JP5042407B2 - ポリオールからのポリヒドロキシアルカノエートの産生 - Google Patents
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Description
(発明の背景)
本発明は、一般的に、細菌酵素の遺伝子操作によるポリヒドロキシアルカノエートの産生の分野にある。
【0002】
多数の微生物は、ポリ[(R)−3−ヒドロキシアルカノエート](PHA)ポリマーの細胞内リザーバーを蓄積する能力を有する。PHAは、広範な範囲の産業的適用および生物医学的適用を有する、生分解性かつ生体適合性の熱可塑性材料である(WilliamsおよびPeoples,1996、CHEMTECH 26,38−44)。PHAは、多数の異なる発酵プロセスを使用して産生され得、そして広範な抽出技術を使用して回収され得る(Brauneggら、1998、J.Boitechnol.65:127−161;ChoiおよびLee,1999に概説される)。植物作物はまた、植物油に沿った原価構造を提供するこれらのポリマーを産生するため、そして石油ベースのポリマーとの価格競合性を指向するために遺伝子操作されている(WilliamsおよびPeoples,1996、CHEMTECH 26,38−44:Poirier,Y.1999、Plant Biotechnology 181−185頁)。PHAは、PHAシンターゼ酵素の作用によって形成される。ポリマー鎖が成長するにつれて、不溶性顆粒を形成する。次いで、PHAは回収され得、次いで、化学物質に変換される得か、または回収プロセスの間に化学物質に変換され得る(Martinら、PCT WO97/15681)。それゆえ、それらのポリマーとしての能力に加えて、PHAは、微生物系および植物作物系の両方において、新たな化学を貯蔵するための独特の機構を示す。
【0003】
3−ヒドロキシバレレート(3HV)(特にPHBV)を含有するPHAコポリマーは、広範に記載されている。多くの野生型微生物は、3HV含有PHAを産生し得る。PHBVは、Ralstonia eutropha(以前は、Alcaligenes eutrophus)を用いて、グルコースおよびプロピオネートから、ならびにグルコースおよびイソブチレートから、商業的に産生されている(Holmesらに対する米国特許第4,477,654号)。多数の他の微生物およびプロセスが、当業者に公知である(Brauneggら、1998、Journal of Biotechnology65:127−161)。ポリ(3HV)ホモポリマーは、Chromobacterium violaceumを用いて、バレレートから産生されている(Steinbuechelら、1993、Appl.Microbiol.Biotechnol.39:443−449)。3HV単位を含有するPHAもまた、組換え微生物を使用して合成されている。R.eutropha PHA生合成遺伝子を保有するEscherichia coliを使用して、グルコースおよびプロピオネートまたはバレレートのいずれかから(Slaterら、1992、Appl.Environ.Microbiol.58:1089−1094)ならびにグルコースおよびバリンまたはトレオニンのいずれかから(Eschenlauerら、1996、Int.J.Biol.Macromol.19:121−130)、PHBVが産生されている。R.eutropha PHA生合成遺伝子を保有するKlebsiella oxytocaを使用して、グルコースおよびプロピオネートからPHBVが産生されている(Zhangら、1994、Appl.Environ.Microbiol.60:1198−1205)。Aeromonas caviaeのPHA生合成遺伝子を保有するR.eutrophaを使用して、奇数の炭素数のアルカン酸からポリ(3HV−co−3HB−co−3HHp)が産生された(Fukuiら、1997、Biotechnol.Lett.19:1093−1097)。
【0004】
3−ヒドロキシプロピオネート単位を含有するPHAコポリマーもまた、記載されている。Holmesら(米国特許第4,477,654号)は、グルコースおよび3−クロロプロピオネートまたはアクリレートのいずれかからポリ(3HP−co−3HB−co−3HV)を合成するために、R.eutrophaを使用した。Doiら(1990、E,A,Dawes(編)、Novel Biodegradable Microbial Polymers,Kluwer Academic Publishers,the Netherlands,37−48頁)は、3−ヒドロキシプロピオネート、1,5−ペンタンジオール、1,7−ヘプタンジオール、または1,9−ノナンジオールからポリ(3HP−co−3HB)を合成するために、R.eutrophaを使用した。HiramitsuおよびDoi(1993、Polymer34:4782−4786)は、スクロースおよび3−ヒドロキシプロピオネートからポリ(3HP−co−3HB)を合成するために、Alcaligenes latusを使用した。Shimamuraら(1994、Macromolecules27:4429−4435)は、3−ヒドロキシプロピオネートおよび3−ヒドロキシブチレートまたはスクロースのいずれかからポリ(3HP−co−3HB)を合成するために、A.latusを使用した。これらのコポリマーに組み込まれた3−ヒドロキシプロピオネートの最高レベルは、88モル%であった(Shimamuraら、1994、同書)。組換え3HP含有PHAプロデューサーは、当該分野では記載されていない。
【0005】
トランスジェニック作物種においてこれらのポリマーを産生し得ることが、経済的に所望される。植物の産生のための方法は、以下に記載されている:米国特許第5,245,023号および同第5,250,430号;同第5,502,273号;同第5,534,432号;同第5,602,321号;同第5,610,041号;同第5,650,555号;同第5,663,063号;WO9100917、WO9219747、WO9302187、WO9302194、およびWO9412014、Poirierら、1992、Science256:520−523、WilliamsおよびPeoples,1996、Chemtech26,38−44。この目的を達成するために、微生物由来のPHAポリメラーゼをコードする遺伝子または1つより多いサブユニットを有するPHAポリメラーゼの場合には複数の遺伝子を、植物細胞に移入して、PHAポリメラーゼ酵素の適切なレベルの産生を得ることが必要である。さらに、さらなるPHA生合成遺伝子(例えば、ケトアシル−CoAチオラーゼ、アセトアセチル−CoAレダクターゼ遺伝子、4−ヒドロキシブチリル−CoAトランスフェラーゼ遺伝子、またはPHAポリメラーゼ酵素についての基質を合成するために必要な酵素をコードする他の遺伝子)を提供する必要性があり得る。多くの場合において、異なる植物組織またはオルガネラにおける発現を制御することが所望される。植物組織またはオルガネラにおける発現を制御するための方法は、当該分野で公知であるs(GasserおよびFraley,1989、Science244;1293−1299;Gene Transfer to Plants,1995、Potrykus,I.およびSpangenberg,G編、Springer−Verlag Berlin Heidelberg New York、および「Transgenic Plants:A Production System for Industrial and Pharmaceutical Proteins」、1996、Owen,M.R.L.およびPen,J.編、Jhon Wiley&Sons Ltd.England)。
【0006】
細菌発酵系における種々の異なるコポリマーの産生のための方法は公知であり、そして植物におけるPHAの産生は達成されているが、細菌において可能な範囲のコポリマーは、植物において達成されていない。トランスジェニック植物において異なるコポリマーを産生し得ること、およびトランスジェニック植物によって利用される基質に関してさらなる選択肢を有することは利点である。
【0007】
それゆえ、本発明の目的は、植物におけるPHAの産生のための方法および試薬を提供することである。
【0008】
本発明のさらなる目的は、単一の糖およびアルコールを基質として使用してPHAを産生するための方法および試薬を提供することである。
【0009】
本発明のなおさらなる目的は、PHBおよびPHVBとは異なるコポリマーの産生のための方法および試薬を提供することである。
【0010】
(発明の要旨)
PHAの産生のために有用である、グリセロールデヒドラターゼ、ジオールデヒドラターゼアシル−CoAトランスフェラーゼ、アシル−CoAシンセターゼ、βケトチオラーゼ、アセトアセチル−CoAレダクターゼ、PHAシンターゼ、グリセロール−3−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、およびグリセロール−3−ホスファターゼのような酵素を発現する生物が提供される。いくつかの場合において、1つ以上のこれらの遺伝子は、宿主生物に対してネイティブであり、そして残りは、導入遺伝子から提供される。これらの生物は、3−ヒドロキシプロピオネートモノマーまたは3−ヒドロキシバレレートモノマーを組み込むポリ(3−ヒドロキシポリアルカノエート)ホモポリマーまたはコポリマーを産生し、ここで、3−ヒドロキシプロピオネートおよび3−ヒドロキシバレレート単位は、ジオールの変換を触媒する酵素から誘導される。使用され得る適切なジオールとしては、1,2−プロパンジオール、1,3−プロパンジオール、およびグリセロールが挙げられる。正常な細胞代謝からグリセロールを得るための生化学経路もまた記載される。PHAポリマーは容易に回収され、そしてポリマーとして、または1,3−プロパンジオール、3−ヒドロキシプロピオンアルデヒド、アクリル、マロン酸、エステルおよびアミンを含む化学中間体の範囲についての開始物質として産業的に有用である。
【0011】
(発明の詳細な説明)
新たな代謝経路は、1,2−プロパンジオールからの3−ヒドロキシバレレート単位を含むPHA、およgび1,3−プロパンジオールまたはグリセロールからの3−ヒドロキシプロピオネート単位を含むPHAの産生のために開発されてきた。グリセロールの場合、グリセロールは、微生物に摂食され得るか、または中心代謝中間体から産生され得るかのいずれかである。これらのモノマーおよびその重合をもたらすこれらの新規な代謝経路の鍵となる酵素成分は、図1に示される。
【0012】
1,2−プロパンジオールおよびグリセロールは、高濃度でさえ多くの微生物に対して毒性ではない安価な基質である。1,3−プロパンジオールは、再生可能資源から産生され得る(Anton,D.「Biological production of 1,3−propandiol」、United Engineering Foundation Metabolic Engineering II conference,Elmau,Germany(1998年10月27日)にて提示された)。1,2−プロパンジオールは、プロピレングリコールの産生からの産業廃棄物の流れに存在する。グリセロールもまた、多数の微生物および植物作物における代謝から得られ得る。多くの場合、これらは、一般的に多くの微生物に対して低濃度で毒性になる有機酸と比較して、発酵のための優れた供給材料である。3−ヒドロキシプロピオン酸は化学的に安定ではなく、それゆえ、商業的に利用可能ではない。
【0013】
(操作される微生物)
1つの実施態様において、図1に例示される全体の経路のための遺伝子は、産生生物に導入される。天然にはPHAを産生しない微生物(例えば、Escherichia coli)が使用され得る。多数の組換えE.coli PHB産生系が記載されている(MadisonおよびHuisman,1999、Microbiology and Molecular Biology Reviews,63:21−53)。ビシナルジオールデヒドラターゼ(天然に、グリセロールを3−ヒドロキシプロピオンアルデヒドに変換し得る生物(例えば、Klebsiella pneumoniae)由来)をコードする遺伝子は、この宿主に導入される。1,2−プロパンジオールの場合、ビシナルジオールデヒドラターゼは、基質をプロピオンアルデヒドに変換し、これは、必要に応じて、外因性アシル−CoAトランスフェラーゼまたはアシル−CoAシンセターゼの補助を伴って、微生物の内因性代謝によってプロピオニル−CoAに変換され得る。プロピオンアルデヒドに対する増加した耐性を有する株を変異誘発しそして選択することは有用であり得る。次いで、プロピオニル−CoAは、アセチル−CoAとの縮合において、ケトアシル−CoAチオラーゼによって受容され、従って、3−ヒドロキシバレリル−CoAが形成され得る。ケトアシル−CoAチオラーゼはまた、アセチル−CoAをアセチル−CoAと縮合させ、よれによって、3−ヒドロキシブチリル−CoAを形成する。3−ヒドロキシバレリル−CoAおよび3−ヒドロキシブチリル−CoAの両方は、組換え宿主において発現されるような様々なPHAシンターゼによって受容され、それゆえ、PHBVは、組換え宿主によって合成される。
【0014】
上記の宿主はまた、増殖中または別々の増殖期の後のいずれかに、1,3−プロパンジオールまたはグリセロールを摂食し得、そして3HPポリマーが、その細胞内に蓄積される。E.coliは、補酵素B−12を新たに合成せず、それゆえ、補酵素B−12たはE.coliが補酵素B−12に変換し得る前駆体(例えば、ビタミンB−12)もまた、摂食されるはずである。グリセロールの場合、ビシナルジオールデヒドラターゼは、基質を、3−ヒドロキシプロピオンアルデヒドに変換し、これは、必要に応じて、外因性アシル−CoAトランスフェラーゼまたはアシル−CoAシンセターゼの補助を伴って、微生物の内因性代謝によって3−ヒドロキシプロピオニル−CoAに変換され得る。次いで、3−ヒドロキシプロピオニル−CoAは、PHAシンターゼによってP3HPに重合され得る。3HPに加えてヒドロキシアシル−CoAモノマー単位もまた、ポリマーに組み込まれ得る。例えば、ケトアシル−CoAチオラーゼおよびレダクターゼが発現される場合、3−ヒドロキシブチレートおよび3−ヒドロキシプロピオネートのコポリマーが形成され得る。
【0015】
炭水化物供給材料から直接3HPポリマーを産生するために、E.coliはさらに、グリセロール−3−ホスフェートデヒドロゲナーゼおよびグリセロール−3−ホスファターゼを発現するように操作される。このような組換えE.coli株およびその構築のための方法は、当該分野で公知である(Anton,D.「Biological production of 1,3−propandiol」、United Engineering Foundation Metabolic Engineering II conference,Elmau,Germany(1998年10月27日)で提示;PCT WO98/21339)。
【0016】
別の実施態様において、ビシナルジオールデヒドラターゼを天然に含む組換え微生物が使用され得る。このような微生物の1つの例は、Klebsiella oxytocaであるが、上記のようにいくつかの他の微生物が存在する。この実施態様において、外因性ビシナルジオールデヒドラターゼが、別の生物から移入される必要はない。しかし、この微生物を変異誘発し、そいて好気性増殖中にこのデヒドラターゼを発現する変異体を選択することもまた有用であり得るか、または好気性条件下でその遺伝子を発現するように遺伝子操作され得る。一般的には、1つ以上の補酵素B−12依存性ビシナルジオールデヒドラターゼを含む生物が補酵素B−12を新たに合成し得る場合であり、そして補酵素B−12またはその密接に関連する前駆体を培養の任意の部分に添加する必要がない場合である。この場合では、PHAシンターゼまたは全体のPHB生合成経路および必要に応じて外因性アシル−CoAまたはアシル−CoAシンセターゼが、この微生物に導入される。これを行うための技術は、当該分野で周知である(例えば、Dennisら、1998、Journal of Biotechnology64:177−186)。炭水化物供給物から直接3HPポリマーを産生するために、この株はさらに、上記のように、グリセロール−3−ホスフェートデヒドロゲナーゼおよびグリセロール−3−ホスファターゼを発現するように操作される。
【0017】
別の実施態様において、PHAを天然に産生する生物が使用され得る。このような生物の例としては、Ralstonia eutropha、Alcalgenes latusおよびAzotobactorが挙げられるが、当業者には多くの他の生物が周知である(Brauneggら、1998、Jounrnal of Biotechnology65:127−161)。ジオールデヒドラターゼの導入は、PeoplesおよびSinskey(1989、J.Biol.Chem.164、5298−15303)によって記載されるような標準的な技術を用いて達成される。これらの場合、生物を変異させ、そして3−ヒドロキシプロピオンアルデヒドに対する増加した耐性について選択することが有用であり得る。PHAを産生する生物は、補酵素B−12を新たに合成する能力において変化し、それゆえ補酵素B−12またはその生物が補酵素B−12に変換し得る前駆体が適切に添加される。次いで、PHBVは、1,2−プロパンジオールおよび少なくとも1つの他の供給材料を摂食することによって産生される。PHBPは、1,3−プロパンジオールまたはグリセロールおよび1つの他の供給材料(例えば、グリセロール)を摂食することによって産生される。炭水化物供給材料から直接3HPポリマーを産生するために、この株はさらに、上記のように、グリセロール−3−ホスフェートデヒドロゲナーゼおよびグリセロール−3−ホスファターゼを発現するように操作される。これらの生物におけるP3HPホモポリマーの産生についての利点である変異を利用することは有用であり得る。特異的変異としては、β−ケトチオラーゼ遺伝子および/またはアセトアセチル−CoAレダクターゼ遺伝子を不活性化することが挙げられる。これらの遺伝子は一般的に周知であり、そして利用可能または単離可能であるので、遺伝子破壊は、例えば、Slaterら、1998(J.Bicteriol.)によって記載されるように、容易に行われ得る。
【0018】
ポリ(3−ヒドロキシプロピオネート)およびそのコポリマーの産生の実行はまた実施例に記載されるような細菌に限定されない。同じ遺伝子が真核生物細胞(酵母および植物を含むがこれらに限定されない)に導入され得、これはまた、細菌のように、ジヒドロキシアセトンホスフェートのような解糖中間体を産生し、そこから、グリセロールおよび最終的にはポリ(3−ヒドロキシプロピオネート)が誘導され得る。
【0019】
(基質の利用のための遺伝子)
本明細書中に記載されるような使用に適切な組換えPHA手順を開発するための遺伝子および技術は、一般的に、当業者に公知である(MadisonおよびHuisman,1991、Microbiology and Molecular Biology Reviews,63:21−53;PCT WO99/14313)。中心代謝中間体からグリセロールを介してポリ(3−ヒドロキシプロピオネート)の産生を実行する必要がある遺伝子の全てはクローニングされており、そして遺伝子操作可能な形態で利用可能であるので、プラスミドにより運ばれた遺伝子および組み込まれた遺伝子の任意の組み合わせが使用され得、それゆえ、この経路の実行は、本明細書中に概説されるスキームに制限されない。多くの異なる実行は、当業者に明らかである。
【0020】
グリセロールデヒドラターゼ(EC4.2.1.30)およびジオールデヒドラターゼ(EC4.2.1.28)は、細菌のいくつかの種に見出される個別の補酵素B−12要求性酵素である。しばしば、グリセロールデヒドラターゼは、グリセロールにおける嫌気性増殖の間に誘導され、そしてジオールデヒドラターゼは、グリセロールまたは1,2−プロパンジオールのいずれかにおける嫌気性増殖の間に誘導される(ForageおよびFoster,1979、Biochim.Biophys.Acta569:249−258)。これらのデヒドラターゼは、グリセロールから3−ヒドロキシプロピオンアルデヒドの形成、および1,2−プロパンジオールからプロピオンアルデヒドの形成を触媒する。これらのアルデヒドは、通常、デヒドロゲナーゼによって対応するアルコールに変換される。1つまたは両方のデヒドラターゼを含む生物は、代表的には、グリセロールを3−ヒドロキシプロピオンアルデヒドまたは1,3−プロパンジオールに変換し得る。この能力で有名な細菌種としては、以下が挙げられる:Klebisiella pneumoniae(Streekstraら、1987、Arch.Microbiol.147:268−275)、Klebsiella oxytoca(Homannら、1990、Appl.Microbiol.Biotechnol.33:121−126)、Klebsiella planticola(Homannら、1990、同書)、およびCitrobacter freundii(Boenigkら、1993、Appl.Microbiol.Biotechnol.38:453−457)。しかし、多くの他の例が一般的に公知である。両方のデヒドラターゼは、3つのサブユニットから形成され、その各々は、他の酵素のその対応物に相同である。
【0021】
グリセロールおよびジオールデヒドラターゼ(これはまた、一般的に、この点から、「ビシナルジオールデヒドラターゼ」と称される)の基質範囲はグリセロールおよびおよび1,2−プロパンジオールに限定されない。Bachovchinら(1977、Biochemistry16:1082−1092)は、例えば、K.pneumoniae酵素によって受容される基質としては、以下が挙げられることを実証した:グリセロール、(R)−1,2−プロパンジオール、(S)−1,2−プロパンジオール、エチレングリコール、チオグリセロール、3−クロロ−1,2−プロパンジオール、1,2−ブタンジオール、2,3−ブタンジオール、イソブチレングリコール、および3,3,3−トリフルオロ−1,2−プロパンジオール。全ての場合において、この反応の産物は、基質の水分子の効果的除去によって形成されるアルデヒドまたはケトンである。
【0022】
ホスホグリセレートを通して糖からグリセロールを天然に産生する生物としては、以下が挙げられる:
【0023】
【数1】
これらの生物の多くにおいて、グリセロールは、ジヒドロキシアセトンホスフェート(グリセロール経路の中間体)から誘導されることが公知である。Escherichia coliは、通常、ほとんどの糖で増殖させた場合には、有意な量ではグリセロールを合成しない(BaldomaおよびAguilar,J.Bcteriol.170:416、1988)。しかし、グルコースのような一般的な糖からグリセロールを形成し得るトランスジェニックE.coli株が、例えば、PCT WO97/20292に記載されている。
【0024】
糖からグリセロールの産生(WO98/21339)、グリセロールから1,3−プロパンジオールの産生(WO96/35796、WO98/21339)、および糖から1,3−プロパンジオールの産生のための遺伝子操作された系が記載されている。Saccharomyces cerevisiaeのDAR1(ジヒドロキシアセトンホスフェートデヒドロゲナーゼ)遺伝子およびGPP2(sn−グリセロール−3−ホスフェートホスファターゼ)遺伝子を発現するE.coliは、グルコースで増殖させた場合に、培地中に高濃度のグリセロールを蓄積することが示された(Anton,D.「Biological production of 1,3−propandiol」、United Engineering Foundation Metabolic Engineering II conference,Elmau,Germany(1998年10月27日)に提示)。
【0025】
(発現の調節)
前述の実施態様のいずれかにおいて、ビシナルジオールデヒドラターゼの発現を制御することによって、または補酵素B−12の利用能を制御することによって、産生されるポリマーの組成を制御することが可能である。デヒドラターゼ活性が高くなるにつれて、基質利用能またはデヒドラターゼの下流の酵素活性のような別の要因が限定される点まで、より活性化されたモノマーが、その活性の結果として誘導される。様々な生物における遺伝子発現(および、従って、酵素活性)の調節のための方法は、当業者に周知である。ビシナルジオールデヒドラターゼ活性の制御のためのさらなる方法は、微生物に対する補酵素B−12の利用能の調節である。Escherichia coliの多くの株は、例えば、補酵素B−12を新たに合成できず、それゆえ、活性について補酵素B−12に依存する組換えビシナルジオールデヒドラターゼは、補酵素B−12またはビタミンB−12のような適切な前駆体が培地に付加される限りは、これらの株において活性ではない。PHA合成遺伝子およびビシナルジオールデヒドラターゼを保有するEscherichia coli株において、補酵素B−12を添加しないと、例えば1,2−プロパンジオールが培地中に存在してもPHBのみが合成されることが見出されている。同じ培地における同じ株の培養への1μMの補酵素B−12の添加は、実施例で議論されるように、PHBVの形成をもたらす。Skalyら(1998、Appl.Environ.Microbiol.64:98−105)は、増加した濃度の補酵素B−12が約20nMの濃度まで培地中に提供され、その後1,2−プロパンジオールの収量が増加しなかったので、トランスジェニックEscherichia coliが、グリセロールから増加したレベルの1,3−プロパンジオールを合成したことを見出した。それゆえ、0〜20nMの濃度の補酵素B−12は、1,2−プロパンジオールを含有する培地中で培養された、PHA合成遺伝子およびビシナルジオールデヒドラターゼ遺伝子を保有するEscherichia coliにおけるPHBV組成を制御するために、使用され得る。同じ基本的な前提は、ポリ(3−ヒドロキシプロピオネート)がグリセロールから誘導されることについて真実である。この細胞は、ビシナルジオールデヒドラターゼが存在しない場合に、コモノマーの存在下でPHA(例えば、PHB)を生成し得る。ポリマー組成を制御するための補酵素B−12の使用は、補酵素B−12を新たに合成できない任意の微生物で達成され得る。このような生物としては、この能力を天然に欠く生物(例えば、Escherichia coli)およびこの能力を天然に保有するが化学変異誘発の使用によってかまたはトランスポゾン変異誘発のようなこの能力を失わせる遺伝的方法によって変異されている生物(例えば、Klebisiella pneumoniae)が挙げられる。
【0026】
いくつかの生物の場合において、いくつかの遺伝子は、宿主染色体に取り込まれ得、他の遺伝子は、プラスミドに提供され得る。いくつかの場合において、適合可能なプラスミド系は、例えば、1つのプラスミドによってコードされる経路のいくつかの工程および第2のプラスミドによってコードされる他の工程とともに使用され得る。この2つのアプローチの組み合わせもまた使用され得る。
【0027】
(基質)
上記で議論したように、PHAを生成するために使用され得る基質としては、グリセロールおよびグルコースが挙げられる。多数の他の基質は、グリセロールまたはグルコースに加えて、首尾よく使用され得る。他の基質の例としては、デンプン、スクロース、ラクトース、フルクトース、キシロース、ガラクトース、コーン油、ダイズ油、獣脂、トール油、脂肪酸またはそれらの組み合わせが挙げられる。
【0028】
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照してさらに理解される。
【0029】
(実施例1.グルコースおよび1,2−プロパンジオールからのPHBV産生)
プラスミドpFS44Cを含むEscherichia coli株MBX769(Huismanら、PCT WO99/14313)(これは、Zoogloea ramigera由来のPHA合成遺伝子(アセトアセチル−CoAチオラーゼ、アセトアセチル−CoAレダクターゼ、およびPHAシンターゼ)を発現する)を使用して、グルコースおよび1,2−プロパンジオールからPHBVを合成した。プラスミドpFS44c(図2に模式的に示される)は、pTC53から単離された、Klebsiella pneumoniaeグリセロールデヒドラターゼをコードする遺伝子(dhaB)(Skralyら、1998、Appl.Environ.Microbiol.64:98〜105)、およびpCK3から単離された、Clostridium Kluyveri 4−ヒドロキシブチリル−CoAトランスフェラーゼをコードする遺伝子(hbcT)(SeuhlingおよびGottschalk、1996、J.Bacteriol.178:871〜880)(両方とも、trcプロモーターの制御下の1つのオペロン内)を含む。pFS44Cはまた、lacリプレッサー遺伝子(lacI)、アンピシリン耐性遺伝子(ampR)、および複製起点(ORI)(全てベクターpSE380(Invitrogen;La Jolla、Calif)に由来する)を含む。
【0030】
これらの細胞を、25g/mLのLBブロス粉末(Difco;Detroit,Mich.)および100mg/Lのアンピシリンを含む、100mLの培地中で予め培養した。これらを、この培地から遠心分離(2000×g、10分)によって取り出し、そして100mLの培地(1リットル当たり:5g LBブロス粉末;50mmolリン酸カリウム、pH7;10g 1,2−プロパンジオール;2g グルコース;1μmol 補酵素B−12;100μg アンピシリン;および0.1mmol イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)を含む)中に再懸濁した。これらの細胞を、225rpmにて30℃で48時間振盪しながら、この培地中でインキュベートした。次いで、これらを、上記のように遠心分離によって取り出し、水で1回洗浄し、そして凍結乾燥した。
【0031】
補酵素B−12を添加しなかったことを除いて、同じ実験を並行して行った。各フラスコからの約25mgの凍結乾燥した細胞塊を、2mLの混合液(内部標準物として添加された2mg/mLの安息香酸とともに、(容量で)90% 1−ブタノールおよび10% 濃塩酸を含む)中での110℃で30時間の同時の抽出およびブタノール溶解(butanolysis)に供した。得られた混合液の水溶性成分を、3mLの水での抽出によって除去した。有機層(2mL/分の全体的な流速にて1:50分割比での1μL)を、以下の温度プロフィール(80℃で2分;1分で10℃から250℃;250℃で2分)を用いて、SPB−1融合シリカキャピラリーGCカラム(30m;0.32mm ID;0.25μmフィルム;Supelco;Bellefonte,Pa.)上にて分析した。ポリマー中の3−ヒドロキシブチレートおよび3−ヒドロキシバレレート(3−hydroxyvalerate)単位の存在について試験するために使用される標準物は、PHBV(Aldrich Chemical Co.;Milwaukee,Wis.)であった。添加された補酵素B−12を用いる実験におけるポリマーは、60.9%の乾燥細胞重量を示し、そしてこれは、97.4%の3−ヒドロキシブチレート単位および2.6%の3−ヒドロキシバレレート単位から構成された。
【0032】
この実験から得られた上清は、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)分析によって0.41g/Lのプロパノールを含むことが見出され、このことは、グリセロールデヒドラターゼが機能的であったことを示す。補酵素B−12を添加していない実験におけるポリマーは、56.7%の乾燥細胞重量を示し、そしてこれは、PHBホモポリマーであった。この実験から得られた上清は、プロパノールを含まなかった。HPLC分析を、0.6mL/分の流速および50℃のカラム温度で、移動相として硫酸(pH2)を用いたAminex HPX−87Hカラムを使用して実行した。検出は、屈折率および紫外線吸収の両方によってであった。
【0033】
(実施例2.唯一の炭素源としての1,2−プロパンジオールからのPHBVおよび増殖)
MBX184は、E.coli株MBX1327を生成するために、1,2−PDでの増殖について選択した。MBX1327を、MBX1164由来のPHB遺伝子ABC5KANを用いて形質導入し、E.coli株MBX1329を生成した。MBX1164は、MBX247::ABC5KANである。MBX247は、標準的な手順(Miller,J.A short course in bacterial genetics、1992、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY)によって、1−メチル−3−ニトロ−1−ニトロソグアニジン(NTG)で変異誘発され、かつ唯一の炭素源として1,2−プロパンジオールを用いて増殖する能力についてスクリーニングされたLJ5218(JenkinsおよびNunn,J.Bact.1984 E.coli genetic stock center CGSC 6966)である。この能力を有するE.coli株およびこのような株を作製するための方法は、以前に記載されている(Sridharaら、1969、J.Bacteriol.93:87)。E.coli株MBX1329は、唯一の炭素源として1,2−プロパンジオールを用いて増殖する能力およびアセチル−CoAを生成する炭素源からPHBを合成する能力の両方を有する。
【0034】
プラスミドpFS44Cを保有するMBX1329(図2に示される)を、培地(1リットル当たり:6.25g LBブロス粉末;3.5g リン酸アンモニウムナトリウム;7.5g 二塩基性リン酸カリウム・3水和物;3.7g 一塩基性リン酸カリウム;0.12g 硫酸マグネシウム;2.78mg 硫酸鉄(II)・7水和物;1.98mg 塩化マンガン(II)・四水和物;2.81mg 硫酸コバルト(II)・7水和物;1.47mg 塩化カルシウム・2水和物;0.17mg 塩化銅(II)・2水和物;0.29mg 塩化亜鉛(II)・7水和物;10mg チミン;10g 1,2−プロパンジオール;50nmol 補酵素B−12;100μg アンピシリン;および0.05mmol イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)を含む)中にて増殖させた。総容量は、250mLエルレンマイアーフラスコにおいて50mLであった;接種物は、25g/L LBブロス粉末および100μg/mLアンピシリンにおける0.5mLの一晩の培養物であった。これらの細胞を、この培地中で、200rpmで振盪しながら37℃で3日間インキュベートした。これらを、この培地から遠心分離(2000×g、10分)によって取り出し、水で1回洗浄し、再度遠心分離し、そして凍結乾燥した。
【0035】
細胞内ポリマー含量を、実施例1のようにブタノール溶解によって分析した。これらの細胞は、9.8の光学密度(600nmにて)まで増殖し、そして乾燥細胞重量の6%のPHBVを含んだ。このポリマー自体は、2.5%の3−ヒドロキシバレレート単位および97.5%の3−ヒドロキシブチレート単位から構成された。
【0036】
(実施例3.1,3−プロパンジオールからのポリ(3−ヒドロキシプロピオネート)およびグリセロールからの1,3−プロパンジオール)
Escherichia coli株MBX184(これは、fadR遺伝子を欠損し、かつ構成的にatoC遺伝子を発現する)を使用して、グリセロールから1,3−プロパンジオールを、および1,3−プロパンジオールからポリ(3−ヒドロキシプロピオネート)を合成した。両方の例において、これらの細胞は、Klebsiella pneumoniaeグリセロールデヒドラターゼ、Clostridium kluyveri 4−ヒドロキシブチリル−CoAトランスフェラーゼ、およびRalstonia eutropha PHAシンターゼをコードする遺伝子(全て、trcプロモーターの制御下の1つのオペロン内)を含むプラスミドpFS45(図3に模式的に示される)を保有した。グリセロールが1,2−プロパンジオールの代わりに存在したことを除いて、これらの細胞を、実施例1に記載されるように培養した。
【0037】
HPLC分析は、補酵素B12含有培地中の細胞が、1.3g/Lの1,3−プロパンジオールを合成したが、補酵素B−12を含まない培地中の細胞が1,3−プロパンジオールを全く合成しないことを示した。1,3−プロパンジオールが1,2−プロパンジオールの代わりに存在し、かつ補酵素B−12が添加されないことを除いて、実施例1の方法を使用して、この同じ株もまた培養した。
【0038】
凍結乾燥した細胞塊を、ポリ(3−ヒドロキシプロピオネート)を定量するためのβ−プロピオラクトンのさらなる標準物とともに、実施例1のようにGCによって分析した。これらの細胞は、GC分析によって、7.8%の乾燥細胞重量でポリ(3−ヒドロキシプロピオネート)ホモポリマーを含むことが示された。グリセロールからのポリ(3−ヒドロキシプロピオネート)の合成は、多くの微生物に非常に有毒である3−ヒドロキシプロピオンアルデヒドの蓄積のために生じなかったようであった(Dobrogoszら、1989、Wenner−Gren Int.Symp.Ser.52:283〜292)。この毒性は、少なくとも2つの様式において、3−ヒドロキシプロピオンアルデヒドの蓄積を阻止することによって扱われ得る:1)1.3−プロパンジオール産生生物(例えば、上記の生物)由来の1,3−プロパンジオールオキシドレダクターゼもまた、発現され得る、そして2)グリセロールデヒドラターゼが存在する場合に、1,3−プロパンジオールの観察された形成を担うEscherichia coli由来の未同定の内因性デヒドロゲナーゼの活性は、グリセロールおよび補酵素B−12の両方の存在下で十分に増殖する、グリセロールデヒドラターゼを発現するEscherichia coli細胞をスクリーニングすることによって増大され得る。第2のアプローチは、例えば、変異誘発されたEscherichia coliを、pFS45のようなプラスミドを用いて形質転換することによって達成され得、その結果、この変異誘発は、グリセロールデヒドラターゼ遺伝子、続いてグリセロールおよび補酵素B−12を含有する培地の富化に影響しなかった。
【0039】
(実施例4.グリセロールからのポリ(3−ヒドロキシプロピオネート))
実施例3における2つの経路(グリセロールから1,3−プロパンジオールおよび1,3−プロパンジオールからポリ(3−ヒドロキシプロピオネート))を、同じ組換えEscherichia coliにおいて活性化した。Zoogloea ramigera由来のPHA生合成遺伝子phaA、phaB、およびphaCを安定に発現するE.coli株MBX820を、Clostridium kluyveri由来の4−ヒドロキシブチリル−CoAトランスフェラーゼならびにKlebsiella pneumoniae由来のグリセロールデヒドラターゼおよび1,3−プロパンジオールオキシドレダクターゼをコードする遺伝子(trcプロモーター制御下)を含むプラスミドpFS47A(図4に模式的に示される)を用いて形質転換した。PFS47Aを、プラスミドpFS16(pFS47Aの前駆体)から以下の通りに構築した:Clostridium kluyveri orfZ遺伝子を、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、プラスミドpCK3(SeulingおよびGottschalk、1996、J.Bacteriol.178:871〜880)からPCRによって増幅した:
【0040】
【化1】
orfZ PCR産物を、XbaI(これは、AvrIIと適合性である)およびSalIで消化されているpTrcNにライゲーションした。
【0041】
これらの細胞を、25g/LのLBブロス粉末(Difco;Detroit、Mich.)および100mg/Lのアンピシリンを含む、100mLの培地中にて予め培養した。これらを、遠心分離(2000×g、10分)によりこの培地から取り出し、そして100mLの培地(1リットル当たり:2.5g LBブロス粉末;50mmol リン酸カリウム、pH7;5gの基質(グリセロール;1,2−プロパンジオール;または1,3−プロパンジオール);2g グルコース;5nmol 補酵素B−12;100μg アンピシリン;および0.1mmol イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)を含む)中に再懸濁した。これらの細胞を、225rpmにて30℃で48時間振盪しながら、この培地中でインキュベートした。次いで、これらを、上記のように遠心分離によって取り出し、水で1回洗浄し、そして凍結乾燥した。
【0042】
凍結乾燥した細胞塊を、ポリ(3−ヒドロキシプロピオネート)を定量するためのβ−プロピオラクトンのさらなる標準物とともに、実施例1のようにGC分析によって分析した。グリセロールおよび1,3−プロパンジオール中で培養された細胞は、両方とも、3−ヒドロキシブチレートおよび3−ヒドロキシプロピオネート単位のコポリマーを含み、そして1,2−プロパンジオール中で培養された細胞は、3−ヒドロキシブチレートおよび3−ヒドロキシバレレート単位のコポリマーを含んだ。乾燥細胞重量の百分率としてのポリマーの組成および量を、表1に示す。グリセロールで培養された細胞は、1,3−プロパンジオールで培養された細胞よりもポリマーを合成したが、3−ヒドロキシプロピオネート単位の百分率は、グリセロールで培養された細胞においてよりも小さかった。これらの差異は、3−ヒドロキシプロピオンアルデヒドが有毒であり、かつこれがグリセロールデヒドラターゼによってグリセロールから生じるよりも1,3−プロパンジオールオキシドレダクターゼによって1,3−プロパンジオールからより迅速におそらく生じるという事実によって説明され得る。3−ヒドロキシプロピオンアルデヒドの毒性は、細胞の調子(従って、全体的なポリマー含量)に負の影響を与えるが、グリセロールからのその形成は、必要な中間体が3−ヒドロキシプロピオンアルデヒドまたは1,3−プロパンジオールであるかに関わらず、3−ヒドロキシプロピオニル−CoA形成に必要である。
【0043】
(表1.種々の基質において培養されたMBX820/pFS47Aによって産生されたポリマー)
【0044】
【表1】
(実施例5.補酵素B−12のバリエーションによるポリマー組成の制御)
(濃度)
ビシナルジオールデヒドラターゼは、活性が補酵素B−12に依存するので、そしてグリセロールからの3−ヒドロキシプロピオニル−CoAまたは1,2−プロパンジオールからのプロピオニル−CoAの形成は、デヒドラターゼ活性に依存するので、いずれかの場合におけるこのコポリマーの組成は、デヒドラターゼに対する補酵素B−12の利用能のバリエーションによって制御され得る。この例において、このことを、プラスミドpFS47Aを保有するE.coli株MBX820がPHAを産生していた培地に添加された補酵素B−12濃度のバリエーションによって達成した。
【0045】
これらの細胞を、25g/LのLBブロス粉末(Difco;Detroit、Mich.)および100mg/Lのアンピシリンを含む、100mLの培地中にて予め培養した。これらを、遠心分離(2000×g、10分)によりこの培地から取り出し、そして100mLの培地(1リットル当たり:2.5g LBブロス粉末;50mmol リン酸カリウム、pH7;10gの基質(グリセロールまたは1,2−プロパンジオール);2g グルコース;100μg アンピシリン;0.1mmol イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(IPTG);および0、5、20、または50nmol 補酵素B−12を含む)中に再懸濁した。これらの細胞を、225rpmにて30℃で72時間振盪しながら、この培地中でインキュベートした。次いで、これらを、上記のように遠心分離によって取り出し、水で1回洗浄し、そして凍結乾燥した。凍結乾燥された細胞塊を、実施例4の通りに、GC分析によって分析した。
【0046】
表2は、この様式において産生されたPHAの量および組成を示す。補酵素B−12の非存在は、基質がグリセロールまたは1,2−プロパンジオールであるかに関わらず、PHBのみの合成を生じた。グリセロールは、最終の光学密度およびポリマー含量によって示される通り、デヒドラターゼ活性の非存在下でPHA形成により適していた。これは、おそらくE.coliが好気性条件下で炭素源およびエネルギー源としてグリセロールを利用し得るからであるが(Lin,Ann.Rev.Microbiol.30:535、1976)、一般にこのことは、1,2−プロパンジオールに関しては当てはまらない(BaldomaおよびAguilar、同書)。補酵素B−12がグリセロールで培養された細胞に漸増量で添加される場合、ポリマー中の3−ヒドロキシプロピオネート単位の百分率は、増加し、一方、全体的なポリマー含量は、減少する。この減少は、おそらく、細胞の調子の減少を生じる3−ヒドロキシプロピオンアルデヒドの毒性に起因する。補酵素B−12が、1,2−プロパンジオールで培養された細胞に漸増量で添加される場合、3−ヒドロキシバレレート単位は、ポリマー中に取り込まれるが、ポリマー中の3−ヒドロキシバレレートの百分率は、グリセロール実験において3−ヒドロキシプロピオネート単位の百分率が増加したのと同程度に増加しない。このことは、補酵素B−12の濃度が数ナノモル濃度にさえ達した場合に、補酵素B−12の濃度が、3−ヒドロキシバレリル−CoA合成に対して律速ではないこと、および他のいくつかの因子が律速となることを示す。
【0047】
この例は、補酵素B−12依存性デヒドラターゼの使用に由来するPHAの組成が、デヒドラターゼに利用可能に作製された補酵素B−12の濃度を変動させることによって制御され得ることを実証する。制御が実行され得る程度は、使用されるジオール基質に依存する。このことは、他の基質を超える特定の基質についてのビシナルジオールの好ましさに起因し得、そしてPHA形成に対して活性化されたモノマーとして働くジオールから誘導されたアルデヒドをアセチルCoAに導く宿主代謝の休止に依存し得る
(表2.種々の補酵素B−12の濃度を有する培地において、MBX820/pFS47Aによってグリセロールおよび1,2−プロパンジオールから産生されるポリマーの組成)
【0048】
【表2】
a光学密度
b3−ヒドロキシブチレート単位
c3−ヒドロキシバレレート単位
d3−ヒドロキシプロピオネート単位
e乾燥細胞重量の百分率。
【0049】
(実施例6.中心代謝中間体からのポリ(3−ヒドロキシプロピオネート)の産生)
実施例1〜5は、グリセロールからポリ(3−ヒドロキシプロピオネート)を得ることが可能であること、ならびに上記のように、トランスジェニック生物および非トランスジェニック生物の両方において、中心代謝中間体からグリセロールを産生することが可能であることを実証する。従って、2つの経路の組合せは、中心代謝中間体からのポリ(3−ヒドロキシプロピオネート)の合成を可能にする。これらの経路は、上記の実施例に記載されるように、グリセロール産生宿主中にポリ(3−ヒドロキシプロピオネート)合成遺伝子を導入することによってか、あるいはグリセロールからポリ(3−ヒドロキシプロピオネート)を既に合成し得る宿主中にグリセロール合成遺伝子を導入することによってのいずれかと組み合わされ得る。
【0050】
前者の場合、ビシナルジオールデヒドラターゼ、PHAシンターゼ、ならびに必要に応じて、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、1,3−プロパンジオールオキシドレダクターゼ、およびヒドロキシアシル−CoAトランスフェラーゼをコードする遺伝子を、中心代謝中間体からグリセロールを産生し得る宿主中に発現させる。このような宿主の例は、上記のような、Saccharomyces cerevisiae DAR1(ジヒドロオキシアセトンホスフェートデヒドロゲナーゼ)遺伝子およびGPP2(sn−グリセロール−3−ホスフェートホスファターゼ)遺伝子(Anton,D.「Biological production of 1,3−propanediol」、United Engineering Foundation Metabolic Engineering II conference、Elmau、Germany、1998年10月27日;PCT WO 98/21339)を発現するEscherichia coliである。E.coliの多くの株は、1,3−プロパンジオールオキシドレダクターゼおよびアルデヒドデヒトロゲナーゼ酵素活性を天然に発現するが、それらのレベルは、必要に応じて、これらの機能を行う酵素の変異誘発または望ましい過剰発現によって増強され得る。必要なさらなる遺伝子は、trcプロモーターの制御下で、Clostridium kluyveri由来の4−ヒドロキシブチリル−CoAトランスフェラーゼ;Zoogloea ramigera由来のPHAシンターゼ;ならびにKlebsiella pneumoniae由来のグリセロールデヒドラターゼおよび1,3−プロパンジオールオキシドレダクターゼを含む、pFS48Bのようなプラスミドに導入され得る。これらの遺伝子のうちのいずれかまたは全てはまた、当業者に周知の標準的な技術を使用して、染色体中への組み込みによって導入され得る。
【0051】
同様に、DAR1およびGPP遺伝子は、上記のポリ(3−ヒドロキシプロピオネート)を既に合成し得る宿主(例えば、MBX820/pFS47A)中に導入され得る。DAR1およびGPP2遺伝子は、pFS47Aと適合性のプラスミド(pFS47Aとともに同時に維持され得るプラスミド)に導入され得るか、またはそれらは、染色体中に組み込まれ得る。MBX820は、アセトアセチル−CoAチオラーゼ、3−ヒドロキシブチリル−CoAレダクターゼ、およびPHAシンターゼを安定に発現し、それによってポリ(3−ヒドロキシブチレート−co−3−ヒドロキシプロピオネート)を合成し得る。ホモポリマーのポリ(3−ヒドロキシプロピオネート)が所望される場合、3つの全てのPHB生合成遺伝子ではなくPHAシンターゼのみを発現する株が、使用され得る。
【0052】
グルコースからのPHPの生合成の経路を実証するために、プラスミドpMS15(図6に模式的に示される)を、trcプロモーターからのオペロンとして以下の遺伝子を発現するように構築した:A.eutrophus由来のPHBシンターゼ、C.kluyveri由来の4−ヒドロキシブチリル−CoAトランスフェラーゼ、Klebsiella由来のグリセロールデヒドラターゼ、S.cerevisae由来のDAR1遺伝子、S.cerevisae由来のGPP2およびK.pneumoniae由来の1,3−プロパノールオキシドレダクターゼ。
【0053】
プラスミドpFS551を、DAR1およびGPP2のPCR産物をpTrcNに一度にライゲーションすることによって構築した。DAR1遺伝子を、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、S.cerevisiaeゲノムDNAからPCRによって増幅した:
【0054】
【化2】
GPP2遺伝子を、同じ様式で以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅した:
【0055】
【化3】
各遺伝子に対するPCRを、以下を含む50μLの反応容量において、pfu DNAポリメラーゼ(Stratagene;La Jolla、Calif.)を用いて実行した:10ユニットのpfuポリメラーゼ、製造業者により提供される1×反応緩衝液、50pmolの各プライマー、約200ngのS.cerebisiaeゲノムDNA、および200μMの各dNTP。この反応の温度プロフィールは、以下の通りであった:(94℃で1分;55℃で2分;72℃で3分)を27サイクル、次いで72℃で2分。反応混合液が94℃に達するまで、Pfuポリメラーゼを添加しなかった。
【0056】
PCR産物を、1%の低融点アガロースゲルから精製し、そして対応する部位がプライマーの5’末端に含まれている制限酵素(DAR1についてはBamHIおよびNotI、GPP2についてはNotIおよびXhoI)で消化した。ベクターpTrcNは、NcoI部位を欠くように改変されたpTrc99aのバージョンである(Pharmacia;Upplala、Sweden)。pTrcNを、DAR1の挿入のために、BamHI、NotI、および仔牛腸アルカリホスファターゼ(CIAP;Promega;Madison、Wis.)で切断し、GPP2の挿入のためにNotI、XhoI、およびCIAPで切断した。ライゲーションを、製造業者により提供される使用説明書に従って、T4 DNAリガーゼ(New England Biolabs;Beverly、Mass.)で実行した。このライゲーションの産物は、pFS49(DAR1)およびpFS50(GPP2)であった。1つのプラスミドに両方の遺伝子を構築するために、pFS49をMluIおよびNotIで切断し、そしてtrcプロモーターおよびDAR1を含む2.3−kbフラグメントを、同じ2つの酵素およびCIAPで消化されているpFS50にライゲーションした。得られたプラスミドは、trcプロモーターの制御下のオペロンDAR1−GPP2を含み、pFS51と命名した。
【0057】
プラスミドpMS15を含むE.coli株MBX184(図6に模式的に示される)を、100μg/mLアンピシリンもまた含む50mLのLB培地中で37℃にて、200mLの四角のボトル中で一晩増殖させた。これらの細胞を、2000×gの10分間の遠心分離によってこの培養物から取り出し、そしてこれらの細胞を、50mLのグルコース培地中に再懸濁し、そして200rpmで振盪しながら30℃で72時間インキュベートした。グルコース培地は、1リットル当たり:6.25g LB粉末;100μg アンピシリン;20g グルコース;50mmol リン酸カリウム、pH7;10μmol イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(IPTG);および0、10、または100nmol 補酵素B−12を含んだ。インキュベーションの後に、これらの細胞を、2000×gでの10分間の遠心分離により培地から取り出し、水で1回洗浄し、そして再度、遠心分離し、次いで凍結乾燥した。
【0058】
凍結乾燥された細胞塊のガスクロマトグラフィー(GC)分析は、以下を示した:10nMの補酵素B−12を用いた実験において、ポリ(3HP)は、乾燥細胞重量の0.11%であり;100nMの補酵素B−12を用いた実験において、ポリ(3HP)は、乾燥細胞重量の0.13%であり;そして補酵素B−12を用いない実験において、ポリ(3HP)は、検出されなかった。3HP以外のポリマー成分は、いずれの場合も見出されなかった。GC分析を、以下の通りに実施した:15〜20mgの凍結乾燥された細胞塊を、内部標準物として添加された2mg/mLの安息香酸とともに、(容量で)50%の1,2−ジクロロエタン、40%の1−プロパノール、および10%の濃縮した塩酸を含む、2mLの混合液中で、100℃にて3時間、同時に抽出およびプロパノール溶解に供した。得られた混合液の水溶性成分を、3mLの水を用いる抽出によって除去した。有機層(2mL/分の全体的な流速にて1:50分割比での1μL)を、以下の温度プロフィール(80℃で2分;1分で10℃から250℃;250℃で2分)を用いて、SPB−1融合シリカキャピラリーGCカラム(30m;0.32mm ID;0.25μmフィルム;Supelco;Bellefonte,Pa.)上にて分析した。3HP残基の存在について試験するために使用された標準物は、β−プロピオラクトンであった。ポリ(3HP)およびβ−プロピオラクトンの両方は、プロパノール溶解に供した場合に、3−ヒドロキシプロピオネートの1−プロピルエステルを生じた。
【0059】
(実施例7.中心代謝中間体からのPHBV)
上記のように、他の炭素源(例えば、グルコース)を必要に応じて添加して、1,2−プロパンジオールからPHBVを得ることが可能であり、そしてトランスジェニック生物および非トランスジェニック生物の両方において、中心代謝中間体から1,2−プロパンジオールを産生することが可能である(Cameronら、1998、Biotechnol.Prog.14 116〜125)。従って、2つの経路の組合せは、中心代謝中間体からのPHBVの合成を可能にする。これらの経路は、上記の実施例に記載されるように、1,2−プロパンジオール産生宿主中にPHBV合成遺伝子を導入することによってか、または1,2−プロパンジオールからPHBVを既に合成し得る宿主中に1,2−プロパンジオール合成遺伝子を導入することによってのいずれかで組み合わされ得る。
【0060】
前者の場合、ビシナルジオールデヒドラターゼ、PHAシンターゼ、3−ケトアシルCoAチオラーゼおよび3−ケトアシルCoAレダクターゼ、ならびに必要に応じて、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、1−プロパンジオールオキシドレダクターゼ、およびヒドロキシアシル−CoAトランスフェラーゼをコードする遺伝子を、中心代謝中間体から1,2−プロパンジオールを産生し得る宿主中に発現させる。このような宿主の例は、上記のような、ラットレンズ(lens)アルドースレダクターゼを発現するか、またはE.coliグリセロールデヒドロゲナーゼを過剰発現するEscherichia coliである。E.coliの多数の株は、1−プロパノールオキシドレダクターゼ酵素活性、アルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素活性、およびプロピオニル−CoAトランスフェラーゼ酵素活性を天然に発現するが、それらのレベルは、必要に応じて、これらの機能を行う酵素の変異誘発または所望の過剰発現によって増強され得る。必要なさらなる遺伝子は、プラスミドにより運ばれた(prasmid−borne)遺伝子として導入され得るか、または染色体中に組み込まれ得るか、あるいはこれらの2つのアプローチの組合せが使用され得る。例えば、pFS48Bのようなプラスミドは、tcrプロモーターの制御下で、Clostridium kluyveri由来の4−ヒドロキシブチリル−CoAトランスフェラーゼ;Zoogloea ramigera由来のPHAシンターゼならびにKlebsiella pneumoniae由来のグリセロールデヒドラターゼおよび1,3−プロパンジオールオキシドレダクターゼを含み、当業者に周知の標準的な技術を使用して、染色体中中へのPHB合成遺伝子の組み込みと組み合せて使用され得る。
【0061】
同様に、ラットレンズアルドースレダクターゼまたはE.coliグリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子は、上記の、PHBV合成が既に可能な宿主(例えば、MBX769/pFS44C)中に導入され得る。さらなる改善は、Cameronら、1998(Biotechnol.Prog.14 116〜125)により示唆されるような、メチルグリオキサール合成遺伝子の過剰発現から生じ得る。ラットレンズアルドースレダクターゼまたはE.coliグリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子は、pFS44Cと適合性のプラスミド(pFS44Cと同時に維持され得るプラスミド)上に導入され得るか、または、それらは、染色体中に組み込まれ得る。
【0062】
(実施例8.3−ヒドロキシプロピオンアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の同定)
E.coli由来のaldH遺伝子配列は、GENBANKから入手可能である。この遺伝子を、実施例6に記載されるアプローチおよび以下のプライマーを使用して、PCR増幅の後にクローニングベクターpSE380のAcc65IおよびNotI部位中にクローニングした:
【0063】
【化4】
得られた組換えプラスミドpALDHを、E.coli DH5α中に導入し、そして100μg/mlのアンピシリンを含む5mlのLB培地中にて37℃で増殖させた。翌日に、100μg/mlのアンピシリンを含む100mlを、100μlの一晩の培養物に接種し、そして600nmの吸光度が0.5に達するまで増殖させた。600nmの吸光度が0.5に達した時点で、trcプロモーターを、1mMのIPTGで誘導し、そして37℃でさらに3時間インキュベートした。これらの細胞を回収し、洗浄し、そして0.1M Tris.HCl pH8.0中に再懸濁し、そして超音波処理により溶解した。これらの細胞溶解物を、補因子としてNADおよびNADPの両方を用いて3−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを使用して、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性についてアッセイした。アッセイを、Hewlett Packardダイオードアレイ分光光度計を使用して実行した。酵素反応を、1.5mlのUVキュベットで、以下を含む溶液中で実行した:0.1M Tris.HCl、pH8.0、1mM NADまたはNADP、6mM ジチオスレイトールおよび最終容量1mlまでの粗細胞抽出物。混合液を、1mM 3−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを添加することによって反応を開始する前に20秒インキュベートし、そして反応を340nmでモニターした。この溶解物は、ベクターのみを使用して調製されたコントロールサンプル中に存在しないNADが補因子である場合に、有意な3−ヒドロキシプロピオンアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を示した(1.35μモル/分/mgタンパク質)。従って、aldH遺伝子は、先の実施例に記載される株における3−ヒドロキシプロピオンアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を増大させるために使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【図1】 図1は、グリセロール−3−Pからの3−ヒドロキシバレリル−CoAの産生のフローチャートである。
【図2】 図2は、グリセロールデヒドラターゼ(dhaB)および4−ヒドロキシブチリル−CoAトランスフェラーゼ(hbcT)をコードするプラスミド構築物pFS44Cの模式図である。
【図3】 図3は、dhaB、hbcTおよびphaCをコードするプラスミド構築物pFS45の模式図である。
【図4】 図4は、dhaT、dhaBおよびhbcTをコードするプラスミド構築物pFS47Aの模式図である。
【図5】 図5は、dhaT、dhaB、hbcTおよびphaCをコードするプラスミド構築物pFS48Bの模式図である。
【図6】 図6は、dhaT、DAR1−GPP2(DAR1、ジヒドロキシアセトンホスフェートデヒドロゲナーゼ;およびGPP2、sn−グリセロール−3−ホスフェートホスファターゼ)、dhaB、hbcTおよびphaCをコードするプラスミド構築物pMS15の模式図である。
【図7】 図7は、GPP2およびDAR1をコードするプラスミド構築物pFS51の模式図である。
Claims (25)
- ポリヒドロキシアルカノエートを産生するための方法であって、以下の工程:
ビシナルジオールデヒドラターゼ、アシル−CoAトランスフェラーゼ、アシル−CoAシンセターゼ、β−ケトチオラーゼ、アセトアセチル−CoAレダクターゼ、1,3−プロパンジオールオキシドレダクターゼ、ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼ、グリセロール−3−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、およびグリセロール−3−ホスファターゼからなる群より選択される酵素を発現するように遺伝子操作されたE.coliを提供する工程;
該E.coliによって発現される酵素によって、3−ヒドロキシプロピオネートモノマーまたは3−ヒドロキシバレレートモノマーに変換され得るジオールを提供する工程;および
3−ヒドロキシプロピオネートまたは3−ヒドロキシバレレートが、重合されてポリヒドロキシアルカノエートを形成する条件下で、該E.coliを培養する工程、
を包含する、方法。 - 前記E.coliが、1つ以上の前記酵素をコードするプラスミドで遺伝子操作される、請求項1に記載の方法。
- 前記E.coliが、前記酵素をコードする遺伝子を染色体へ組み込むために遺伝子操作される、請求項1に記載の方法。
- 前記ジオールが、1,2−プロパンジオール、1,3−プロパンジオール、およびグリセロールからなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記デヒドラターゼが、グリセロールデヒドラターゼおよびジオールデヒドラターゼからなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法であって、酵素アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を提供する工程をさらに包含する、方法。
- ポリヒドロキシアルカノエートを産生するための系であって、
ビシナルジオールデヒドラターゼ、アシル−CoAトランスフェラーゼ、アシル−CoAシンセターゼ、β−ケトチオラーゼ、アセトアセチル−CoAレダクターゼ、1,3−プロパンジオールオキシドレダクターゼ、ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼ、グリセロール−3−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、およびグリセロール−3−ホスファターゼからなる群より選択される酵素を発現するように遺伝子操作されたE.coliを包含し、
ここで、該E.coliが、重合されてポリヒドロキシアルカノエートを形成する、3−ヒドロキシプロピオネートモノマーまたは3−ヒドロキシバレレートモノマーに、ジオールを変換し得る、系。 - 前記E.coliが、1つ以上の前記酵素をコードするプラスミドで遺伝子操作される、請求項7に記載の系。
- 前記E.coliが、前記酵素をコードする遺伝子を染色体へ組み込むために遺伝子操作される、請求項7に記載の系。
- 補酵素B−12をさらに包含する、請求項7に記載の系。
- 前記ビシナルジオールデヒドラターゼが、グリセロールデヒドラターゼおよびジオールデヒドラターゼからなる群より選択される、請求項7に記載の系。
- 酵素アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子をさらに含む、請求項7に記載の系。
- 3−ヒドロキシプロピオン酸を産生するための方法であって、以下の工程:
3−ヒドロキシプロピオネートを産生するのに有効な、ビシナルジオールデヒドラターゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、1,3−プロパンジオールオキシドレダクターゼ、グリセロール−3−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、およびグリセロール−3−ホスファターゼからなる群より選択される1以上の酵素を発現するように遺伝子操作されたE.coliを提供する工程;
該E.coliによって発現される酵素によって、3−ヒドロキシプロピオネートに変換され得るポリオール基質を提供する工程;および
3−ヒドロキシプロピオネートが産生される条件下で該E.coliを培養する工程、
を包含する、方法。 - 前記基質が、1,2−プロパンジオール、1,3−プロパンジオール、グリセロール−3−ホスフェートおよびグリセロールからなる群より選択される、請求項13に記載の方法。
- ビシナルジオールデヒドラターゼが、グリセロールデヒドラターゼおよびジオールデヒドラターゼからなる群より選択される、請求項13に記載の方法。
- 糖および糖代謝物の代謝中間体からなる群から選択される基質をさらに含む、請求項13に記載の方法。
- 前記E.coliが、アルデヒドデヒドロゲナーゼおよびビシナルジオールデヒドラターゼを発現する、請求項13に記載の方法。
- 基質としてグリセロール−3−ホスフェートを提供することを包含する、請求項13に記載の方法。
- 3−ヒドロキシプロピオン酸を産生するための系であって、
ビシナルジオールデヒドラターゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、1,3−プロパンジオールオキシドレダクターゼ、グリセロール−3−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、およびグリセロール−3−ホスファターゼからなる群より選択される1以上の酵素を発現するように遺伝子操作されたE.coliであって、基質を3−ヒドロキシプロピオネートに変換し得るE.coli、および
有効量のポリオール基質であって、3−ヒドロキシプロピオネートが産生される条件下で、3−ヒドロキシプロピオネートに変換されるポリオール基質、
を包含する系。 - 請求項13に記載のプロピオン酸から3−ヒドロキシプロピオニルCoAを産生するための方法であって、
3−ヒドロキシプロピオン酸を3−ヒドロキシプロピオニルCoAに変換し得るE.coliであって、3−ヒドロキシプロピオニルCoAシンセターゼまたは3−ヒドロキシプロピオニルCoAトランスフェラーゼの活性を有する酵素を含むE.coliを提供する工程を包含する、方法。 - 3−ヒドロキシプロピオニル−CoAからポリヒドロキシアルカノエートを産生するための方法であって、
ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼの活性を有する酵素を含むE.coliを提供する工程を包含し、3−ヒドロキシプロピオニル−CoAがポリヒドロキシアルカノエートシンターゼによってポリヒドロキシアルカノエートに組み込まれる、方法。 - ポリヒドロキシアルカノエートが、3−ヒドロキシプロピオネートポリマーまたはコポリマーである、請求項21に記載の方法。
- 前記E.coliが、グリセロール−3−ホスフェートデヒドロゲナーゼおよびグリセロール−3−ホスファターゼからなる群より選択される酵素を発現するように遺伝子操作されており、それにより代謝中間体をグリセロールに変換し、該中間体がさらに3−ヒドロキシプロピオン酸に変換される、請求項21に記載の方法。
- 前記E.coliがさらに、アシル−CoAトランスフェラーゼ、アシル−CoAシンセターゼおよびポリヒドロキシアルカノエートシンターゼからなる群から選択される1以上の酵素を発現するよう遺伝子操作される、請求項21に記載の方法。
- 前記E.coliがさらに、アシル−CoAトランスフェラーゼ、アシル−CoAシンセターゼおよびポリヒドロキシアルカノエートシンターゼからなる群から選択される1以上の酵素を発現するよう遺伝子操作される、請求項19に記載の系。
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