CN105199977A - 一种耐高温产聚羟基丁酸酯细菌的培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种耐高温产聚羟基丁酸酯细菌的培养基，主要由下述按重量配比计的：酵母浸粉10g/L，蛋白胨10g/L，牛肉浸粉5g/L，葡萄糖20g/L，硫酸铵5g/L，加蒸馏水定容至1L而成。用这种培养基培养的细菌可以耐受60℃的高温，因而可以很方便地通过控制温度进而控制氧浓度，降低生产工艺和设备要求；可以在很简单的发酵设备中，利用高有机质含量的蔗糖、木薯工业废水作为碳源生长和合成PHB，降低设备投入及发酵底物成本；还可以通过提高温度杀死其他非耐高温细菌，从而保证目标菌体单一性，并提高其生物量和所提取的PHB纯度。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术，具体是一种耐高温产聚羟基丁酸酯细菌（PHB）的培养基。
背景技术
聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxybutyrate，PHB)是一种细胞内聚酯,具有生物降解性，为生物可降解塑料的新型高分子材料。
目前PHB的生产方法有微生物合成和转基因植物合成；转基因植物合成PHB降低生产成本尚未成功；利用微生物合成PHB的生产成本相对较高，主要是由于高的发酵底物价格及提取纯化费用。
工业上主要采用两步法培养微生物（有氧/富氮和贫氧/贫氮）来获得PHB，控制氧含量的方法为单纯的氧浓度控制（主要是灌注纯氮）在成本、设备、工艺上要求很高。
发明内容
本发明的目的是要提供一种耐高温、产聚羟基丁酸酯（PHB）多的细菌培养基。
本发明一种耐高温产聚羟基丁酸酯细菌的培养基，主要由下述按重量配比计的：
酵母浸粉10g/L
蛋白胨10g/L
牛肉浸粉5g/L
葡萄糖20g/L
硫酸铵5g/L
加蒸馏水定容至1L而成。
本发明的优点是：由于该耐高温产PHB细菌可以耐受60℃的高温，因而可以很方便地通过控制温度进而控制氧浓度，降低生产工艺和设备要求；可以在很简单的发酵设备（如无防杂菌污染装置）中，利用高有机质含量的蔗糖、木薯工业废水作为碳源生长和合成PHB，降低设备投入及发酵底物成本；还可以通过提高温度杀死其他非耐高温细菌，从而保证目标菌体单一性，并提高其生物量和所提取的PHB纯度。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的阐述，但不是对本发明内容的限定。
本发明一种耐高温产聚羟基丁酸酯细菌的培养基，主要由下述按重量配比计的：
酵母浸粉10g/L，蛋白胨10g/L，牛肉浸粉5g/L，葡萄糖20g/L，硫酸铵5g/L，加蒸馏水定容至1L而成。
应用实施例：
将本发明培养基应用于筛选耐高温产聚羟基丁酸酯细菌的方法，是：
（1）采集土壤样品：
采样区域：①北方（天津、山东）、②南方（广西、广东）。
土壤类型：果园、花园、菜园、田地、山丘、河边、居民区和工业区。
样地设置和采样：在各种土壤类型区域划定面积为100m2的正方形为样地，以对角线交叉点为圆心的一半对角线长度为半径画圆圈，圆圈与对角线交叉点为采样点。采集各点地表以下5cm处土壤为样品，每份样品1千克，每个样地4份样品，共32份；
（2）样品预处理：
分别取10g样品装入已灭菌并盛有90mL无菌水的玻璃瓶中，将其编号并密封后，剧烈震摇10min。静置悬浮液，待分层后取上层液体离心(4500r/min，2min)，取出离心后的上层菌液备用；
（3）扩大培养：分别取菌悬液10μL接种于250mLLB培养液中，置于37℃恒温箱培养震荡（100r/min）培养72h，获得扩大菌种培养液；
（4）逐级梯升温阶筛选：取10μL扩大菌种培养液接种于250mLLB培养液中，按温度逐级递升（37℃→40℃→45℃→50℃→55℃→60℃→65℃→70℃→75℃→80℃）进行培养；其中，后一温阶所用接种菌液取自前一温阶培养的菌液，接种量为10μL；
（5）选定耐高温菌群：若在某培养温度下，接种菌液后的LB培养液出现浑浊，则可判定该菌可在此温度生长，反之则可排除此编号土壤样品；
（6）选定耐高温菌株：取耐50℃以上菌液以生理盐水稀释(10-6)并均匀涂布于富氮培养基内，37℃培养48h；挑取有不同外形特征的单菌落，于37℃富氮培养基上分别扩繁后，以完全营养液体培养基加20%甘油与-80℃保存；
（7）采用尼罗蓝染色法，分别接种耐50℃以上具不同形态特征的单菌落于LB培养基温度培养12h；耐高温菌株经适当扩繁后稀释(10-6)涂布筛选培养基，30℃条件下培养36h后，在365nm紫外灯照射下呈橘粉色菌落为产PHB菌株。目标菌株以富氮培养基37℃扩繁后，以完全营养液体培养基加20%甘油-80℃保存。
本耐热产PHB菌可以在30～60℃条件下，利用富氮培养基：酵母浸粉10g/L，蛋白胨10g/L，牛肉浸粉5g/L，葡萄糖20g/L，硫酸铵5g/L，加蒸馏水至1000mL，进行扩繁。
经检测：与传统产PHB且最高耐受45℃的细菌相比，本耐热产PHB菌可耐受60℃高温。
Claims (1)
1.一种耐高温产聚羟基丁酸酯细菌的培养基，其特征是：主要由下述按重量配比计的：
酵母浸粉10g/L
蛋白胨10g/L
牛肉浸粉5g/L
葡萄糖20g/L
硫酸铵5g/L
加蒸馏水定容至1L而成。
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2014
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