでにポリヒドロキシアルカノエートを産生する生物であって、代替の基質を利用するか、もしくはさらなるモノマーを取り込むように改変された生物、または産生を増大するように改変された生物を含み、そしてポリヒドロキシアルカノエートを産生しないが、ポリヒドロキシアルカノエートの産生に必要とされる酵素を全く発現しないかまたはいくらか発現する生物を含む。例としては、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｌａｔｕｓ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｅ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、およびＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａが含まれる。
【００２０】
（トランスジェニックＰＨＢプロデューサーを生成するための方法）
操作された遺伝子構築物を、細菌細胞の染色体ＤＮＡに組み込むための方法は、当業者に周知である。代表的な組み込み機構には、ｒｅｃＢＣ株またはｒｅｃＤ株中で線状化ＤＮＡを使用する相同組換え、続いてＰ１形質導入（Ｍｉｌｌｅｒ １９９２，Ａ Ｓｈｏｒｔ Ｃｏｕｒｓｅ ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ ＆ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｆｏｒ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、特別なプラスミド（Ｈａｍｉｌｔｏｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：４６１７（１９８９）；Ｍｅｔｃａｌｆら，Ｐｌａｓｍｉｄ ３５：１（１９９６）；Ｍａｓｃａｒｅｎｈａｓらに対する米国特許第５，４７０，７２７号）、またはトランスポゾンに基づくシステムを使用するランダム挿入（Ｈｅｒｒｅｒｏら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：６５５７（１９９０）；Ｐｅｒｅｄｅｌｃｈｕｋ＆Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｇｅｎｅ １８７：２３１（１９９７）；Ｒｉｃｈａｕｄらに対する米国特許第５，５９５，８８９号；Ｔｕｃｋｅｒらに対する米国特許第５，１０２，７９７号）が含まれる。一般に、挿入を含む微生物株は、組み込まれた構築物によって供給される獲得された抗生物質耐性遺伝子に基づいて選択される。しかし、栄養要求性変異体の相補性もまた使用され得る。
【００２１】
染色体組み込みのための目的の遺伝子の発現は、転写活性化配列（プロモーター）を、組み込まれるべきＤＮＡ構築物中に含ませることによって達成され得る。部位特異的相同組換えは、Ｉｎｇｒａｍらに対する米国特許第５，００，０００号によって記載されるように、目的の遺伝子の発現の増幅と組み合わされ得る。ミニトランスポゾンシステムが多年にわたって使用されてきたが、それらは、組み込まれた目的の遺伝子の発現レベルが調節されないように設計されている。Ｉｎｇｒａｍらは、相同組換えによってＥ．ｃｏｌｉ染色体中に挿入した外来遺伝子の増大した発現について選択した。これは、目的の遺伝子の下流に、プロモーターのないクロラムフェニコール（Ｃｍ）耐性遺伝子を挿入して、転写的融合を作成することによって達成された。アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターのないクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子との転写的融合がｐｆｌ遺伝子中に組み込まれた後、増大した発現が、クロラムフェニコールの濃度を増大させることに関して変異体を選択することによって達成される。しかし、ケモスタット研究において、これらの安定した株は、なお、エタノールを産生する能力を失っていた（Ｌａｗｆｏｒｄ ＆ Ｒｏｕｓｓｅａｕ，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５７−５８：２９３−３０５（１９９６））。また、染色体上のエタノール産生性（ｅｔｈａｎｏｌｏｇｅｎｉｃ）遺伝子を含んでいた株は、グルコース最小培地で、成長速度の減少を示した（Ｌａｗｆｏｒｄ ＆ Ｒｏｕｓｓｅａｕ，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５７−５８：２７７−９２（１９９６））。
【００２２】
これらのアプローチは、組み込まれた遺伝子の発現を調節するためのスクリーニングシステムと組み合わせて、健康な、迅速に増殖するトランスジェニック株を選択するために、ミニトランスポゾンを染色体中にランダムに組み込むように組み合わされ、そして改変されている。一連の発現カセットは、異種遺伝子を細菌染色体中に挿入するために開発されている。これらのカセットは、Ｈｅｒｒｅｒｏら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：６５５７−６７（１９９０）；ｄｅ Ｌｏｒｅｎｚｏら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：６５６８（１９９０）によって記載されるトランスポゾン送達システムに基づいている。これらのシステムは、ＲＰ４媒介接合移入を特定し、そしてトランスポゾンＴｎ１０およびＴｎ５のみを使用するが、トランスポゾン末端および送達系の任意の組み合わせが記載される技術に適合され得、持続的かつ均一なＰＨＡ産生を生じる。
【００２３】
以下の一般的なアプローチは、トランスジェニックＥ．ｃｏｌｉ ＰＨＢプロデューサーを生成するために使用される：（１）プロモーターのない抗生物質耐性（ａｂｒ）遺伝子は、ポリリンカーの主要な部分がａｂｒの上流にあるように、ｐＵＣ１８ＮｏｔＩまたはｐＵＣ１８ＳｆｉＩのような適切なプラスミドのポリリンカーにおいてクローニングされる；（２）ｐｈｂ遺伝子は、ａｂｒ遺伝子の上流に、そしてそれと同じ方向に引き続いてクローニングされる；（３）ｐｈｂ−ａｂｒカセットは、ＮｏｔＩまたはＡｖｒＩＩフラグメント（ＡｖｒＩＩは、ｐＵＣ１８ＳｆｉＩ中のＳｆｉＩ部位を認識する）として切り出され、そしてｐＵＴ−またはｐＬＯＦ−シリーズ由来のもののような任意のプラスミドの対応する部位にクローニングされる；（４）得られるプラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉ λｐｉｒ株中に維持され、そして選り抜きのＥ．ｃｏｌｉ株中にエレクトロポレーションされるか、または結合体化され、その中では、これらのプラスミドは、複製しない；ならびに（５）ｐｈｂ−ａｂｒカセットが染色体中に首尾良く組み込まれた新たな株は、宿主について（例えば、宿主がナリジクス酸耐性である場合、ナリジクス酸）、およびカセットについて（例えば、クロラムフェニコール、カナマイシン、テトラサイクリン、塩化水銀、バイアラフォス（ｂｉａｌａｐｈｏｓ））、選択培地上で選択される。得られるｐｈｂ組み込み体は、増殖およびＰＨＢ形成についてグルコースの存在下で最小培地においてスクリーニングされる。
【００２４】
この手順のいくつかの改変がなされ得る。プロモーターのない抗生物質耐性マーカーが使用されない場合、ＰＨＡ遺伝子の挿入は、ベクターに存在するマーカー基づいて選択され、そして所望のレベルのＰＨＡを産生する組み込まれた株が、ＰＨＡ産生についてスクリーニングすることによって検出される。ｐｈｂ遺伝子は、内因性転写配列（例えば、上流の活性化配列）、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位、および／またはオペレータ配列を有し得るが、かならずしも必要ではない。ｐｈｂ遺伝子がこのような配列を有さない場合、所望のアプローチが、ｐＵＴシリーズ（そこでは、転写は、挿入配列を介して進行し得る）のようなベクターの使用に限定される。この限定は、ＲＮＡポリメラーゼが、ｐＬＯＦプラスミドのＴｎ１０隣接領域を通して読むことができないことに原因がある。ａｂｒ遺伝子は、所望であれば、それ自体の発現配列を保有し得る。ａｂｒ遺伝子のかわりに、その構築物は、必須の遺伝子が、その宿主株が、対応する野生型遺伝子における変異を有する場合、選択マーカーとして作用するように設計され得る。この目的のために有用な遺伝子の例は、当該分野において一般に公知である。異なる構築物は、両方の構築物が異なるマーカー遺伝子を保有する限り、連続的に、または同時にのいずれかで、１つの宿主に組み込まれ得る。複数の組み込み事象を使用して、ｐｈｂ遺伝子は、別々に組み込まれ得、例えば、ＰＨＢポリメラーゼ遺伝子は、ｐｈｂＣ−ｃａｔカセットとしてまず組み込まれ、続いてｐｈｂＡＢ−ｋａｎカセットとしてチオラーゼおよびレダクターゼ遺伝子が組み込まれる。あるいは、１つのカセットは、全てのｐｈｂ遺伝子を含有し得る一方、別のカセットは、所望のＰＨＡポリマーを産生するために必要とされるいくつかのｐｈｂ遺伝子のみを含有する。
【００２５】
いくつかの場合において、ｐＪＭＳ１１（Ｐａｎｋｅら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４：７４８−７５１）のようなトランスポゾン組み込みベクターは、その選択マーカーが、組み込まれた株の染色体から切り出され得るように、使用され得る。これは、同じマーカー遺伝子を使用して、各挿入事象の後にそのマーカーを切り出すことによって、複数のトランスポゾン構築物を挿入する機構を提供することを含む多くの理由によって有用である。
【００２６】
（ＰＨＡ形成に関与するｐｈｂおよび他の遺伝子の供給源）
一般的な参考文献は、ＭａｄｉｓｏｎおよびＨｕｉｓｍａｎ、１９９９、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｕｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ６３：２１−５３である。ｐｈｂ遺伝子は、異なる供給源に由来し、そして１つの生物において組み合わされ得るか、または同じ供給源に由来し得る。
【００２７】
（チオラーゼをコードする遺伝子）
チオラーゼをコードする遺伝子は、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｌａｔｕｓ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ（Ｐｅｏｐｌｅｓ ＆ Ｓｉｎｓｋｅｙ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４（２６）：１５２９８−３０３（１９８９）；Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ種（Ｓｃｈｅｍｂｒｉら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７（１５）：４５０１−７（１９９５））、Ｃｈｒｏｍｏｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ（Ｌｉｅｂｅｒｇｅｓｅｌｌ ＆ Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０９（１）：１３５−５０（１９９２））、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ（Ｙａｂｕｔａｎｉら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１３３（１−２）：８５−９０（１９９５））、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ（Ｔｏｍｂｏｌｉｎｉら、Ｍｉｃｒｏｂｉｌｏｇｙ １４１：２５５３−５９（１９９５））、Ｔｈｉｏｃｙｓｔｉｓ ｖｉｏｌａｃｅａ（Ｌｉｅｂｅｒｇｅｓｅｌｌ ＆ Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８（４）：４９３−５０１（１９９３））、およびＺｏｏｇｌｏｅａ ｒａｍｉｇｅｒａ（Ｐｅｏｐｌｅｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２（１）：９７−１０２（１９８７））から単離されている。
【００２８】
ＰＨＡ形成において関連づけられていないが、ｐｈｂ遺伝子と有意な相同性を共有する他の遺伝子および／またはその対応する遺伝子産物もまた使用され得る。チオラーゼ様酵素およびレダクターゼ様酵素をコードする遺伝子は、広範な非ＰＨＢ産生細菌において同定されている。Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｕ２９５８１、Ｄ９０８５１、Ｄ９０７７７）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（Ｕ３２７６１）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｒａｇｉ（Ｄ１０３９０）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（Ｕ８８６５３）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ（Ｕ０８４６５）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ（Ｕ０００１４）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（Ｚ７３９０２）、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ（ＡＥ０００５８２）、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ（Ｚ９２９７４）、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ（ＡＥ００１０２１）、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ（Ｕ３７７２３）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ（Ｌ０５７７０）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（Ｄ８４４３２、Ｚ９９１２０、Ｕ２９０８４）、およびＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ種（Ｄ９０９１０）は、全て、それらの染色体由来の１つ以上のチオラーゼをコードする。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｌ２０４２８）、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ（Ｄ８９１８４）、Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ（Ｄ１３４７０）、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ（Ｕ４１１０５）、ヒト（Ｓ７０１５４）、ラット（Ｄ１３９２１）、マウス（Ｍ３５７９７）、ラディッシュ（Ｘ７８１１６）、カボチャ（Ｄ７０８９５）、およびキュウリ（Ｘ６７６９６）のような真核生物もまた、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ由来の３−ケトチオラーゼに対して有意な相同性を有するタンパク質を発現する。
【００２９】
（レダクターゼをコードする遺伝子）
レダクターゼをコードする遺伝子は、Ａ．ｌａｔｕｓ、Ｒ．ｅｕｔｒｐｈａ（Ｐｅｏｐｌｅｓ ＆ Ｓｉｎｓｋｅｙ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４（２６）：１５２９８−３０３（１９８９）；Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ種（Ｓｃｈｅｍｂｒｉら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７（１５）：４５０１−７（１９９５））、Ｃ．ｖｉｎｏｓｕｍ（Ｌｉｅｂｅｒｇｅｓｅｌｌ ＆ Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０９（１）：１３５−５０（１９９２））、Ｐ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌａ、Ｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ（Ｙａｂｕｔａｎｉら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１３３（１−２）：８５−９０（１９９５））、Ｒ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ（Ｔｏｍｂｏｌｉｎｉら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４１：２５５３−５９（１９９５））、およびＺ．ｒａｍｉｇｅｒａ（Ｐｅｏｐｌｅｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２（１）：９７−１０２（１９８７））から単離されている。
【００３０】
ＰＨＡ形成は関与しないが、ｐｈｂ遺伝子と有意な相同性を有する他の遺伝子および／またはその対応する遺伝子産物もまた、使用され得る。アセトアセチルＣｏＡレダクターゼをコードするｐｈｂＢ遺伝子との有意な相同性を有する遺伝子は、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｅ（Ｘ６４７７２、Ｘ５２９１３）、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ種（Ｕ５３３２７、Ｙ００６０４）、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｄ９０７４５）、Ｖｉｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｙｉ（Ｕ３９４４１），Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（Ｕ３２７０１）、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（Ｕ５９４３３）、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（Ｕ９１６３１）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ種（Ｄ９０９０７）、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ（ＡＥ０００５７０）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（Ｘ６４４６４）、Ｃｕｐｈｅａ ｌａｎｃｅｏｌａｔａ（Ｘ６４５６６）、およびＭｙｃｏｂａｃｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ（Ｕ６６８００）を含むいくつかの生物から単離されている。
【００３１】
（ＰＨＡポリメラーゼをコードする遺伝子）
ＰＨＡポリメラーゼをコードする遺伝子は、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ（Ｆｕｋｕｉ ＆ Ｄｏｉ、Ｊ．Ｂａｃｔｒｒｉｏｌ．１７９（１５）：４８２１−３０（１９９７））、Ａ．ｌａｔｕｓ、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ（Ｐｅｏｐｌｅｓ ＆ Ｓｉｎｓｋｅｙ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４（２６）：１５２９８−３０３（１９８９）；Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ（Ｓｃｈｅｍｂｒｉら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７（１５）：４５０１−７（１９９５））、Ｃ．ｖｉｎｏｓｕｍ（Ｌｉｅｂｅｒｇｅｓｅｌｌ ＆ Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０９（１）：１３５−５０（１９９２））、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ（Ｖａｌｅｎｔｉｎ ＆ Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３９（３）：３０９−１７（１９９３））、Ｎｏｃａｒｄｉａ ｃｏｒａｌｌｉｎａ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０１９９６４）、Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ、Ｐ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌａ、Ｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ（Ｕｅｄａら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８（３）：７７４−７９（１９９６））、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（Ｔｉｍｍ ＆ Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０９（１）：１５−３０（１９９２））、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ（Ｈｕｉｓｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２１９１−９８（１９９１））、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｅｔｌｉ（Ｃｅｖａｌｌｏｓら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８（６）：１６４６−５４（１９９６））、Ｒ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ（Ｔｏｍｂｏｌｉｎｉら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４１（Ｐｔ１０）：２５５３−５９（１９９５））、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｕｂｅｒ（Ｐｉｅｐｅｒ ＆Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．９６（１）：７３−８０（１９９２））、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｒｉｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ（Ｈｕｓｔｅｄｅら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．９３：２８５−９０（１９９２））、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ（Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．９（２−４）：２１７−３０（１９９２）；Ｈｕｓｔｅｄｅら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１５：７０９−１４（１９９３））、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｉｔｉｓ種（Ｋａｎｅｋｏ、ＤＮＡ Ｒｅｓ．３（３）：１０９−３６（１９９６））、Ｔ．ｖｉｏｌａｃｅａｅ（Ｌｉｅｂｅｒｇｅｓｅｌｌ ＆ Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８（４）：４９３−５０１（１９９３））、およびＺ．ｒａｍｉｇｅｒａ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｕ６６２４２）から単離されている。
【００３２】
（細菌染色体中への遺伝子の組み込みのためのベクター）
本明細書において記載されるＰＨＡ産生法において有用なプラスミドトランスポゾン送達ベクターのｐＵＴおよびｐＬＯＦシリーズは、トランスポゾンＴｎ５およびトランスポゾンＴｎ１０の特徴を、それぞれ使用する。転移を促進する酵素をコードするトランスポザーゼ遺伝子は、「トランスポザーゼ認識配列」の外側に位置し、そしてその結果、転移の際に失われる。Ｔｎ５およびＴｎ１０の両方は、例えば、Ｔｎ７トランスポゾンとは異なり、標的ゲノム中にランダムに組み込まれることが知られている。しかし、一般に、任意のトランスポゾンは、異種遺伝子（例えば、ｐｈｂ遺伝子）の細菌ゲノムへの挿入を容易にするために改変され得る。従って、この方法論は、本明細書に記載される方法に使用されるベクターに限定されていない。
【００３３】
（増強されたポリマー産生のスクリーニングのための方法および材料）
（細菌株のスクリーニング）
上記の技術は、新たなＰＨＡ産生株の生成を可能にし、そしてまた、スクリーニングの目的のために有用な新たな細菌株を提供する。以下の表１は、染色体に、そしてプラスミドにコードされるＰＨＢ酵素の異なる組み合わせ、およびどのように特定の株が新たな酵素または改善された酵素を同定するために使用され得るかを示す。
【００３４】
改善された酵素を発現する遺伝子のためのスクリーニングツール以外に、染色体に組み込まれた完全なＰＨＡ経路を有するＥ．ｃｏｌｉ株は、ＰＨＡ形成に影響を及ぼす異種遺伝子をスクリーニングするために使用され得る。Ｅ．ｃｏｌｉは、有用な宿主である。なぜなら、遺伝子は、多数のプラスミドベクター（高コピー数、低コピー数、化学または熱誘導性など）から容易に発現され、そして変異誘発手順は、この細菌について十分に確立されているからである。さらに、Ｅ．ｃｏｌｉの完全に決定されたゲノム配列は、ＰＨＡ代謝に影響を及ぼす遺伝子の特徴付けを容易にする。
【００３５】
不完全なＰＨＡ経路を発現するトランスジェニックＥ．ｃｏｌｉ株は、他の生物（原核生物または真核生物のいずれか）から欠失した遺伝子のホモログを同定するために、遺伝子ライブラリーを用いて形質転換され得る。これらのスクリーニング株は、完全なＰＨＡ生合成経路を有さないので、その欠失している機能は、ＰＨＡを生合成する宿主株の能力によって相補され、そして同定され得る。一般に、ＰＨＡを合成する細菌のコロニーは、寒天プレート上で不透明であり、一方、ＰＨＡを合成しないコロニーは、透明に見える。欠失している遺伝子を相補する遺伝子ライブラリー由来のクローンは、スクリーニング培地上で増殖する場合、宿主に白い表現型を与える。一般に、スクリーニング培地は、過剰の炭素源を含む全ての必須の栄養素、および耐性がライブラリー構築において使用されるベクターによって特定される抗生物質を含有する。
【００３６】
新たな遺伝子以外に、改善されたＰＨＡ生合成酵素をコードする遺伝子もまたスクリーニングされ得る。この活性を欠くが、他のＰＨＡ生合成酵素をコードする遺伝子を含有するＥ．ｃｏｌｉ宿主株中へのｐｈｂ生合成遺伝子を含有するプラスミドの変異誘発された収集物は、増大したか、または変更された活性についてスクリーニングされ得る。例えば、増大した活性を有するＰＨＡポリメラーゼは、ＰＨＢ形成の支持が不十分である条件下で、ＰＨＢ含有コロニーを同定することによって染色体から、チオラーゼおよびレダクターゼを発現する株中でスクリーニングされ得る。Ｃ₄に対する増大した特異性を有するｍｃｌ−ＰＨＡポリメラーゼは、ＰＨＢ蓄積促進条件下で、同様に、スクリーニングされ得る。ｐｈａＧにコードされたＡＣＰ：：ＣｏＡトランスフェラーゼにおける変更された活性は、この遺伝子の変異されたバージョンを、ｐｈｂＣ組み込み体中で発現させ、そして短鎖の脂肪酸からのＰＨＢ形成についてスクリーニングすることによってスクリーニングされ得る。最適未満の物理的条件（例えば、温度、ｐＨ、浸透圧、および酸素テンション）下での増大した活性を有する酵素は、このような条件下で、宿主を増殖させ、そして所望の遺伝子の変異バージョンを収集物をプラスミド上に提供することによってスクリーニングされ得る。中程度の側鎖の３−ケトアシル−ＣｏＡ（例えば、３−ケトヘキサノイル−ＣｏＡ）に対する特異性を有するレダクターゼ酵素は、染色体に組み込まれたｍｓｃ−ＰＨＡポリメラーゼ遺伝子およびプラスミド上にｐｈｂＢ遺伝子の変異誘発バージョンを有する株中でＰＨＡ合成コロニーを同定することによってスクリーニングされ得る。異なる特異性のＰＨＡ酵素の組み合わせにより、多数の新たな基質特異性のスクリーニングが可能になる。増殖条件のさらなる順列により、最適未満の条件下で活性な酵素または細胞性補因子（例えば、補酵素ＡおよびＣｏＡ誘導体、還元されたかもしくは酸化されたニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、ＮＡＤＨ、およびＮＡＤＰＨ）によってより少なく阻害される酵素のスクリーニングが可能になる。
【００３７】
本明細書に記載される技術を使用して、中程度の側鎖のＰＨＡ経路のための酵素をコードする遺伝子を発現するＥ．ｃｏｌｉ株が、構築され得る。ｐｈａＣまたはｐｈａＧのいずれか、またはその両方がＥ．ｃｏｌｉの染色体に組み込まれている株は、中程度の鎖長の３−ヒドロキシ脂肪酸（３−ヒドロキシデカノエートが優勢な構築物である）を含むＰＨＡを蓄積する。ｐｈａＣが、それ自体に組み込まれている場合、ｍｓｃ−ＰＨＡは、脂肪酸から合成され得る。このような株において、３−ヒドロキシ脂肪酸前駆体が細胞内に蓄積するように、脂肪酸酸化を操作することは有利である。この操作は、変異誘発によって、またはＥ．ｃｏｌｉ脂肪酸分解酵素ＦａｄＡおよびＦａｄＢをコードする遺伝子を、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａまたは関連するｒＲＮＡホモロジーＩ群蛍光シュードモナス菌由来の対応するｆａｏＡＢ遺伝子で置換することによって達成され得る。
【００３８】
【表１】

（実施例）
本明細書中に記載される方法および組成物は、以下の非限定的な実施例を参照することによってさらに理解される。これらの実施例は、以下の一般的な方法および材料を使用する。
【００３９】
（材料および方法）
Ｅ．ｃｏｌｉ株を、３７℃もしくは３０℃で、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ［１９９２中で、または最小Ｅ２培地（Ｌａｇｅｖｅｅｎら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：２９２４−２９３２（１９８８））中で増殖させた。ＤＮＡ操作を、Ｑｉａｇｅｎプラスミド調製キットまたはＱｉａｇｅｎ染色体ＤＮＡ調製キットを用いて、製造業者の推奨に従って精製されたプラスミドおよび染色体ＤＮＡで行った。ＤＮＡを、製造業者の推奨に従って、制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を使用して消化した。ＤＮＡフラグメントを、Ｑｉａｇｅｎキットを使用して、０．７％アガロースＴｒｉｓ／酢酸／ＥＤＴＡゲルから単離した。
【００４０】
プラスミドＤＮＡを、形質転換またはエレクトロポレーションによって、Ｅ． ｃｏｌｉ細胞に導入した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ））。ｐＵＴベクターからのｐｈｂ遺伝子の転移を、プラスミドドナー株およびレシピエントの接合によって達成した（Ｈｅｒｒｅｒｏら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：６５５７（１９９０））。使用されるレシピエント株は、ＬＳ５２１８またはＭＢＸ２３のいずれか由来のＥ．ｃｏｌｉのナリジクス酸（ｎａｌａｄｉｘｉｃ ａｃｉｄ）またはリファンピシンの自然発生的な耐性変異体であった。ＭＢＸ２３は、ＬＪ１４ ｒｐｏＳ：：Ｔｎ１０であり、ここでｒｐｏＳ：：Ｔｎ１０対立遺伝子が、株１１０６（Ｅｉｓｅｎｓｔａｒｋ）からＰ１形質導入によって導入された。ｐｈｂ遺伝子が染色体中に組み込まれたレシピエントを、ミニトランスポゾン、カナマイシン、またはクロラムフェニコールによって特定される抗生物質耐性を補充したナリジクス酸（ｎａｌａｄｉｘｉｃ ａｃｉｄ）またはリファンピシンプレート上で選択した。オリゴヌクレオチドを、ＢｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓまたはＧｅｎｅｓｙｓから購入した。ＤＮＡ配列を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＡＢＩ ３７３Ａ自動配列決定装置を使用して自動化配列決定によって決定した。ＤＮＡを、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）からのＰＣＲ−ｍｉｘおよびＥｒｉｃｏｍｐ ＤＮＡ増幅装置を使用して、５０μｌ容量で、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して増幅した。
【００４１】
ＤＮＡフラグメントを、０．７％アガロース／ＴＡＥゲル上で分離した。サザンブロットを、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ）によって記載される手順に従って実行した。ｐｈｂ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントの検出を、ＵＳＢ／Ａｍｅｒｓｈａｍからの化学発光標識および検出キットを使用して実行した。タンパク質サンプルを、２−メルカプトエタノールおよびドデシル硫酸ナトリウムの存在下で、３分間、沸騰しているウォーターバス中でのインキュベーションによって変性させ、引き続いて１０％、１５％、または１０％〜２０％のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル上で分離した。支持されたニトロセルロース膜（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）へのタンパク質の転写後、３−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ、およびＰＨＢポリメラーゼを、これらの酵素に対して惹起されたポリクローナル抗体および西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体、続いて化学発光検出（ＵＳＢ／Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して、検出した。
【００４２】
アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ活性およびアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ活性を、３７℃にてＬＢ培地中で１６時間増殖させた株からの無細胞抽出物中で、ＰｅｏｐｌｅｓおよびＳｉｎｓｋｅｙ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１５２９３−１５２９７（１９８９）に記載されるように決定した。アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ活性を、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋｅｒ分光光度計を使用して無細胞抽出物の添加後の３０４ｎｍにおける吸光度の減少をモニタリングすることによって、Ｍｇ²⁺−アセトアセチル−ＣｏＡ複合体の分解として測定する。アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ活性を、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋｅｒ分光光度計を使用して、ＮＡＤＨからＮＡＤへの転換を３４０ｎｍでモニタリングすることによって測定する。
【００４３】
蓄積したＰＨＡを、以下のようにガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析によって決定した。約２０ｍｇの凍結乾燥した細胞塊を、内部標準として添加された２ｍｇ／ｍＬ安息香酸を含む、容量で９０％の１−ブタノールおよび１０％の濃塩酸を含む２ｍｌの混合液中で、１１０℃で３時間、同時抽出およびブタノール分解（ｂｕｔａｎｏｌｙｓｉｓ）に供した。得られる混合液の水溶性成分を、３ｍＬの水を用いる抽出によって除去する。有機層（全体の流速２ｍＬ／分での１：５０の分離比で１μＬ）を、ＳＰＢ−１融合シリカキャピラリーＧＣカラム（３０ｍ；０．３２ｍｍ ＩＤ； ０．２５μｍ フィルム；Ｓｕｐｅｌｃｏ；Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ，ＰＡ）を使用して、以下の温度プロフィール：８０℃、２分間；１分間当たり１０℃で２５０℃まで；２５０℃、２分間を用いて、ＦＩＤ検出器を備えるＨＰ ５８９０ ＧＣ（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ Ｃｏ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）で分析した。ポリマー中の４−ヒドロキシブチレート単位の存在について試験するために使用される標準は、γ−ブチロラクトンであった。これは、ポリ（４−ヒドロキシブチレート）と同様に、ブタノール分解の際にｎ−ブチル−４−ヒドロキシブチレートを形成する。ポリマー中の３−ヒドロキシブチレート単位について試験するために使用される標準は、精製されたＰＨＢであった。
【００４４】
クロロホルム抽出後のポリマーの分子量を、Ｗａｔｅｒｓ Ｓｔｙｒａｇｅｌ ＨＴ６Ｅカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．，Ｗａｔｅｒｓ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用して、狭い多分散性であるポリスチレンサンプルに対して較正したゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって決定した。サンプルを、１ｍｇ／ｍＬでクロロホルムに溶解し、そして５０μＬサンプルを注入し、そして１ｍＬ／分で溶出した。検出を、示差屈折計を使用して実行した。
【００４５】
１−メチル−３−ニトロ−１−ニトロソ−グアニジン（ＮＴＧ）変異誘発を、９９％の殺傷に対応する１ｍｇ／ｍｌ ＮＴＧを用いる９０分間の処理を使用して、Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ Ｓｈｏｒｔ Ｃｏｕｒｓｅ ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）に記載されるように実行した。
【００４６】
（実施例１：遺伝子組込みのための宿主株ツールおよびプラスミドツール）
トランスポゾンベクターおよびトランスポゾン誘導体を開発した由来の株およびプラスミドは、以下の表２および３に列挙される。ＭＢＸ２４５およびＭＢＸ２４７を、約３０ｇ／ｍｌのナリジクス酸（ｎａｌａｄｉｘｉｃ ａｃｉｄ）を含むＬＢプレート上で、それぞれ、ＭＢＸ２３およびＬＳ５２１８を増殖させることによって選択した。ＭＢＸ２４６およびＭＢＸ２４８を、５０ｇ／ｍｌのリファンピシンを含むＬＢプレート上で、それぞれ、ＭＢＸ２３およびＬＳ５２１８を増殖させることによって選択した。これらの選択培地上に２４時間以内に出現したコロニーを、同じ培地でレプリカプレート作製し、増殖後、１５％グリセロール／栄養ブロス中で−８０℃で保存した。
【００４７】
ＭＢＸ２４５およびＭＢＸ２４７を、３０μｇ／ｍｌのナリジクス酸（ｎａｌａｄｉｘｉｃ ａｃｉｄ）を含むＬＢプレート上で、それぞれ、ＭＢＸ２３およびＬＳ５２１８を増殖させることによって選択した。ＭＢＸ２４６およびＭＢＸ２４８を、５０μｇ／ｍｌのリファンピシンを含むＬＢプレート上で、それぞれ、ＭＢＸ２３およびＬＳ５２１８を増殖させることによって選択した。２４時間以内にこれらの選択培地上に出現したコロニーを、同じ培地でレプリカプレートを作製し、増殖後、１５％グリセロール／栄養ブロス中で−８０℃で保存した。
【００４８】
【表２】

【００４９】
【表３】

（実施例２：ｐｈｂ遺伝子の組込みを容易にするクローニングベクターの構築）
プラスミドｐＭＮＸＴｐｌｋａｎおよびプラスミドｐＭＮＸＴｐｌｃａｔは、プラスミドｐＵＣ１８ＮｏｔおよびプラスミドｐＵＣｌ８Ｓｆｉに基づき、図１Ａ〜１Ｃに示されるように開発された。
【００５０】
プラスミドｐＢＧＳ１８由来のＴｎ９０３カナマイシン（Ｋｍ）耐性遺伝子を、
オリゴヌクレオチドプライマーｌｉｎｋＫ１、５’ＴＧＣＡＴＧＣＧＡＴＡＴＣＡＡＴＴＧＴＣＣＡ ＧＣＣＡＧＡＡＡＧＴＧＡＧＧ、およびｌｉｎｋＫ２、５’ＡＴＴＴＡＴＴＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＣを使用して、ＰＣＲによって増幅した。
【００５１】
ＰＣＲ増幅の前に、これらのプライマーを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて標準的手順を使用してリン酸化した。このＤＮａを、以下のプログラムを使用して増幅した：１サイクル（９５℃で３分間、４２℃で４０秒間、７２℃で２分間）続いて３０サイクル（９５℃で４０秒間、４２℃で４０秒間、および
７２℃で９０秒間）。次いで、ＤＮＡをフェノール抽出し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理し、その後ゲル精製した。次いで、平滑末端の０．８ｋｂ ＤＮＡフラグメントを、ｐＵＣ１８Ｎｏｔのポリリンカー中のＥｘ１１３６ＩＩ部位に挿入して、ｐＭＮＸｋａｎを得た。
【００５２】
ｃａｔ遺伝子を、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｉｎｃ．ＮＪ）からＨｉｎｄＩＩＩカセットとして得、ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗフラグメントを使用して平滑末端化し、そしてｐＵＣ１８ＮｏｔのＥｃ１１３６ＩＩ部位に挿入して、ｐＭＮＸｃａｔを得た。
【００５３】
ｔｒｐターミネーター配列を、２つの合成オリゴヌクレオチドＴＥＲＭ１（５’ＣＣＣＡＧＣＣＣＧＣＴＡＡＴＧＡＧＣＧＧＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴＧＡＡＣＡＡ ＡＡ ３’）およびＴＥＲＭ２（５’ＴＡＣＧＴＡＴＴＴＴＧＴＴＣＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＣＣＧＣＴＣＡＴＴＡＧＣＧＧＧＣＴＧＧＧ ３’）をアニーリングさせることによって構築した。
【００５４】
次いで、このターミネーターを、ｐＭＮＸｋａｎおよびｐＭＮＸｃａｔのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｐｈＩ部位に挿入して、ｐＭＮＸＴｋａｎおよびｐＭＮＸＴｃａｔをそれぞれ得た。これらのベクターを、任意のプロモーターフラグメントがＳｐｈＩ部位およびＳａｃＩ部位の間に付加され得るように構築した。プロモーターｐ₁を、合成オリゴヌクレオチドＰＨＢＢ１（５’ＴＡＣＧＴＡＣＣＣＣＡＧＧＣＴＴＴＡＣＡＴＴＴＡＴＧＣＴＴＣＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＧＴＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧ ＴＧＡＧＣＧＧＴＴ ３’）およびＰＨＢＢ２（５’ＴＴＣＧＡＡＣＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴＣＣＡＣＡＣＡＡＣＡＴＡＣＧＡＧＣＣＧＧＡＡＧＣＡＴＡＡＡＴＧＴＡＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧ ３’）のアニーリングによって構築した。続いて、ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗフラグメントを用いて末端を平滑化した。次いで、平滑末端化プロモーターフラグメントｐ₁をｐＭＮＸＴｋａｎおよびｐＭＮＸＴｃａｔのＨｉｎｃＩＩ部位に挿入して、ｐＭＮＸＴｐ₁ｋａｎおよびｐＭＮＸＴｐ₁ｃａｔをそれぞれ得た。
【００５５】
Ｔｐ₁ｃａｔカセットをｐＭＮＸＴｐ₁ｃａｔからＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとしてｐＵＣ１８ＳｆｉのＥｃｏＲ１−ＨｉｎｄＩＩＩ部位に移すことによって、プラスミドｐＭＳＸＴｐ₁ｃａｔを構築した。同様に、Ｔｐ₁ｋａｎを含むＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントをｐＵＣ１８ＳｆｉのＥｃｏＲｌ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位に移すことによって、ｐＭＳＸＴｐ₁ｋａｎを構築した。
【００５６】
（実施例３：ＰＨＢポリメラーゼをコードするｐｈｂＣの染色体組込みのためのプラスミドの構築）
図２Ａ〜２Ｂに示されるように、プラスミドｐＭＵＸＣ₅ｃａｔは、レシピエント株の染色体上でのこの遺伝子の組込みのために、転位因子上にＺ．ｒａｍｉｇｅｒａ由来のｐｈｂＣ遺伝子を含む。強力な翻訳配列をｐＫＰＳ４から得、これは、ｐＴｒｃベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）中のＰ．ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓからのＰＨＡポリメラーゼをコードするｐｈａＣｌを含む。この構築物において、ｐｈａＣｌの前には、強力なリボソーム結合部位：ＡＧＧＡＧＧＴＴＴＴＴ（−ＡＴＧ）がある。このｐｈａＣ１遺伝子（上流の配列を含む）を、ｐＵＣ１８ＳｆｉのＳｍａＩ部位に平滑末端ＥｃｏＲｌ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとしてクローニングして、ｐＭＳＸＣ₃を得た。平滑末端ｃａｔ遺伝子カセットを、引き続いて平滑末端Ｓｓｅ８３８７ＩＩ部位にクローニングし、ｐＭＳＸＣ₃ｃａｔを得た。この時点において、５’の２７塩基対以外のｐｈａＣ１コード領域のすべてを、ＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩフラグメントとして除去し、そしてＺ．ｒａｍｉｇｅｒａ由来のｐｈｂＣ遺伝子由来の対応するフラグメントで置き換えた。得られるプラスミドｐＭＳＸＣ₅ｃａｔは、Ｐ．ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ ＰＨＡポリメラーゼ由来の９アミノ末端残基、および残りのＺ．ｒａｍｉｇｅｒａ由来の残基を有する、ハイブリッドＰＨＢポリメラーゼ酵素をコードする。次いで、このＣ₅ｃａｔカセットを、ＡｖｒＩＩフラグメントとして切除し、そしてｐＵＴＨｇの対応する部位においてクローニングし、それによってこのベクター由来の水銀耐性マーカーを欠失させる。得られるプラスミド、ｐＭＵＸＣ₅ｃａｔは、Ｃ₅ｃａｔミニトランスポゾンを含み、ここでｐｈｂＣの前には、プロモーター配列はない。従って、組込みに基づくこのカセットの発現は、組込み部位に隣接するＤＮＡによって提供される転写配列に依存する。
【００５７】
（実施例４：チオラーゼおよびレダクターゼをコードするｐｈｂＡＢの染色体組込みのためのプラスミドの構築）
図３Ａ〜３Ｂに部分的に示されるように、ｐＭＳＸＴｐ₁ＡＢ₅ｋａｎ２をｐＭＳＸＴｐ₁ｋａｎから構築した。第１のｐＭＳＸＴｐ₁ｋａｎをＮｄｅＩで消化し、Ｋｌｅｎｏｗで平滑化し、そして再連結して、ｐＭＳＸＴｐ₁ｋａｎ２を得た。ここで、ＮｄｅＩ部位は欠失されている。この欠失は、クローニング手順の後の段階で、Ｚ．ｒａｍｉｇｅｒａのｐｈｂＡのすぐ上流の独特なＮｄｅＩ部位を生じる。
【００５８】
Ｂ₅を、ｐＵＣＤＢＫ１（Ｐｅｏｐｌｅｓ ａｎｄ Ｓｉｎｓｋｅｙ １９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３： ３４９−３５７）由来のＮａｒＩフラグメントとしてクローニングし、そしてｐＵＣｌ８ＳｆｉのＨｉｎｃＩＩ部位にクローニングして、ｐＭＳＸＢ₅を生成した。Ａ₅をＦｓｅＩ／ｂｌｕｎｔ−ＳａｌＩフラグメントとして、Ｅｃｌｌ３６ＩＩ−ＳａｌＩ部位に挿入して、ｐＭＳＸＡＢ₅を得、そしてＺ．ｒａｍｉｇｅｒａ ＡＢ₅遺伝子間領域を再生した。ｐＭＳＸＡＢ₅ｃａｔを、ｐＭＳＸＡＢ₅のＨｉｎｄＩＩＩ部位に、プロモーターを有さないｃａｔカセットを挿入することによって作製した。ｐＭＳＸＡＢ₅ｃａｔ由来のＡＢ₅フラグメントを、ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩフラグメントとして、ｐＭＳＸＴｐ₁ｋａｎ２のＳｍａＩ部位にクローニングして、ｐＭＳＸＴｐ₁ＡＢ₅ｋａｎ２を得た。
【００５９】
次いで、発現カセットＡＢ₅ｃａｔを２．８ｋｂ ＡｖｒＩＩフラグメントとして切除し、そしてｐＵＴＨｇのＡｖｒＩＩ部位に連結し、そしてＥ．ｃｏｌｉ株ＣＣ１１８ λｐｉｒに形質転換して、プラスミドｐＭＵＸＡＢ₅ｃａｔを得た。次いで、このプラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｓ１７−１λｐｉｒに形質転換し、そしてこれを使用して、接合によってＥ．ｃｏｌｉ ＭＢＸ２４７の染色体にＡＢ５ｃａｔ発現カセットを挿入した。得られるＡｐ^s／Ｃｍ^rトランス接合体を、ｐｈｂＡＢ遺伝子によってコードされるチオラーゼ遺伝子およびレダクターゼ遺伝子の組込みおよび発現について特徴付けた。
【００６０】
（実施例５：ｐｈｂＡＢのＥ．ｃｏｌｉ染色体への組込みのための改善されたプロモーターを有するプラスミドの構築）
図３Ａ〜３Ｂに示されるように、ｐｈｂＡＢ５の発現を、これらの遺伝子の上流の強力なプロモーターの導入によって改善した。これらのプロモーターを、上流の活性化配列、−３５プロモーター領域、転写開始部位を有する−１０プロモーター領域、および可能な安定化機能を有するｍＲＮＡ配列を提供する、オリゴヌクレオチドのセットを用いて生成した。プラスミドｐＭＳＸＴｐ₁ＡＢ₅ｋａｎ２を、ＰｓｔＩ／ＸｂａＩを用いて消化し、そしてｌａｃプロモーターの−１０領域を含むフラグメントを、オリゴヌクレオチド３Ａ（５’ＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＧＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＣＧＧＧＣＴＣＧＣＧＣＣＧＴＴ）および３Ｂ（５’ＣＴＡＧＡＡＣＧＧＣＧＣＧＡＧＣＣＣＧＧＣＧＧＴＴＣＴＣＣＣＴＣＣＡＣＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＧＣＣＴＧＣＡ）をアニーリングさせた後に得られるフラグメントとして挿入した。次に、ｌａｃ−３５領域およびｒｒｎＢ領域を含むフラグメントを、オリゴヌクレオチド：１Ａ（５’ＴＴＣＡＧＡＡＡＡＴＴＡＴＴＴＴＡＡＡＴＴＴＣＣＴＣＴＴＧＡＣＡＴＴＴＡＴＧＣＴ ＧＣＡ）および１Ｂ（５’ＧＣＡＴＡＡＡＴＧＴＣＡＡＧＡＧＧＡＡＡＴＴＴＡＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＣＴＧＡＡＴＧＣＡ）をアニーリングさせた後に得られるフラグメントとしてＰｓｔＩ部位に挿入した。次に、ＡＢ₅からの転写開始部位を含むメッセンジャー安定化配列を、オリゴヌクレオチド：４Ａ（５’ＣＴＡＧＴＧＣＣＧＧＡＣＣＣＧＧＴＴＣＣＡＡＧＧＣＣＧＧＣＣＧＣＡＡＧＧＣＴＧＣＣＡＧＡＡＣＴＧＡＧＧＡＡＧＣＡＣＡ）および４Ｂ（５’ＴＡＴＧＴＧＣＴＴＣＣＴＣＡＧＴＴＣＴＧＧＣＡＧＣＣＴＴＧＣＧＧＣＣＧＧＣＣＴＴＧＧＡＡＣＣＧＧＧＴＣＣＧＧＣＡ）をアニーリングさせた後に得られるフラグメントとしてＸｂａＩ−ＮｄｅＩ部位に挿入した。得られるプラスミドは、ｐＭＳＸｐ₁₁ＡＢ₅ｋａｎ２である。Ｔｐ₁₁ＡＢ₅ｋａｎ２を含むＡｖｒＩＩフラグメントを、ＡｖｒＩＩで切断したｐＵＴＨｇにクローニングし、ＭＢＸ３７９およびＭＢＸ２４５のゲノムへの組込みのために使用した。
【００６１】
プラスミドｐＭＳＸＴｐ₁₂ＡＢ₅ｋａｎ２を、以下のオリゴヌクレオチド：２Ａ（５’ＴＣＣＣＣＴＧＴＣＡＴＡＡＡＧＴＴＧＴＣＡＣＴＧＣＡ）および２Ｂ（５’ＧＴＧＡＣＡＡＣＴＴＴＡＴＧＡＣＡＧ ＧＧＧＡＴＧＣＡ）がオリゴヌクレオチド１Ａおよび１Ｂの代わりに使用されたという区別を有するｐＭＳＸＴｐ₁₁ＡＢ₅ｋａｎ２として構築した。これらのオリゴヌクレオチドは、コンセンサスＥ．ｃｏｌｉ ｐｈｏボックスおよび−３５プロモーター領域を提供し、培地中のリン酸濃度によって強力に調節されるプロモーターを生成する。
【００６２】
ｐＭＳＸＴｐ₁₃ＡＢ₅ｋａｎ２を構築して、一般的なストレス条件下（例えば、栄養の制限、ｐＨまたは熱ショック、および毒性化学物質の投与）で発現されることが示されているプロモーターからのＡＢ₅の発現を提供した。ｕｓｐＡのプロモーター領域をオリゴヌクレオチドＵｓｐＵｐ（５’ＴＧＡＣＣＡＡＣＡＴＡＣＧＡ ＧＣＧＧＣ）およびＵｓｐＤｗｎ（５’ＣＴＡＣＣＡＧＡＡＣＴＴＴＧＣＴＴＴＣＣ）を使用して、ＰＣＲ反応（９５℃で３分間のインキュベーション、続いて９５℃で４０秒間、４２℃で４０秒間、６８℃で７分間のインキュベーションの３０サイクル、および４℃での最終保存からなる）において増幅した。約３５０ｂｐ ＰＣＲ産物を、ＰＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，ＵＳＡ）にクローニングして、ｐＭＢＸｐ₁₃を生成した。プロモーターおよびｕｓｐＡについての転写開始部位およびｕｓｐＡ ｍＲＮＡの最初の９３ｂｐを含む約１９０ｂｐのＨｉｎｃＩＩ−ＭｓｃＩフラグメントを、平滑末端ＢａｍＨＩ−Ｓｓｅ８３８７Ｉ ｐＭＳＸＴｐ₁ｋａｎ２にクローニングし、ｐＭＳＸＴｐ₁₃ｋａｎ２を得た。次いで、プラスミドｐＭＳＸＴｐ₁₃ｋａｎ２を、ＫｐｎＩで消化し、Ｔ４ポリメラーゼで平滑末端化し、そして仔ウシ腸ホスファターゼを使用して脱リン酸化した。ＡＢ₅遺伝子を、ｐＭＳＸＡＢ₅からの２．０ｋｂ ＥｃｏＲＩ／Ｓｓｅ８３８７Ｉフラグメントとして単離し、ＫｌｅｎｏｗおよびＴ４ポリメラーゼを使用して平滑末端化し、そしてｐＭＳＸＴｐ₁₃ｋａｎ２のＫｐｎＩ部位に連結した。得られるプラスミドｐＭＳＸＴｐ₁₃ＡＢ₅ｋａｎ２において、ｐｈｂＡＢ遺伝子およびｋａｎ遺伝子は、ｕｓｐＡ（ｐ₁₃）プロモーターから発現される。
【００６３】
次いで、ｐ_nＡＢ₅ｋａｎ（ｎ＝１１、１２、１３）発現カセットは、２．８ｋｂ ＡｖｒＩＩフラグメントとして切除され、そしてｐＵＴＨｇのＡｖｒＩＩ部位に連結され、そしてＥ．ｃｏｌｉ株ＣＣ１１８ λｐｉｒに形質転換されて、プラスミドｐＭＵＸｐ_nＡＢ₅ｋａｎを得た。次いで、このプラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｓ１７−１λｐｉｒに形質転換し、そしてこれを使用してｐ₁₁ＡＢ₅ｋａｎ、ｐ₁₂ＡＢ₅ｋａｎ、およびｐ₁₃ＡＢ₅ｋａｎ発現カセットを、接合によってＥ．ｃｏｌｉ株の染色体に挿入した。
【００６４】
（実施例６：Ｅ．ｃｏｌｉの染色体へのＣ₅ｃａｔの組込み）
Ｃ₅ｃａｔを、ドナー株としてＳ１７−１ λｐｉｒ（ｐＭＵＸＣ₅ｃａｔ）を使用して、接合によってＭＢＸ２３の染色体に導入した。接合混合物をＬＢ／Ｎｌ／Ｃｍプレートに広げ、そして組込み体を得た。それらの４０％がアンピシリンに感受性であり、このことは、これらの株にはプラスミドが存在しないことを示した。５つの組込み体を、ｐＭＳＸＡＢ₅ｃａｔ（Ａｐ^r）を用いて形質転換し、そしてＰＨＢポリメラーゼの生合成活性を試験するためにＬＢ／Ａｐ／Ｃｍ／２％ グルコースで増殖させた（表４）。
【００６５】
【表４】

（実施例７：組み込まれた株におけるＣ５発現の増幅）
ＰＨＢポリメラーゼの発現を、１００、２００、５００、および１０００μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢプレートでＭＢＸ３２６を連続的に再ストリークすることによって増大させた。株ＭＢＸ３７９を、ＭＢＸ３２６から誘導し、そして１０００μｇ／ｍｌまで高いクロラムフェニコール耐性を示した。ＭＢＸ３７９およびその祖先から単離された染色体ＤＮＡのサザンブロット分析において、ｐｈｂＣ５のコピー数は増加しなかった。ウェスタンブロット分析は、ｐｈｂＡＢ遺伝子がプラスミドに存在した場合に、これらの株の無細胞抽出物においてＰＨＢポリメラーゼレベルの強力な増加を示した。
【００６６】
（実施例８：ｐ₁₁ＡＢ₅ｋａｎ、ｐ₁₂ＡＢ₅ｋａｎ、およびｐ₁₃ＡＢ₅ｋａｎのＭＢＸ３７９への組込み）
ｐＭＵＸｐ₁₁ＡＢ₅ｋａｎ、ｐＭＵＸｐ₁₂ＡＢ₅ｋａｎ、またはｐＭＵＸｐ₁₃ＡＢ₅ｋａｎのいずれかを有するＳ１７−１ λｐｉｒ株を、ＭＢＸ３７９と接合させた。ｐｈｂＡＢ₅ｋａｎがその染色体に組み込まれたトランスジェニック株を、ＬＢ／Ｎｌ／Ｋｍプレート上で選択した。組込み体の間で、ＰＨＢプロデューサーをＬＢ／グルコースプレート上で同定した。個々の構築物の表示は、ＭＢＸ６１２（ＭＢＸ３７９：：ｐ₁₁ＡＢ₅ｋａｎ）、ＭＢＸ６７７（ＭＢＸ３７９：：ｐ₁₂ＡＢ₅ｋａｎ）、およびＭＢＸ６８０（ＭＢＸ３７９：：ｐ₁₃ＡＢ₅ｋａｎ）であった。サザンブロットおよびウェスタンブロットは、ｐｈｂＡＢ遺伝子が染色体に組込まれ、これらの株においても同様に発現されたことを示した。表５は、２％グルコースを有するＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地、または２％グルコースおよび０．５％トウモロコシ浸漬液を含む最小Ｅ２培地中で増殖させたトランスジェニックＥ．ｃｏｌｉ ＰＨＢプロデューサーのＰＨＢ蓄積レベルを示す。
【００６７】
【表５】

（実施例９：改善された株を産生するための選択およびバクテリオファージＰ１形質導入）
ＭＢＸ６１２、６７７、および６８０の増殖特性を、バクテリオファージＰ１形質導入によって改善した。単回の形質導入工程が、異なる株由来のＣ₅ｃａｔ対立遺伝子およびＡＢ₅ｋａｎ対立遺伝子をＬＳ５２１８に形質導入するために必要であった。このことは、２つの別々の組込みカセットを、染色体上で互いに密接させて配置したことを示す。得られる株は、ＭＢＸ６９０（ＭＢＸ６８１由来）、ＭＢＸ６９１（ＭＢＸ６７７由来）、およびＭＢＸ６９８（ＭＢＸ６８０由来）である。制限された窒素を有する最小Ｅ２培地上でのＭＢＸ６１２の反復接種は、ＭＢＸ６８１を生じた。Ｐ１形質導入によって生成される株と違って、ＭＢＸ６８１は、改善された増殖特性を示さなかった。サザンブロットおよびウェスタンブロットは、ｐｈｂＣ遺伝子およびｐｈｂＡＢ遺伝子が首尾よく形質導入され、そしてこれらの株中で同様に発現されたことを示す。以下の表６は、２％グルコースを有するＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地、または２％グルコースおよび０．５％トウモロコシ浸漬液を含む最小Ｅ２培地中で増殖させた、これらのトランスジェニックＥ．ｃｏｌｉ ＰＨＢプロデューサーについてのＰＨＢ蓄積レベルを示す。
【００６８】
【表６】

（実施例１０：ＰＨＢ産生についてのトランスジェニックＥ．ｃｏｌｉ株のさらなる改善）
ＮＴＧまたはＥＭＳを使用する変異誘発を使用して、ＭＢＸ６８０中のＰＨＢ産生をさらに改善した。ＭＢＸ７６９株およびＭＢＸ７７７株を、ＥＭＳおよびＮＴＧをそれぞれ用いたＭＢＸ６８０の処理後に選択した。これらの株は、１％グルコース、０．５％トウモロコシ浸漬液、および１ｍｇ／ｍｌ クロラムフェニコールを補充したＲ２培地上で増殖し得ることが見出された。ＭＢＸ７６９を、２または３％ グルコースを有する５０ｍｌ Ｒ−１０培地／０．５％ ＣＳＬ中で、３７℃にて２０時間〜２６時間増殖させた。ＰＨＢは、細胞乾燥重量の７１％まで蓄積した。同様に、ＭＢＸ７６９は、０．３７５ｇ／Ｌ ＫＨ₂ＰＯ₄、０．８７５ Ｋ₂ＨＰＯ₄、０．２５（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、および総計５０ｇ／Ｌグルコース（インキュベーションの過程にわたって５つのアリコートを添加した）を含むかまたは含まない、５０ｍＬ ＬＢ中で増殖させた。６３時間のインキュベーションの後、ＰＨＢは細胞乾燥重量の９６％まで蓄積した。
【００６９】
ＭＢＸ７７７由来のｐｈｂＣ対立遺伝子およびｐｈｂＡＢ対立遺伝子を、引き続きＬＳ５２１８に形質導入し、ＭＢＸ８２０を得た。サザンブロットおよびノーザンブロットは、ｐｈｂＣ遺伝子およびｐｈｂＡＢ遺伝子が首尾よく形質導入され、そしてこれらの株中で同様に発現されたことを示す。表７は、２％グルコースを有するＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地、または２％グルコースおよび０．５％トウモロコシ浸漬液を含む最小Ｅ２培地中で増殖させた、これらのトランスジェニックＥ．ｃｏｌｉ ＰＨＢプロデューサーのＰＨＢ蓄積レベルを示す。
【００７０】
【表７】

（実施例１１：トランスジェニックＥ．ｃｏｌｉ ＰＨＢプロデューサーの増殖特性）
ｐｈｂ遺伝子のＭＢＸ２４５への導入（ｔ_d＝４７分）は、増殖速度における減少に付随した（ＭＢＸ６８０、ｔ_d＝７１分）。改良したＰＨＢ産生は、ＥＭＳ変異誘発によって達成されたが、増殖速度を改良しなかった（ＭＢＸ７７７、ｔ_d＝７２分）。ＰＨＢ遺伝子の野生型株（ＭＢＸ１８４）へのＰ１形質導入は、ＭＢＸ２４５によって示される速度と同程度の速い増殖速度、および２４時間未満に細胞乾燥重量の５０％までのＰＨＢ蓄積を生じた（ＭＢＸ８２０、ｔ_d＝４５分）。
【００７１】
（実施例１２：他のｐｈａ遺伝子の染色体組み込みのためのプラスミド）
本明細書中に記載されるＺ．ｒａｍｉｇｅｒａ由来のｐｈｂＣ、ｐｈｂＡおよびｐＡｂＢの組み込みはまた、他のｐｈａ遺伝子（例えば、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ由来のＰＨＢポリメラーゼをコードする遺伝子（Ｃ１）、Ｐ．ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ由来のＰＨＡポリメラーゼをコードする遺伝子（Ｃ３）、Ａ．ｃａｖｉａｅ由来のＰＨＢポリメラーゼをコードする遺伝子（Ｃ１２）、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ由来のＡＣＰ：：ＣｏＡトランスアシラーゼをコードする遺伝子（Ｇ３）、Ａ．ｃａｖｉａｅ由来の（Ｒ）特異的エノイル（ｅｎｏｕｙｌ）−ＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子（Ｊ１２）、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ由来の広範囲基質特異的３−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼをコードする遺伝子（Ａ１−ＩＩ）、またはＲ．ｅｕｔｒｏｐｈａ由来のファジン（ｐｈａｓｉｎ）をコードする遺伝子（Ｐ１−ＩおよびＰ１−ＩＩ））に適用可能である。これらの遺伝子を、以下のプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応増幅によって得た：
【００７２】
【化１】

ＰＣＲ反応物は、１０ｐｍｏｌの各プライマー、１〜５μｌの染色体ＤＮＡまたは煮沸した細胞、およびＧｉｂｃｏ ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）からの４５μｌ ＰＣＲ混合物を含んだ。増幅は、９４℃で６０秒のインキュベーション、４５℃と６８℃との間の温度で６０秒のインキュベーションならびに７２℃で１〜３分のインキュベーションの３０サイクルによった。ＰＣＲ産物を精製し、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗフラグメントで平滑末端化し、そして図１Ａ〜１Ｃおよび２Ａ〜２Ｂに示されるスキームに従ってｐＭＳＸｃａｔ、ｐＭＳＸｋａｎ、ｐＭＮＸｃａｔまたはｐＭＮＸｋａｎのＳｍａＩ部位にクローン化した。ｐＭＵＸｐｈａは、ｐＵＴＨｇまたはｐＵＴｋａｎ由来であった；そして、ｐＭＬＸｐｈａは、ｐＬＯＦＨｇ由来であった（ここで、ｐｈａは選り抜きのｐｈａ遺伝子を表す）。これらのプラスミドを、所望のｐｈａ遺伝子をＥ．ｃｏｌｉまたはＰＨＡ産生に適切な任意の他のグラム陰性微生物株の染色体へ組み込むために使用した。
【００７３】
（実施例１３：ＰＨＢＶコポリマーを産生するトランスジェニックＥ．ｃｏｌｉ株）
上記に記載されるような、染色体に組み込まれたｐｈｂ遺伝子を有するＥ．ｃｏｌｉ株をまた使用して、ＰＨＢＶコポリマーを産生した。ＰＨＢＶは、一般に、プロピオン酸がグルコースまたは他の糖質と同時補給される（ｃｏ−ｆｅｄ）発酵系において合成される。取り込み後、プロピオネートは、プロピオニル−ＣｏＡに変換され、これは、アシル−ＣｏＡチオラーゼおよび３−ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼの作用により、３−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡ（３ＨＶ−ＣｏＡ）に変換される。３ＨＶ−ＣｏＡは、続いてＰＨＡポリメラーゼによって重合される。
【００７４】
ＰＨＢＶを蓄積する能力は、ＨＶモノマーを特異的に合成する酵素のレベルを増大させることによって増大し得る。このような酵素は、プロピオン酸の取り込み、プロピオン酸のプロピオニル−ＣｏＡへの活性化、または任意のＰＨＢ生合成酵素に関与し得る。さらに、代替の酵素は、他の供給源から単離され得るか、またはプロピオニル−ＣｏＡは、代替の経路から（例えば、メチルマロニル−ＣｏＡ経路から）得られ得る。この経路において、スクシニル−ＣｏＡは、メチルマロニル−ＣｏＡに変換され、これは次いで、脱カルボン酸化されてプロピオニル−ＣｏＡを生じる。
【００７５】
（実施例１４：ＰＨＢ−４ＨＢコポリマーを産生するトランスジェニックＥ．ｃｏｌｉ株）
４ＨＢモノマーを含むホモポリマーおよびコポリマーを、トランスジェニックＥ．ｃｏｌｉ株によって産生し得る。４ＨＢ−ＣｏＡ由来の４ＨＢの組み込みを、ＰＨＡ産生生物に対する４−ヒドロキシブチレートの補給によって達成し得る。４ＨＢを、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼ（例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｋｌｕｙｖｅｒｉ由来のｈｂｃＴ（ＯｒｆＺ））によるか、または内因性Ｅ．ｃｏｌｉ酵素もしくはこの能力を有する任意の他の酵素によるかのいずれかで、４ＨＢ−ＣｏＡに活性化する。Ｐ４ＨＢホモポリマーは、トランスジェニックＥ．ｃｏｌｉ株がｐｈｂＣ遺伝子のみを含む場合に産生される。４ＨＢを含むコポリマーは、トランスジェニックＥ．ｃｏｌｉ株が完全なＰＨＢ生合成経路をコードする遺伝子を含む場合に合成され得る。
【００７６】
Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＢＸ８２１（ＬＳ５２１８：：Ｃ₅−ｃａｔ³⁷⁹、ａｔｏＣ^C）を、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地中で増殖させ、そして５ｇ／Ｌ ４ＨＢおよび２ｇ／Ｌ グルコースを含有する１００ｍｌの１０％ ＬＢ中に再懸濁した。この培養物を２４時間インキュベーションした後、ＰＨＡを特徴付けし、そして４ＨＢモノマーのみを含むと同定した。同様に、ｈｂｃＴ（例えば、ｐＦＳ１６）を含むプラスミドを有するＥ．ｃｏｌｉ ＭＢＸ７７７を、ＬＢ／４ＨＢ（５ｇ／Ｌ）中で増殖させ、そして得られたポリマーを、３５．５％の４ＨＢモノマーを含有するＰＨＢ４ＨＢと同定した。
【００７７】
（実施例１５：染色体外ＤＮＡを含有しない組換えＥ，ｃｏｌｉ中での４−ポリヒドロキシブチレートからのポリ（４−ヒドロキシブチレート）の産生）
ポリ（４−ヒドロキシブチレート）を、プラスミドから４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼ（ｈｂｃＴ）遺伝子およびＰＨＡシンターゼ（ｐｈａＣ）遺伝子を発現するＥ．ｃｏｌｉによって、４−ヒドロキシブチレートから合成し得る。これらの遺伝子がＥ．ｃｏｌｉ染色体へ組み込まれ、そして高レベルで発現される場合、組換えＥ．ｃｏｌｉは、ポリ（４−ヒドロキシブチレート）を４−ヒドロキシブチレートから合成し得るべきである。ｈｂｃＴ遺伝子およびｐｈｂＣ遺伝子を、以下のようにｐＵＴＨｇ（Ｈｅｒｒｅｒｏら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：６５５７〜６７，１９９０）に挿入した。ｐＭＳＸＣ₅ｃａｔおよびｐＦＳ１６を両方、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで消化した。このようにして得られたｐＭＳＸＣ₅ｃａｔの大きなフラグメントおよびｈｂｃＴ遺伝子を含むｐＦＳ１６のフラグメントを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて共に連結して、ｐＭＳＸＣ₅ｈｂｃＴ−ｃａｔを形成した。ｐｈａＣ遺伝子、ｈｂｃＴ遺伝子およびｃａｔ遺伝子を含むフラグメントを、ＡｖｒＩＩでの消化によってｐＭＳＸＣ₅ｈｂｃＴ−ｃａｔから取り出し、そしてそれを、ＡｒｖＩＩで消化され、そして自己連結を防止するために仔ウシ腸アルカリホスファターゼで処理されたｐＵＴＨｇへＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて挿入した。このようにして得られたプラスミドを、ｐＭＵＸＣ₅ｈｂｃＴ−ｃａｔと命名した。このプラスミドｐＭＵＸＣ₅ｈｂｃＴ−ｃａｔを、ＭＢＸ１２９中に複製し、そしてＭＢＸ１１７７へ結合体化した。株ＭＢＸ１１７７は、それが最小の４−ヒドロキシブチレート寒天プレート上で増殖する能力について選択されたＥ．ｃｏｌｉ株ＤＨ５αの偶発変異体である。ＭＢＸ１１７７はまた、ナリジクス酸に対して天然に耐性である。レシピエント細胞を、２５μｇ／ｍＬ クロラムフェニコールおよび３０μｇ／ｍＬ ナリジクス酸を補充したＬＢ−寒天上でプレート化することによってドナー細胞から分離した。このプレートからの生存物を、１リットルあたり、以下を含む最少培地上で再び画線した：１５ｇ 寒天；２．５ｇ／Ｌ ＬＢ粉末（Ｄｉｆｃｏ；Ｄｅｔｒｏｉｔ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ）；５ｇ グルコース；１０ｇ ４−ヒドロキシブチレート；１ｍｍｏｌ ＭｇＳＯ₄；１０ｍｇ チアミン；０．２３ｇ プロリン；２５．５ｍｍｏｌ Ｎａ₂ＨＰＯ₄；３３．３ｍｍｏｌ Ｋ₂ＨＰＯ₄；２７．２ｍｍｏｌ ＫＨ₂ＰＯ₄；２．７８ｍｇ ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ；１．９８ｍｇ ＭｎＣｌ₂・４Ｈ₂Ｏ；２．８１ｍｇ ＣｏＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ；０．１７ｍｇ ＣｕＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ；１．６７ｍｇ ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ；０．２９ｍｇ ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ；および０．５ｍｇ クロラムフェニコール。特に白く不透明であるようであるこのプレートからのコロニーを、寒天を含有しないことを除いては上記と同じ培地を含む振盪フラスコ中で評価した。個々のコロニーを、まず、３ｍＬのＬＢ培地中で８時間増殖させ、そして０．５ｍＬの各培養物を使用して、上記の５０ｍＬの培地に接種した。これらのフラスコを、３０℃で９６時間インキュベートした。１つの単離物は、ＧＣ分析（このために、細胞を１０分間、２０００×ｇでの遠心分離によって培地から取り出し、そして水で一回洗浄し、次いで再び遠心分離し、凍結乾燥した）によって、４．９重量％のポリ（４−ヒドロキシブチレート）を含むことが見出された。この株を、ＭＢＸ１４６２と示し、そしてさらなる操作について選択した。ＭＢＸ１４６２を、ＭＢＸ１４６２の液体培養物を０．１ｍｇ／ｍＬ ＭＮＮＧに９０分間曝露することによって、化学変異原である変異原１−メチル−３−ニトロ−１−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）で処理した。９９．８％の細胞が、この処理によって殺傷されたことが見出された。上記のプレーティングおよび振盪フラスコ実験を繰り返し、そして１つの単離物が、ＧＣ分析によって、１１重量％のポリ（４−ヒドロキシブチレート）を含むことが見出された。この株を、ＭＢＸ１４７６と示し、そしてさらなる操作について選択した。ＮＴＧ処理を繰り返し、そして９６．３％の細胞が殺傷された。上記のプレーティングおよび振盪フラスコ実験を再度繰り返し、そして１つの単離物が、ＧＣ分析によって、１９重量％のポリ（４−ヒドロキシブチレート）を含むことが見出された。この株を、ＭＢＸ１５０９と示した。
【００７８】
（実施例１５：ＰＨＢＨコポリマーを産生するトランスジェニックＥ．ｃｏｌｉ株）
Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＢＸ２４０は、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ由来の、ＰＨＢポリメラーゼをコードするｐｈｂＣ遺伝子の染色体的に組み込まれたコピーを含む、ＸＬ１−ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）誘導体である。アセチル−ＣｏＡ（グルコースのような糖質から生成される）または脂肪酸の酸化中間体を、重合のための（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡモノマーへ変換する酵素が存在しないので、この株は、グルコースまたは脂肪酸のような炭素源からＰＨＡを形成しない。ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで消化したＡ．ｃａｖｉａｅ由来のｐｈａＪ遺伝子をｐＵＣ１８Ｓｆｉの対応部位へ挿入することによって、ｐＭＳＸＪ１２を構築した。ｐｈａＪ遺伝子を、９５℃で４５秒、５５℃で４５秒および７２℃で２．５分の３０サイクルを含むＰＣＲプログラムを使用して、プライマーＡｃ３−５’：５’ＡＧＡＡＴＴＣＡＧＧＡＧＧＡＣＧＣＣＧＣＡＴＧＡＧＣＧＣＡＣＡＡＴＣＣＣＴＧＧおよびＡｃ３−３’：５’ＴＴＣＣＴＧＣＡＧＣＴＣＡＡＧＧＣＡＧＣＴＴＧＡＣＣＡＣＧを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって得た。Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ由来のｐｈａＪ遺伝子によってコードされる（Ｒ）−特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼを含むプラスミドｐＭＴＸＪ１２を有するＥ．ｃｏｌｉ ＭＢＸ２４０の形質転換体を、１０ｍＭ オクタノエートおよび１ｍＭ オレエートを有するＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地上で増殖させた。４８時間の増殖後、細胞を遠心分離によって５０ｍｌの培養物から収集し、そして細胞ペレットを凍結乾燥した。凍結乾燥した細胞をクロロホルム（８ｍｌ）で１６時間抽出し、そしてＰＨＡを、１０倍過剰のエタノールにクロロホルム層を添加することによって、クロロホルム溶液から特異的に沈殿させた。沈殿物を４℃で生じさせ、そして固体ポリマーを風乾し、そして酸性ブタノリシス（ｂｕｔａｎｏｌｙｓｉｓ）によって組成について分析した。ブチル化ＰＨＡモノマーを、ガスクロマトグラフィーによって分離し、そしてこのＰＨＡを、２．６％ ３−ヒドロキシヘキサノエートモノマーを有するポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサノエート）コポリマーと同定した。
【００７９】
（実施例１６：ＰＨＡ産生のための新たなおよび／または改良した遺伝子のスクリーニングのためのトランスジェニックＥ．ｃｏｌｉ株の構築）
ｐｈｂＣ遺伝子を、バクテリオファージＰ１形質導入によってＥ．ｃｏｌｉクローニング株へ導入した。ｐｈｂＣ₅組み込みに従う手順と同様の手順において、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ由来のｐｈｂＣ遺伝子を、ＭＢＸ２３の染色体へ組み込み、ＭＢＸ１４３を得た。クロラムフェニコール増幅後、ＭＢＸ１５０（これは、５００μｇ／ｍｌ クロラムフェニコールに耐性である）を、単離した。ＭＢＸ１５０上で増殖したバクテリオファージＰ１溶解物を使用して、ｐｈｂＣ−ｃａｔ対立遺伝子をＸＬ１−Ｂｌｕｅ［ｐＴ７−ＲｅｃＡ］へ形質導入した。プラスミドｐＴ７ＲｅｃＡは、首尾よいＰ１形質導入に必要な機能的ＲｅｃＡタンパク質を発現する。得られた株ＭＢＸ２４０は、染色体から発現される機能的ＰＨＢポリメラーゼを含むＸＬ１−Ｂｌｕｅ誘導体である。ＭＢＸ６１３およびＭＢＸ６８３を、同じ手順を使用して開発した。これらの株は、それぞれ、ＭＢＸ２４５およびＸＬ１−Ｂｌｕｅ由来であり、組み込まれたＡＢ₅ｃａｔ（ＭＢＸ６１３）またはｐ₁₃ＡＢ₅ｋａｎ（ＭＢＸ６８３）オペロンを含む。
【００８０】
（実施例１７：新たな、改良された、または補助的なＰＨＡ生合成酵素をコードする遺伝子の同定）
ＭＢＸ２４０、６１３および６８３は、新たなまたは改良されたＰＨＡ遺伝子についてのスクリーニング手順において使用され得る３つの株である。これらの株を使用して、以下の遺伝子を同定した：Ｐ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌａ由来のｐｈｂＣＡＢＦＡ２およびＡ．ｌａｔｕｓ由来のｐｈｂＣＡＢ。さらに、Ａ．ｃａｖｉａｅ由来のｐｈａＪ遺伝子をＭＢＸ２４０中で機能的に発現して、脂肪酸からＰＨＡを生成した。Ｃ₃〜Ｃ₅モノマーに特異的なＰＨＡ生合成遺伝子に加えて、中鎖側鎖３−ヒドロキシ酸からなるＰＨＡについてのＰＨＡ生合成酵素はまた、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現され得る。このような株は、さらなるＰＨＡ生合成酵素を同定することにおいて有用である。
【００８１】
（実施例１８：Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ中へのｐｈａ遺伝子の組み込み）
先の実施例に記載されるプラスミドを使用して、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ中へｐｈａ遺伝子を組み込んだ。Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａのＰＨＡ陰性変異体（例えば、＃２（ＰｅｏｐｌｅｓおよびＳｉｎｓｋｅｙ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１５２９８〜３０３（１９８９））またはＰＨＢ−４（Ｓｃｈｕｂｅｒｔら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：５８３７〜４７（１９８８）））を使用して、ＰＨＡ形成を、Ｚ．ｒａｍｉｇｅｒａ由来のｐｈｂＡＢまたはＡ．ｃａｖｉａｅ由来のｐｈａＪと組み合わせたＡ．ｃａｖｉａｅ由来のｐｈａＣの組み込みによって元に戻す。得られた株は、可変的なレベルのＰＨＡを産生し、このＰＨＡは、４００，０００〜１０，０００，０００Ｄａの範囲の分子量を有し、そして３−ヒドロキシヘキサノエートおよび３−ヒドロキシオクタノエートのようなモノマーを含む組成物を有する。
【００８２】
（実施例１９：Ｐ．ｐｕｔｉｄａ中でのｐｈａ遺伝子の組み込み）
先の実施例に記載されるプラスミドを使用して、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ中へｐｈａ遺伝子を組み込んだ。Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＧＰｐ１０４のＰＨＡ陰性表現型（Ｈｕｉｓｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２１９１〜９８（１９９１））を、ｐｈａＣ３がＰ．ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ由来のＰＨＡポリメラーゼをコードするｐｈａＣ３ｋａｎカセットの組み込みによって、元に戻す。ｐＭＵＸＣ３ｋａｎを使用するｐｈａＣ３ｋａｎの組み込みをまた、ｐｈａＣ以外のＰＨＡ代謝に影響を及ぼす酵素をコードする遺伝子における変異を有するＰ．ｐｕｔｉｄａの変異体を生成するために適用した。Ａ．ｃａｖｉａｅ由来のＰＨＡポリメラーゼ遺伝子をまた、染色体へ導入して、Ｃ₃〜Ｃ₉範囲の３−ヒドロキシ脂肪酸を含むＰＨＡを産生する株を生じた。
【００８３】
（実施例２０：得られるＰＨＡの分子量を制御するためのｐｈａＣ遺伝子の染色体組み込み）
基質が過剰に利用可能である場合、ＰＨＡポリメラーゼの濃度が、産生されるＰＨＡの分子量を決定することは、周知である。ポリマーの特性は分子量に依存するので、分子量のバリエーションは望ましい。ｐｈｂ遺伝子の染色体組み込みは、染色体組み込み部位によって決定されるような、ｐｈａ遺伝子の可変的な発現レベルを生じる。従って、可変的なレベルのｐｈａＣ発現を有する異なるトランスジェニック細菌を得ることが可能であり、それゆえに、可変的な分子量のＰＨＡを産生することが可能である。この系を用いて、４００，０００Ｄａより多い、そして頻繁にはなお１，０００，０００Ｄａを超える分子量を有するＰＨＡを産生することが可能である。この手順は、ｐＵＴまたはｐＬＯＦに由来するプラスミドが導入され得る任意のグラム陰性細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｌａｔｕｓ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓおよび一般には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ属の種）に対して適用可能である。
【００８４】
（実施例２１：単一オペロンとしてのＰＨＢ遺伝子の組み込み）
プラスミドｐＭＳＸＡＢＣ₅ｋａｎを、Ｚｏｏｇｌｏｅａ ｒａｍｉｇｅｒａ由来のチオラーゼ（ｐｈｂＡ）、レダクターゼ（ｐｈｂＢ）およびＰＨＢシンターゼ（ｐｈｂＣ）の遺伝子、ならびにカナマイシン耐性遺伝子（ｋａｎ）をベクターｐＵＣ１８Ｓｆｉ中にオペロンとして連結するように構築した。次いで、この発現カセットを、ＡｖｒＩＩフラグメントとして切り出し、そしてｐＵＴのＡｖｒＩＩ部位へ挿入してｐＭＵＸＡＢＣ₅ｋａｎを得た。
【００８５】
ｐＭＵＸＡＢＣ₅ｋａｎを有するＳ１７−１ λｐｉｒ株を、ＭＢＸ２４７と交配した。ｐｈｂＡＢＣ₅ｋａｎが染色体へ組み込まれたトランスジェニック株を、ＬＢ／Ｎｌ／Ｋｍプレート上で選択した。組み込み体のうちで、ＰＨＢプロデューサーを、ＬＢ／グルコースプレート上で同定した。このようにして構築した１つの株ＭＢＸ１１６４を、さらなる研究のために選択した。
【００８６】
チオラーゼ（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら、１９７８，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１１６：２１〜２４）およびレダクターゼ（Ｓａｉｔｏら、１９７７，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１１４：２１１〜２１７）アッセイを、ＭＢＸ１１６４粗抽出物上で実施した。この培養物を、２０ｇ／Ｌ グルコースを補充した５０ｍＬの０．５×Ｅ２培地中で増殖させた。１単位（Ｕ）を、１分あたり１μｍｏｌの基質を産物に変換させる酵素の量として定義した。３−ケトチオラーゼ活性は、２回の独立試行において、２．２３±０．３８および２．４８±０．５０Ｕ／ｍｇであると決定され、そして３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ活性は、２回の独立試行において、４．１０±１．５１および３．８７±０．１５Ｕ／ｍｇであると決定された。
【００８７】
株ＭＢＸ１１６４を、角型振盪ボトル（ｓｑｕａｒｅ ｓｈａｋｅ ｂｏｔｔｌｅ）中でのそのＰＨＢ産生能力について評価した。細胞を、２ｍＬのＬＢ中で増殖させ、そしてこの０．１ｍＬを、５０ｍＬの振盪ボトル培養のための接種材料として使用した。振盪ボトルは、０．２５％ コーンスティープリカー（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）および２０ｇ／ｌ グルコースを補充したＥ２培地を含んだ。２００ｒｐｍで振盪しながら３０℃で４８時間のインキュベーション後、生物体量の濃度は、２．６ｇ／Ｌに達し、そしてＰＨＢ濃度は、１１．７ｇ／Ｌに達した；従って、細胞は８２重量％のＰＨＢを含んだ。
【００８８】
（実施例２２：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ ＰＨＡシンターゼのＥ．ｃｏｌｉ染色体への組み込み）
Ｐ．ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ染色体由来のＰＨＡシンターゼ（ｐｈａＣ）カセット、およびプロモーターを有さないクロラムフェニコール耐性遺伝子を、ｐＵＣ１１８へ挿入し、その結果、２つの遺伝子のオペロンを形成した；すなわち、これらは、同じ方向に配向し、そして同じｍＲＮＡ上に転写され得る。Ｐ．ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ ｐｈａＣ遺伝子の配列を、以下に示す。ｐｈａＣ−ｃａｔオペロンを、ＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩでの消化によってこのプラスミドから切り出し、そして同じ２つの酵素で消化したｐＵＣ１８ＳｆｉＩに連結して、ｐＭＳＸＣ₃ｃａｔを形成した。これは、ｐｈａＣ−ｃａｔオペロンがＡｖｒＩＩ部位に隣接することを可能にした。ｐｈａＣ−ｃａｔオペロンを、ＡｖｒＩＩおよびＦｓｐＩでの消化によってｐＭＳＸＣ₃ｃａｔから取り出した。ｐＭＳＸＣ₃ｃａｔの２つのＡｖｒＩＩフラグメントはほぼ同じサイズであるので、ＦｓｐＩを使用して、このベクターの残りを二片へ切断することによってｐｈａＣ−ｃａｔオペロンの単離を容易にした。ＡｖｒＩＩフラグメントを、ＡｖｒＩＩで消化したｐＵＴｋａｎに連結し、そしてアルカリホスファターゼで処理して自己連結を防止した。このようにして産生したプラスミドを、ｐＭＵＸＣ₃ｃａｔと示した。このプラスミド上のオペロンは、実際、ｐｈａＣ−ｃａｔ−ｋａｎからなっていた。株ＣＣ１１８λｐｉｒ（λｐｉｒ溶菌性菌株）を、ｐＭＵＸＣ₃ｃａｔで形質転換して、株ＭＢＸ１３０を産生した。等量の株ＭＢＸ１３０およびＭＢＸ２４５を、ＬＢ寒天プレート上で混合し、そして３７℃で８時間インキュベートした。次いで、混合した細胞を、３７℃で一晩のＬＢ−クロラムフェニコール（２５μｇ／ｍＬ）−ナリジクス酸（３０μｇ／ｍＬ）培養のための接種物として使用した。単一コロニーを、ＬＢ−クロラムフェニコール（２５μｇ／ｍＬ）−ナリジクス酸（３０μｇ／ｍＬ）−カナマイシン（２５μｇ／ｍＬ）上でのプレーティングによって、この培養物から単離した。このカセットを他の株の染色体へ導入するためにＰ１形質導入を使用する能力、ならびにクロラムフェニコールおよびカナマイシンの両方に対する耐性について選択する能力によって示されるように、このようにして単離したコロニーは、染色体上に、形質導入可能なｐｈａＣ−ｃａｔ−ｋａｎカセットを有する。
【００８９】
【表８】

【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】 図１Ａ〜１Ｃは、ｐＭＮＸＴｐ₁ｋａｎ、ｐＭＮＸＴｐ₁ｃａｔ、ｐＭＳＸＴｐ₁ｋａｎ、およびｐＭＳＸＴｐ₁ｃａｔの構築を示す図である。
【図１Ｂ】 図１Ａ〜１Ｃは、ｐＭＮＸＴｐ₁ｋａｎ、ｐＭＮＸＴｐ₁ｃａｔ、ｐＭＳＸＴｐ₁ｋａｎ、およびｐＭＳＸＴｐ₁ｃａｔの構築を示す図である。
【図１Ｃ】 図１Ａ〜１Ｃは、ｐＭＮＸＴｐ₁ｋａｎ、ｐＭＮＸＴｐ₁ｃａｔ、ｐＭＳＸＴｐ₁ｋａｎ、およびｐＭＳＸＴｐ₁ｃａｔの構築を示す図である。
【図２Ａ】 図２Ａ〜２Ｂは、ｐＭＵＸＣ₅ｃａｔの構築を示す図である。
【図２Ｂ】 図２Ａ〜２Ｂは、ｐＭＵＸＣ₅ｃａｔの構築を示す図である。
【図３Ａ】 図３Ａ〜３Ｃは、ｐＭＵＸＡＢ₅ｃａｔ、ｐＭＵＸＴｐ₁ＡＢ₅ｋａｎ、ｐＭＵＸＴｐ₁₁ＡＢ₅ｋａｎ、ｐＭＵＸＴｐ₁₂ＡＢ₅ｋａｎ、およびｐＭＵＸＴｐ₁₃ＡＢ₅ｋａｎの構築を示す図である。
【図３Ｂ】 図３Ａ〜３Ｃは、ｐＭＵＸＡＢ₅ｃａｔ、ｐＭＵＸＴｐ₁ＡＢ₅ｋａｎ、ｐＭＵＸＴｐ₁₁ＡＢ₅ｋａｎ、ｐＭＵＸＴｐ₁₂ＡＢ₅ｋａｎ、およびｐＭＵＸＴｐ₁₃ＡＢ₅ｋａｎの構築を示す図である。
【図３Ｃ】 図３Ａ〜３Ｃは、ｐＭＵＸＡＢ₅ｃａｔ、ｐＭＵＸＴｐ₁ＡＢ₅ｋａｎ、ｐＭＵＸＴｐ₁₁ＡＢ₅ｋａｎ、ｐＭＵＸＴｐ₁₂ＡＢ₅ｋａｎ、およびｐＭＵＸＴｐ₁₃ＡＢ₅ｋａｎの構築を示す図である。

Claims (18)

1. ポリヒドロキシアルカノエートを産生する遺伝子操作された微生物であって、チオラーゼ、レダクターゼ、ＰＨＢシンターゼ、ＰＨＡシンターゼ、アシル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、およびエノイル−ＣｏＡヒドラターゼからなるポリヒドロキシアルカノエートの合成に関与する酵素をコードする外因性細菌遺伝子が染色体に組み込まれ、その酵素を安定して発現することによってポリヒドロキシアルカノエートの産生が増強された微生物。
2. 大腸菌、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｏｒ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、およびＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）からなる群より選択される、請求項１に記載の微生物。
3. 前記外因性細菌遺伝子が、トランスポゾン送達を使用して挿入される、請求項１に記載の微生物。
4. ポリヒドロキシアルカノエートを産生する遺伝子操作された微生物であって、チオラーゼ、レダクターゼ、ＰＨＢシンターゼ、ＰＨＡシンターゼ、アシル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、およびエノイル−ＣｏＡヒドラターゼからなるポリヒドロキシアルカノエートの合成に関与する酵素をコードする外因性細菌遺伝子が染色体に組み込まれ、その酵素を安定して発現することによってポリヒドロキシアルカノエートの産生が増強された微生物であって、ここで該遺伝子が、オペロンとして作動可能に連結されて組み込まれる、微生物。
5. 前記組み込まれた細菌遺伝子が、プロモーターの制御下で作動可能に連結されている、請求項１に記載の微生物。
6. 前記組み込まれた細菌遺伝子が、上流の活性化配列と作動可能に連結されている、請求項１に記載の微生物。
7. 前記組み込まれた細菌遺伝子が、ｍＲＮＡ安定化配列と作動可能に連結されている、請求項１に記載の微生物。
8. プロモーターが、培地中のリン酸濃度によって調節されるコンセンサスＥ．ｃｏｌｉ ｐｈｏボックスおよび−３５プロモーター領域を含むプロモーターである、請求項５に記載の微生物。
9. 前記プロモーターが、栄養制限、ｐＨまたは熱ショック、および毒性化学物質の投与のような一般的なストレス条件下で発現を誘導するプロモーターからなる群より選択される、請求項５に記載の微生物。
10. 前記組み込まれた細菌遺伝子が、選択マーカーと作動可能に連結されている、請求項１に記載の微生物。
11. 前記組み込まれた細菌遺伝子が、Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ、Ｚｏｏｇｌｏｅａ ｒａｍｉｇｅｒａ、Ｎｏｃａｒｄｉａ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ Ｓｐ．６１−３、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖａｒａｎｓ、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｅｕｕｍ、およびＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｌａｔｕｓからなる群より選択される微生物から単離されるか、または該微生物に由来する、請求項１に記載の微生物。
12. 前記組み込まれた細菌遺伝子が、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ由来のＰＨＢポリメラーゼ（Ｃ１）、Ｐ．ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ由来のＰＨＡポリメラーゼ（Ｃ３）、Ａ．ｃａｖｉａｅ由来のＰＨＢポリメラーゼ（Ｃ１２）、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ由来のＡＣＰ：：ＣｏＡトランスアシラーゼ（Ｇ３）、Ａ．ｃａｂｉａｅ由来の（Ｒ）特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ（Ｊ１２）、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ由来の広範な基質特異的３−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ（Ａ１−ＩＩ）、およびＲ．ｅｕｔｒｏｐｈａ由来のファシン（Ｐ１−ＩおよびＰ１−ＩＩ）からなる群より選択される酵素をコードする、請求項１に記載の微生物。
13. 前記細菌遺伝子が、前記微生物の染色体上に単一コピーとして組み込まれる、請求項１に記載の微生物。
14. 産生を増強するポリヒドロキシアルカノエートの合成に関与する細菌遺伝子についてスクリーニングするための方法であって、以下： チオラーゼ、レダクターゼ、ＰＨＢシンターゼ、ＰＨＡシンターゼ、アシル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、およびエノイル−ＣｏＡヒドラターゼからなる群より選択されるポリヒドロキシアルカノエートの合成に関与する酵素をコードする少なくとも１つの細菌遺伝子を有する遺伝子操作された微生物を変異させる工程であって、該遺伝子は染色体に組み込まれ微生物がＰＨＡを産生するように酵素を安定に発現するものである工程；ならびに組み込まれていない遺伝子からの酵素を発現する微生物でのＰＨＡの産生とＰＨＡの重量％における増大を測定することにより比較したポリヒドロキシアルカノエートの産生の増強についてスクリーニングする工程、を包含する、方法。
15. 前記組み込まれた細菌遺伝子が、Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ、Ｚｏｏｇｌｏｅａ ｒａｍｉｇｅｒａ、Ｎｏｃａｒｄｉａ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ Ｓｐ．６１−３、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖａｒａｎｓ、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ、およびＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｌａｔｕｓからなる群より選択される微生物から単離されるか、または該微生物に由来する、請求項１４に記載の方法。
16. チオラーゼ、レダクターゼ、ＰＨＢシンターゼ、ＰＨＡシンターゼ、アシル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、およびエノイル−ＣｏＡヒドラターゼからなる群より選択されるポリヒドロキシアルカノエートの合成に関与する酵素をコードする少なくとも１つの細菌遺伝子が染色体に組み込まれたＰＨＡを産生することができる遺伝的に操作された微生物を、該微生物がＰＨＡを産生する条件下で適切な基質とともに培養することを含むＰＨＡの産生方法。
17. ＰＨＡの合成に関与する細菌遺伝子が微生物に複数組み込まれ、該組み込まれた遺伝子はオペロンとして作動可能に連結されている請求項１６に記載の方法。
18. 微生物が、プロモーターの制御下において作動可能に連結され組み込まれた遺伝子、組み込まれ上流の活性配列に作動可能に連結された遺伝子、組み込まれｍＲＮＡ安定化配列に作動可能に連結された遺伝子、培地中のリン酸濃度によって調節されるコンセンサスＥ．ｃｏｌｉ ｐｈｏボックスおよび−３５プロモーター領域を含むプロモーターと作動可能に連結された遺伝子、及び組み込まれ選択マーカーに作動可能に連結された遺伝子からなる群から選択される細菌遺伝子を含む請求項１６に記載の方法。

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