CN101445813B - 一种生产3-羟基丙酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生产3-羟基丙酸的方法。本发明的生产3-羟基丙酸的方法是以1，3-丙二醇为原料，用表达1，3-丙二醇脱氢酶和醛基氧化酶的微生物生产3-羟基丙酸。所述表达1，3-丙二醇脱氢酶和醛基氧化酶的微生物为天然表达1，3-丙二醇脱氢酶和醛基氧化酶的微生物或将1，3-丙二醇脱氢酶的编码基因和醛基氧化酶的编码基因转入微生物宿主中得到的能表达1，3-丙二醇脱氢酶和醛基氧化酶的重组微生物。利用本发明方法以1，3-丙二醇为原料生产3-羟基丙酸，每升培养基中3-羟基丙酸的含量可达0.24-12.1g。
Description
技术领域
本发明涉及一种生产3-羟基丙酸的方法。
背景技术
3-羟基丙酸(3HP)是一种粘性液体，在水中酸解离常数对数值(pKA)为4.5，极易溶于水、溶于乙醇，可以与乙醚混溶(Merck Index，11th Edition，4681)。3HP具有广泛的应用价值，可以作为化工合成前体、药物合成前体，用于生产涂料、胶黏剂、水处理化学品、个人护肤品等。目前已报道的可由3HP转化合成的化工产品包括乙氧基丙酸乙酯(Ethyl ethoxy propionate，EEP)、丙烯酰胺化合物、丙烯酸酯、丙烯酸聚合物及1，3-丙二酸等。3HP还可以作为合成超高性能聚酯塑料PHP的前体以及合成高性能生物可降解塑料聚羟基脂肪酸酯(PHA)的高性能单体组分前体(MattCarr.The Biobased Revoluation.ASC Fall Convention&Expo.Oct.11th 2005)。当利用3HP和其他PHA前体一起供应给PHA合成菌时，可以得到含有3HP组分的PHA(METABOLIX Inc.Polyhydroxyalkanoate production from polyols.WO00/08198)。基于3HP的这些应用价值，其在商业上具有重大的开发价值和潜在市场。2004年8月美国能源部(DOE)报告将3HP列为当前世界上12种最具开发潜力的化学产品之一。
3HP是生物天然代谢中的一种中间体，是3-羟基丙酸循环(Alber，B.E.，and G.Fuchs.2002.Propionyl-coenzyme A synthase from Chloroflexus aurantiacus.a keyenzyme of the 3-hydroxypropionate cycle for autotrophic CO2 fixation.J.Biol.Chem.277：12137-12143.)和丙氨酸代谢中的一个环节。在人工构建的代谢途径中通过甘油脱氢代谢与醛基氧化两步也可以得到3HP(NIPPON SHOKUBAI CO LTD.Production of 3-hydroxypropionic acid by enzyme reaction from glycerin，involvesperforming enzyme reactions by glycerol dehydratase and/or diol dehydratase，andhydroxy aldehyde dehydrogenase.JP2007082476)。因此，理论上3HP可以通过生物发酵途径由廉价的非相关碳源(如葡萄糖、淀粉等)得到。从化学角度来讲，3HP的产生主要是通过空间特异性催化剂催化丙烯酸加水获得(LG CHEM.Ltd.Methodfor producing 3-hydroxypropionic acid from acrylic acid，comprises using Rhodococcuserythropolis lg12 under various culture conditions.KR2006034794)，但是副产物多、产率低。目前合成3HP的方法主要是化学合成，具有能耗高、污染大、副产物多、分离困难、成本高昂等缺点。因此长期以来，3HP一直不能有效地规模量产。
美国能源部能效和可再生资源办公室在2002年4月提出了6个关于生物物质研究及能源、可再生资源、经济资源生产项目，其中卡吉尔(Cargill)公司和陶氏(Dow)公司的共同合作项目，研究以谷物类碳水化合物生产3HP的发酵新工艺就是其中之一(Cargill Inc.Novel transformed cell comprising beta-alanine/pyruvateaminotransferase activity，useful for producing 3-hydroxypropionic acid 3-HP frombeta-alanine，and for producing ester of 3-HP，1，3-propanediol and polymerized 3-HP.WO 2005/118719)。另外，关于利用丙氨酸代谢途径生物转化合成3HP、利用甘油脱氢酶和醛脱氢酶合成3HP都有相关专利，但是没有能够大量生产的报道。根据现有专利报道的数据，3HP的产量为0.24g/L(Cargill Inc.Production of3-hydroxypropanoic acid using beta-alanine/pyruvate aminotransferase.EP1706457)。
3HP是PHA多种组分中一种重要而特殊的短链组分(Metabolix Inc.Polyhydroxyalkanoate Biopolymer compositions.WO 99/61624；Shimamura.1994，Macromolecules 27：4429-4435；Cao.1997 Macromol.Chem.Phys.198：3539-3557；SHOWA DENKO K.K.New biodegradable microbial polyester copolymers-contg.3-hydroxy-butyrate，3-hydroxy-valerate，3-hydroxy-propionate and 5-hydroxy-valerateunits.EP 440165)，具有没有侧链、不具有手性、分子量最低、能够增加PHA降解性能等特点。在PHA多种组分中，3HP的摩尔比可以达到88％(Shimamura.1994.Macromolecules 27：4429-4435)。因此，3HP对于PHA结构单元组分优化可以起到提高PHA的性能和应用价值的作用(Metabolix Inc.Producing polyhydroxyalkanoatespolymer useful for，e.g.drug delivery，comprises expressing in an organism，a geneencoding polyhydroxyalkanoate synthase and coenzyme A-dependent aldehydedehydrogenase.WO 2004/024876)。但是由于3HP难于大规模生产，因此，含有3HP组分的PHA也难于规模性地生产。
发明内容
本发明的目的是提供一种生产3-羟基丙酸的方法。
本发明的生产3-羟基丙酸的方法，是以1，3-丙二醇为原料，用表达1，3-丙二醇脱氢酶和醛基氧化酶的微生物生产3-羟基丙酸。
所述表达1，3-丙二醇脱氢酶和醛基氧化酶的微生物为天然表达1，3-丙二醇脱氢酶和醛基氧化酶的微生物或将1，3-丙二醇脱氢酶的编码基因和醛基氧化酶的编码基因转入微生物宿主中得到的能表达1，3-丙二醇脱氢酶和醛基氧化酶的重组微生物。
所述天然表达1，3-丙二醇脱氢酶和醛基氧化酶的微生物可为恶臭假单孢菌(Pseudomonas putida)KT2440、恶臭假单孢菌(Pseudomonas putida)KT2442、嗜水气单孢菌(Aeromonas hydrophila)ATCC7966。
所述能表达1，3-丙二醇脱氢酶和醛基氧化酶的重组微生物的出发菌株可为天然表达1，3-丙二醇脱氢酶和醛基氧化酶的微生物；也可为不能天然表达1，3-丙二醇脱氢酶和所述醛基氧化酶的微生物，如大肠杆菌(Escherichia coli)K12 MG1655、大肠杆菌(Escherichia coli)S17-1或谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032。
所述1，3-丙二醇脱氢酶的编码基因和醛基氧化酶的编码基因可通过质粒导入宿主细胞。
所述1，3-丙二醇脱氢酶的氨基酸序列具体可为GenBank Accession NumberNP_744947的自氨基末端第1位至394位氨基酸残基；所述醛基氧化酶的氨基酸序列具体可为GenBank Accession Number NP_742708的自氨基末端第1位至506位氨基酸残基。
所述1，3-丙二醇脱氢酶的编码基因序列具体可为序列表中的序列1所示；所述醛基氧化酶的编码基因序列具体可为序列表中的序列2所示。
上述微生物可为细菌。
所述微生物具体可为恶臭假单孢菌(Pseudomonas putida)，优选为恶臭假单孢菌(Pseudomonas putida)KT2440或恶臭假单孢菌(Pseudomonas putida)KT2442。
所述微生物具体可为嗜水气单孢菌(Aeromonas hydrophila)，优选为嗜水气单孢菌(Aeromonas hydrophila)ATCC7966或嗜水气单孢菌(Aeromonas hydrophila)4AK4。
所述微生物具体可为大肠杆菌(Escherichia coli)，优选为大肠杆菌(Escherichiacoli)K12MG1655或大肠杆菌(Escherichia coli)S17-1。
所述微生物具体可为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，优选为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032。
本发明对于含有3-羟基丙酸组分PHA的生产成本的降低和生产规模化提供了前提和基础。利用本发明方法以1，3-丙二醇为原料生产3-羟基丙酸，每升培养基中3-羟基丙酸的含量可达0.24-12.1g。
附图说明
图1为pZL-dhaT质粒图谱
图2为pZL-dhaT-aldD质粒图谱
图3为pEC-XK99EMOB-DhaT-AldD质粒图谱
具体实施方式
实施例1、野生型Pseudomonas putida KT2440利用1，3-丙二醇生产3HP
菌种：Pseudomonas putida KT2440(DSMZ，商品目录号：DSM6125)
培养基由如下浓度的物质组成：10g/L蛋白胨、5g/L酵母膏、10g/L氯化钠、10g/L 1，3-丙二醇，pH值为6.7-7.2。该培养基的溶剂为水。121℃条件下灭菌20分钟。
培养方法：将Pseudomonas putida KT2440(DSMZ，商品目录号：DSM6125)在无菌条件下用接种环接2环于装有50ml上述培养基的500ml三角瓶中，在13mm旋转半径、转速为225rpm/min的摇床中30℃培养48小时。实验共设三次重复，每次重复10瓶。
处理和检测：上述发酵液经离心去除菌体，取3ml上清液置于酯化管中，冰冻干燥处理。同时以未接菌的培养基作为空白对照，进行同样的冰冻干燥处理。用2ml含有3％(体积百分含量)硫酸、97％(体积百分含量)甲醇和2g/L苯甲酸(内参)的酯化液分别与冰干产物和3HP标样在100℃反应4小时。酯化产物用氯仿进行萃取，收集氯仿层，用气相色谱法检测3-羟基丙酸。具体的气相色谱检测条件如下：
气相色谱分析使用安捷伦公司的HP 6890气相色谱仪。色谱柱为HP-5毛细管柱，柱长30m，内径320μm，固定相为25nm的苯基甲基聚硅氧烷。检测器为火焰离子化检测器(Flame ionization detector，FID)。用高纯氮气作为载气，氢气作为燃气，空气为助燃气。
根据样品浓度的不同，进样量为0.4～1μl，使用安捷伦公司的微量进样器。
气相色谱分析的条件如下：
柱温：80℃开始，停留1.5min；30℃/min的速率升温到140℃，停留0min；40℃/min的速率升温到220℃，停留1.5min。总计时间为6min。
柱压：10psi开始，停留1.5min；2.5psi/min的速率升压到20psi，停留1.5min。(psi为压力单位，即磅/平方英寸，1psi＝6.89476kPa)
进样口：温度为200℃，使用分流模式，分流比为30～100。
检测器：温度为220℃，氢气流量30ml/min，空气流量400ml/min。
标样采用日本TCI公司的3-羟基丙酸(30％水溶液，3.6mol/L)。结果表明野生型Pseudomonas putida KT2440利用1，3-丙二醇生产3HP，每升培养基中3-羟基丙酸的产量为0.5g±0.1g。
实施例2、野生型Pseudomonas putida KT2442利用1，3-丙二醇生产3HP
菌种：Pseudomonas putida KT2442(清华大学)(Franklin，F.C.H.，Bagdasarian，M.，Bagdasarian，M.M.and Timmis，K.N.，1981.Molecular and functional analysis ofthe TOL plasmid pWW0 from Pseudomonas putida and cloning of genes for the entireregulated aromatic ring meta-cleavage pathway.Proceedings of the National Academy ofSciences USA 78，pp.7458-7462)
培养基由如下浓度的物质组成：10g/L蛋白胨、5g/L酵母膏、10g/L氯化钠、10g/L 1，3-丙二醇，pH值为6.7-7.2。该培养基的溶剂为水。121℃条件下灭菌20分钟。
培养方法：将Pseudomonas putida KT2442在无菌条件下用接种环接2环于装有50ml上述培养基的500ml三角瓶中，在13mm旋转半径、转速为225rpm/min的摇床中30℃培养48小时。实验共设三次重复，每次重复10瓶。
处理和检测：上述发酵液经离心去除菌体，取3ml上清液置于酯化管中，冰冻干燥处理。同时以未接菌的培养基作为空白对照，进行同样的冰冻干燥处理。用2ml含有3％(体积百分含量)硫酸、97％(体积百分含量)甲醇和2g/L苯甲酸(内参)的酯化液分别与冰干产物和3HP标样在100℃反应4小时。酯化产物用氯仿进行萃取，收集氯仿层，用气相色谱法检测3-羟基丙酸。气相色谱检测条件如实施例1。标样采用日本TCI公司所产3-羟基丙酸(30％水溶液，3.6mol/L)。结果表明野生型Pseudomonas putida KT2442利用1，3-丙二醇生产3HP，每升培养基中3-羟基丙酸的产量为0.6g±0.1g。
实施例3、野生型Aeromonas hydrophila，ATCC7966利用1，3-丙二醇生产3HP
菌种：Aeromonas hydrophila ATCC7966(美国模式典型物收集中心ATCC，商品目录号：ATCC7966)
培养基由如下浓度的物质组成：10g/L蛋白胨、5g/L酵母膏、10g/L氯化钠、10g/L 1，3-丙二醇，pH值为6.7-7.2。该培养基的溶剂为水。121℃条件下灭菌20分钟。
培养方法：将Aeromonas hydrophila，ATCC7966(美国模式典型物收集中心ATCC，商品目录号：ATCC7966)在无菌条件下用接种环接2环于装有50ml上述培养基的500ml三角瓶中，在13mm旋转半径、转速为225rpm/min的摇床中30℃培养48小时。实验共设三次重复，每次重复10瓶。
处理和检测：上述发酵液经离心去除菌体，取3ml上清液置于酯化管中，冰冻干燥处理。同时以未接菌的培养基作为空白对照，进行同样的冰冻干燥处理。用2ml含有3％(体积百分含量)硫酸、97％(体积百分含量)甲醇和2g/L苯甲酸(内参)的酯化液分别与冰干产物和3HP标样在100℃反应4小时。酯化产物用氯仿进行萃取，收集氯仿层，用气相色谱法检测3-羟基丙酸。气相色谱检测条件如实施例1。标样采用日本TCI公司所产3-羟基丙酸(30％水溶液，3.6mol/L)。结果表明：野生型Aeromonas hydrophila，ATCC7966利用1，3-丙二醇生产3HP，每升培养基中3-羟基丙酸的产量为0.8g±0.1g。
实施例4、重组E.coli S17-1′和重组恶臭假单孢菌KT2440-1利用1，3-丙二醇生产3HP
一、质粒的构建
利用引物dhaT-U和dhaT-D(序列见表1)从Pseudomonas putida KT2440的基因组DNA中克隆1，3-丙二醇脱氢酶基因(dhaT基因)(NCBI-GENEID：1042663)，其编码序列如序列表中序列1所示。用XhoI和ClaI酶切消化20小时得到酶切产物A；将pBBRlMCS2(NCBI-GENEID：U23751)载体(中国高校工业微生物资源平台CICIM，商品目录号CICIM B0035)用XhoI和ClaI酶切20小时，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，回收其中5.1kb的DNA片段得到酶切产物B。将酶切产物A和酶切产物B按照4∶1的体积比混合并加入等体积的Solution I(Takara LigationKit 2.0)，连接1小时，得到连接体系C。将连接体系C转化E.coli TOP10(北京全式金生物技术公司)感受态细胞，涂平板，培养16小时后挑取单克隆；将获得的单克隆提取质粒并酶切验证，琼脂糖凝胶电泳检测，将6.3kb的连接了dhaT基因的质粒命名为pZL-dhaT。pZL-dhaT的质粒图谱如图1所示。
利用引物aldD-U和aldD-D(序列见表1)从Pseudomonas putida KT2440的基因组DNA中克隆醛基氧化酶基因(aldD基因)(NCBI-GENEID：1044329)，其编码序列如序列表中序列2所示。用ClaI和BamHI酶切消化20小时得到酶切产物E；将重组质粒pZL-dhaT用ClaI和BamHI酶切20小时，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，回收其中6.3kb的DNA片段得到酶切产物F。将酶切产物E和酶切产物F按照4∶1的体积比混合并加入等体积的Solution I(Takara Ligation Kit 2.0)，连接1小时，得到连接体系G。将连接体系G转化E.coli TOP10(北京全式金生物技术公司)感受态细胞，涂平板，培养16小时后挑取单克隆；将获得的单克隆提取质粒并酶切验证，琼脂糖凝胶电泳检测，将7.8kb的连接了aldD基因的质粒命名为pZL-dhaT-aldD。pZL-dhaT-aldD的质粒图谱如图2所示。
二、构建重组E.coli S17-1′和重组恶臭假单孢菌KT2440-1
将质粒pZL-dhaT-aldD电转化到E.coli S17-1(美国模式典型物收集中心ATCC，商品目录号：ATCC47055)中，将得到的菌株命名为E.coli S17-1′。将E.coliS17-1′接种于LB培养基上，37℃培养13小时，同时将Pseudomonas putida KT2440(DSMZ，商品目录号：DSM6125)在30℃培养20小时，将上述两种菌液等体积混合，30℃温浴培养20分钟后涂布在含有100ug/ml氨苄青霉素和50ug/ml卡那霉素的LB平板上，培养16小时以进行接合转化，挑取单克隆进行鉴定，得到转入pZL-dhaT-aldD的恶臭假单胞菌KT2440，将其命名为恶臭假单孢菌KT2440-1。
三、重组E.coli S17-1′利用1，3-丙二醇生产3HP
培养基由如下浓度的物质组成：10g/L蛋白胨、5g/L酵母膏、10g/L氯化钠和10g/L 1，3-丙二醇，pH值为6.7-7.2。该培养基的溶剂为水。121℃条件下灭菌20分钟。
培养方法：将重组E.coli S17-1′在无菌条件下用接种环接2环于装有50ml上述培养基的500ml三角瓶中，在13mm旋转半径、转速为225rpm/min的摇床中30℃培养48小时。实验共设三次重复，每次重复10瓶。
处理和检测：上述发酵液经离心去除菌体，取5ml上清液置于酯化管中，冰冻干燥处理。同时以未接菌的培养基作为空白对照，进行同样的冰冻干燥处理。用2ml含有3％(体积百分含量)硫酸、97％(体积百分含量)甲醇和2g/L苯甲酸(内参)的酯化液分别与冰干产物和3HP标样在100℃反应4小时。酯化产物用氯仿进行萃取，收集氯仿层，用气相色谱法检测3-羟基丙酸。气相色谱检测条件如实施例1。标样采用日本TCI公司所产3-羟基丙酸(30％水溶液，3.6mol/L)。结果表明重组E.coli S17-1′利用1，3-丙二醇生产3HP，每升培养基中3-羟基丙酸的产量为1.3g±0.1g。
四、重组恶臭假单孢菌KT2440-1利用1，3-丙二醇生产3HP
培养基由如下浓度的物质组成：10g/L蛋白胨、5g/L酵母膏、10g/L氯化钠、35g/L 1，3-丙二醇，pH值为6.7-7.2。该培养基的溶剂为水。121℃条件下灭菌20分钟。
培养方法：将重组恶臭假单孢菌KT2440-1在无菌条件下用接种环接2环于装有50ml上述培养基的500ml三角瓶中，在13mm旋转半径、转速为225rpm/min的摇床中30℃培养48小时。实验共设三次重复，每次重复10瓶。
处理和检测：上述发酵液经过离心去除菌体，取5ml上清液置于酯化管中，冰冻干燥处理。同时以未接菌的培养基作为空白对照，进行同样的冰冻干燥处理。用2ml含有3％(体积百分含量)硫酸、97％(体积百分含量)甲醇和2g/L苯甲酸(内参)的酯化液分别与冰干产物和3HP标样在100℃反应4小时。酯化产物用氯仿进行萃取，收集氯仿层，用气相色谱法检测3-羟基丙酸。气相色谱检测条件如实施例1。标样采用日本TCI公司所产3-羟基丙酸(30％水溶液，3.6mol/L)。结果表明重组恶臭假单孢菌KT2440-1利用1，3-丙二醇生产3HP每升培养基中3-羟基丙酸的产量为4.3g±0.2g。
实施例5、重组大肠杆菌(Escherichia coli)K12 MG1655’利用1，3-丙二醇生产3HP
将质粒pZL-dhaT-aldD电转化到E.coli K12 MG1655(美国模式典型物收集中心ATCC，商品目录号：ATCC47076)中，将得到的菌株命名为E.coli K12 MG1655’。
培养基由如下浓度的物质组成：10g/L蛋白胨、5g/L酵母膏、10g/L氯化钠和10g/L 1，3-丙二醇，pH值为6.7-7.2。该培养基的溶剂为水。121℃条件下灭菌20分钟。
培养方法：将重组E.coli K12 MG1655’在无菌条件下用接种环接2环于装有50ml上述培养基的500ml三角瓶中，在13mm旋转半径、转速为225rpm/min的摇床中30℃培养48小时。实验共设三次重复，每次重复10瓶。
处理和检测：上述发酵液经离心去除菌体，取5ml上清液置于酯化管中，冰冻干燥处理。同时以未接菌的培养基作为空白对照，进行同样的冰冻干燥处理。用2ml含有3％(体积百分含量)硫酸、97％(体积百分含量)甲醇和2g/L苯甲酸(内参)的酯化液分别与冰干产物和3HP标样在100℃反应4小时。酯化产物用氯仿进行萃取，收集氯仿层，用气相色谱法检测3-羟基丙酸。气相色谱检测条件如实施例1。标样采用日本TCI公司所产3-羟基丙酸(30％水溶液，3.6mol/L)。结果表明重组E.coli K12 MG1655’利用1，3-丙二醇生产3HP，每升培养基中3-羟基丙酸的产量为1.1g±0.1g。
实施例6、重组嗜水气单孢菌4AK4-1利用1，3-丙二醇生产3HP
一、构建重组嗜水气单孢菌4AK4-1
将实施例4步骤二构建的重组菌E.coli S17-1′接种于LB培养基上，37℃培养13小时，同时将Aeromonas hydrophila 4AK4(清华大学)(Lee，S.H.，Oh，D.H.，Ahn，W.S.，Lee，Y.，Choi，J.，Lee，S.Y.(2000)Production ofpoly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate)by high-cell density cultivation ofAeromonas hydrophila.Biotechnol.Bioeng.67，240-244.)
在30℃培养20小时，将上述两种菌液等体积混合，30℃温浴培养20分钟后涂布在含有100ug/ml氨苄青霉素和50ug/ml卡那霉素的LB平板上培养16小时以进行接合转化，挑取单克隆进行鉴定，得到转入pZL-dhaT-aldD的重组嗜水气单孢菌4AK4-1。
二、重组嗜水气单孢菌4AK4-1利用1，3-丙二醇生产3HP
培养基由如下浓度的物质组成：10g/L蛋白胨、5g/L酵母膏、10g/L氯化钠、60g/L 1，3-丙二醇，pH值为6.7-7.2。该培养基的溶剂为水。121℃条件下灭菌20分钟。
培养方法：将重组嗜水气单孢菌4AK4-1在无菌条件下用接种环接2环于装有50ml上述培养基的500ml三角瓶中，在13mm旋转半径、转速为225rpm/min的摇床中30℃培养48小时。实验共设三次重复，每次重复10瓶。
处理和检测：上述发酵液经离心去除菌体，取5ml上清液置于酯化管中，冰冻干燥处理。同时以未接菌的培养基作为空白对照，进行同样的冰冻干燥处理。用2ml含有3％(体积百分含量)硫酸、97％(体积百分含量)甲醇和2g/L苯甲酸(内参)的酯化液分别与冰干产物和3HP标样在100℃反应4小时。酯化产物用氯仿进行萃取，收集氯仿层，用气相色谱法检测3-羟基丙酸。气相色谱检测条件如实施例1。标样采用日本TCI公司所产3-羟基丙酸(30％水溶液，3.6mol/L)。结果表明重组嗜水气单孢菌4AK4-1利用1，3-丙二醇生产3HP，每升培养基中3-羟基丙酸的产量为12.1g±0.2g。
实施例7、重组谷氨酸棒杆菌ATCC13032-1利用1，3-丙二醇生产3HP
一、质粒构建
利用引物mobR-U和mobR-D(序列见表1)从pK18MobSacB(Sch
fer，A.，Tauch，A.，Jger，W.，Kalinowski，J.，Thierbach，G.，and Pühler，A.1994 Gene Amst.145，69-73)载体(美国模式典型物收集中心ATCC，商品目录号：ATCC87097)中克隆Mob序列，用NdeI和EcoRV酶切20小时，得到酶切产物H；将pEC-XK99E(DSMZ，商品目录号：DSM13455)(NCBI-GENEID：AY219683)载体用NdeI和EcoRV酶切20小时，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，回收其中5.8kb的DNA片段得到酶切产物I。将酶切产物H和酶切产物I按照4∶1的体积比混合并加入等体积的Solution I(Takara Ligation Kit 2.0)，连接1小时，得到连接体系J。将连接体系J转化到E.coli TOP10(北京全式金生物技术公司)感受态细胞，涂平板，培养16小时后挑取单克隆；将获得的单克隆提取质粒并酶切验证，琼脂糖凝胶电泳检测，将6.4kb的连接了Mob序列的质粒命名为K。
人工合成多克隆位点Linker序列(序列3)。利用Takara公司的LA Taq withGC Buffer和引物mcs-U、mcs-D(序列见表1)以Linker序列为模板，PCR构建含poly-A尾巴的Linker序列。将PCR产物与pMD18-T Simple载体(Takara公司)按照9∶1的体积比混合，加入等体积的pMD18-T Simple载体(Takara公司)附带的Solution I，16℃连接1小时，得到连接体系L。将连接体系L转化到E.coli TOP10(北京全式金生物技术公司)感受态细胞，涂平板，培养16小时后挑取单克隆；将获得的单克隆提取质粒并酶切验证，琼脂糖凝胶电泳检测，将2.8kb的连接了Linker序列的质粒命名为M。
将质粒pZL-dhaT-aldD用XhoI和BamHI酶切20小时，琼脂糖凝胶电泳回收其中2.Tkb的包含dhaT和aldD基因序列的DNA片段，得到酶切产物N；将质粒M用XhoI和BamHI酶切20小时，琼脂糖凝胶电泳回收其中2.7kb的DNA片段，得到酶切产物O。将酶切产物N和酶切产物O按照4∶1的体积比混合并加入等体积的Solution I(Takara Ligation Kit 2.0)，连接1小时，得到连接体系P。将连接体系P转化到E.coli TOP10(北京全式金生物技术公司)感受态细胞，涂平板，培养16小时后挑取单克隆；将获得的单克隆提取质粒并酶切验证，琼脂糖凝胶电泳检测，将5.4kb的连接了dhaT和aldD基因序列以及Linker序列的DNA片段的质粒命名为Q。
将质粒Q用SacI和BamHI酶切20小时，琼脂糖凝胶电泳回收其中2.7kb的包含dhaT和aldD基因序列的DNA片段，得到酶切产物R；将质粒K用SacI和BamHI酶切20小时，琼脂糖凝胶电泳回收其中6.4kb的DNA片段得到酶切产物S；将酶切产物R和酶切产物S按照4∶1的体积比混合并加入等体积的Solution I(TakaraLigation Kit 2.0)，连接1小时，得到连接体系T。将连接体系T转化到E.coli TOP10(北京全式金生物技术公司)感受态细胞，涂平板，培养16小时后挑取单克隆；将获得的单克隆提取质粒并酶切验证，琼脂糖凝胶电泳检测，将9.1kb的连接了dhaT和aldD基因序列、Linker序列和Mob序列的DNA片段的质粒命名为pEC-XK99EMOB-DhaT-AldD。pEC-XK99EMOB-DhaT-AldD的质粒图谱如图3所示。
二、构建重组谷氨酸棒杆菌ATCC 13032-1
将质粒pEC-XK99EMOB-DhaT-AldD电转化到E.coli S17-1(美国模式典型物收集中心ATCC，商品目录号：ATCC47055)中，将得到的菌株命名为E.coliS17-1″。将E.coli S17-1″接种于LB培养基上，37℃培养13小时，同时将Corynebacterium glutamicum ATCC13032(美国模式典型物收集中心ATCC，商品目录号：ATCC13032)在30℃培养20小时，将上述两种菌液等体积混合，30℃温浴培养12小时后涂布在含有50ug/ml萘啶酮酸和50ug/ml卡那霉素的LB平板上，再培养16小时以进行接合转化，挑取单克隆进行鉴定，得到转入pEC-XK99EMOB-DhaT-AldD的重组谷氨酸棒杆菌ATCC 13032-1。
三、重组谷氨酸棒杆菌ATCC13032-1利用1，3-丙二醇生产3HP
培养基由如下浓度的物质组成：10g/L蛋白胨、5g/L酵母膏、10g/L氯化钠、5g/L 1，3-丙二醇，pH值为6.7-7.2。该培养基的溶剂为水。121℃条件下灭菌20分钟。
培养方法：将重组谷氨酸棒杆菌ATCC 13032-1在无菌条件下用接种环接2环于装有50ml上述培养基的500ml三角瓶中，在13mm旋转半径、转速为225rpm/min的摇床中30℃培养48小时。
处理和检测：上述发酵液经离心去除菌体，取5ml上清液置于酯化管中，冰冻干燥处理。同时以未接菌的培养基作为空白对照，进行同样的冰冻干燥处理。用2ml含有3％(体积百分含量)硫酸、97％(体积百分含量)甲醇和2g/L苯甲酸(内参)的酯化液分别与冰干产物和3HP标样在100℃反应4小时。酯化产物用氯仿进行萃取，收集氯仿层，用气相色谱法检测3-羟基丙酸。气相色谱检测条件如实施例1。标样采用日本TCI公司所产3-羟基丙酸(30％水溶液，3.6mol/L)。标样采用日本TCI公司的3-羟基丙酸(30％水溶液，3.6mol/L)。结果表明重组谷氨酸棒杆菌ATCC13032-1利用1，3-丙二醇生产3HP，每升培养基中3-羟基丙酸的产量为0.24g±0.1g。
引物列表：
| 引物编号 | 序列 |
| dhaT-U | GCTCTCGAGCTAATGACAACAATTGAGCA |
| dhaT-D | AAGATCGATTTACGCGACGAAGTGGTAAG |
| aldD-U | CAGATCGATATGCGTTATGCACATCCCGG |
| aldD-D | TTTGGATCCCTAGAAGAAGCCCAGCGGAT |
| mobR-U | TTAACATATGAGTCCACGACGCCCGTGATTTTGTA |
| mobR-D | TTAAGATATCCTTTGGCATCGTCTCTCGCCTGTCC |
| mcs-U | GAGCTCACTCGAGACTTGAGGAAGCCCAGCATGACAT |
| mcs-D | GATACTGGATCCGGGTTTACACGGAGTTCTATCG |
序列表
Claims (2)
1.一种生产3-羟基丙酸的方法，是以1,3-丙二醇为原料，用表达1,3-丙二醇脱氢酶和醛基氧化酶的微生物生产3-羟基丙酸；
所述微生物为恶臭假单孢菌（Pseudomonas putida）、嗜水气单孢菌（Aeromonashydrophila）、大肠杆菌（Escherichia coli）或谷氨酸棒杆菌（Corynebacteriumglutamicum）；
所述恶臭假单孢菌（Pseudomonas putida）为恶臭假单孢菌（Pseudomonasputida）KT2440或恶臭假单孢菌（Pseudomonas putida）KT2442；
所述嗜水气单孢菌（Aeromonas hydrophila）为嗜水气单孢菌（Aeromonashydrophila）ATCC7966或嗜水气单孢菌（Aeromonas hydrophila）4AK4-1；
所述大肠杆菌（Escherichia coli）为大肠杆菌（Escherichia coli）K12MG1655＇或大肠杆菌（Escherichia coli）S17-1＇；
所述谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）为谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）ATCC13032-1；
所述大肠杆菌（Escherichia coli）S17-1＇的制备方法如下：
将序列表中序列1所示1,3-丙二醇脱氢酶基因用XhoI和ClaI酶切，得到酶切产物A；将pBBR1MCS2载体用XhoI和ClaI酶切，回收其中5.1kb的DNA片段得到酶切产物B；将酶切产物A和酶切产物B连接，得到重组载体pZL-dhaT；
将序列如序列表中序列2所示醛基氧化酶基因用ClaI和BamHI酶切，得到酶切产物E；将重组载体pZL-dhaT用ClaI和BamHI酶切，回收其中6.3kb的DNA片段，得到酶切产物F；将酶切产物E和酶切产物F连接，得到重组载体pZL-dhaT-aldD；pZL-dhaT-aldD的质粒图谱如图2所示；
将质粒pZL-dhaT-aldD电转化到E.coli S17-1中，将得到的菌株命名为大肠杆菌（Escherichia coli）S17-1＇；
所述大肠杆菌（Escherichia coli）K12MG1655＇的制备方法如下：
将所述重组载体pZL-dhaT-aldD电转化到E.coli K12MG1655中，将得到的菌株命名为大肠杆菌（Escherichia coli）K12MG1655＇；
所述嗜水气单孢菌（Aeromonas hydrophila）4AK4-1的制备方法如下：
将大肠杆菌（Escherichia coli）S17-1＇接种于LB培养基上，37℃培养13小时，同时将Aeromonas hydrophila 4AK4在30℃培养20小时，将上述两种菌液等体积混合，30℃温浴培养20分钟后涂布在含有100ug/ml氨苄青霉素和50ug/ml卡那霉素的LB平板上培养16小时以进行接合转化，挑取单克隆进行鉴定，得到转入pZL-dhaT-aldD的重组嗜水气单孢菌4AK4-1；
所述谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）ATCC13032-1的制备方法如下：
利用引物mobR-U和mobR-D从pK18MobSacB载体中克隆Mob序列，用NdeI和EcoRV酶切，得到酶切产物H；将pEC-XK99E载体用NdeI和EcoRV酶切，回收其中5.8kb的DNA片段得到酶切产物I；将酶切产物H和酶切产物I连接，得到6.4kb的连接了Mob序列的质粒，命名为K；
以序列表中序列3所示Linker为模板，用引物mcs-U、mcs-D进行PCR构建含poly-A尾巴的Linker序列；将PCR产物与pMD18-T Simple载体连接，得到2.8kb的连接了Linker序列的质粒，命名为M；
将质粒pZL-dhaT-aldD用XhoI和BamHI酶切，回收其中2.7kb的包含dhaT和aldD基因序列的DNA片段，得到酶切产物N；将质粒M用XhoI和BamHI酶切，琼脂糖凝胶电泳回收其中2.7kb的DNA片段，得到酶切产物O；将酶切产物N和酶切产物O连接，得到5.4kb的连接了dhaT和aldD基因以及Linker的DNA片段的质粒，命名为Q；
将质粒Q用SacI和BamHI酶切，回收其中2.7kb的包含dhaT和aldD基因序列的DNA片段，得到酶切产物R；将质粒K用SacI和BamHI酶切，回收其中6.4kb的DNA片段得到酶切产物S；将酶切产物R和酶切产物S连接，得到9.1kb的连接了dhaT和aldD基因序列、Linker序列和Mob序列的DNA片段的质粒，命名为pEC-XK99EMOB-DhaT-AldD；pEC-XK99EMOB-DhaT-AldD的质粒图谱如图3所示；
将质粒pEC-XK99EMOB-DhaT-AldD转化到E.coli S 17-1中，将得到的菌株命名为E.coli S 17-1″；
将E.coli S17-1″接种于LB培养基上，37℃培养13小时，同时将Corynebacterium gutamicum ATCC13032在30℃培养20小时，将上述两种菌液等体积混合，30℃温浴培养12小时后涂布在含有50ug/ml萘啶酮酸和50ug/ml卡那霉素的LB平板上，再培养16小时以进行接合转化，挑取单克隆进行鉴定，得到转入pEC-XK99EMOB-DhaT-AldD的重组谷氨酸棒杆菌ATCC13032-1；
mobR-U的序列为TTAACATATGAGTCCACGACGCCCGTGATTTTGTA；
mobR-D的序列为TTAAGATATCCTTTGGCATCGTCTCTCGCCTGTCC；
mcs-U的序列为GAGCTCACTCGAGACTTGAGGAAGCCCAGCATGACAT；
mcs-D的序列为GATACTGGATCCGGGTTTACACGGAGTTCTATCG。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述1,3-丙二醇脱氢酶的氨基酸序列是GenBank Accession Number NP_744947的自氨基末端第1位至394位氨基酸残基；所述醛基氧化酶的氨基酸序列是GenBank Accession Number NP_742708的自氨基末端第1位至506位氨基酸残基。
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