CN103667153B

CN103667153B - 一株产聚3-羟基丁酸酯的嗜热菌

Info

Publication number: CN103667153B
Application number: CN201310705052.4A
Authority: CN
Inventors: 郗丽君; 肖梓军; 张瑜; 朱贤琨; 钟骏; 吕建仁
Original assignee: China University of Petroleum East China
Current assignee: China University of Petroleum East China
Priority date: 2013-12-19
Filing date: 2013-12-19
Publication date: 2015-05-13
Anticipated expiration: 2033-12-19
Also published as: CN103667153A

Abstract

本发明提供了一株产聚3-羟基丁酸酯的嗜热菌Aneurinibacillus sp.XH2，保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC），保藏日期2013年11月6日，保藏号为CCTCC M2013550。本发明是首次报道Aneurinibacillus属的菌株可以产生聚3-羟基丁酸酯。Aneurinibacillus sp.XH2能在较高温度50℃下合成聚3-羟基丁酸酯，其发酵温度高于其他聚3-羟基丁酸酯常温生产菌（发酵温度为30-40℃），可以有效避免杂菌的污染，从而具有广阔的应用前景。

Description

一株产聚3-羟基丁酸酯的嗜热菌

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株产生聚3-羟基丁酸酯的嗜热菌Aneurinibacillus sp.XH2。

背景技术

聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates)是一类由微生物合成的高分子聚合物，是细菌胞内的一种能源储备物，因其具有生物可降解性和较好的环境相容性而被广泛应用，例如：环境友好的生物塑料制品、可生物降解和生物相容的手术植入物、药物控释载体材料、食品和饲料添加物和生物燃料等。目前，微生物来源的聚羟基脂肪酸酯已经形成了包括：工业发酵、材料、医药、生物燃料和精细化工等行业在内的庞大产业价值链。

根据单体组成，人们把微生物合成的聚羟基脂肪酸酯分成两大类：一类是短链聚羟基脂肪酸酯，如聚3-羟基丁酸酯(poly(3-hydroxybutyrate),PHB)；另一类是中长链聚羟基脂肪酸酯，如聚羟基己酸酯(Polyhydroxyhexanoate)。聚羟基脂肪酸酯的分子量从几万至几百万不等。影响其结构的因素有共聚单体的个数、侧链基团、聚合单体的数目及羟基的位置等，随着这些不定因素的改变而形成了不同的聚羟基脂肪酸酯，从而使其具有不同的物理化学性质，例如：熔点、韧度、玻璃态温度等。经过对物理性质和分子结构等方面研究，发现：PHB作为高度结晶的晶体与聚丙烯的相似度很高，具体表现在其熔点、结晶度、玻璃化转变温度等方面。除此之外，PHB还具有许多独特的优点，例如光学活性好、比重大、透氧性低、生物组织相溶性、抗凝血等，从而使其具有较好的应用前景。

虽然目前发现有300多种微生物可以产生聚羟基脂肪酸酯，但极端环境下的微生物资源因其具有适应特殊环境的特点，如：嗜热、嗜盐、嗜压等，因此具有重要的应用价值和研究意义。目前PHB的生物发酵合成主要是在常温条件（30-40℃）下进行，在实际生产过程中容易造成杂菌的污染，并且经过基因改造过的工程菌株存在不稳定性及其他潜在风险。自然界存在的嗜热微生物产生PHB的报道较少。因此，开发利用天然嗜热PHB产生菌具有重要的实际意义。

发明内容

本发明的目的是提供一株新发现的产聚3-羟基丁酸酯(PHB)的嗜热菌Aneurinibacillus sp.XH2。是首次报道该Aneurinibacillus属的菌株可以产生PHB。

本发明提供的PHB合成菌为Aneurinibacillus sp.XH2，该菌已于2013年11月6日保藏在中国典型培养物保藏中心（地址：中国.武汉.武汉大学），保藏编号为：CCTCC M2013550。

本发明的PHB合成菌XH2分离自胜利油田孤岛采油厂原油采出水。该菌在LB培养基上生长良好（LB培养基组成为10g蛋白陈，5g酵母粉，5g NaCl）。菌落呈圆形，乳白色，边缘整齐。菌株为革兰氏阳性。菌体长杆状，大小约为0.5-1.0μm宽，3.0-6.0μm长。该菌的最适生长温度为50℃。其产生PHB细胞内含物的透射电子显微镜见说明书附图1。该菌的16S rRNA基因的核苷酸序列的GenBank登录号为：KF791865。将16S rRNA基因和GenBank中的登录序列进行相似性比对，发现该菌株与已报道的Aneurinibacillus属的16S rRNA基因序列相似性最高。菌株XH2和相似性高的标准菌株的系统进化树见说明书附图2。

本发明采取以下技术方案：种子培养基为LB。发酵培养基为YPG（m/v）：2%葡萄糖、2%蛋白胨、1%酵母粉。将菌种接种到50ml种子培养基，50℃下水浴摇床振荡培养，转速150rpm，培养24小时后，按照1%的接种量接种到液体发酵培养基，摇瓶发酵48-96h。离心发酵液，弃上清，收集菌体后干燥。用氯仿对干细胞中的PHB进行提取：使用量为1g干细胞加入10ml氯仿。于抽提瓶反应釜中，在100℃下密封加热4h；冷却后，用抽滤法去掉细胞碎片，得到澄清的氯仿溶液；将氯仿溶液加入到10倍体积的冰冷乙醇中，得到PHB沉淀，抽滤；收集沉淀；将收集的PHB沉淀物至40℃真空干燥箱中24h待其溶剂挥发完全后，即可得到PHB；制作PHB膜的方法即用PHB再溶解于氯仿中，经回流加热充分融解后至平皿中，挥发干溶剂后至真空干燥箱烘干即可。经过鉴定，该菌株Aneurinibacillus sp.XH2产生的聚羟基脂肪酸酯的单体为3-羟基脂肪酸，见说明书附图3-5。

本发明与现有技术相比所具有的突出优点在于：首次报道Aneurinibacillus属的菌株能产生PHB，该菌株XH2能在高温50℃下合成PHB。其嗜热的特点，使发酵温度高于其他绝大多数天然PHB产生菌和工程菌（30-40℃），可以有效避免杂菌的污染，从而具有广阔的应用前景。利用本专利提供的方法，该菌发酵产生PHB的主要单体形式为3-羟基脂肪酸（占提取物的95%以上），有效的避免了其他杂合形式PHB造成的影响。

附图说明

图1是菌株Aneurinibacillus sp.XH2的透射电镜照片；

图2是菌株Aneurinibacillus sp.XH2的系统进化树；

图3是菌株Aneurinibacillus sp.XH2合成的PHB单体的甲醇酯化产物质谱图和化学结构式；

图4是菌株Aneurinibacillus sp.XH2合成的PHB产物红外图谱和购买的标准品的红外图谱；

图5是菌株Aneurinibacillus sp.XH2合成PHB的核磁共振图谱。

具体实施方式

在下面的实施例中，所用菌种均为Aneurinibacillus sp.XH2。

实施例中所用的不同培养基配方如下:

(1)筛选培养基：

牛肉浸膏1g，蛋白胨1g，NaCl0.5g，葡萄糖2g，琼脂粉1.5g，蒸馏水100ml，pH7.0。

(2)富集培养基和发酵培养基：

YPG培养基（m/v）：2%葡萄糖、2%蛋白胨、1%酵母粉，pH7.0。

实施例1分离筛选Aneurinibacillus sp.XH2

实验材料来自胜利油田孤岛采油厂的原油采出水。

具体实施步骤如下：

富集培养：在水样品中加入富集培养基，然后将上述富集培养物分装到锥形瓶中，迅速加热至100℃，然后再迅速转入60℃的水浴摇床中进行往复震荡（150rpm）培养2d。

菌株分离纯化：配制固体种子培养基，每升中含有：20g葡萄糖，20g蛋白胨，10g酵母粉，17g琼脂粉。调整pH值至7.0；将富集培养液用无菌生理盐水进行梯度稀释，涂布到上述固体种子培养基上，置于60℃的恒温箱中培养2d，用接种环挑取单菌落，得到纯菌。

实施例2Aneurinibacillus sp.XH2鉴定与保藏

(1)形态特征

菌株XH2的菌落在LB培养基上呈圆形，乳白色，边缘整齐。为革兰氏阳性菌。菌体长杆状，大小约为0.5-1.0μm宽，2.0-6.0μm长，细胞内可见大量的颗粒状内含物（透射电镜见说明书附图1）。

(2)菌株16S rRNA鉴定与保藏

使用细菌16S rRNA通用引物27F和1492R作为扩增引物，采取PCR方法扩增菌株Aneurinibacillus sp.XH2的16S rRNA片段，电泳检测后，送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，获得测序结果，并用美国国立生物技术信息中心（NCBI）的BLAST程序对该菌的16S rRNA序列和GenBank已收录的序列进行核苷酸同源性比对。发现与之序列相似性大于99%的已知菌株是Aneurinibacillus属，因此本发明菌株鉴定为Aneurinibacillus属，并命名为Aneurinibacillus sp.XH2。根据相似标准菌株的16S rRNA序列构建的系统发育树如说明书附图2。本发明菌株Aneurinibacillus sp.XH2已于2013年11月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M2013550。该菌株的16S rRNA序列已提交到GenBank数据库中，登录号为KF791865。

(3)菌株生理生化特征

对菌株Aneurinibacillus sp.XH2进行了生理生化特征鉴定，结果如表1所示。

表1Aneurinibacillus sp.XH2的生理生化特征

实施例3Aneurinibacillus sp.XH2最适生长温度测定

选取30℃、40℃、50℃、60℃四个温度对菌株Aneurinibacillus sp.XH2的代时进行测定。培养基为YPG，培养条件为水浴摇床振荡培养，转速150rpm，每个温度设定三个重复。

代时的计算方法：代时是每个细菌分裂繁殖一代所需的时间，单位是小时h，可以根据初始时细胞数目N₀、最终细胞数目N_t、生长时间t、比生长速率μ（单位为个/h）、细胞OD600nm、细胞干重DWC（单位为g/L）值计算出来。所需公式如下：

μ=[(lgN_t-lgN₀)/(t-t₀)]*2.303

N_t/N₀=始末时细胞干重比；

细胞干重DCW=OD×0.39；

代时G=ln/μ；

代时越短，说明菌株繁殖速度快，生长得越好。因为在60℃时，培养基基本无任何变化，可以得出此菌株在60℃条件下不生长。结果得出50℃是菌株XH2的最适生长温度。

实施例4Aneurinibacillus sp.XH2发酵合成PHB

具体步骤如下：种子培养基为LB。发酵培养基为YPG。将菌种接种到50mL种子培养基，50℃下水浴摇床振荡培养，转速150rpm，培养24h后，按照1%的接种量接种到液体发酵培养基，摇瓶发酵48-96h。离心发酵液，弃上清，收集菌体后干燥。用氯仿对干细胞中的PHB进行提取：使用量为1g干细胞加入10ml氯仿。于抽提瓶反应釜中，在100℃下密封加热4h；冷却后，使用抽滤法去掉细胞碎片，得到澄清的氯仿溶液；将氯仿溶液加入到10倍体积的冰冷乙醇中，得到PHB沉淀，抽滤；收集沉淀；将收集的PHB沉淀物至40℃真空干燥箱中24h待其溶剂挥发完全后，即可得到PHB；制作PHB膜的方法即用PHB再溶解于氯仿中，经回流加热充分融解后至平皿中，挥发干溶剂后至真空干燥箱中烘干即可。

实施例5产物PHB的结构单体的气相色谱-质谱(GC-MS)分析

取20mg提取物，加人2ml酸化甲醇（含有1g/L苯甲酸和3%v/v的浓硫酸）及2ml氯仿，于旋塞试管中100℃加热4h，再冷却到室温，然后加入1ml蒸馏水，充分摇匀10min，分层以后，取2μl有机相用于气相色谱-质谱联用检测该酸水解样品，以确定单体种类。经检测，菌株Aneurinibacillus sp.XH2合成PHB单体的甲醇酯化产物的质谱图和推导化学结构式如说明书附图3所示，为3-羟基丁酸甲酯。

实施例6产物PHA和标准品的傅立叶红外光谱（FT-IR）分析

将得到的胞内物提取物和PHB标准品CAS:29435-48-1(Sigma-Aldrich,Germany)进行傅立叶红外光谱分析：将待测样品与溴化钾混合后进行研磨，确保研磨的足够均匀与细致；研磨结束后，将混合物放于红外灯下干燥，以减少水分对光谱图所造成的影响；然后通过模具进行压片处理，通过压片机给模具施加压力。将压好片的样品立即使用傅立叶红外光谱仪进行测试。由于不同的PHB由于其侧链长短的差异导致样品具有不同的结晶程度，故根据单体碳原子数的多少其羰基峰的位置也略有不同，在PHB样品充分结晶的情况下其对应的特征峰在1735cm_-1左右。实验结果表明：分离产物与标准品具有相同的红外谱图（说明书附图4）。实施例7产物PHB的结构单体的核磁共振光谱(NMR)分析

在核磁共振仪上进行PHB成分和结构分析。以CDCl₃为溶剂，样品体积分数为0.5%，采用5mm PABBO bb探头：在24038.416H_z宽，以100.622MH_z观察记录碳谱；在8223.685H_z宽，400.132MHz观察记录氢谱。实验结果表明：该菌发酵产生PHB的主要单体形式为3-羟基脂肪酸，占提取物的95%以上（说明书附图5）。

Claims

1.一株产聚3-羟基丁酸酯的嗜热菌Aneurinibacillus sp.XH2，其特征在于：该菌株已于2013年11月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC M2013550。