ES2302386T3 - Produccion de polihidroxialcanoatos a partir de polioles. - Google Patents
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Abstract
Una proteína de quimioquina CX3C aislada de aproximadamente 11000 a 12500 Daltons cuando está en forma no glicosilada y que contiene un motivo estructural CXXXC, en la que dicha proteína de quimioquina CX3C se une específicamente con un anticuerpo generado contra un inmunógeno seleccionado del grupo que consiste en (a) el polipéptido de SEQ ID NO:2 que comienza en Gln25; (b) el polipéptido maduro de SEQ ID NO:4; y (c) el polipéptido maduro de SEQ ID NO:8; y dicha quimioquina CX3C carece de los motivos estructurales de cisteína y secuencia característicos de una quimioquina C, CC, o CXC.
Description
Producción de polihidroxialcanoatos a partir de
polioles.
Esta invención se encuadra de forma general en
el campo de la producción de polihidroxialcanoatos mediante
ingeniería genética de enzimas bacterianas.
Numerosos microorganismos tienen la habilidad de
acumular reservas intracelulares de los polímeros
poli[(R)-3-hidroxialcanoato] (PHA).
Los PHAs son materiales termoplásticos biodegradables y
biocompatibles con un intervalo amplio de aplicaciones industriales
y biomédicas (Williams y Peoples, 1996, CHEMTECH 26:
38-44). Los PHAs pueden producirse usando varios
procesos de fermentación diferentes y ser recuperados usando una
gama de técnicas de extracción (revisadas por Braunegg et
al. 1998, J. Biotechnol. 65: 127-161; Choi y
Lee, 1999). También están diseñándose genéticamente cultivos de
plantas para producir estos polímeros que ofrecen una estructura de
costos en línea con los aceites vegetales y competitividad del
precio directo con polímeros basados en el petróleo (Williams y
Peoples, 1996, CHEMTECH 26:38-44; Poirier, Y. 1999,
Plant Biotechnology, págs. 181-185). Los PHAs se
forman por la acción de una enzima PHA sintasa. Cuando las cadenas
del polímero crecen, forman gránulos insolubles. Los PHAs pueden
entonces recuperarse y luego convertirse en productos químicos o
pueden convertirse en productos químicos durante el proceso de
recuperación (Martin et al. PCT WO 97/15681). Por
consiguiente, además de su utilidad como polímeros, los PHAs
representan un mecanismo único para la provisión de nuevos productos
químicos en ambos sistemas, tanto el microbiano como el de cultivo
de plantas.
Los copolímeros del PHA que contienen
3-hidroxivalerato (3HV), especialmente PHBV, han
sido extensamente descritos. Muchos microorganismos naturales son
capaces de producir PHAs que contienen 3HV. El PHBV se ha producido
comercialmente usando Ralstonia eutropha (anteriormente,
Alcaligenes eutrophus) a partir de la glucosa y el propionato
y de la glucosa e isobutirato. (Patente de EE.UU. 4.477.654 de
Holmes et al.). Varios otros microorganismos y procesos son
conocidos para aquellos expertos en la técnica (Braunegg et
al. 1998, Journal of Biotechnology 65:
127-161). El homopolímero poli (3HV) se ha producido
usando Chromobacterium violaceum a partir del
valerato (Steinbüchel et al., 1993, Appl. Microbiol.
Biotechnol. 39:443-449). También se han sintetizado
PHAs que contienen unidades 3HV usando microorganismos
recombinantes. Escherichia coli que alberga los genes de la
biosíntesis de los PHAs de R. eutropha se ha usado para
producir PHBV a partir de la glucosa y del propionato o valerato
(Slater et al., 1992, Appl. Environ. Microbiol.
58:1089-1094) y a partir de la glucosa y de valina
o treonina (Eschenlauer et al., 1996, Int. J. Biol. Macromol.
19:121-130). Klebsiella oxytoca que alberga
los genes de la biosíntesis de los PHA de R. eutropha se ha
usado para producir PHBV a partir de glucosa y propionato (Zhang
et al., 1994, Appl. Environ. Microbiol.
60:1198-1205). R Eutropha que alberga el gen
de la PHA sintasa de Aeromonas caviae se usó para producir
poli(3HV-co-3HB-co-3HHp)
a partir de los ácidos alcanoicos de números de carbono impares
(Fukui et al., 1997, Biotechnol. Lett.
19:1093-1097).
También se han descrito copolímeros de PHA que
contienen unidades 3-hidroxipropionato. Holmes et
al. (Patente de EE.UU. 4.477.654) usaron R. eutropha
para sintetizar
poli(3HP-co-3HB-co-3HV)
a partir de glucosa y 3-cloropropionato o acrilato.
Doi et al. (1990, en E.A. Dawes (ed.), Novel Biodegradable
Microbial Polymers, Kluwer Academic Publishers, the Netherlands,
pp. 37-48) usaron R. eutropha para sintetizar
poli(3HP-co-3HB) a partir de
3-hidroxipropionato,
1,5-pentanodiol, 1,7-heptanodiol, o
1,9-nonanodiol. Hiramitsu y Doi (1993, Polymer
34:4782-4786) usaron Alcaligenes latus para
sintetizar poli(3HP-co-3HB) a
partir de sacarosa y 3-hidroxipropionato. Shimamura
et al. (1994, Macromolecules 27: 4429-4435)
usaron el A. latus para sintetizar
poli(3HP-co-3HB) a partir de
3-hidroxipropionato y
3-hidroxibutirato o sacarosa. El mayor nivel de
3-hidroxipropionato incorporado dentro de estos
copolímeros fue 88 mol % (Shimamura et al., 1994, ibídem).
Ningún recombinante de 3HP que contenga productores de PHA ha sido
descrito en la técnica.
Es deseable poder producir de forma económica
estos polímeros en especies transgénicas de cultivo. Los métodos
para la producción de plantas se han descrito en las Patentes de
EE.UU. No. 5.245.023 y No. 5.250.430; las Patentes de EE.UU. No.
5.502.273; No. 5.534.432; No. 5.602.321; No. 5.610.041; No.
5.650.555; No. 5.663.063; los documentos WO 9100917, WO 9219747, WO
9302187, WO 9302194, y WO 9412014, Poirier et al., 1992,
Science 256, 520-523; Williams y Peoples, 1996,
Chemtech 26, 38-44. Para lograr este objetivo es
necesario transferir un gen, o genes en el caso de una PHA
polimerasa con más de una subunidad, que codifican una PHA
polimerasa a partir de un microorganismo en las células de la
planta y obtener el nivel apropiado de producción de la enzima PHA
polimerasa. Además puede ser necesario proporcionar genes
adicionales de la biosíntesis del PHA, por ejemplo una
cetoacil-CoA tiolasa, un gen de
acatoicetil-CoA reductasa, un gen de
4-hidroxibutiril-CoA transferasa u
otros genes que codifican las enzimas requeridas para sintetizar los
sustratos para las enzimas PHA polimerasa. En muchos casos, se
desea controlar la expresión en diferentes tejidos u organelas de la
planta. Los métodos para controlar la expresión en los tejidos de
la planta u organelas se conocen por los expertos en la técnica
(Gasser y Fraley, 1989, Science 244:1293-1299; Gene
Transfer to Plants, 1995, Potrykus, I. y Spangenberg G., eds
Springer - Verlag Berlín Heidelberg Nueva York. y "Transgenic
Plants: A Production System for Indutrial and Pharmaceutical
Proteins", 1996, Owen, M.R.L. y Pen, J. Eds. John Wiley &
Sons Ltd. Inglaterra).
Aunque los métodos para la producción de una
variedad de copolímeros diferentes en los sistemas de fermentación
bacterianos son conocidos, y se ha logrado la producción de PHAs en
plantas, el intervalo de copolímeros posibles en las bacterias no
se ha logrado en las plantas. Sería ventajoso ser capaz de producir
copolímeros diferentes en plantas transgénicas, y tener más
opciones con respecto a los sustratos a ser utilizados por las
plantas transgénicas.
Por consiguiente, es un objeto de la presente
invención proporcionar métodos y reactivos para la producción de
PHAs en las plantas.
Es un objeto adicional de la presente invención
proporcionar métodos y reactivos para la producción de PHAs usando
azúcares y alcoholes simples como sustratos.
Es aún otro objeto de la presente invención
proporcionar métodos y reactivos para la producción de copolímeros
de forma diferente al PHB y al PHVB.
La presente invención proporciona un método de
producir polihidroxialcanoato que comprende:
(a) proporcionar organismos no humanos diseñados
por ingeniería genética que recombinantemente expresen enzimas
seleccionadas entre diol deshidratasa y aldehído deshidrogenasa
vecinas;
(b) proporcionar dioles que puedan convertirse
en los monómeros de 3-hidroxipropionato o
3-hidroxivalerato mediante las enzimas expresadas
por los organismos; y
(c) cultivar los organismos bajo unas
condiciones por las que el 3-hidroacipropionato o el
3-hidroxivalerato se conviertan en monómeros que
polimericen para formar polihidroxialcanoatos.
Los organismos pueden ser bacterias o plantas.
Los organismos pueden diseñarse genéticamente con plásmidos que
codifican para uno o ambas de la diol deshidratasa y aldehído
deshidrogenasa vecinas, o se diseñan genéticamente para incorporar
los genes que codifican para una o ambas, la diol deshidratasa y
aldehído deshidrogenasa vecinas dentro del cromosoma. La diol
deshidratasa vecina puede ser diol deshidratasa, y adicionalmente,
el organismo puede expresar recombinantemente al menos una enzima
seleccionada a partir de la aldosa reductasa de cristalinos de
rata, glicerol deshidrogenasa de la E. coli y metilglioxal
sintasa.
La diol deshidratasa vecina puede ser glicerol
deshidratasa y el organismo puede expresar también enzimas
seleccionadas entre
glicerol-3-fosfatasa y
glicerol-3-fosfato deshidrogenasa
y/o dihidroxiacetona fosfato deshidrogenasa y
glicerol-3-fosfatasa. La enzima
dihidroxiacetona fosfato deshidrogenasa puede ser DAR1. La enzima
glicerol-3-fosfatasa puede ser GPP2.
Los genes recombinantes que codifican para las enzimas
dihidroxiacetona fosfato deshidrogenasa y
glicerol-3-fosfatasa pueden ser
ambos integradas cromosomáticamente.
También el organismo puede expresar la enzima
1,3-propanodiol oxidorreductasa.
El organismo también puede expresar
recombinantemente al menos una enzima seleccionada entre
acil-CoA transferasa, acil-CoA
sintetasa, \beta-cetotiolasa,
acetoacil-CoA reductasa, y PHA sintasa.
El método de la invención puede usar dioles
seleccionados entre 1,2-propanodiol,
1,3-propanodiol y glicerol.
Pueden convertirse los dioles usados a monómeros
seleccionados entre monómeros de 3-hidroxipropionato
o 3-hidroxivalerato.
Además, el método puede comprender la adición de
la coenzima B-12, o su precursor, para el cultivo,
por ejemplo, a una concentración hasta 1 \muM, o hasta 20 nM.
La presente invención proporciona también un
organismo no humano diseñado por ingeniería genética como se
definió anteriormente.
Se proporcionan los organismos de la invención,
los cuales expresan enzimas como glicerol deshidratasa, diol
deshidratasa, acil-CoA transferasa,
acil-CoA sintetasa
\beta-cetotiolasa, acetoacetil-CoA
reductasa, PHA sintasa,
glicerol-3-fosfato deshidrogenasa y
glicerol-3-fosfatasa, las cuales son
útiles para la producción de PHAs. En algunos casos uno o más de
estos genes son nativos para el organismo huésped y el resto se
proporciona a partir de los transgenes. Estos organismos producen
homopolímeros poli (3-hidroxialcanoato) o
copolímeros que incorporan monómeros de
3-hidroxipropionato o
3-hidroxivalerato, en donde las unidades del
3-hidroxipropionato y
3-hidroxivalerato se derivan de la conversión de los
dioles catalizada por la enzima. Dioles convenientes que pueden
usarse incluyen 1,2-propanodiol, 1,3 propanodiol y
glicerol. También se describen las trayectorias bioquímicas para
obtener el glicerol a partir de los metabolitos celulares normales.
Los polímeros de PHA se recuperan rápidamente y son industrialmente
útiles como polímeros o como materiales de inicio para una gama de
químicos intermedios incluyendo 1,3-propanodiol,
3-hidroxipropionaldehído, acrílicos, ácido malónico,
ésteres y aminas.
La Figura 1 es un esquema de flujo de la
producción de 3-hidroxivaleril-CoA a
partir de glicerol-3-P.
La Figura 2 es una representación esquemática de
la estructura del plásmido pFS44C que codifica para glicerol
deshidratasa (dhaB) y
4-bidroxibutiril-CoA transferasa
(hbcT).
La Figura 3 es una representación esquemática de
la estructura del plásmido pFS45 que codifica para dhaB, hbcT y
phaC.
La Figura 4 es una representación esquemática de
la estructura del plásmido pFS47A, que codifica para dhaT, dhaB, y
hbcT.
La Figura 5 es una representación esquemática de
la estructura del plásmido pFS48B, que codifica para dhaT, dhaB,
hbcT, y phaC.
La Figura 6 es una representación esquemática de
la estructura del plásmido pMS15, que codifica para dhaT,
DAR1-GPP2 (DAR1, dihidroxiacetona fosfato
deshidrogenasa; y GPP2,
sn-glicerol-3-fosfato
fosfatasa), dhaB, hbcT, y phaC.
La Figura 7 es una representación esquemática de
la estructura del plásmido pFS51, que codifica para GPP2 y
DAR1.
Se han desarrollado nuevas trayectorias
metabólicas para la producción de PHAs que contienen unidades
3-hidroxivalerato a partir de
1,2-propanodiol, y de PHAs que contienen unidades
3-hidroxipropionato a partir de 1,3 propanodiol o
glicerol. En el caso del glicerol, éste puede alimentarse al
microorganismo, o puede producirse a partir de los intermedios
metabólicos centrales. En la Figura 1 se ilustran los componentes
claves de las enzimas de estas nuevas trayectorias metabólicas que
conducen a estos monómeros y a su polimerización.
El 1,2-propanodiol y el glicerol
son sustratos baratos que no son tóxicos a muchos microorganismos
aún a altas concentraciones. Puede producirse
1,3-propanodiol de recursos renovables (Anton, D.
"United Engineering Foundation Metabolic Engineering II
conference", presentado en la II Conferencia de Ingeniería
Metabólica de la Fundación de Ingeniería Unida, Elmau, Alemania,
Oct. 27, 1998). El 1,2-propanodiol está presente en
las corrientes de desechos industriales de la producción de
propileno glicol. El glicerol puede también obtenerse del
metabolismo en varios microbios y cultivos de planta. En muchos
casos, éstos son reservas superiores de alimentos para la
fermentación en comparación con los ácidos orgánicos, que
generalmente se vuelven tóxicos a bajas concentraciones para muchos
microorganismos. El ácido 3-Hidroxipropiónico no es
químicamente estable y por consiguiente no está disponible
comercialmente.
En una realización, se introducen genes en la
producción del organismo para la trayectoria completa ilustrada en
la Figura 1. Puede usarse un organismo que no produce PHAs de forma
natural, como Escherichia coli. Varios sistemas de
producción de PHB de la E. coli recombinante se han
descrito (Madison y Huisman, 1999, Microbiology and Molecular
Biology Reviews, 63: 21-53). Los genes que codifican
para una diol deshidratasa vecina, a partir de un organismo que, de
forma natural, puede convertir el glicerol a
3-hidroxipropionaldehido (Klebsiella
pneumoniae, por ejemplo), se introducen en este huésped. En el
caso de 1,2-propanodiol, la diol deshidratasa
vecina convierte el sustrato a propionaldehido, el cual puede
convertirse en propionil-CoA mediante el
metabolismo endógeno del microorganismo, opcionalmente con la ayuda
de una acil-CoA transferasa o
acil-CoA sintetasa exógenas. Puede ser útil mutar y
seleccionar las cepas con mayor resistencia al propionaldehido.
Entonces el propionil-CoA puede aceptarse en
sustitución de la cetoacil-CoA tiolasa en una
condensación con acetil-CoA, formando así
3-hidroxivaleril-CoA. La
cetoacil-CoA tiolasa también condensará
acetil-CoA con acetil-CoA, formando
así 3-hidroxibutiril-CoA. Ambos
3-hidroxivaleril-CoA y
3-hidroxibutiril-CoA pueden
aceptarse mediante varias PHA sintasas como las expresadas en el
huésped recombinante, y por tanto se sintetiza PHBV por el huésped
recombinante.
El huésped descrito anteriormente también puede
alimentarse de 1,3 propanodiol o glicerol durante el crecimiento o
después de una fase de crecimiento separada, y un polímero 3HP se
acumula dentro de las células. La E. coli no sintetiza
ninguna coenzima B-12 de novo, y por
consiguiente la coenzima B-12 o un precursor E.
coli que puede también convertirse a coenzima
B-12, como la vitamina B-12, también
debe ser alimentada. En el caso del glicerol, la diol deshidratasa
vecina convierte el sustrato a
3-hidroxipropionaldehido, el cual puede convertirse
a 3-hidroxipropionil-CoA mediante el
metabolismo endógeno del microorganismo, opcionalmente con la ayuda
de una acil-CoA transferasa exógena o
acil-CoA sintetasa.
3-Hidroxipropionil-CoA puede
entonces ser polimerizado a P3HP mediante PHA sintasa. En adición
al 3HP, también luego pueden incorporarse unidades del monómero
hidroxiacil-CoA dentro del polímero. Si se expresan
cetoacil-CoA tiolasa y reductasa, por ejemplo,
entonces puede formarse un copolímero de
3-hidroxibutirato y
3-hidroxipropionato.
Para producir los polímeros 3HP directamente a
partir de las reservas de alimentos de carbohidratos, la E.
coli se diseña para expresar además
glicerol-3-fosfato deshidrogenasa y
glicerol-3-fosfatasa. Tales cepas
de E. coli recombinante y los métodos para su construcción
son conocidos en la técnica (Anton, D. "Biological production of
1,3-propanediol", presentado en la II Conferencia
de Ingeniería Metabólica de la Fundación de Ingeniería Unida,
Elmau, Alemania, Oct. 27, 1998; PCT WO 98/21339).
En otra realización, puede usarse un organismo
recombinante que de forma natural contiene una diol deshidratasa
vecina. Un ejemplo de tal organismo es Klebsiella oxytoca,
aunque existen varios otros, como se indicó anteriormente. En esta
realización ninguna diol deshidratasa vecina exógena necesita ser
importada a partir de otro organismo. Sin embargo puede ser útil
mutar este organismo y escoger los mutantes que expresan la
deshidratasa durante el crecimiento aeróbico o puede ser diseñado
por ingeniería genética para expresar el gen en condiciones
aeróbicas. El caso general es que los organismos que contienen una o
más coenzimas B-12-dependientes de
las diol deshidratasas vecinas pueden sintetizar la coenzima
B-12 de novo, y en esos casos no es
necesario agregar a cualquier parte del cultivo la coenzima
B-12 o precursores de ella estrechamente
relacionados. En este caso, una PHA sintasa o una trayectoria
biosintética completa de PHB y opcionalmente una
acil-CoA transferasa o acil-CoA
sintetasa exógenas se introducen en este organismo. Las técnicas
para hacer esto son bien conocidas en la técnica (por ejemplo,
Dennis et al., 1998, Journal of Biotechnology 64:
177-186). Para producir los polímeros 3HP
directamente a partir de las reservas de alimentos con
carbohidratos, se diseña además la cepa para expresar la
glicerol-3-fosfato deshidrogenasa y
glicerol-3-fosfatasa como se
describió anteriormente.
En otra realización, puede usarse un organismo
que produce de forma natural PHAs. Ejemplos de tales organismos
incluyen Ralstonia eutropha, Alcaligenes latus y
Azotobacter, pero muchos otros son muy conocidos por los
expertos en la técnica (Braunegg et al. 1998, Journal of
Biotechnology 65:127-161). La introducción de la
diol deshidratasa se lleva a cabo usando técnicas estandarizadas
como se describió por Peoples y Sinskey (1989, J. Biol. Chem. 164,
15298-15303). En estos casos puede ser útil mutar el
organismo y seleccionarlo para aumentar la resistencia a
3-hidroxipropionaldehido. Los organismos que
producen PHA varían en su habilidad para sintetizar la coenzima
B-12 de novo, y por consiguiente, se
agregaría la coenzima B-12 o un precursor que el
organismo pueda convertir a coenzima B-12, cuando
sea apropiado. El PHBV se produce entonces alimentando 1,2
propanodiol y por lo menos alguna otra reserva de alimento. El PHBP
se produce alimentando 1,3 propanodiol o glicerol y alguna otra
reserva de alimento, por ejemplo, glucosa. Para producir los
polímeros de 3HP directamente de las reservas de alimentos con
carbohidratos, la cepa se diseña además para expresar
glicerol-3-fosfato deshidrogenasa y
glicerol-3-fosfatasa como se
describió anteriormente. Puede ser útil utilizar mutaciones que son
beneficiosas para la producción de homopolímeros del P3HP en estos
organismos. Las mutaciones específicas incluyen volver inactivos
los genes de \beta-cetotiolasa y/o
acetoacetil-CoA reductasa. Como estos genes
generalmente se conocen bien y están disponibles o aislables, las
rupturas del gen pueden llevarse a cabo sin esfuerzo como se
describió por ejemplo por Slater et al., 1998 (J.
Bacteriol.).
La aplicación de la producción de
poli(3-hidroxipropionato) y sus copolímeros
tampoco se limita a las bacterias como se describió en los
ejemplos. Los mismos genes pueden introducirse en células
eucarióticas, incluyendo pero no restringido a levadura y plantas,
las cuales, como bacterias, también producen intermedios
glicolíticos como fosfato de dihidroxiacetona, a partir del cual
pueden derivarse el glicerol y finalmente el
poli(3-hidroxipropionato).
Los genes y técnicas para el desarrollo de
productores recombinantes de PHA apropiados para el uso como se
describió aquí, son generalmente conocidos por los expertos en la
técnica (Madison y Huisman, 1999, Microbiology and Molecular
Biology Reviews, 63: 21-53); PCT WO 99/14313).
Debido a que se han clonado todos los genes necesarios para llevar
a cabo la producción de
poli(3-hidroxipropionato) a partir de los
intermedios metabólicos centrales por la vía del glicerol, y están
disponibles en forma genéticamente manipulables, puede usarse
cualquier combinación de plásmido-resistivo y genes
integrados, y la aplicación de esta trayectoria no está, por
consiguiente, restringida a los esquemas esbozados aquí. Muchas
implementaciones diferentes estarán claras para los expertos en la
técnica.
La glicerol deshidratasa (EC 4.2.1.30) y la diol
deshidratasa (EC 4.2.1.28) son diferentes a la coenzima
B-12, requiriendo enzimas encontradas en varias
especies de bacterias. A menudo la glicerol deshidratasa se induce
durante el crecimiento anaerobio en glicerol, y la diol deshidratasa
se induce durante el crecimiento anaerobio en glicerol o
1,2-propanodiol (Forage y Foster, 1979, Biochim.
Biophys. Acta 569:249-258). Estas deshidratasas
catalizan la formación de 3-hidroxipropionaldehido a
partir del glicerol y del propionaldehido a partir de
1,2-propanodiol. Estos aldehídos normalmente se
convierten a los alcoholes correspondientes mediante un
deshidrogenasa. Típicamente, los organismos que contienen una o
ambas deshidratasas son capaces de convertir glicerol a
3-hidroxipropionaldehido o
1,3-propanodiol. Especies bacterianas conocidas por
esta habilidad incluyen Klebsiella pneumoniae (Streekstra
et al., 1987, Arch. Microbiol. 147: 268-275),
Klebsiella oxytoca (Homann et al., 1990, Appl.
Microbiol. Biotechnol. 33: 121-126), Klebsiella
planticola (Homann et al., 1990, ibídem) y Citrobacter
freundii (Boenigk et al., 1993, Appl. Microbiol.
Biotechnol. 38: 453-457), aunque en general se
conocen muchos otros ejemplos. Ambas deshidratasas están formadas
por tres subunidades, cada una de las cuales es homóloga a su
complemento en la otra
enzima.
enzima.
El intervalo de sustratos de la glicerol y diol
deshidratasas (a los cuales también nos referiremos genéricamente
en lo adelante como "diol deshidratasas vecinas") no se limita
al glicerol y 1,2-propanodiol. Bachovchin et
al. (1977, Biochemistry, 16:1082-1092), por
ejemplo, demostró que los sustratos aceptados por la enzima del
K. pneumoniae incluyen el glicerol,
(R)-1,2-propanodiol,
(S)-1,2-propanodiol, etilenglicol,
tioglicerol,
3-cloro-1,2-propanodiol,
1,2-butanodiol, 2,3-butanodiol,
glicol del isobutileno, y
3,3,3-trifluoro-1,2-propanodiol.
En todos los casos, el producto de la reacción es el aldehído o la
cetona formados por la eliminación efectiva de una molécula de agua
a partir del sustrato.
Organismos que naturalmente producen glicerol a
partir de azúcares a través del fosfoglicerato incluyen el
Bacilo licheniformis (Neish et al., 1945, Can. J. Res.
23B: 290-296), Lactobacillus sp. (Nelson y
Werkman, 1935, J. Bacteriol. 30: 547-557),
Halobacterium cutirubrum (Wassef et al., 1970, Can. J.
Biochem. 48: 63-67), Microcoleus
chthonoplastes (Moezelaar et al., 1996, Appl. Environ.
Microbiol. 62: 1752-1758), Zymomonas mobilis
(Viikari, 1988, CRC Crit. Rev. Biotechnol. 7:
237-261), Phycomyces blakesleeanus (Van
Schaftigen y Van Laere, 1985, Eur. J. Biochem. 148:
399-405), Saccharomyces cerevisiae (Tsuboi y
Hudson, 1956, Arch. Biochem. Biophys. 61: 197-210),
Saccharomyces carlsbergensis (Tonino y
Steyn-Parvé, 1963, Biochim. Biophys. Acta 67:
453-469), Rhizopus javanicus (Lu et
al., 1995, Appl. Biochem. Biotechnol. 51/52:
83-95), Candida magnoliae (Sahoo, D.K., 1991,
Tesis de Doctorado, Instituto Indio de Tecnología, Delhi),
Candida utilis (Gancedo et al., 1968, Eur. J. Biochem.
5: 165-172), Aspergillus niger (Legisa y
Mattey, 1986, Enzime, Microb. Technol. 8: 607-609),
Trichomonas vaginalis (Steinbüchel y Müller, 1986, Molec.
Biochem. Parasitol. 20: 45-55), Dunaliella
salina (Sussman y Avron, 1981, Biochim. Biophys. Acta 661:
199-204; Ben-Amotz et al.,
1982, Experientia 38: 49-52), Asteromonas
gracilis (Ben-Amotz et al., íbídem),
Leishmania mexicana (Cazzulo et al., 1988, FEMS
Microbiol. Lett. 51: 187-192), y Crithidia
fasciculata (Cazzulo et al., ibídem). En muchos de
estos organismos, se conoce que el glicerol se deriva de la
dihidroxiacetona fosfato, un intermedio de la trayectoria del
glicolítico. La Escherichia coli normalmente no sintetiza
ningún glicerol en cantidades significativas cuando ha desarrollado
en la mayoría de los azúcares (Baldomà y Aguilar, J., Bacteriol.
170:416, 1988). Sin embargo, se han descrito las cepas de E.
coli transgénica que pueden formar glicerol a partir de
azúcares comunes como la glucosa, por ejemplo, en el documento PCT
WO 97/20292.
Se han descrito sistemas diseñados por
ingeniería genética para la producción de glicerol a partir de
azúcares (documento WO 98/21339), de
1,3-propanodiol a partir de glicerol (documentos WO
96/35796, WO 98/21339) y de 1,3-propanodiol a
partir de azúcares. La E. coli que expresa los genes del DAR1
(dihidroxiacetona fosfato deshidrogenasa) y del GPP2
(sn-glicerol-3-fosfato
fosfatasa) de Saccharomyces cerevisiae se mostraron para
acumular altas concentraciones de glicerol en el medio cuando se
desarrollaron en glucosa (Anton, D. "Biological production of
1,3-propanediol", presentado en la II Conferencia
de Ingeniería Metabólica de la Fundación de Ingeniería Unida,
Elmau, Alemania, Oct. 27, 1998).
En cualquiera de las realizaciones mencionadas,
es posible controlar la composición del polímero producido
controlando la expresión de la diol deshidratasa vecina o
controlando la disponibilidad de coenzima B-12. A
mayor actividad de la deshidratasa, más monómeros activados se
derivarán como resultado de su actividad, hasta el punto donde se
vuelve limitante otro factor como la disponibilidad del sustrato o
la actividad de una enzima descendente de la deshidratasa. Los
métodos para la modulación de la expresión del gen (y por tanto la
actividad de la enzima) en varios organismos, son muy conocidos por
los expertos en la técnica. Un método adicional para el control de
la actividad de la diol deshidratasa vecina es la modulación de la
disponibilidad de coenzima B-12 al microorganismo.
Por ejemplo, muchas cepas de Escherichia Coli son incapaces
de sintetizar la coenzima B-12 de
novo, y por consiguiente la diol deshidratasa recombinante
vecina, que depende de la coenzima B-12 para la
actividad, no es activa en estas cepas a menos que se añada al medio
la coenzima B-12 o un precursor conveniente como la
vitamina B-12. En las cepas de Escherichia
coli que albergan genes de la síntesis del PHA y una diol
deshidratasa vecinas, se ha encontrado que sin la adición de la
coenzima B-12, sólo se sintetiza PHB incluso aún
cuando 1,2-propanodiol está presente en el medio. La
adición de 1 \muM de la coenzima B-12 a un
cultivo de la misma cepa en el mismo medio conduce a la formación de
PHBV como se discutió en los ejemplos. Skraly et al. (1998,
Appl. Environ. Microbiol. 64:98-105) encontraron que
el transgénico de Escherichia coli sintetizaba niveles
crecientes de 1,3-propanodiol a partir del glicerol
cuando se suministraban en el medio concentraciones crecientes de la
coenzima B-12, hasta una concentración de
aproximadamente 20 nM, después de la cual no aumentó la cantidad
producida de 1,3-propanodiol. Por consiguiente,
pueden usarse concentraciones de la coenzima B-12
desde 0 a 20 nM para controlar la composición de PHBV en la
Escherichia Coli que alberga genes de la síntesis del PHA y
un gen de la diol deshidratasa vecina cultivada en un medio que
contiene 1,2-propanodiol. La misma premisa básica es
válida para derivar el
poli(3-hidroxipropionato) del glicerol. Las
células son capaces de hacer un PHA (como PHB) en presencia del
comonómero cuando ninguna diol deshidratasa vecina está presente.
El uso de la coenzima B-12 para controlar la
composición del polímero puede lograrse con cualquier
microorganismo que sea incapaz de sintetizar la coenzima
B-12 de novo. Tales organismos
incluyen aquéllos que naturalmente carecen de esta habilidad (como
Escherichia Coli) y aquéllos que naturalmente poseen esta
habilidad (como Klebsiella pneumoniae), pero han sido mutados
para perder esta habilidad mediante el uso de mutagénesis química
por métodos genéticos como la mutagénesis del trasposón.
En el caso de algunos microorganismos, parte de
los genes pueden ser integrados en el cromosoma del huésped y otros
ser proporcionados en un plásmido. En algunos casos, pueden usarse
los sistemas compatibles del plásmido, por ejemplo, con varios
pasos en la trayectoria codificados en un plásmido y los otros pasos
codificados por un segundo plásmido. También puede usarse una
combinación de las dos aproximaciones.
Como se discutió anteriormente, los sustratos
que pueden usarse para hacer PHAs incluyen glicerol y glucosa.
Pueden usarse con éxito varios otros sustratos, además de glicerol o
glucosa. Ejemplos de otros sustratos incluyen almidón, sacarosa,
lactosa, fructosa, xilosa, galactosa, aceite de maíz, aceite de
soya, sebo, aceite de madera, ácidos grasos o combinaciones de
ellos.
La presente invención se entenderá además por
referencia a los siguientes ejemplos no limitantes.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
La cepa de Escherichia Coli MBX769
(Huisman et al. PCT WO 99/14313) que expresa los genes de la
síntesis de PHA a partir de Zoogloea ramigera
(acetoacetil-CoA tiolasa,
acetoacetil-CoA reductasa, y PHA sintasa)
conteniendo el plásmido pFS44C fue usada para sintetizar PHBV a
partir de glucosa y 1,2-propanodiol. El plásmido
pFS44C (mostrado esquemáticamente en la Figura 2) contiene los genes
que codifican para la deshidratasa glicerol de Klebsiella
pneumoniae (dhaB), aislado a partir de pTC53 (Skraly
et al., 1998, Appl. Environ. Microbiol.
64:98-105), y
4-hidroxibutiril-CoA transferasa del
Clostridium kluyveri (hbcT), aislado a partir de pCK3
(Söhling y Gottschalk, 1996, J. Bacteriol.
178:871-880), ambos en un operón bajo el
control del promotor trc. El pFS44C también contiene el gen
del represor lac (lacI), un gen de resistencia del
ampicilina (ampR), y un origen de repetición (ORI), todos
derivados del vector pSE380 (Invitrogen; La Jolla, Calif.).
Las células fueron precultivadas en 100 ml de un
medio conteniendo 25 g/l de polvo de caldo LB (Difco; Detroit,
Mich.) y 100 mg/l de ampicilina. Fueron separadas de este medio por
centrifugación (2000 x g, 10 minutos) y resuspendidas en 100 ml de
un medio conteniendo, por litro: 5 g del polvo del caldo LB; 50 mmol
de fosfato de potasio, pH 7; 10 g de
1,2-propanodiol; 2 g de glucosa; 1 \mumol de
coenzima B-12; 100 \mug de ampicilina; y 0,1 mmol
de
isopropil-\beta-D-tiogalactopiranosida
(IPTG). Las células se incubaron en este medio con agitación a 225
rpm a 30ºC durante 48 horas. Fueron separadas luego por
centrifugación como antes, lavadas una vez con agua, y
liofilizadas.
El mismo experimento se hizo en paralelo,
excepto que no se agregó ninguna coenzima B-12.
Aproximadamente 25 mg de masa celular liofilizada de cada frasco se
sometió a extracción simultánea y butanólisis a 110ºC durante 3
horas en 2 ml de una mezcla conteniendo (en volumen) 90% de
1-butanol y 10% de ácido clorhídrico concentrado,
con 2 mg/ml de ácido benzoico adicionado como un estándar interno.
Los componentes solubles en agua de la mezcla resultante fueron
separados por extracción con 3 ml de agua. La fase orgánica (1
\mul a una proporción de división de 1:50 a una proporción de
flujo global de 2 ml/min) se analizó en una columna de CG capilar
de sílice fundida SPB-1 (30 m; 0,32 mm DI; 0,25
\mum de película; Supelco; Bellefonte, Pa.) con el siguiente
perfil de temperatura: 80ºC, 2 min; 10ºC por min a 250ºC; 250ºC, 2
min. El estándar usado para probar la presencia de unidades de
3-hidroxibutirato y
3-hidroxivalerato en el polímero fue el PHBV
(Aldrich Chemical Co.; Milwaukee, Wis.). El polímero en el
experimento con la coenzima B-12 adicionada se
calculó para 60,9% del peso celular seco, y el 97,4% estaba
compuesto de unidades 3-hidroxibutirato y 2,6% de
unidades 3-hidroxivalerato.
El sobrenadante al final de este experimento se
encontró por análisis de Cromatografía Líquida de Alta Resolución
(HPLC) al contener 0,41 g/l de propanol, indicando que la glicerol
deshidratasa era funcional. El polímero en el experimento sin la
coenzima B-12 adicionada se calculó para 56,7% del
peso celular seco, y era el homopolímero de PHB. El sobrenadante al
final de este experimento no contenía propanol. El análisis de HPLC
se hizo con una columna Aminex HPX-87H con ácido
sulfúrico (pH 2) como la fase móvil a una velocidad de flujo de 0,6
ml/min y una temperatura de la columna de 50ºC. La detección fue
por ambos índices, índice refractivo y absorción ultravioleta.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
El MBX 184 fue seleccionado para el crecimiento
en 1,2-PD, para obtener la cepa de E. coli
MBX 1327. El MBX1327 fue transducido con los genes de PHB ABC5KAN a
partir de MBX1164 para producir la cepa de E. coli MBX 1329.
MBX1164 es MBX247::ABCSKAN. MBX247 es LJ5218 (Jenkins y Nunn, J.
Bact. 1984 E. coli del centro de acción genética CGSC 6966)
mutado con
1-metilo-3-nitro-1-nitrosoguanidina
(NTG) por un procedimiento estándar (Miller, J., A short course in
bacterial genetics, 1992, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Spring Harbor, NY), y seleccionado por la habilidad de crecer con
1,2-propanodiol como única fuente de carbono. Se
han descrito previamente las cepas de E. coli con esta
habilidad y los métodos para la generación de tales cepas (Sridhara
et al., 1969, J. Bacteriol. 93:87). La cepa de E. coli
MBX1329 tiene tanto la capacidad para desarrollarse con
1,2-propanodiol como única fuente de carbono, como
la de sintetizar PHB a partir de las fuentes de carbono que genera
el acetil-CoA.
El MBX1329 que alberga el plásmido pFS44C
(mostrado en la Figura 2) fue desarrollado en un medio conteniendo,
por litro: 6,25 g de polvo de caldo LB; 3,5 g de fosfato de amonio
sódico; 7,5 g de trihidrato de fosfato de potasio bibásico; 3,7 g
de fosfato de potasio monobásico; 0,12 g de sulfato de magnesio;
2,78 mg de heptahidrato del sulfato de hierro (II); 1,98 mg de
tetrahidrato de cloruro de manganeso (II); 2,81 mg de heptahidrato
de sulfato de cobalto (II); 1,47 mg de cloruro de calcio
dihidratado; 0,17 mg de dihidrato de cloruro de cobre (II); 0,29 mg
de heptahidrato de cloruro de cinc (II); 10 mg de tiamina; 10 g de
1,2-propanodiol; 50 nmol de coenzima
B-12; 100 \mug de ampicilina; y 0,05 mmol de
isopropil-\beta-D-tiogalactopiranosida
(IPTG). El volumen total fue 50 ml en un frasco Erlenmeyer de 250
ml; el inóculo fue 0,5 ml de un cultivo toda la noche en 25 g/l del
polvo de caldo LB y 100 \mug/ml de ampicilina. Las células se
incubaron en este medio durante 3 días a 37ºC con agitación a 200
rpm. Fueron separadas del medio por centrifugación (2000 x g, 10
minutos), lavadas una vez con agua, centrifugadas de nuevo, y
liofilizadas.
El contenido intracelular del polímero se
analizó por butanólisis como en el Ejemplo 1. Las células se
desarrollaron a una densidad óptica (a 600 nM) de 9,8 y contenían
PHBV hasta 6% del peso celular seco. El propio polímero estaba
compuesto de 2,5% unidades del 3-hidroxivalerato y
97,5% unidades del 3-hidroxibutirato.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
La cepa de Escherichia coli
MBX184, que es deficiente en el gen del fadR y expresa
el gen del atoC constitutivamente, se usó para sintetizar
1,3-propanodiol a partir de glicerol y
poli(3-hidroxipropionato) a partir de
1,3-propanodiol. En ambos casos las células
albergaron el plásmido pFS45 (mostrado esquemáticamente en la
Figura 3) el cual contiene genes que codifican para glicerol
deshidratasa de Klebsiella pneumoniae,
4-hidroxibutiril-CoA transferasa de
Clostridium kluyveri, y PHA sintasa de Ralstonia
eutropha, todos en un operón bajo el control del promotor
trc. Las células fueron cultivadas como se describió en el
Ejemplo 1, excepto que el glicerol estaba presente en lugar de
1,2-propanodiol.
El análisis de HPLC mostró que las células en el
medio que contenía coenzima B12 sintetizaron 1,3 g/l de
1,3-propanodiol mientras las células en el medio
libre de coenzima B-12 no sintetizaron ningún
1,3-propanodiol. También se cultivó la misma cepa
usando el método del Ejemplo 1, excepto que estaba presente
1,3-propanodiol en lugar de 1,2 - propanodiol, y no
se adicionó ninguna coenzima B-12.
La masa de la célula liofilizada se analizó por
CG como en el Ejemplo 1, con un estándar adicional de
beta-propiolactona para cuantificar el
poli(3-hidroxipropionato). Estas células se
mostraron mediante el análisis de CG al contener el homopolímero
poli(3-hidroxipropionato) en 7,8% del peso
celular seco. La síntesis de
poli(3-hidroxipropionato) a partir de
glicerol probablemente no ocurrió debido a la acumulación de
3-hidroxipropionaldehido, que es muy tóxico para
muchos microorganismos (Dobrogosz et al, 1989,
Wenner-Gren Int. Symp. Ser.
52:283-292). Esta toxicidad puede dirigirse
evitando la acumulación de 3-hidroxipropionaldehido
por lo menos de dos maneras: 1) puede expresarse una
1,3-propanodiol oxidorreductasa como las mencionadas
anteriormente a partir del organismo productor de
1,3-propanodiol, y 2) puede aumentarse la actividad
de la deshidrogenasa endógena no identificada a partir de
Escherichia coli, que es responsable de la formación de
1,3-propanodiol observada cuando la glicerol
deshidratasa está presente, mediante la selección de las células que
expresan la glicerol deshidratasa del Escherichia coli, para
que se desarrollen bien en presencia tanto de glicerol como de la
coenzima B-12. La segunda aproximación puede
lograrse, por ejemplo, transformando la Escherichia Coli
mutada con un plásmido como el pFS45, para que la mutagénesis no
afecte al gen de glicerol deshidratasa, seguido por el
enriquecimiento en un medio que contenga glicerol y coenzima
B-12.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Las dos trayectorias en el Ejemplo 3 (glicerol a
1,3-propanodiol y 1,3-propanodiol a
poli(3-hidroxipropionato) se activaron en el
mismo recombinante de la Escherichia Coli. La cepa de E.
coli MBX820, que expresa de forma estable genes de la
biosíntesis del PHA phaA, phaB, y phaC a partir de Zoogloea
ramigera, se transformó con el plásmido pFS47A (mostrado
esquemáticamente en la Figura 4), que contiene, bajo control del
promotor trc, los genes que codifican para
4-hidroxibutiril-CoA transferasa a
partir de Clostridium kluyveri y glicerol deshidratasa y
1,3-propanodiol oxidorreductasa a partir de
Klebsiella pneumoniae. El pFS47A se fabricó a partir del
plásmido pFS 16, un predecesor del pFS47A, como sigue: El gen del
Clostridium kluyveri orfZ se amplió por PCR a partir del
plásmido pCK3 (Söhling y Gottschalk, 1996, J. Bacteriol. 178:
871-880) usando los siguientes cebadores
oligonucleótidos:
5' -
TCCCCTAGGATTCAGGAGGTTTTTATGGAGTGGGAAGAGATATATAAAG - 3' (orfz
5 ' AvrII)
5' - CCTTAAGTCGACAAATTCTAAAATCTCTTTTTAAATTC - 3'
(orfz 3' SalI)
El producto orfZ se ligó a pTrcN, el cual
se había digerido con XbaI (que es compatible con
AvrII) y SalI.
Las células fueron precultivadas en 100 ml de un
medio que contenía 25 g/l de polvo de caldo LB (Difco; Detroit,
Mich.) y 100 mg/l de ampicilina. Éstas fueron separadas a partir de
este medio por centrifugación (2000 x g, 10 minutos) y
resuspendidas en 100 ml de un medio que contenía, por litro: 2,5 g
del polvo del caldo LB; 50 mmol de fosfato de potasio, pH 7; 5 g de
sustrato (glicerol; 1,2-propanodiol; o
1,3-propanodiol); 2 g de glucosa; 5 nmol de
coenzima B-12; 100 \mug de ampicilina; y 0,1 mmol
de
isopropil-\beta-D-tiogalactopiranosida
(IPTG). Las células se incubaron en este medio con agitación a 225
rpm a 30ºC durante 48 horas. Fueron separadas después por
centrifugación como anteriormente, lavadas una vez con agua, y
liofilizadas.
La masa celular liofilizada se analizó por CG
como en el Ejemplo 1, con un estándar adicional de
beta-propiolactona para cuantificar el
poli(3-hidroxipropionato). Las células
cultivadas en glicerol y 1,3-propanodiol ambas
contenían un copolímero de unidades
3-hidroxibutirato y
3-hidroxipropionato, y las células cultivadas en
1,2-propanodiol contenían un copolímero de unidades
3-hidroxibutirato y
3-hidroxivalerato. En la Tabla 1 se dan las
composiciones y cantidades del polímero como porcentaje de peso de
la célula seca. Las células cultivadas en glicerol sintetizaron más
polímeros que las células cultivadas en
1,3-propanodiol, pero el porcentaje de unidades
3-hidroxipropionato fue menor en las células
cultivadas en glicerol. Estas diferencias pueden explicarse por el
hecho de que el 3-hidroxipropionaldehído es tóxico
y que es probable que se genere más rápidamente por la
1,3-propanodiol oxidorreductasa a partir de
1,3-propanodiol que por la glicerol deshidratasa a
partir de glicerol. La toxicidad del
3-hidroxipropionaldehído puede impactar
negativamente en la salud celular, y por consiguiente el contenido
global del polímero, pero su formación a partir del glicerol es
necesaria para la formación del
3-hidroxipropionil-CoA si el
intermedio necesario es 3-hidroxipropionaldehído o
1,3-propanodiol.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Debido a que las diol deshidratasas vecinas
dependen de la coenzima B-12 para su actividad, y a
que la formación de
3-hidroxipropionil-CoA a partir del
glicerol o del propionil-CoA a partir de
1,2-propanodiol depende de la actividad de la
deshidratasa, la composición del copolímero en cualquier caso puede
controlarse mediante la variación de la disponibilidad de la
coenzima B-12 a la deshidratasa. En este ejemplo,
esto fue cumplido mediante la variación de la concentración de la
coenzima B-12 adicionada al medio en el cual la cepa
de E. coli MBX820, que lleva el plásmido pFS47A, estaba
produciendo PHA.
Las células fueron precultivadas en 100 ml de un
medio conteniendo 25 g/l de polvo del caldo LB (Difco; Detroit,
Mich.) y 100 mg/l de ampicilina. Fueron separadas de este medio por
centrifugación (2000 x g, 10 minutos) y resuspendidas en 100 ml de
un medio que contenía, por litro: 2,5 g del polvo del caldo LB; 50
mmol de fosfato de potasio, pH 7; 10 g de sustrato (glicerol o
1,2-propanodiol); 2 g de glucosa; 100 \mug de
ampicilina; 0,1 mmol de
isopropil-\beta-D-tiogalactopiranosida
(IPTG); y 0, 5, 20, o 50 nmol de coenzima B-12. Las
células se incubaron en este medio con agitación a 225 rpm a 30ºC
durante 72 horas. Fueron separadas después por centrifugación como
anteriormente, lavadas una vez con agua, y liofilizadas. La masa
celular liofilizada se analizó por análisis de CG como en el
Ejemplo 4.
La Tabla 2 muestra las cantidades y
composiciones de los PHAs producidos de esta forma. La ausencia de
coenzima B-12, si el sustrato fue glicerol o
1,2-propanodiol, resultó en la síntesis sólo de
PHB. El glicerol fue más conducente a la formación de PHA en
ausencia de actividad de la deshidratasa, como se muestra por la
densidad óptica final y el contenido de polímero, probablemente
porque la E. coli puede utilizar el glicerol como una fuente
de carbono y energía en condiciones aeróbicas (Lin, Ann. Rev.
Microbiol. 30:535, 1976), mientras que generalmente esto e falso
para el 1,2-propanodiol (Baldomà y Aguilar,
íbídem.). Cuando la coenzima B-12 se agrega en
cantidades crecientes a células cultivadas con glicerol, el
porcentaje de unidades 3-hidroxipropionato en el
polímero aumenta, mientras el contenido total del polímero
disminuye. Esta disminución se debe probablemente a la toxicidad
del 3-hidroxipropionaldehído, lo cual resulta en una
disminución de la salud de las células. Cuando la coenzima
B-12 se agrega en cantidades crecientes a células
cultivadas con 1,2-propanodiol, se incorporan
unidades 3-hidroxivalerato dentro del polímero, pero
el porcentaje de 3-hidroxivalerato en el polímero no
aumenta en la misma magnitud que lo hizo el porcentaje de unidades
3-hidroxipropionato en el experimento del glicerol.
Esto indica que la concentración de coenzima B-12 no
está limitando a la síntesis de
3-hidroxivaleril-CoA cuando su
concentración alcanza incluso unos pocos nanomolares, y que algún
otro factor se vuelve limitante.
Este ejemplo demuestra que la composición de los
PHAs derivada del uso de las deshidratasas dependientes de la
coenzima B-12 puede ser controlada variando la
concentración de coenzima B-12 que hizo disponible a
la deshidratasa. La magnitud a la cual el control puede ejecutarse
depende del sustrato del diol usado. Esto puede deberse a la
preferencia del diol vecino por ciertos sustratos sobre otros y
sobre el resto del metabolismo del huésped que lleva desde el
aldehído derivado del diol al acil-CoA que sirve
como el monómero activado para la formación de PHA.
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\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Los ejemplos 1-5 demuestran que
es posible obtener el
poli(3-hidroxipropionato) a partir del
glicerol, y, como se discutió anteriormente, es posible tanto en
organismos transgénicos como no transgénicos, producir el glicerol
a partir de intermedios metabólicos centrales. Por consiguiente, una
combinación de las dos trayectorias permitirá la síntesis de
poli(3-hidroxipropionato) a partir de los
intermedios metabólicos centrales. Estas trayectorias pueden
combinarse introduciendo los genes de la síntesis del
poli(3-hidroxipropionato) en un huésped
productor de glicerol o introduciendo los genes de la síntesis de
glicerol en un huésped capaz de la síntesis del
poli(3-hidroxipropionato) a partir del
glicerol, como se describió en los ejemplos anteriores.
En el caso anterior, los genes que codifican
para una diol deshidratasa vecina, una PHA sintasa, y opcionalmente
una aldehído deshidrogenasa, 1,3-propanodiol
oxidorreductasa, y una hidroxiacil-CoA transferasa
son expresados en un huésped capaz de producir glicerol a partir de
intermedios metabólicos centrales. Un ejemplo de tal huésped es una
Escherichia Coli que expresa el Saccharomyces
cerevisiae del DAR1 (dihidroxiacetona fosfato deshidrogenasa) y
los genes del GPP2
(sn-glicerol-3-fosfato
fosfatasa) (Anton, D. "Biological production of
1,3-propanediol", presentado en la II Conferencia
de Ingeniería Metabólica de la Fundación de Ingeniería Unida,
Elmau, Alemania, Oct. 27, 1998; PCT WO 98/21339), como se describió
anteriormente. Muchas cepas de E. coli expresan naturalmente
1,3-propanodiol oxidorreductasa y las actividades
enzimáticas de la aldehído deshidrogenasa, pero sus niveles pueden
aumentarse opcionalmente por mutagénesis o determinada sobrecarga
de enzimas que lleven a cabo estas funciones. Los genes adicionales
necesarios pueden introducirse en un plásmido como el pFS48B, el
cual contiene, bajo el control del promotor trc,
4-hidroxibutiril-CoA transferasa a
partir del Clostridium kluyveri; PHA sintasa a partir de
Zoogloea ramigera y glicerol deshidratasa y
1,3-propanodiol oxidorreductasa a partir de
Klebsiella. pneumoniae. Cualquiera de estos genes o todos
pueden introducirse también por integración en el cromosoma, usando
las técnicas normalizadas bien conocidas por los expertos en la
técnica.
De forma similar, los genes de DAR1 y de GPP2
pueden introducirse en un huésped capaz de la síntesis del
poli(3-hidroxipropionato), como
MBX820/pFS47A, descrito anteriormente. Pueden introducirse los genes
de DAR1 y de GPP2 en un plásmido compatible con el pFS47A (un
plásmido que puede ser mantenido simultáneamente con el pFS47A), o
pueden integrarse en el cromosoma. El MBX820 expresa de forma
estable la acetoacetil-CoA tiolasa,
3-hidroxibutiril-CoA reductasa y
PHA sintasa, y por consiguiente es capaz de sintetizar
poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxipropionato).
Si se desea el homopolímero
poli(3-hidroxipropionato), puede usarse una
cepa que exprese sólo PHA sintasa en lugar de los tres genes
biosintéticos del PHB.
Para demostrar la trayectoria para la
biosíntesis de PHP forma glucosa, fue fabricado el plásmido pMS 15
(mostrado esquemáticamente en la Figura 6) para expresar los
siguientes genes como un operón a partir del promotor trc: PHB
sintasa a partir de A. eutrophus,
4-hidroxibutiril-CoA transferasa a
partir de C. kluyveri, la glicerol deshidratasa a partir de
Klebsiella, el gen de DAR1 a partir de S. cerevisae,
el gen de GPP2 a partir de S. cerevisae y la
1,3-propanodiol oxidorreductasa a partir de
K. pneumoniae.
El plásmido pFS51 se formó ligando, uno a uno,
los productos PCR DAR1 y GPP2 al pTrcN. El gen de DAR1 fue ampliado
por PCR a partir del ADN genómico del S. cerevisiae que usa
los siguientes cebadores oligonucleótidos:
5' -
CTTCCGGATCCATTCAGGAGGTTTTTATGTCTGCTGCTGCTGATAGA - 3' (S. cer.
DAR1 5' BamHI)
5' - CTTCCGCGGCCGCCTAATCTTCATGTAGATCTAATTC - 3'
(S. cer. DAR1 3' NotI)
El gen de GPP2 fue ampliado de la misma manera
usando los cebadores oligonucleótidos siguientes:
5' -
CTTCCGCGGCCGCATTCAGGAGGTTTTTATGGGATTGACTACTAAACCTC - 3' (S.
cer. GPP2 5' NotI)
5 ' - CCTTCTCGAGTTACCATTTCAACAGATCGTCC - 3'
(S. cer. GPP2 3' XhoI)
El PCR para cada gen se llevó a cabo con la
polimerasa de ADN Pfu (Stratagene; La Jolla, Calif.) en un
volumen de la reacción de 50 \mul que contenía: 10 unidades de la
polimerasa de Pfu, 1x buffer de reacción suministrado por el
fabricante, 50 pmol de cada cebador, aproximadamente 200 ng del ADN
genómico del S. cerevisiae y 200 \muM de cada dNTP. El
perfil termal de las reacciones fue como sigue: 27 ciclos de (94ºC,
1 min; 55ºC, 2 min; 72ºC, 3 min), después 7 min a 72ºC. La
polimerasa Pfu no se agregó hasta que la mezcla de la reacción
había alcanzado 94ºC.
Los productos PCR fueron purificados a partir de
un gel de agarosa de baja fusión al 1% y digeridos con la
restricción de enzimas cuyos sitios correspondientes habían sido
incluidos en los extremos 5' de los cebadores (BamHI y
NotI para DAR1, NotI y XhoI para GPP2). El
vector pTrcN es una versión de pTrc99a (Pharmacia; Uppsala, Suecia)
modificado de tal forma que le falta un sitio NcoI. El pTrcN
fue cortado con BamHI, NotI, y fosfatasa alcalino
intestinal de ternero (CIAP; Promega; Madison, Wis.) para la
inserción de DAR1 y con NotI, XhoI, y CIAP para la
inserción de GPP2. Las ligaduras se llevaron a cabo con la ligasa
de ADN T4 (New England Biolabs; Beverly, Mass.) según las
instrucciones proporcionadas por el fabricante. Los productos de
las ligaduras fueron pFS49 (DAR1) y pFS50 (GPP2). Para unir ambos
genes en un plásmido, el pFS49 fue cortado con MluI y
NotI, y el fragmento 2,3-kb que contenía el
promotor trc y DAR1 fue ligado a pFS50 que había sido digerido con
las mismas dos enzimas y CIAP. El plásmido resultante, que contenía
el operón DAR1-GPP2 bajo el control del promotor
trc, se identificó como pFS51.
La cepa de E. coli MBX184 que contenía el
plásmido pMS15 (mostrado esquemáticamente en la Figura 6) fue
desarrollada toda la noche en una botella cuadrada de
200-ml a 37ºC en 50 ml del medio LB, el cual también
contenía 100 \mug/ml de ampicilina. Las células fueron extraídas
de este cultivo por centrifugación durante 10 minutos a 2000 x g, y
resuspendidas en 50 ml de un medio de glucosa e incubadas durante 72
horas a 30ºC con agitación a 200 rpm. El medio de glucosa contenía,
por litro: 6,25 g de polvo LB; 100 \mug de ampicilina; 20 g de
glucosa; 50 mmol de fosfato de potasio, pH 7; 10 \mumol de
isopropil-\beta-D-tiogalactopiranosida
(IPTG); y 0,10, ó 100 nmol de la coenzima B-12.
Después de la incubación, las células fueron separadas del medio
por centrifugación durante 10 minutos a 2000 x g, lavadas una vez
con agua y centrifugadas de nuevo, después liofilizadas. El
análisis de la masa celular liofilizada por cromatografía gaseosa
(CG) mostró que, en el experimento con 10 nM de coenzima
B-12, se produjo poli(3HP) hasta 0,11% del
peso celular seco; en el experimento con 100 nM de la coenzima
B-12, se produjo poli(3HP) hasta 0,13% del
peso celular seco; y en el experimento sin la coenzima
B-12, no se detectó poli(3HP). En ningún caso
se encontró otro componente del polímero que no fuera el 3HP. El
análisis de CG se condujo como sigue: 15 a 20 mg de la masa celular
liofilizada se sometió a extracción y propanólisis simultáneas a
100ºC durante 3 horas en 2 ml de una mezcla que contenía (en
volumen) 50% de 1,2-dicloroetano, 40% de
1-propanol, y 10% de ácido clorhídrico concentrado,
con 2 mg/ml de ácido benzoico adicionado como un estándar interno.
Los componentes solubles en agua de la mezcla resultante fueron
removidos por extracción con 3 ml de agua. La fase orgánica (1
\mul a una relación de división de 1:50 a una velocidad de flujo
global de 2 ml/min) se analizó en una columna de CG capilar de
sílice fundida SPB-1 (30 m; 0,32 mm DI; 0,25 \mum
de película; Supelco; Bellefonte, Pa.) con el siguiente perfil de
temperatura: 80ºC, 2 min; 10ºC por min a 250ºC; 250ºC, 2 min. El
estándar usado para probar la presencia de residuos de 3HP fue
\beta-propiolactona. Ambos, poli(3HP) y
\beta-propiolactona producen el
1-propil éster de
3-hidroxipropionato cuando se someten a
propanólisis.
\newpage
Ejemplo
7
Como se demostró anteriormente, es posible
obtener PHBV a partir de 1,2-propanodiol con la
adición opcional de otras fuentes de carbono como la glucosa, y es
posible en ambos organismos, transgénicos y no transgénicos,
producir 1,2-propanodiol a partir de intermedios
metabólicos centrales (Cameron y otros, 1998, Biotechnol. Prog. 14
116-125). Por consiguiente, una combinación de las
dos trayectorias permitirá la síntesis de PHBV a partir de
intermedios metabólicos centrales. Estas trayectorias pueden
combinarse introduciendo los genes de la síntesis del PHBV en un
huésped productor de 1,2-propanodiol o introduciendo
los genes de la síntesis del 1,2-propanodiol en un
huésped capaz ya de la síntesis de PHBV a partir de
1,2-propanodiol, como se describió en los
ejemplos
anteriores.
anteriores.
En el caso anterior, los genes que codifican
para una diol deshidratasa vecina, una PHA sintasa, una
3-cetoacil-CoA tiolasa y reductasa,
y opcionalmente una aldehído deshidrogenasa,
1-propanol oxidorreductasa, e
hidroxiacil-CoA transferasa se expresan en un
huésped capaz de producir 1,2-propanodiol a partir
de los intermedios metabólicos centrales. Un ejemplo de tal huésped
es una Escherichia Coli que expresa aldosa reductasa de los
cristalinos de rata o sobrecarga la E. coli de la glicerol
deshidrogenasa, como se describió anteriormente. Muchas cepas de
E. coli naturalmente expresan actividades enzimáticas de la
1-propanol oxidorreductasa, aldehído
deshidrogenasa, y propionil-CoA transferasa, pero
sus niveles pueden aumentarse opcionalmente por mutagénesis o
sobrecarga determinada de las enzimas que llevan a cabo estas
funciones. Los genes adicionales necesarios pueden introducirse
como genes llevados por el plásmido o pueden integrarse en el
cromosoma, o puede usarse una combinación de los dos acercamientos.
Por ejemplo, un plásmido como el pFS48B, el cual contiene, bajo el
control del promotor trc, 4-hidroxibutiril de CoA
transferasa a partir de Clostridium kluyveri; PHA sintasa a
partir de Zoogloea ramigera y glicerol deshidratasa, y 1,3-
propanodiol oxidorreductasa a partir de Klebsiella
pneumoniae, pueden usarse en combinación con la integración de
los genes de la síntesis del PHB en el cromosoma, empleando las
técnicas normalizadas bien conocidas por los expertos en la
técnica.
De forma similar, pueden introducirse la aldosa
reductasa de los cristalinos de rata o genes de glicerol
deshidrogenasa de la E. coli en un huésped ya capaz
de la síntesis de PHBV, como el MBX769/pFS44C, descrito
anteriormente. Una mejora adicional puede resultar de la sobrecarga
de un gen de metilglioxal sintasa, como se sugirió por Cameron
et al., 1998 (Biotechnol. Prog. 14 116-125).
La aldosa reductasa de los cristalinos de rata o el gen de glicerol
deshidrogenasa de la E. coli pueden ser introducidos en un
plásmido compatible con el pFS44C (un plásmido que puede mantenerse
simultáneamente con el pFS44C), o pueden ser integrados en el
cromosoma.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8
La secuencia del gen de aldH a partir de
E. coli está disponible a partir de GENBANK. Este gen fue
clonado en el Acc65I y los sitios NotI del vector que clona
pSE380 siguiendo la ampliación PCR usando el enfoque descrito en el
Ejemplo 6 y los cebadores siguientes:
El plásmido recombinante resultante pALDH fue
introducido en la E. coli alfa DH5 y desarrollado en 5 ml
del medio LB con 100 \mug/ml de ampicilina a 37ºC. Al día
siguiente unos 100 ml conteniendo 100 \mug/ml de ampicilina fue
inoculado con 100 \mul del cultivo de toda la noche y desarrollado
hasta que la absorbancia a 600 nm alcanzó 0,5, momento en el cual
fue inducido el promotor trc con 1 mM de IPTG e incubado unas
3 horas más a 37ºC. Las células fueron recolectadas, lavadas y
resuspendidas en 0,1M Tris.HCl pH 8,0 y lisado por sonicación. El
lisado celular se ensayó para la actividad de aldehído
deshidrogenasa usando 3-hidroxipropionaldehído con
ambos, NAD y NADP como cofactor. Se realizaron los ensayos usando un
espectrofotómetro de diodos en fila de Hewlett Packard. Las
reacciones de la enzima se llevaron a cabo en cubetas de UV de 1,5
ml en una solución que contenía lo siguiente: 0,1 M Tris.HCl, pH
8,0, 1 mM de NAD o NADP, 6 mM de ditiotreitol y extracto crudo de
la célula hasta un volumen final de 1 ml. La mezcla se incubó
durante 20 segundos antes de comenzar la reacción agregando 1 mM de
3-hidroxipropionaldehido y supervisando la reacción
a 340 nm. El lisado mostró actividad significante de la
3-hidroxipropionaldehido deshidrogenasa cuando NAD
fue el cofactor (1,35 \mumol/min/mg de proteína) el cual no
estaba presente en la muestra de control preparada usando el vector
exclusivamente. Por consiguiente, el gen del aldH puede
usarse para aumentar la actividad de la
3-hidroxiproionaldehido deshidrogenasa en las cepas
descritas en los ejemplos
anteriores.
anteriores.
\vskip1.000000\baselineskip
- \bullet WO 9715681 A
- \bullet WO 9100917 A
- \bullet US 4477654 A, Holmes
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- \bullet US 5245023 A
- \bullet WO 9302187 A
- \bullet US 5250430 A
- \bullet WO 9302194 A
- \bullet US 5502273 A
- \bullet WO 9412014 A
- \bullet US 5534432 A
- \bullet WO 9821339 A
- \bullet US 5602321 A
- \bullet WO 9914313 A
- \bullet US 5610041 A
- \bullet WO 9720292 A
- \bullet US 5650555 A
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<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcccctagga ttcaggaggt ttttatggag tgggaagaga tatataaag
\hfill49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccttaagtcg acaaattcta aaatctcttt ttaaattc
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttccggatc cattcaggag gtttttatgt ctgctgctgc tgataga
\hfill47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttccgcggc cgcctaatct tcatgtagat ctaattc
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttccgcggc cgcattcagg aggtttttat gggattgact actaaacctc
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccttctcgag ttaccatttc aacagatcgt cc
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtggtacct taagaggagg tttttatgaa ttttcatcac ctggctt
\hfill47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
cebador oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtgcggccg ctcaggcctc caggcttatc ca
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (19)
1. Un método de producir polihidroxialcanoato
que comprende:
- (a)
- proporcionar organismos no humanos diseñados genéticamente que recombinantemente expresen enzimas seleccionadas entre la diol deshidratasa y aldehído deshidrogenasa vecinas;
- (b)
- proporcionar dioles que puedan ser convertidos en monómeros de 3-hidroxipropionato o 3-hidroxivalerato por las enzimas expresadas por los organismos; y
- (c)
- cultivar los organismos en condiciones en las cuales el 3-hidroxipropionato o 3-hidroxivalerato es convertido en monómeros, los cuales son polimerizados para formar polihidroxialcanoatos.
2. El método de la Reivindicación 1, en el que
los organismos son bacterias o plantas.
3. El método de la Reivindicación 1 ó 2, en el
que los organismos se diseñan genéticamente con plásmidos que
codifican para una o ambas, diol deshidratasa y aldehído
deshidrogenasa vecinas.
4. El método de la Reivindicación 1 ó 2, en el
que los organismos se diseñan genéticamente para incorporar genes
que codifican para una o ambas, diol deshidratasa y aldehído
deshidrogenasa vecinas, al cromosoma.
5. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la diol deshidratasa vecina
es diol deshidratasa.
6. El método de la Reivindicación 5, en el que,
adicionalmente, el organismo expresa recombinantemente por lo
menos una enzima seleccionada entre la aldosa reductasa de
cristalinos de rata, la glicerol deshidrogenasa y la metilglioxal
sintasa de la E. coli.
7. El método de una cualquiera de las
Reivindicaciones 1 a 4, en el que la diol deshidratasa vecina es
glicerol deshidratasa.
8. El método de la Reivindicación 7, en el que
el organismo también expresa enzimas seleccionadas entre la
glicerol-3-fosfatasa y la
glicerol-3-fosfato
deshidrogenasa.
9. El método de la Reivindicación 7 u 8, en el
que el organismo coexpresa recombinantemente las enzimas de la
dihidroxiacetona fosfato deshidrogenasa y de la
glicerol-3-fosfatasa.
10. El método de la Reivindicación 9, en el que
la enzima dihidroxiacetona fosfato deshidrogenasa es DAR1 y/o la
enzima glicerol-3-fosfatasa es
GPP2.
11. El método de la Reivindicación 9 ó 10, en el
que los genes recombinantes que codifican las enzimas
dihidroxiacetona fosfato deshidrogenasa y
glicerol-3-fosfatasa están ambos
integrados cromosomalmente.
12. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el organismo también expresa
la enzima 1,3-propanodiol oxidorreductasa.
13. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que, adicionalmente, el
organismo expresa recombinantemente por lo menos una enzima
seleccionada entre acil-CoA transferasa,
acil-CoA sintetasa,
\beta-cetotiolasa, acetoacil-CoA
reductasa, y PHA sintasa.
14. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que los dioles se seleccionan
entre 1,2-propanodiol,
1,3-propanodiol y glicerol.
15. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que los dioles son convertidos
en monómeros seleccionados entre monómeros de
3-hidroxipropionato o
3-hidroxivalerato.
16. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes que comprende además la adición de la
coenzima B-12, o su precursor, al cultivo.
17. El método de la Reivindicación 16, en el que
la coenzima B-12, o su precursor, se adiciona al
cultivo a una concentración de hasta 1 \muM.
18. El método de la Reivindicación 16, en el que
la coenzima B-12, o su precursor, se adiciona al
cultivo en una concentración hasta 20 nM.
19. Un organismo no humano diseñado por
ingeniería genética como queda definido en cualquiera de las
Reivindicaciones de 1 a 13.
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