CN110527644A - 一种低温秸秆堆腐复合菌剂的筛选方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种低温秸秆堆腐复合菌剂的筛选方法及应用，包括枯草芽孢杆菌和酵母菌，其保藏机构为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18001\CGMCC No.18002，保藏日期为2019年6月19日。本发明从不同地区土壤的中分离筛选高效低温纤维素分解菌，并研究其对温度、碳源、pH等的适应性，并通过不同比例菌株组合形成复合微生物菌剂，再通过加入低温玉米秸秆堆肥中，加快玉米秸秆的腐熟进度。减少东北地区秸秆焚烧对环境的影响，为农业可持续发展奠定坚实基础。

Description

一种低温秸秆堆腐复合菌剂的筛选方法及应用

技术领域

本发明涉及一种低温秸秆堆腐复合菌剂对玉米秸秆进行低温腐解的应用，属于微生物学领域，更具体的说，是涉及一种低温秸秆堆腐复合菌剂的筛选方法及应用。

背景技术

我国作为一个农业大国，农作物的产量很高，作物秸秆的产量也随之很大，居世界第一，作物秸秆也成为了一种巨大的可再生资源，秸秆综合利用的前景十分广阔，但是这种资源很难被利用，其中大部分的秸秆被焚烧处理，这样不仅造成了资源浪费，还会造成严重的环境污染。有研究表明，在土壤表层大面积的焚烧秸秆会使土壤微生物数量和种类减少，微生物群落的多样性也随之降低，秸秆焚烧后破坏了地表的土壤结构，地表的水分也被大量的蒸发，使土壤丧失保水性；同时这种方式也严重污染了环境，也浪费了宝贵的生物资源，同时也破坏了土壤结构，造成土壤的有机质和土壤养分含量大量减少。在传统农业中，秸秆主要用于取暖、养殖饲料等，然而随着传统农业向现代农业的转变、农村饲料和能源结构化的调整以及经济的迅速发展，使作物秸秆的利用途径发生了巨大的变化，从而造成了作物秸秆的大量剩余。

低温微生物是指在低温环境下具有生长繁殖能力的微生物群体，它们在各种低温的环境中生长繁殖。根据微生物的生长温度的选择，将低温微生物分为两类，嗜冷型和耐冷型两种微生物，其中嗜冷型微生物的能够生长、繁殖的，而最适温度是在15℃左右，可以生存的温度是在20 ℃左右的微生物；耐冷型微生物是生存温度在0℃左右，能够生长、繁殖的最适温度在20℃左右的微生物。在生物圈中存在非常丰富的微生物资源和低温微生物资源，因此将微生物资源充分的运用到生活、生产实践中，而低温微生物的生长、繁殖的温度一般在常温下就可以进行，无需使用其他能源，极易得到，分布的也较为广泛，因此人们开始致力于研究低温微生物，也受到了一些专家和学者的关注。目前为止，对于低温微生物的开发和利用上相对较少，从国内外的研究进展来看，仍然是研究中、高温微生物的居多，而且对于土壤低温微生物降解菌的研究甚少。

秸秆还田是一项提高秸秆利用率，提高土壤肥力的有效措施,也是秸秆资源化利用的主要方式。但是在北方由于温度等原因影响,秸秆进入土壤之后，腐解较慢，达不到预期的效果。为了使秸秆能够快速腐解，起到培肥土壤，又不影响下季耕种的作用，通过秸秆异位还田施用低温高效快速分解秸秆的菌剂是非常必要。

总之，一种低温秸秆堆腐复合菌剂的筛选方法及应用尚未见报道。

发明内容

本发明目的是针对上述问题，提供了一种低温秸秆堆腐复合菌剂的筛选方法及应用。

为了实现本发明的上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种低温秸秆堆腐复合菌剂，包括枯草芽孢杆菌和酵母菌两种菌株，保藏机构为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，枯草芽孢杆菌保藏编号为CGMCCNo.18001，保藏日期为2019年6月19日；酵母菌保藏编号为CGMCCNo.18002，保藏日期为2019年6月19日。

本发明的优点是：

1、本发明通过在采集东北地区低温森林土壤，富集分解秸秆低温培养，筛选到低温高效降解秸秆的微生物菌株，可在低温(5℃)下产生高效纤维素酶，分解秸秆，可用于东北低温冷凉地区秸秆还田的腐熟菌剂。通过上述菌剂低温发酵降解玉米秸秆，异位还田后改善土壤团粒结构，营造有益菌群优势，促进了土壤团粒结构的形成，极大地改善了土壤的微生态系统，增强了土壤透气性，提高了土壤保水保肥能力。

2、本发明使土壤有了可持续增产增收的发展潜力。并且有效转化秸秆中的养分，释出小分子养份与活性因子，改良土壤肥力，培肥土壤。

3、本发明生产的肥料产品具有独特的低温分解秸秆的特点，并且成本低廉，施用后可以有效改善改良土壤理化性状，提高种子出苗率，增强秧苗的抗旱、抗寒、病虫害的能力。

附图说明

图1是本发明的5℃条件下液体培养条件下H4纤维酶酶学动力学变化图。

图2是本发明的5℃条件下液体培养条件下TY-1纤维酶酶学动力学变化图。

图3是本发明的5℃条件下复筛H4和TY-1菌株分解秸秆效率变化图。

图4是本发明的低温秸秆腐解菌株对玉米秸秆堆肥温度的影响图。

图5是本发明的低温秸秆腐解菌株对玉米秸秆堆肥中半纤维素的影响图。

图6是本发明的低温秸秆腐解菌株对玉米秸秆堆肥中纤维素的影响图。

图7是本发明的低温秸秆腐解菌株对玉米秸秆堆肥中木质素的影响图。

具体实施方式

下面结合说明书附图1-7及实施例对本发明进一步详细说明。

一种低温秸秆堆腐复合菌剂，包括枯草芽孢杆菌(TY-1)和酵母菌 (H4)两种菌株，保藏机构为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis保藏编号为CGMCC No.18001，保藏日期为2019年6月19日；酵母菌Saccharomycessp.保藏编号为CGMCC No.18002，保藏日期为2019年6月19日。

菌株的分离方法：

将采集的东北地区寒地森林土壤悬液按10％的接种量接种于含有 100mg/L秸秆粉末的无机盐培养基中，10℃下摇床150r/min，培养3 天后，以5℃下10％接种量转至秸秆浓度为300mg/L的无机盐培养基中，继续培养；按此方式连续循环3次，三次所用的无机盐培养基中的秸秆浓度依次为300mg/L、600mg/L、1000mg/L，然后进行平板涂布，将培养皿放于5℃恒温培养箱中培养72h，挑取单菌落，转接入秸秆浓度为1000mg/L的无机盐培养基中，得到秸秆降解菌菌悬液。

无机盐培养基的组成为(NH₄)₂SO₄ 2g/L，KH₂PO₄ 2g/L，Na ₂HPO₄1.3g/L，秸秆100～1000m g/L，NaCl 5g/L，余量为水；培养基的PH＝4.8～7.2。

菌株的筛选：

a.初筛：将5ml1000mg/L无机盐培养基加到15mm×150mm试管中，121℃下灭菌30min后冷却至室温，接着将1ml秸秆降解菌菌悬液加入到试管中，每株菌重复2管，5℃低温避光培养5天，每24h观察记录1次生长情况；将纯化后的菌株点种到纤维素刚果红培养基上，5℃培养4天.根据水解圈直径(D)与菌落直径(d)比值(D/d)的大小进行初选,即D/d值越大越好。

b、复筛：将50ml1000mg/L无机盐培养基加到250ml三角瓶中,121 ℃下灭菌30min后冷却至室温，接着将每个三角瓶中加入1ml初筛得到的秸秆降解菌菌悬液，5℃下避光培养10天，检测秸秆残留量，同时设立空白对照组，空白对照组中用无菌水代替菌悬液，计算降解率；并将初筛得到的秸秆分解菌株的菌悬液1mL分别接种到1000mg/L无机盐液体发酵培养基中，5℃下培养3天，测定其纤维素酶活力，进行复选。

复合微生物菌剂的制备方法：

将酵母菌和枯草芽孢杆菌按照2:3的菌株比例置于培养基中，在 pH＝4.8～7.2,温度为5～15℃的条件下培养12-28小时，得到的产物复合微生物菌剂。

一种低温秸秆堆腐复合菌剂的应用，应用复合微生物菌剂的制备肥料的方法：

(1)将酵母菌H4、枯草芽孢杆菌TY-1按照2:3的菌株比例置于培养基中，在pH＝4.8～7.2,温度为5～15℃的条件下培养12-28小时，得到的复合微生物菌剂；

(2)培养基的组成，按重量百分比为，可溶性淀粉2～3％，蛋白胨0.5～1％,(NH₄)₂SO₄ 0.5～1％，K₂HPO₄ 0.07～0.1％，KH₂PO₄ 0.03～ 0.5％，MgSO₄·7H₂O 0.01～0.05％，余量为水；

培养基的组成及重量配比为，可溶性淀粉2％，蛋白胨0.5％, (NH₄)₂SO₄ 0.5％，K₂HPO₄ 0.07％，KH₂PO₄ 0.03％，MgSO₄·7H₂O 0.01％，余量为水。

枯草芽孢杆菌TY-1该菌16SrDNA序列发表在GenBank，登陆号为 DPYBCB8U015，其16SrDNA序列为：

gggaatggcgggtgctatacatgcaagtcgagcggacagatgggagcttgctccct gatgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataa ctccgggaaaccggggctaataccggatggttgtttgaaccgcatggttcaaacataaa aggtggcttcggctaccacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggt aacggctcaccaaggcaacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggac gaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctg ttgttagggaagaacaagtaccgttcgaatagggcggtaccttgacggtacctaaccag aaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtc cggaattattgggcgtaaagggctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccc cggctcaaccggggagggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagaggagagtg gaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggc gactctctggtctgtaactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattag ataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgcccc ttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaa actcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagc aacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaatcctagagataggacgtcc ccttcggggcagagtgacaagtgtgcatgctgtcgtcagctcgtgtcatgagatgtggg ttagtcccgcaacgagcgcaacctgatcttgtgccagcattcagtggcactcctaaggt gactgccggtgtccaaccacttcctgtcacttcggcggctggctcctaaaaggttacct caccgacttcgggtgttacaaactctcgtggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgg gaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcgattccagcttcacgcagt cgagttgcagactgcgatccgaactgagaacagatttgtgggattggcttaacctcgcg gtttcgctgccctttgttctgtccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtcaccttagag tgcccaactgaatgctggcaactaagatcaagggttgcgctcgttgcgggacttaaccc aacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcactctgcccccgaag gggacgtcctatctctaggattgtcagaggatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgt tgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgag tttcagtcttgcgaccgtactccccaggcggagtgcttaatgcgttagctgcagcacta aggggcggaaaccccctaacacttagcactcatcgtttacggcgtggactaccagggta tctaatcctgttcgctccccacgctttcgctcctcagcgtcagttacagaccagagagt cgccttcgccactggtgttcctccacatctctacgcatttcaccgctacacgtggaatt ccactctcctcttctgcactcaagttccccagtttccaatgaccctccccggttgagccgggggctttcacatcagac。

酵母菌H4该菌26S rDNA序列发表在GenBank，登陆号为 DPYBCB8U014，其26S rDNA序列为：

Tatgtcacatcctaagcacgtacgtggacgaatcccggccataaaggcgtgctgcg ttcctcagtcccaaccactgtatgtgacaggaggctataagtttacccgagggtactac gttcctccagcctttatccagcgatcaaaactgatgttgaccccactcaaaggaagtac accggcagaaccggctgaatccaaagagcacgactgacttcaatcgtttccctttcaac aatttcacatactgtttaactctctttccaaagtgcttttcatctttccctcacggtacttgttcgctatcggtctctcgccaatatttagctttagatggaatttaccacccatttt gagctgcattcccaaacaactcgactcgttgaaaatgtatcacagagcactggtagttc atgtcaaggacgggattctcaccctctatgacgccctgttccaagggacttgtacatga gccagcacggaaaacacttctatagattacaactcggatgacctgaggccaccagattt caaatttgagctcttcccgcttcactcgccgttactaggggaatccttgttagtttcttttcctccgcttccgggtatatgca。

本发明的两株菌株对含有秸秆100～1000mg/L在144小时内可有效分解最高降解率达到75.47％，两个菌株酶学动力学上，分别在72小时、 96小时达到纤维素酶峰值。

实施案例

CK：1吨玉米秸秆调节含水量达到50％。

H4：在CK基础上添加菌剂H4 4kg。

TY-1：在CK基础上添加TY-1 6kg。

H4+TY-1：在CK基础上添加H4+TY-1复合微生物菌剂(2:3)10kg。

堆肥时间：2019.3.13-2019.4.25。

堆肥地点：沈阳。

具体流程:堆肥每堆1000kg，将玉米秸秆平行于地面整齐堆放，每升高20cm时，在其表面分别撒少许接种菌剂，同时踩踏紧实，堆高保持1.5高，外表面覆盖农用塑料薄膜，共堆积45天。

指标：测定不同时期的秸秆堆肥温度和秸秆的木质素、纤维素、半纤维素含量。

结果表明：在春季平均气温6℃条件下，通过添加低温玉米秸秆腐解菌，秸秆堆肥平均温度达到58.7℃，比对照提高86.7％，，木质素、纤维素、半纤维素含量比对照降低20.6-66.7％。说明低温秸秆腐解菌剂可以提高堆肥温度，并加速分解秸秆中木质素和纤维素、半纤维素含量。

序列表

<110> 辽宁省农业科学院

<120> 一种低温秸秆堆腐复合菌剂的筛选方法及应用

<141> 2019-08-09

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2022

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<400> 1

gggaatggcg ggtgctatac atgcaagtcg agcggacaga tgggagcttg ctccctgatg 60

ttagcggcgg acgggtgagt aacacgtggg taacctgcct gtaagactgg gataactccg 120

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tctcgtggtg tgacgggcgg tgtgtacaag gcccgggaac gtattcaccg cggcatgctg 1260

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tgtagcacgt gtgtagccca ggtcataagg ggcatgatga tttgacgtca tccccacctt 1440

cctccggttt gtcaccggca gtcaccttag agtgcccaac tgaatgctgg caactaagat 1500

caagggttgc gctcgttgcg ggacttaacc caacatctca cgacacgagc tgacgacaac 1560

catgcaccac ctgtcactct gcccccgaag gggacgtcct atctctagga ttgtcagagg 1620

atgtcaagac ctggtaaggt tcttcgcgtt gcttcgaatt aaaccacatg ctccaccgct 1680

tgtgcgggcc cccgtcaatt cctttgagtt tcagtcttgc gaccgtactc cccaggcgga 1740

gtgcttaatg cgttagctgc agcactaagg ggcggaaacc ccctaacact tagcactcat 1800

cgtttacggc gtggactacc agggtatcta atcctgttcg ctccccacgc tttcgctcct 1860

cagcgtcagt tacagaccag agagtcgcct tcgccactgg tgttcctcca catctctacg 1920

catttcaccg ctacacgtgg aattccactc tcctcttctg cactcaagtt ccccagtttc 1980

caatgaccct ccccggttga gccgggggct ttcacatcag ac 2022

<210> 2

<211> 611

<212> DNA

<213> Saccharomyces

<400> 2

tatgtcacat cctaagcacg tacgtggacg aatcccggcc ataaaggcgt gctgcgttcc 60

tcagtcccaa ccactgtatg tgacaggagg ctataagttt acccgagggt actacgttcc 120

tccagccttt atccagcgat caaaactgat gttgacccca ctcaaaggaa gtacaccggc 180

agaaccggct gaatccaaag agcacgactg acttcaatcg tttccctttc aacaatttca 240

catactgttt aactctcttt ccaaagtgct tttcatcttt ccctcacggt acttgttcgc 300

tatcggtctc tcgccaatat ttagctttag atggaattta ccacccattt tgagctgcat 360

tcccaaacaa ctcgactcgt tgaaaatgta tcacagagca ctggtagttc atgtcaagga 420

cgggattctc accctctatg acgccctgtt ccaagggact tgtacatgag ccagcacgga 480

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cttcccgctt cactcgccgt tactagggga atccttgtta gtttcttttc ctccgcttcc 600

gggtatatgc a 611

Claims (7)

1.一种低温秸秆堆腐复合菌剂，其特征在于，包括枯草芽孢杆菌和酵母菌两种菌株，保藏机构为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，枯草芽孢杆菌保藏编号为CGMCCNo.18001，保藏日期为2019年6月19日；酵母菌保藏编号为CGMCCNo.18002，保藏日期为2019年6月19日。

2.根据权利要求书1所述的一种低温秸秆堆腐复合菌剂，其特征在于，

菌株的分离方法：

将采集的东北地区寒地森林土壤悬液按10％的接种量接种于含有100mg/L秸秆粉末的无机盐培养基中，10℃下摇床150r/min，培养3天后，以5℃下10％接种量转至秸秆浓度为300mg/L的无机盐培养基中，继续培养；按此方式连续循环3次，三次所用的无机盐培养基中的秸秆浓度依次为300mg/L、600mg/L、1000mg/L，然后进行平板涂布，将培养皿放于5℃恒温培养箱中培养72h，挑取单菌落，转接入秸秆浓度为1000mg/L的无机盐培养基中，得到秸秆降解菌菌悬液。

3.根据权利要求书2所述的一种低温秸秆堆腐复合菌剂，其特征在于，

无机盐培养基的组成为(NH₄)₂SO₄ 2g，KH₂PO₄ 2g，Na₂HPO₄ 1.3g，秸秆100～1000m g，NaCl 5g，余量为水定容到1L；培养基的PH＝4.8～7.2。

4.根据权利要求书1所述的一种低温秸秆堆腐复合菌剂，其特征在于，

菌株的筛选：

a.初筛：将5ml,1000mg/L无机盐培养基加到15mm×150mm试管中，121℃下灭菌30min后冷却至室温，接着将1ml秸秆降解菌菌悬液加入到试管中，每株菌重复2管，5℃低温避光培养5天，每24h观察记录1次生长情况；将纯化后的菌株点种到纤维素刚果红培养基上，5℃培养4天.根据水解圈直径D与菌落直径d比值D/d的大小进行初选,即D/d值越大越好；

b、复筛：将50ml,1000mg/L无机盐培养基加到250ml三角瓶中,121℃下灭菌30min后冷却至室温，接着将每个三角瓶中加入1ml初筛得到的秸秆降解菌菌悬液，5℃下避光培养10天，检测秸秆残留量，同时设立空白对照组，空白对照组中用无菌水代替菌悬液，计算降解率；并将初筛得到的秸秆分解菌株的菌悬液1mL分别接种到1000mg/L无机盐液体发酵培养基中，5℃下培养3天，测定其纤维素酶活力，进行复选。

5.根据权利要求书1所述的一种低温秸秆堆腐复合菌剂，其特征在于，

复合微生物菌剂的制备方法：

将酵母菌和枯草芽孢杆菌按照2:3的菌株比例置于培养基中，在pH＝4.8～7.2，温度为5～15℃的条件下培养12-28小时，得到的产物复合微生物菌剂。

6.一种低温秸秆堆腐复合菌剂的应用，其特征在于，

应用复合微生物菌剂的制备肥料的方法：

(1)将酵母菌H4、枯草芽孢杆菌TY-1按照2:3的菌株比例置于培养基中，在pH＝4.8～7.2，温度为5～15℃的条件下培养12-28小时，得到的复合微生物菌剂；

(2)培养基的组成，按重量百分比为，可溶性淀粉2～3％，蛋白胨0.5～1％,(NH₄)₂SO₄0.5～1％，K₂HPO₄ 0.07～0.1％，KH₂PO₄ 0.03～0.5％，MgSO₄·7H₂O 0.01～0.05％，余量为水。

7.根据权利要求书6所述的一种低温秸秆堆腐复合菌剂的应用，其特征在于，

培养基的组成及重量配比为，可溶性淀粉2％，蛋白胨0.5％,(NH₄)₂SO₄0.5％，K₂HPO₄0.07％，KH₂PO₄ 0.03％，MgSO₄·7H₂O 0.01％，余量为水。