CN102174542B - 产3-羟基丙酸均聚物和/或3-羟基丙酸共聚物的重组菌及其应用 - Google Patents
产3-羟基丙酸均聚物和/或3-羟基丙酸共聚物的重组菌及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种产3-羟基丙酸均聚物和/或3-羟基丙酸共聚物的重组菌及其应用。本发明提供的重组菌的一种构建方法，包括如下步骤：将1，3-丙二醇脱氢酶编码基因、醛脱氢酶编码基因、3-羟基丙酸辅酶A连接酶编码基因和PHA聚合酶编码基因导入出发菌，得到重组菌。本发明的实验证明，该工程菌可高效表达3-羟基丙酸辅酶A连接酶及PHA聚合酶基因，使3-羟基丙酸经过3-羟基丙酰辅酶A最终被聚合为3-羟基丙酸均聚物(P(3HP))。小型发酵罐实验表明将本发明的工程菌在6L发酵罐中发酵后，P(3HP)的产量最高可达8.9g/L以上，P(3HP)最高可达细胞干重的91.5％。且本发明的生产工艺简单，成本低廉，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明涉及一种基因工程菌，尤其涉及一种产3-羟基丙酸均聚物和/或3-羟基丙酸共聚物的重组菌及其应用。
背景技术
聚羟基烷酸(Polyhydroxyalkanoates，PHAs)是由许多微生物在不平衡生长条件下在胞内积累的，具有热可塑性、生物相容性、光学活性和压电特性等优良性能的一类聚合物，在自然界中可被微生物完全降解生成水和二氧化碳。它完全有可能取代日益严重污染环境的化学塑料，在医学、药学、精细化学等方面也极具有应用价值。其结构式如式I所示：
根据单体的种类，PHA分为同聚物(均聚物，homopolymer)和共聚物(copolymer)两类：前者只有一种单体；后者含有两种或两种以上的单体。
聚3-羟基丙酸是一种新型生物可降解高分子聚合物，它具有良好的生物降解性和生物相容性，而且高分子量的P(3HP)具有很高的机械强度和拉伸强度(＞400MPa)，以及具有较大的断裂伸长率等优异性能。目前其合成主要采用生物发酵或者两步法开环聚合得到。相对于纯化学合成方法如开环聚合途径来合成有机物，生物合成方法具有经济消耗低，污染少，反应条件宽松(37℃和标准大气压)等优点。但由于3HP的特殊结构，至今国际上关于P(3HP)的合成研究报道仍然较少。
目前，已有研究用微生物法以甘油为底物合成P(3HP)，该途径克隆了甘油脱水酶基因(dhaBlCb)，丙醛脱氢酶(pduPSe)基因及PHA聚合酶基因(phaClCn)。此为首例采用微生物方法以甘油为前体合成均聚P(3HP)的报道，最终积累的P(3HP)仅占细胞干重的12％，且需要二步培养法，生产工艺较为复杂。
发明内容
本发明的一个目的是提供重组菌的一种构建方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：将1，3-丙二醇脱氢酶编码基因、醛脱氢酶编码基因、3-羟基丙酸辅酶A连接酶编码基因和PHA聚合酶编码基因导入出发菌，得到重组菌。
所述1，3-丙二醇脱氢酶的氨基酸序列为序列表中序列10；
所述醛脱氢酶的氨基酸序列为序列表中序列11；
所述3-羟基丙酸辅酶A连接酶的氨基酸序列为序列表中序列12；
所述PHA聚合酶的氨基酸序列为序列表中序列13。
所述1，3-丙二醇脱氢酶基因的核苷酸序列为序列表中序列1；
所述醛脱氢酶基因的核苷酸序列为序列表中序列2；
所述3-羟基丙酸辅酶A连接酶基因的核苷酸序列为序列表中序列3；
所述PHA聚合酶基因的核苷酸序列为序列表中序列4；
所述出发菌为大肠杆菌，具体为Escherichia coli Trans5α、Escherichia coliTrans1-T1或Escherichia coli S17-1。但不限于大肠杆菌(Escherichia coli)。
所述1，3-丙二醇脱氢酶编码基因和所述醛脱氢酶编码基因通过重组载体A导入所述出发菌中；
所述3-羟基丙酸辅酶A连接酶编码基因和所述PHA聚合酶编码基因通过重组载体B导入所述出发菌中；
所述重组载体A为将启动子PRe插入pZL-dhaT-aldD的ApaI和Xhol识别位点间得到的载体；
所述重组载体B为将3-羟基丙酸辅酶A的编码基因插入到pBHR68的StuI和EcoRI识别位点间得到的载体。
所述启动子PRe的核苷酸序列为序列表中的序列5。
由所述的方法构建的重组菌。
本发明的另一个目的是提供一种生产3-羟基丙酸均聚物和/或3-羟基丙酸共聚物的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：发酵所述的重组菌，收集发酵产物，即得到3-羟基丙酸均聚物和/或3-羟基丙酸共聚物。
所述发酵温度为30℃-40℃；所述发酵的溶氧量为10％-30％(体积百分含量)；所述发酵培养基的pH为6-8；
所述发酵温度具体为30℃、37℃或40℃；所述发酵的溶氧量具体为10％、20％或30％(体积百分含量)；所述发酵培养基的pH具体为6、7或8。
所述发酵过程中，在所述重组菌进入稳定期起至发酵结束，向所述发酵培养基中分批补加1，3-丙二醇和/或1，4-丁二醇，使每L发酵产物中的1，3-丙二醇或1，4-丁二醇含量均不高于30g。
所述分批发酵为当细菌生长进入稳定期，加入1，3-丙二醇3瓶(共含30g 1，3-丙二醇，溶于15ml水)。此后，每间隔4h取样，当1，3-丙二醇浓度低于5g/L时，补加1，3-丙二醇10g。
也可采用流加的方式，将1，3-丙二醇溶液加入发酵液中，采用流加方法时，流加速度按照每L培养基1～10mL/h(丙二醇溶液配置方法如上所述)。
所述每L发酵产物中的1，3-丙二醇或1，4-丁二醇含量均为1g/L-30g/L，
所述每L发酵产物中的1，3-丙二醇或1，4-丁二醇含量均具体为1g/L-10g/L、10g/L-20g/L或20-30g/L；
所述发酵时间为32h-50h，所述发酵时间具体为32h、44h或50h；所述3-羟基丙酸共聚物为3-羟基丙酸和4-羟基丁酸共聚物。
可采用生物工程领域中常用的方法将含有1，3-丙二醇脱氢酶、醛脱氢酶、3-羟基丙酸辅酶A连接酶及PHA聚合酶基因的表达载体转化假单胞菌宿主菌，如接合转化法、电击转化法、氯化锂转化法或原生质体转化法等，优选为接合转化法。
可采用大肠杆菌的常规培养条件对重组大肠杆菌进行培养。
在发酵罐发酵中，可采用如下的LB培养基进行发酵：罐底成分：5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl，其余为水；也可采用适用与本发明工程菌的改良LB培养基(LB’)配方：10g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl，其余为水。本发明中，还可使用TB培养基进行发酵，罐底成分：24g/L酵母提取物，12g/L蛋白胨，4ml/L甘油，0.017mol/L KH2PO4，0.072mol/L K2HPO4。(溶液先在15psi高压下蒸汽灭菌20min，当冷至60℃或60℃以下时加入无菌的KH2PO4水溶液，K2HPO4水溶液)。
在实际培养过程中，可向上述培养基中再添加一定浓度的抗生素以维持质粒的稳定性，如50μg/mL氨苄青霉素和硫酸卡那霉素。
本发明的第三个目的是提供一种生产3-羟基丙酸均聚物和/或3-羟基丙酸共聚物的载体组合物。本发明提供的组合物，由所述的方法中的重组载体A和重组载体B组成；所述3-羟基丙酸共聚物为3-羟基丙酸和4-羟基丁酸共聚物。
本发明的实验证明，本发明提供了一种含有1，3-丙二醇脱氢酶基因，醛脱氢酶基因，3-羟基丙酸辅酶A连接酶及PHA聚合酶的专用表达工程菌，该工程菌可高效表达1，3-丙二醇脱氢酶及醛脱氢酶基因，在脱氢酶的作用下转化底物1，3-丙二醇为3-羟基丙酸，转化效率较高。同时，该工程菌也高效表达3-羟基丙酸辅酶A连接酶及PHA聚合酶基因，使3-羟基丙酸经过3-羟基丙酰辅酶A最终被聚合为3-羟基丙酸均聚物(P(3HP))。小型发酵罐实验表明将本发明的工程菌在6L发酵罐中发酵后，P(3HP)的产量最高可达8.9g/L以上，P(3HP)最高可达细胞干重的91.5％。且本发明的生产工艺简单，成本低廉，应用前景广阔。
附图说明
图1为1，3-丙二醇、3-羟基丙酸、3-羟基丙酸均聚物和3-羟基丙酸共聚物的转化关系示意图
图2为质粒pZQ01和pZQ03的结果示意图
图3为1H核磁共振NMR检测细胞中均聚物
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
所用酶试剂均购自MBI Fermentas公司，提取质粒所用的试剂盒购自北京博迈德科技发展公司，回收DNA片段所用的试剂盒购自美国omega公司，相应的操作步骤按照产品说明书进行；所有培养基如无特别说明均用去离子水配制。
本发明中的溶氧是6升发酵罐(NBS Bioflo 3000，New Brunswick Scientific，U.S.A.)探头获得的结果，即指在1大气压，25℃时，按照C*＝0.2mmol/L(发酵液中)来计算溶氧率。
培养基配方：
1)摇瓶发酵培养基：
LB培养基含：5g/L酵母提取物(购自英国OXID公司，产品目录号LP0021)，10g/L蛋白胨(购自英国OXID公司，产品目录号LP0042)，10g/L NaCl，其余为水。调pH值至7.0-7.2，高压蒸汽灭菌。
LB’培养基含：10g/L酵母提取物(购自英国OXID公司，产品目录号LP0021)，10g/L蛋白胨(购自英国OXID公司，产品目录号LP0042)，10g/L NaCl，其余为水。调pH值至7.0-7.2，高压蒸汽灭菌。
TB培养基配置方法：将下列组分溶解在0.9L水中：蛋白胨(购自英国OXID公司，产品目录号LP0042)12g，酵母提取物(购自英国OXID公司，产品目录号LP0021)24g，甘油4ml。各组分溶解后高压灭菌。冷却到60℃，再加100ml灭菌的170mmol/LKH2PO4，0.72mol/L K2HPO4的溶液(2.31g的KH2PO4和12.54gK2HPO4溶在足量的水中，使终体积为100ml。高压灭菌或用0.22um的滤膜过滤除菌)。K2HPO4，KH2PO4均购自国药集团化学试剂有限公司，目录号分别为10017528，1017628。
2)6升发酵罐(NBS Bioflo 3000，New Brunswick Scientific，U.S.A.)：初始培养基体积为3L，用LB’和TB培养基进行发酵实验。
采用LB’为培养基的罐底成分如下：10g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/LNaCl，其余为水。
采用TB为培养基的罐底成分如下：24g/L酵母提取物，12g/L蛋白胨，4ml/L甘油，0.017mol/L KH2PO4，0.072mol/L K2HPO4(溶液先在15psi高压下蒸汽灭菌20min，当冷至60℃或60℃以下时加入无菌的KH2PO4，K2HPO4溶液)。
以上发酵补料成分：1，3-丙二醇溶液和浓缩10倍的LB’或TB培养基。通过液相色谱监测保证罐内1，3-丙二醇浓度维持在10g/L以下，通过监测细胞生长情况补充对应的培养基以维持细胞良好生长。
在实际培养过程中，可向上述培养基中再添加一定浓度的抗生素以维持质粒的稳定性，如50μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL硫酸卡那霉素。
1，3-丙二醇、3-羟基丙酸、3-羟基丙酸均聚物和3-羟基丙酸共聚物(3-羟基丙酸和4-羟基丁酸共聚物)的结构式及转化关系见图1所示。
实施例1、表达工程菌的构建
一、表达载体pZQ03的构建
1)提取真氧产碱杆菌(Ralstonia eutropha H16)(ATCC编号：17699，可购自美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection))的基因组，以R.eutrophaH16基因组为模板，以PReSense和PReAntisense为引物，用pfu酶进行PCR反应扩增目的启动子PRe，并在片段两端设计引入酶切位点。
PReSense： 5’ATAAGTCGACCTCCTATTTGATTGTCTCTCTGCCGTC 3’(序列6)
SalI
PReAntisense：5’TTAAGGGCCCGATGCGAGCGCTGCATACCGTC 3’(序列7)
ApaI
PCR反应条件：
先94℃预变性8min；再94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸1min24sec，29次循环；然后72℃后延伸10min。
PCR扩增目的片断(20μL体系)
模版DNA 0.4μL
引物1 0.5μL
引物2 0.5μL
pfu buffer 2.0μL
pfu酶 0.2μL
dNTP 1.5μL
ddH2O 14.9μL
PCR扩增体系配制时，DNA聚合酶最后加入。
得到的PCR产物，经过测序，该PCR产物具有序列表中的序列5，序列表中的序列5为启动子PRe的核苷酸序列；序列5由410个核苷酸组成。
用ApaI和XhoI双酶切质粒pZL-dhaT-aldD(Zhang，L；Shi，ZY；Wu，Q，et al.Microbial production of 4-hydroxybutyrate，poly-4-hydroxybutyrate，andpoly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate)by recombinant microorganisms，Applied Microbiology and Biotechnology，2009，84(5)，909-916，公众可从清华大学获得。)得到酶切后载体大片段，与经ApaI和SalI(SalI与XhoI为同尾酶)酶切上述PCR产物得到的片段连接，得到连接产物，转化到大肠杆菌E.coliTop10中，得到转化子，提取转化子的质粒，送去测序，结果为该质粒为将序列表中的序列5插入pZL-dhaT-aldD的ApaI和Xhol酶切位点得到的载体，该质粒记作pZQ01，该质粒中还含有1，3-丙二醇脱氢酶基因(dhaT，核苷酸序列为序列1，氨基酸序列为序列10，NCBI GenBank号为NC_002947.所述的dhaT(REGION：3194879..3196063))，醛脱氢酶基因(aldD，核苷酸序列为序列2，氨基酸序列为序列11，GenBank号为PP_0545所述的(aldD，REGION：631918..633438)。该质粒的结果示意图见图2的左图。
2)提取橙色绿屈挠菌(Chloroflexus aurantiacus)(ATCC编号：29365，可购自美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection))的基因组，以Chloroflexus aurantiacus基因组为模板，以pcs Sense和pcs Antisense为引物，用pfu酶进行PCR反应扩增目的基因pcs，并在片段前加入SD序列(Shine-Dalgarnosequence)，片段末尾加入终止密码子UAG。
引物为：
pcs Sense：5’TATACAGGCCT 
ATGGTCGATG 3’(序列8)(请核实序列，
StuI SD
pcs Antisense：5’GCGTGAATTC 
TTCGATGATCTGCTGC 3’(序列9)
EcoRI终止密码子
PCR反应条件：
1.94℃预变性8min；
2.94℃变性30sec；
3.62±2℃退火30sec；
4.72℃延伸1min24sec；
5.重复步骤2-4，29次循环；
6.72℃后延伸10min。
PCR扩增目的片断(20μL体系)
模版DNA 0.4μL
引物1 0.5μL
引物2 0.5μL
pfu buffer 2.0μL
pfu酶 0.2μL
dNTP 1.5μL
ddH2O 14.9μL
PCR扩增体系配制时，DNA聚合酶最后加入。
得到的PCR产物，经过测序，该PCR产物具有序列表中序列3所示的核苷酸，序列表中序列3为3-羟基丙酸辅酶A连接酶编码基因pcs的核苷酸序列；序列3由2571个核苷酸组成，为NCBI GenBank号为AF445079所述的丙酰-辅酶A合成酶基因中编码3-羟基丙酸辅酶A连接酶结构域的片段基因，3-羟基丙酸辅酶A连接酶的氨基酸序列为序列表中的序列12。
pBHR68记载在Spiekermann P，Rehm BHA，Kalscheuer R，BaumeisterD，Steinbüchel A(1999)A sensitive，viable-colony staining method using Nilered for direct screening of bacteria that accumulate polyhydroxyalkanoic acidsand other storage com-pounds.Arch Microbiol 171：73-80，中，公众可从清华大学获得，质粒中含有来源于R.eutropha的phaC2基因，和phaA，phaB基因。
用StuI和EcoRI酶切pBHR68(将phaA，phaB基因切除)，回收载体大片段(含有phaC2基因的载体片段)，与经过同样酶切的PCR产物连接，得到连接产物，将连接产物通过化学转化方法转化入E.coli Top10中，挑取在LB-Km固体培养平板上长出的单克隆，将其接种到LB-Km液体培养基中，在37℃、200rpm下摇床培养12h，提取质粒，并用限制性内切酶StuI和EcoRI对质粒进行酶切鉴定，阳性质粒经酶切后可产生大小约为2.6kb及5.0kb的DNA片断，将酶切鉴定的阳性质粒送去测序，结果为该质粒为将序列表中的序列3插入pBHR68的StuI和EcoRI酶切位点得到的载体，该质粒记作pZQ03。该质粒还含有PHA聚合酶基因(phaC，核苷酸序列为序列4，氨基酸序列为序列表中序列13，NCBI GenBank号为NC_008313所述的pahC2(REGION：2175046..2176821)。该质粒的结果示意图见图2的右图。
二、表达工程菌E.coli Trans1-T1(pZQ01，pZQ03)，E.coli Trans5α(pZQ01，pZQ03)及E.coli S17-1(pZQ01，pZQ03)的获得
将步骤一构建的表达载体pZQ01和pZQ03用化学转化法同时转入到E.coliTrans1-T1(购自北京全式金生物技术有限公司，产品目录号：CD51。)中，得到重组菌1；
将步骤一构建的表达载体pZQ01和pZQ03用化学转化法同时转入到E.coliTrans5α(购自全式金公司，目录号CD201)中，得到重组菌2；
将步骤一构建的表达载体pZQ01和pZQ03用电转化法同时导入到E.coli S17-1(ATCC编号：47055，可购自美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection))中，得到重组菌3；
分别将重组菌1、2、3涂布于LB-Amp，Km的固体培养平板上，在37℃、200rpm下摇床培养12h；分别挑取在LB-Amp，Km固体培养平板上长出的单克隆，将其接种到LB-Amp，Km液体培养基中，在37℃、200rpm下摇床培养12h。
分别从重组菌1、2、3中提取质粒，分别用引物(PReSense和PReAntisense、pcsSense和pcs Antisense)进行PCR验证，结果分别均得到约400bp(启动子PRe)和2.6kb(pcs)的片段，为阳性重组菌，说明这两种质粒都已被成功转入到上述菌株中。
同时将上述的各种阳性重组菌均提取质粒，分别用ApaI和Xhol双酶切、StuI和EcoRI双酶切，分别得到约400bp(启动子PRe大小)和2.6k(pcs大小)片段，进一步证明pZQ01和pZQ03已经被成功转入上述菌中；
将上述各种阳性重组菌分别命名为E.coliTrans1-T1(pZQ01，pZQ03)，E.coliTrans5α(pZQ01，pZQ03)和E.coli S17-1(pZQ01，pZQ03)。
按照上述方法将pZQ03分别转入E.coliTrans1-T1(pZQ03)，E.coli Trans5α(pZQ03)和E.coliS17-1(pZQ03)得到E.coliTrans1-T1(pZQ03)，E.coliTrans5α(pZQ03)和E.coliS17-1(pZQ03)，经过PReSense和PReAntisense为引物的PCR验证，没有目的片段，用pcs Sense和pcs Antisense为引物进行PCR，含有2.6k(pcs大小)片段，说明这些菌株中含有pZQ03而不含有pZQ01。
按照上述方法将pZQ01分别转入E.coliTrans1-T1(pZQ01)，E.coliTrans5α(pZQ01)和E.coliS17-1(pZQ01)得到E.coliTrans1-T1(pZQ01)，E.coliTrans5α(pZQ01)和E.coliS17-1(pZQ01)，经过PReSense和PReAntisense为引物的PCR验证，得到400bp片段，用pcs Sense和pcs Antisense为引物进行PCR，没有目的片段，说明这些菌株中含有pZQ01而不含有pZQ03。
实施例2、用表达工程菌生产3-羟基丙酸均聚物P(3HP)的实验
一、摇瓶培养摸索试验
1、以LB为培养基生产3-羟基丙酸均聚物P(3HP)
表达工程菌E.coliTrans1-T1(pZQ01，pZQ03)，E.coliTrans5α(pZQ01，pZQ03)和E.coliS17-1(pZQ01，pZQ03)分别用LB培养基，在37℃，200rpm过夜培养；然后按5％接种量(v/v)，分别接种至100mL含1，3-丙二醇(1，3-PDO)的LB培养基(含：5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl，10g/L 1，3-PDO，其余为水，pH 7.0-7.2)，37℃，200rpm，摇瓶培养48小时，得到菌液。每个菌种设置三组平行。运用核磁共振谱仪NMR(JEOL，ECA-600SCC)和气相色谱仪(GC，Hewlett-Packard model 6890)验证细胞中均聚物的积累；运用气相色谱仪对细胞中均聚物或共聚物进行定量分析；运用液相色谱仪(HPLC，SpectroSYSTEM，ThermoSeparation Products，USA)检测1，3-PDO的消耗和3HP的积累。
液相检测色谱柱为Bio-rad公司有机酸柱，Aninex HPX-87X Ion Exclusion Column(300×7.8mm)。流动相为5mM H2SO4，流速为0.5ml/min。进样量为10μl。检测器使用美国SPECTRA SYSTEM公司的RI-150示差检测器。
样品检测：取1.5ml菌液，10000rpm离心后取上清液，用0.45mm滤膜过滤后作为色谱的样品(1，3-PDO和3HP是存在于细胞外的上清液中)。
标准曲线测定：3HP(日本东京化成工业株式会社(TCI)，产品目录号H0297)或1，3-PDO(国药集团化学试剂有限公司，产品目录号30157194)的标样均为体积含量为30％的水溶液。将3HP或1，3-PDO的标准样品稀释不同倍数，以0.5ml/min的流速，通过HPLC检测，并绘制标准曲线。
3HP标样的出峰时间为第18.5min，1，3-PDO标样的出峰时间为第23.8min。
结果为表达工程菌E.coliTrans1-T1(pZQ01，pZQ03)，E.coliTrans5α(pZQ01，pZQ03)和E.coliS17-1(pZQ01，pZQ03)的菌液均有第18.5min的峰值，证明这些菌株均能产生3HP。根据标样定量检测出3种表达工程菌的培养基中3HP和1，3-PDO的浓度，用于监测培养基中底物1，3-PDO和中间产物3HP的变化从而适当的补加底物。
气相检测3-羟基丙酸均聚物的方法：
设定炉温为80℃，进样器温度为200℃，检测器温度为220℃，柱头压力为0.25Mpa，程序升温条件为：80℃停留1.5分钟，以30℃/min的速度升温至140℃，接着以40℃/min的速度升温至220℃并在此温度保持0.5分钟。样品的进样量为1μl，使用安捷伦公司生产的微量进样器。
气相样品准备：取40-70mg待测样品的干细胞(菌液10000rpm，10min条件下离心，所得细胞沉淀水洗一次之后，冰干，得到干细胞，均聚物产于细胞中)，加2ml氯仿，2ml酯化液(纯甲醇中含3％(v/v)的浓硫酸及2g/L苯甲酸作内标)于酯化管中，加盖密封后于100下加热4小时。冷却后加入1ml蒸馏水，充分振荡后静置，待氯仿相与水相完全分层后，取下层氯仿相1μl注入气相色谱仪(HP公司HewlettPackard 6890)中进行色谱分析。依照HP公司Hewlett Packard 6890气相色谱仪的说明书操作气相色谱仪。
标准样品准备：取30ul左右的30％浓度(体积浓度)3HP(日本东京化成工业株式会社(TCI)，产品目录号H0297)水溶液于酯化管中，加2ml氯仿，2ml酯化液，加盖密封后在100℃进行酯化。在本实施例中的气相检测条件下，标准样品在第2.7min有明显出峰，表征酯化样品中的3-羟基丙酸。
以标准样品为对照，如果待测细胞的酯化样品(待测样品)在2.7min也有明显的出峰，且无其它特异峰出现，说明待测细胞的酯化样品有且仅有3HP单体。因为在干细胞中3HP只能以聚合物的形式存在(3HP单体会释放到细胞外)，这样的结果即证明了均聚物的产生。
结果为E.coliTrans1-T1(pZQ01，pZQ03)，E.coliTrans5α(pZQ01，pZQ03)和E.coliS17-1(pZQ01，pZQ03)的干细胞在2.7min也有明显的出峰，并且没有其它特异出峰，说明能够生产均聚物。
通过分析气相检测到的出峰面积和样品量，可得到干细胞中含有均聚物的比重(wt％)，及每L培养体系中能够生产的均聚物或共聚物的浓度(g/L)，具体结果见表1所示。
1H核磁共振NMR检测细胞中均聚物的方法：
样品：从细胞中提取提纯的成膜聚合物(均聚物)，具体如下：
1)称量干菌体粉末若干；2)加入5～10倍体积的乙酸正丁酯，混匀，在150转/min下搅拌，并在75℃下回流加热处理1.5h；3)大转速离心，除去细菌残渣，留上清；4)将上清液中加入10倍体积的无水乙醇中，搅拌混合均匀，静置，有白色絮状或粉末状沉淀析出；5)离心收集沉淀，对其用无水乙醇反复浸泡洗涤，离心收集沉淀；6)将经洗涤的沉淀进行干燥，得到提纯均聚物。
实验条件：核磁仪器(购买JEOL公司，型号ECA-600SCC)；采用氘代氯仿CDCl3为氘代溶液；测试核种：1H；扫描次数：16次；采用14.1T超导磁场，氢核子共振频率为600MHZ。
结果为：E.coliTrans1-T1(pZQ01，pZQ03)，E.coliTrans5α(pZQ01，pZQ03)和E.coliS17-1(pZQ01，pZQ03)在含有PDO的培养基中生长后，提取干细胞，并从中提取提纯均聚物，送核磁检测。这些样品的核磁结果均显示出3个明显的出峰。以E.coliS17-1(pZQ01，pZQ03)，为例，如图3，其中2.6535ppm-2.6741ppm检测到3-羟基丙酸单体的C2位亚甲基的共振出峰；4.3576ppm-3782ppm检测到3-羟基丙酸单体的C3位亚甲基的共振出峰；而7.2619ppm则为CDCl3的共振出峰。该结果进一步证明，细胞中确实积累了均聚物P(3HP)。
在含有1，3-PD0的培养基中培养E.coli Trans1-T1(pZQ03)，E.coli Trans5α(pZQ03)、E.coli S17-1(pZQ03)、E.coli Trans1-T1(pZQ01)，E.coli Trans5α(pZQ01)、E.coli S17-1(pZQ01)、E.coli Trans1-T1，E.coli Trans5α、E.coliS17-1菌株，按照上述“气相样品准备”得到待测样品，以标准样品的气相检测结果为参照，分析这些菌株是否积累了均聚物。
结果发现仅含有pZQ01质粒的菌株E.coli Trans1-T1(pZQ01)，E.coli Trans5α(pZQ01)和E.coli S17-1(pZQ01)在含有10g/L 1，3-丙二醇条件下的培养基中生长，只能将1，3-丙二醇转化为3-羟基丙酸，均能够得到2.3g/L 3-羟基丙酸(3HP)，但检测不到均聚物产生。而仅含有pZQ03质粒的菌株E.coli Trans1-T1(pZQ03)，E.coli Trans5α(pZQ03)、E.coli S17-1(pZQ03)没有检测到3-羟基丙酸(3HP)，说明几乎不能利用1，3-丙二醇。未转任何质粒的E.coli Trans1-T1、E.coli Trans5α、E.coli S17-1均检测不到3-羟基丙酸均聚物的产生。可以看出仅仅含有一种上述质粒，都不能积累3-羟基丙酸均聚物。
分别在含有和不含有1，3-PDO的培养基中培养E.coli Trans1-T1(pZQ01，pZQ03)，E.coli Trans5α(pZQ01，pZQ03)和E.coli S17-1(pZQ01，pZQ03)菌株，48h后将菌液离心、水洗、冰干后得到干细胞待测样品，并通过气相色谱检测，结果也如表1所示。
表1LB培养基条件下摇瓶培养的检测结果
ND：not detected，即未检测到该物质。
由表1的测定结果可以看出，带有pZQ01和pZQ03质粒的细菌能够以1，3-丙二醇为底物积累3-羟基丙酸均聚物P(3HP)，说明pcs基因的导入使菌株具备了将3-羟基丙酸转为3-羟基丙酰辅酶A的能力，从而为phaC聚合酶作用于3-羟基丙酰辅酶A，合成均聚P(3HP)提供了基础。摇瓶条件下，P(3HP)就达到细胞干重的88.71％，从表1的结果也可以看到，菌株体内积累均聚物时，其细胞干重相对于不积累聚合物条件下明显提高。但以LB为培养基，细胞干重普遍不高。
2、以LB’为培养基生产3-羟基丙酸均聚物
表达工程菌E.coliTrans1-T1(pZQ01，pZQ03)，E.coliTrans5α(pZQ01，pZQ03)和E.coli S17-1(pZQ01，pZQ03)分别用LB’培养基，在37℃，200rpm过夜培养；然后按5％接种量(v/v)，分别接种至100mL含1，3-丙二醇的LB’培养基(含：10g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl，10g/L 1，3-PDO，其余为水，pH7.0-7.2)，37℃，200rpm，摇瓶培养48小时，得到菌液，经离心、水洗、冰干后得到干细胞待测样品，并通过气相色谱检测(条件和方法同上)，结果如表2所示。每个菌种设置三组平行。
表2LB’培养基条件下摇瓶培养的检测结果
由表2的结果可以看出，LB’培养基条件下，各菌株的细胞干重相对于LB培养基条件下的干重有明显提高，与此同时，菌株体内积累的3-羟基丙酸均聚物P(3HP)百分比也有所下降，但总体的P(3HP)积累浓度明显提高。三种表达载体菌株中，以E.coli S17-1菌株的生产水平最高，最适合用于P(3HP)的生产积累。
3、以TB为培养基生产3-羟基丙酸均聚物
表达工程菌E.coliTrans1-T1(pZQ01，pZQ03)，E.coliTrans5α(pZQ01，pZQ03)和E.coliS17-1(pZQ01，pZQ03)分别用LB培养基，37℃，200rpm过夜培养；然后按5％接种量(v/v)，分别接种至100mL含1，3-丙二醇(1，3-PDO)的TB培养基(含：10g/L 1，3-PDO，24g/L酵母提取物，12g/L蛋白胨，4ml/L甘油，0.017mol/LKH2PO4，0.072mol/L K2HPO4。其余为水，pH 7.0-7.2)，37℃，200rpm，摇瓶培养48小时，得到菌液，每个菌种设置三组平行。
采用上述气相检测方法进行检测，结果如表3所示：
表3TB培养基条件下摇瓶培养的检测结果
由表3可以看出，TB培养基作为一种能够提高质粒DNA复制水平和细胞干重的培养基，能够极大程度的提高本发明中三种表达菌株的生长水平，特别是E.coliS17-1，其菌株细胞干重在摇瓶条件下就达到了7.76g/L，虽然细胞积累的P(3HP)百分比下降到43.47％，但总体的P(3HP)生产浓度相对于表1，表2中的结果都有进一步提高。三种表达菌株中，E.coli S17-1相对于E.coliTrans1-T1和E.coliTrans5α生产P(3HP)的优势也更加明显。
二、重组菌Escherichia coli S17-1(pZQ01，pZQ03)生产P(3HP)的小型发酵罐实验
方法一：
1、种子液的培养：重组菌Escherichia coli S17-1(pZQ01，pZQ03)菌种在20mL抗性LB培养基(含50μg/mL氨苄氯霉素，硫酸卡那霉素)中37℃，200rpm培养12h，获得一级种子；接种量为5％(V/V)将一级种子接种至100mL抗性LB’培养基或TB培养基中37℃，200rpm培养12h，获得二级种子；
2、发酵：
以接种量为10％(V/V)将上述二级种子进行发酵罐培养。发酵培养基分别为LB’和TB。发酵罐初始设定：空气流速3L/min，即通气量为1；设定温度为37℃，用5M氢氧化钠和硫酸调pH，设定发酵罐的pH＝7.0，均采用P-I-D监测；溶氧控制为30％，与搅拌速度耦联，搅拌速度控制范围为200-800rpm之间。与摇瓶实验不同的是，为了减轻1，3-丙二醇对于细胞的毒害作用，在细胞生长进入稳定期后，才向发酵罐中加入底物1，3-丙二醇。
将1，3-丙二醇溶液加入发酵液中的方式为分批补加；培养过程中，用分光光度计检测细菌OD值，结合罐内溶氧和转速的检测值补加浓缩10倍的培养基；用液相色谱监测罐上清的1，3-丙二醇浓度，当细菌生长进入稳定期，加入1，3-丙二醇3瓶(共含30g 1，3-丙二醇，溶于15ml水)。此后，每间隔4h取样，当1，3-丙二醇浓度低于5g/L(“浓度”为1，3-丙二醇占此时发酵体系中的浓度，也就是即时浓度)时，补加1，3-丙二醇10g，使发酵罐中1，3-丙二醇浓度维持在1g/L-10g/L。
当罐体内3-羟基丙酸浓度和1，3-丙二醇浓度变化进入平台期，说明菌株已经不能继续有效消耗底物积累聚合物，终止发酵，发酵44h。分别收集不同发酵培养基中获得的发酵产物，10000rpm，10min条件下离心，所得细胞沉淀水洗一次之后，冰干，得到含有3-羟基丙酸均聚物的干细胞。
3、检测
上述气相检测方法检测含有3-羟基丙酸均聚物的干细胞，
结果为：以LB’为培养基的发酵过程中，细菌生长正常。细菌在发酵32h时达到CDW(菌体干重)最大值，为5.52g/L。细菌对数生长期时，细胞内中迅速积累P(3HP)，24h后，P(3HP)的积累进入平台期，细胞干重和P(3HP)浓度值在小范围内上下浮动，44h时菌株内积累的均聚P(3HP)百分比达到了最高值91.5％，总的P(3HP)浓度达到5.01g/L。
以TB为培养基的发酵过程中，细菌生长正常。细菌在发酵28h时达到CDW(菌体干重)最大值，为19.9g/L。细菌对数生长期时，细胞内中迅速积累P(3HP)，28h后，P(3HP)的积累进入平台期，细胞干重和P(3HP)浓度值在小范围内上下浮动。44h时菌株内积累的均聚P(3HP)百分比达到了最高值66.76％，总的P(3HP)浓度达到12.39g/L。采用TB培养基，虽然细胞体内积累的P(3HP)比例下降，但总体积累浓度明显上升。
方法二、
1、种子液的培养：与方法一相同。
2、发酵：与方法一基本相同，不同的是发酵温度为30℃、发酵的溶氧量为10％，发酵培养基的pH为6。发酵容器中每L发酵产物中的底物浓度为10g/L-20/L；发酵时间为32h。
3、检测：检测方法与方法一相同，检测结果与方法一无显著差异，补加一句：不同的是细胞干重下降2-3倍。
方法三、
1、种子液的培养：与方法一相同。
2、发酵：与方法一基本相同，不同的是发酵温度为40℃、发酵的溶氧量为20％，发酵培养基的pH为8。发酵容器中每L发酵产物中的底物浓度为20g/L-30g/L；发酵时间为50h。
3、检测：检测方法与方法一相同，检测结果基本与方法一基本无显著差异，不同的是细胞干重下降2-3倍。
实施例3、用表达工程菌E.coli S17-1(pZQ01，pZQ03)生产P(3HP-co-4HB)共聚物的摇瓶实验
表达工程菌E.coliS17-1(pZQ01，pZQ03)分别用LB，LB’和TB培养基，在37℃，200rpm条件下过夜培养；然后按5％接种量(v/v)，分别接种至100mL含不同浓度1，3-丙二醇(1，3-PDO，见表4)和/或不同浓度1，4-丁二醇(1，4-BD，见表4)的LB，LB’和TB培养基，37℃，200rpm，摇瓶培养48小时，每个菌种设置三组平行。
采用上述气相检测方法中的条件，标样制备如下：
3-羟基丙酸和4-羟基丁酸共聚物的标准样品的准备：取30ul左右30％浓度(体积浓度)的3HP(日本东京化成工业株式会社(TCI)，产品目录号H0297)水溶液于酯化管中，加2ml氯仿，2ml酯化液，加盖密封后在100℃进行酯化。经气相检测，标准样品在第2.7min有明显出峰，表征酯化样品中的3-羟基丙酸。
取10ul的99％浓度的γ-丁内酯(美国Sigma-Aldrich公司，目录号cat.：B10，360-8)于酯化管中，加2ml氯仿，2ml酯化液，加盖密封后在100℃进行酯化。经气相检测，标准样品在第3.0min有明显出峰，表征酯化样品中的4-羟基丁酸。(γ-丁内酯是4-羟基丁酸的内酯结构，可替代市面上少见的4-羟基丁酸作为气相检测的标准样品。)
以标准样品为对照，如果待测细胞的酯化样品(待测样品)在2.7min有明显的出峰，在第3.0min也有明显出峰，且无其他特异峰出现，说明待测细胞的酯化样品存在3HP单体和4HB。因为在干细胞中3HP和4HB只能以聚合物的形式存在(3HP单体会释放到细胞外)，
结果为E.coliS17-1(pZQ01，pZQ03)在2.7min有明显的出峰，在第3.0min也有明显出峰，说明产生P(3HP-co-4HB)共聚物。
通过分析气相检测得到的出峰面积和样品量，可得到干细胞中含有共聚物的比重(wt％)，及每L培养体系中能够生产的均共聚物的浓度(g/L)。
在含有1，3-丙二醇和/或1，4-丁二醇的LB或LB’或TB培养基中培养E.coliS17-1(pZQ01，pZQ03)，48h后将菌液离心、水洗、冰干后得到干细胞待测样品，并通过气相色谱检测，结果如表4所示。该结果证实了细胞中3-羟基丙酸和4-羟基丁酸共聚物的产生。
结果如表4所示：
表4三种培养基条件下摇瓶培养的共聚物检测结果
ND：not detected，即检测不到该物质的产生。
由表4可以看出，在提供1，3-丙二醇和1，4-丁二醇的条件下，菌株也能够积累P(3HP-co-4HB)共聚物(3-羟基丙酸和4-羟基丁酸共聚物)。
Claims (10)
1.重组菌的一种构建方法，包括如下步骤：将1,3-丙二醇脱氢酶编码基因、醛脱氢酶编码基因、3-羟基丙酸辅酶A连接酶编码基因和PHA聚合酶编码基因导入出发菌，得到重组菌；所述出发菌为大肠杆菌；
所述1,3-丙二醇脱氢酶的氨基酸序列为序列表中序列10；
所述醛脱氢酶的氨基酸序列为序列表中序列11；
所述3-羟基丙酸辅酶A连接酶的氨基酸序列为序列表中序列12；
所述PHA聚合酶的氨基酸序列为序列表中序列13。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述1,3-丙二醇脱氢酶编码基因的核苷酸序列为序列表中序列1；
所述醛脱氢酶编码基因的核苷酸序列为序列表中序列2；
所述3-羟基丙酸辅酶A连接酶编码基因的核苷酸序列为序列表中序列3；
所述PHA聚合酶编码基因的核苷酸序列为序列表中序列4；
所述出发菌具体为Escherichia coli Trans5α、Escherichia coli Trans1-T1或Escherichia coliS17-1。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
所述1,3-丙二醇脱氢酶编码基因和所述醛脱氢酶编码基因通过重组载体A导入所述出发菌中；
所述3-羟基丙酸辅酶A连接酶编码基因和所述PHA聚合酶编码基因通过重组载体B导入所述出发菌中；
所述重组载体A为将启动子PRe插入pZL-dhaT-aldD的多克隆识别位点得到的载体；
所述重组载体B为将3-羟基丙酸辅酶A的编码基因插入到pBHR68的多克隆识别位点得到的载体。
所述启动子PRe的核苷酸序列为序列表中的序列5。
4.由权利要求1-3中任一所述的方法构建的重组菌。
5.一种生产3-羟基丙酸均聚物和/或3-羟基丙酸共聚物的方法，包括如下步骤：发酵权利要求4所述的重组菌，收集发酵产物，即得到3-羟基丙酸均聚物和/或3-羟基丙酸共聚物。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：
所述发酵温度为30℃-40℃；所述发酵的溶氧量的体积百分含量为10%-30%；所述发酵培养基的pH为6-8；
所述发酵过程中，在所述重组菌进入稳定期起至发酵结束，向所述发酵培养基中分批补加1,3-丙二醇和/或1,4-丁二醇，使每L发酵产物中的1,3-丙二醇或1,4-丁二醇含量均不高于30g。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：
所述发酵温度具体为30℃、37℃或40℃；所述发酵的溶氧量的体积百分含量具体为10%、20%或30%；所述发酵培养基的pH具体为6、7或8。
8.根据权利要求5-7中任一所述的方法，其特征在于：
所述每L发酵产物中的1,3-丙二醇或1,4-丁二醇含量均为1g/L-30g/L；
所述发酵时间为32h-50h；
所述3-羟基丙酸共聚物为3-羟基丙酸和4-羟基丁酸共聚物。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：
所述每L发酵产物中的1,3-丙二醇或1,4-丁二醇含量均具体为1g/L-10g/L、10g/L-20g/L或20-30g/L；
所述发酵时间具体为32h、44h或50h。
10.一种生产3-羟基丙酸均聚物和/或3-羟基丙酸共聚物的载体组合物，由权利要求3所述的方法中的重组载体A和重组载体B组成；所述3-羟基丙酸共聚物为3-羟基丙酸和4-羟基丁酸共聚物。
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| CN102174542A (zh) | 2011-09-07 |
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