CN109593686B - 一种希瓦氏菌及其在控制菜地土壤氮素污染中的应用 - Google Patents

一种希瓦氏菌及其在控制菜地土壤氮素污染中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及土壤氮素污染控制技术领域，特别是涉及一种希瓦氏菌及其在控制菜地土壤氮素污染中的应用。该希瓦氏菌保藏编号为CGMCC No.16843，保藏日期为2018年11月30日，本发明还公开了上述菌株的分子生物学特性和培养方法，验证了其具有促进作物生长的特性，并进一步将其作为土壤调理剂用于控制菜地土壤氮素污染。

Description

一种希瓦氏菌及其在控制菜地土壤氮素污染中的应用
技术领域
本发明涉及土壤氮素污染控制技术领域，特别是涉及一种希瓦氏菌及其在控制菜地土壤氮素污染中的应用。
背景技术
我国是传统农业大国，为了追求蔬菜作物的高产，农民往往在菜地使用大量的氮肥。蔬菜的生长周期短，施肥灌溉频率相较于其他农作物高，长期如此，菜地土壤氮投入量远远大于作物需求量，因此导致土壤中的氮素含量不断累积，尤其是菜地土壤中硝态氮的含量急剧增加。并且，氮素积累导致作物对氮素吸收利用率降低，同时，硝态氮不易被土壤胶体吸附，因此导致地表水及地下水的硝酸盐污染以及氮肥的严重浪费。
目前对氮素污染的主要方法包括水肥控制技术、化学添加剂技术、填闲作物技术、种植制度优化技术以及汇源景观组合及生态拦截技术等。水肥控制技术主要强调合理施肥与灌溉的结合，主要从源头控制氮肥的使用。化学添加剂技术是指在蔬菜生产上适当施用化学添加剂如硝化抑制剂来减少铵态氮向硝态氮的转化或者使用生物炭等提高作物对氮素的利用。填闲作物技术是指在蔬菜作物轮作的间歇期，种植填闲作物降低硝态氮在土壤中的累积。种植制度优化技术是指通过调控种植制度如改变作物轮作模式结合管理制度提高氮肥的利用率。汇源景观组合及生态草带拦截技术主要包括作物种植带组合、生态草带以及生态沟渠技术等。
目前所有涉及土壤氮素污染控制的技术中，多数技术未涉及通过微生物调控控制氮素污染的技术，只有公开号为CN108342343A公开了一种微生物复合菌剂，可以降低土壤中氮磷含量。
希瓦氏菌属γ-变形菌门细菌，其目前主要应用涉及微生物燃料电池制造、污水处理、合成纳米金属、控制蓝藻、生产胞外多糖以及微生物转化肉桂醇等。例如，公开号为CN101838622A、CN101880638、CN102315471A、CN101645515A、CN103275887A、CN104263672B、CN108531500A、CN101645515A的专利申请公开了希瓦氏菌在微生物电池中的应用；公开号为CN1621513A、CN102925383A、CN101942400A、CN104560823B、CN106007000A、CN107236684A、CN105754902B、CN101486989B、CN102174401A的专利申请公开了希瓦氏菌在水体污染物、固体有机废弃物以及染料处理中的应用；公开号为CN102715357A、CN103232950A、CN104531560B、CN103966137B、CN103173383B、CN103509744B的专利申请公开了希瓦氏菌在海洋养殖以及抑制蓝藻中的应用；公开号为CN104588677B的专利申请公开了希瓦氏菌合成纳米金的方法；公开号为CN105838647A的专利申请公开了冷海希瓦氏菌胞外多糖的生产方法；公开号为CN105524950A的专利申请公开了利用腐败希瓦氏菌选择性加氢制备肉桂醇的方法。另外，希瓦氏菌能够还原硝酸盐以及亚硝酸盐产生氮气或者铵盐。
目前未见到希瓦氏菌对植物具有促进生长作用或者在菜地土壤修复氮素污染中的应用。
发明内容
本发明是针对上述存在土壤氮素污染问题而提供的一种希瓦氏菌及其在控制菜地土壤氮素污染中的应用，该希瓦氏菌具有促进作物生长的特性。
本发明的技术方案为：
一种希瓦氏菌，保藏编号为CGMCC No. 16843，保藏日期为2018年11月30日。
本发明的希瓦氏菌是由山东省科学院生态研究所分离获得并保存，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，其保藏编号是：CGMCC NO. 16843，分类命名：希瓦氏菌Shewanella sp.，参据微生物（株）：A0B14，保藏日期为2018年11月30日。
经过16S rDNA序列鉴定，本发明的希瓦氏菌A0B14的分子生物学特性为菌体短杆状，弯曲，革兰氏阴性，菌落酪黄色，较小，光滑，边缘规整，略凸起。
所述的希瓦氏菌Shewanellasp.A0B14，其16S rDNA序列如SEQ NO.1所示。
本发明的另一目的还提供一种希瓦氏菌在控制菜地土壤氮素污染中的应用，用于降低菜地土壤中氮素含量。
进一步的，本发明的应用在于，所述的希瓦氏菌具有促进植物生长的应用，进一步为菌体浸种提高作物根系长度和植株高度。
进一步的，本发明的希瓦氏菌在制备菜地土壤氮素污染控制菌剂中的应用。
本发明的菜地土壤氮素污染控制菌剂为希瓦氏菌A0B14或其发酵液，用于降低菜地土壤中氮素含量。
本发明中，希瓦氏菌A0B14发酵液的制备方法，具体步骤如下：
（1）种子培养
一级种子的制备：使用培养基为LB培养基，成分为蛋白胨10g，氯化钠10g，酵母提取物5g，琼脂10g，pH调整至7.0-7.2，加水定容至1000 mL，121℃灭菌15min备用；A0B14接种到上述LB培养基200ml后，180rpm/min、30℃培养过夜至OD600为0.6-0.8，上述培养液作为一级种子；
二级种子的制备：使用培养基为LB培养基，成分为蛋白胨10g，氯化钠10g，酵母提取物5g，琼脂10g，pH调整至7.0-7.2，加水定容至1000 mL，121℃灭菌15min备用；一级种子10ml接种到上述LB培养基100ml后，180rpm/min、30℃培养过夜至OD600为0.8以上，上述培养液作为二级种子；
（2）发酵培养
使用大豆粉10重量份、玉米粉6重量份、葡萄糖4重量份、酵母粉5重量份、水275份混匀后灭菌制成培养基，将二级种子接种到上述培养基中，接种量10%，180rpm/min、30℃培养发酵5天后得发酵液。
本发明得到的菜地土壤氮素污染控制菌剂作为肥料施用。
本发明的有益效果为：
本发明的希瓦氏菌具有促进植物生长的特性，并可以控制菜地土壤氮素污染，该希瓦氏菌菌或其发酵液可以作为菜地土壤氮素污染控制菌剂使用，用于降低菜地土壤中氮素含量。
总之，本发明的具有植物促生作用的希瓦氏菌属可以作为肥料使用减少菜地化肥的施用量，同时，希瓦氏菌可以还原土壤中过量的硝酸盐和亚硝酸盐，减轻菜地土壤氮素污染问题，对于控制土壤氮素污染，改善农田生态环境具有重大意义。
本发明验证了其具有促进作物生长的活性以及在控制菜地土壤氮素污染中的应用。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1
希瓦氏菌A0B14的分离培养和筛选纯化
样品为山东省兰陵县鸿强蔬菜产销专业合作社温室大棚根际土壤，将采集的土壤放入封口袋并记录。
土壤样品带回实验室后，取0.1g 土样加入到5 mL PBS缓冲液中，充分震荡混匀后，2000g 离心取上清，10倍梯度稀释至10-8，然后取10-4至10-7稀释液涂布于LB平板，28℃培养箱培养36h后，挑取单菌落划线于新的LB平板，挑取划线后的单菌落保存在LBA平板。
准备试剂A和B，A为氨基苯磺酸5 mol/L（醋酸溶液100mL），B为α-萘胺5mol/L（醋酸溶液100mL），取纯菌株一部分接种于硝酸盐培养基(内含小倒管)中，35℃孵育1-4d。将AB等量混合液(用时混合) 0.1mL加于试管内， 10min内观察结果，以一支未接种细菌的培养基作对照试验，若出现红色为阳性反应。如欲观察有无氮气产生，可于培养基管内加1只小倒管，有气泡产生，则表示有氮气生成。如欲检查培养基中硝酸盐是否被分解，可取锌粉少许加入培养基内，如出现红色表明硝酸盐仍存在；若不出现红色，表示硝酸盐已被分解。挑选有阳性反应的菌株进行鉴定。
所用固体基为LB养基，具体成分为蛋白胨10g，氯化钠10g，酵母提取物5g，琼脂10g，pH调整至7.0-7.2，加水定容至1000 mL，121℃灭菌15 min备用；液体培养基LB方成分与固体培养基相似，只是不加入琼脂。
菌株鉴定
将所得菌株使用LB培养12h后，取1 mL菌液2000g离心10 min收集菌体，使用DNA提取试剂盒提取菌株基因组DNA。采用细菌16S rDNA通用引物1492 R (5’-GGCTCGAGCGGCCGCCCGGGTTACCTTGTTACGACTT-3’)和8F (5’-GCGGATCCGCGGCCGCTGCAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)以基因组DNA为模板对细菌16S rDNA序列进行扩增，扩增后PCR产物送上海生工生物有限公司测序，并将序列上传至GenBank数据库，所得序列号为MK156203，使用细菌模式种数据库EzBioCloud进行鉴定时，菌株A0B14序列与多株希瓦氏菌的相似性超99 %，只能将该菌株鉴定到属Shewanellasp.。该菌株已经保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：中国，北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2018年11月30日，保藏号：CGMCC No.16843。
实施例2
希瓦氏菌Shewanellasp. A0B14对辣椒的促生效果
在花盆中使用无菌土壤种植辣椒，待植株高度约7cm左右时进行实验。
希瓦氏菌A0B14发酵液的制备方法，具体步骤如下：
（1）种子培养
一级种子的制备：使用培养基为LB培养基，成分为蛋白胨10g，氯化钠10g，酵母提取物5g，琼脂10g，pH调整至7.0-7.2，加水定容至1000 mL，121℃灭菌15min备用；液体培养基LB方成分与固体培养基相似，只是不加入琼脂。A0B14接种到上述LB培养基200ml后，180rpm/min、30℃培养过夜至OD600为0.6-0.8，上述培养液作为一级种子。
二级种子的制备：使用培养基为LB培养基，成分为蛋白胨10g，氯化钠10g，酵母提取物5g，琼脂10g，pH调整至7.0-7.2，加水定容至1000 mL，121℃灭菌15min备用；液体培养基LB方成分与固体培养基相似，只是不加入琼脂。一级种子10ml接种到上述LB培养基100ml后，180rpm/min、30℃培养过夜至OD600为0.8以上，上述培养液作为二级种子。
（2）发酵培养
使用大豆粉10重量份、玉米粉6重量份、葡萄糖4重量份、酵母粉5重量份、水275份混匀后灭菌制成培养基，将二级种子接种到上述培养基中，接种量10%，180rpm/min、30℃培养发酵5天后得发酵液。
取1mLA0B14发酵液（液体培养基培养）加入到辣椒苗根部进行灌根处理，对照组使用1mL 培养基液体代替菌液，重复7次，每棵辣椒苗作为一个重复。每周灌根处理一次，连续三周后测定植株生长高度和根系生长状况。结果表明，希瓦氏菌Shewanellasp. A0B14处理后辣椒植株的根系变长、植株高度增加。因此，该菌株对于辣椒具有促生效果。
实施例3
希瓦氏菌Shewanellasp. A0B14土壤氮素污染控制菌剂对菜地土壤氮素污染的控制效果
希瓦氏菌A0B14发酵液的制备方法，具体步骤如下：
（1）种子培养
一级种子的制备：使用培养基为LB培养基，成分为蛋白胨10g，氯化钠10g，酵母提取物5g，琼脂10g，pH调整至7.0-7.2，加水定容至1000 mL，121℃灭菌15min备用；液体培养基LB方成分与固体培养基相似，只是不加入琼脂。A0B14接种到上述LB培养基200ml后，180rpm/min、30℃培养过夜至OD600为0.6-0.8，上述培养液作为一级种子。
二级种子的制备：使用培养基为LB培养基，成分为蛋白胨10g，氯化钠10g，酵母提取物5g，琼脂10g，pH调整至7.0-7.2，加水定容至1000 mL，121℃灭菌15min备用；液体培养基LB方成分与固体培养基相似，只是不加入琼脂。一级种子10ml接种到上述LB培养基100ml后，180rpm/min、30℃培养过夜至OD600为0.8以上，上述培养液作为二级种子。
（2）发酵培养
使用大豆粉10重量份、玉米粉6重量份、葡萄糖4重量份、酵母粉5重量份、水275份混匀后灭菌制成培养基，将二级种子接种到上述培养基中，接种量10%，180rpm/min、30℃培养发酵5天后得发酵液。
将上述A0B14发酵液菌剂对温室栽培的辣椒进行灌根处理，每棵辣椒20 mL；另外设立两个对照组，阴性对照使用清水处理，阳性对照正常使用化肥施肥，每个处理150棵辣椒。菌剂处理组和清水对照组每周处理一次，连续处理三次，施肥组正常施肥，在整个生长季结束后测定土壤中硝态氮含量以及辣椒产量，比较三个处理间差异。结果表明，菌剂处理组与肥料处理组辣椒产量无显著差异，均高于清水处理组；土壤硝态氮检测表明，清水组、菌剂处理组、肥料处理组硝态氮含量依次上升，菌剂处理组硝态氮含量显著低于肥料处理组硝态氮含量。因此，希瓦氏菌Shewanellasp. A0B14土壤氮素污染控制菌剂对设施大棚菜地土壤氮素污染具有显著的控制效果。
序列表
<110> 山东省科学院生态研究所(山东省科学院中日友好生物技术研究中心)
<120> 一种希瓦氏菌及其在控制菜地土壤氮素污染中的应用
<130> 19-1-010
<141>
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1446
<212> DNA
<213> Shewanella sp. A0B14
<400> 1
gactggcgcg gctaccatgc agtcgagcgg cagcacaagg gagtttactc ctgaggtggc 60
gagcggcgga cgggtgagta atgcctaggg atctgcccag tcgaggggga taacagttgg 120
aaacgactgc taataccgca tacgccctac gggggaaaga gggggacctt cgggcctctc 180
gcgattggat gaacctaggt gggattagct agttggtgag gtaatggctc accaaggcga 240
cgatccctag ctgttctgag aggatgatca gccacactgg gactgagaca cggcccagac 300
tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg cacaatgggg gaaaccctga tgcagccatg 360
ccgcgtgtgt gaagaaggcc ttcgggttgt aaagcacttt cagtagggag gaaagggtga 420
gtcttaatac ggctcatctg tgacgttacc tacagaagaa ggaccggcta actccgtgcc 480
agcagccgcg gtaatacgga gggtccgagc gttaatcgga attactgggc gtaaagcgtg 540
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gaactggcga actagagtct tgtagagggg ggtagaattc caggtgtagc ggtgaaatgc 660
gtagagatct ggaggaatac cggtggcgaa ggcggccccc tggacaaaga ctgacgctca 720
tgcacgaaag cgtggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga 780
tgtctactcg gagtttggtg tcttgaacac tgggctctca agctaacgca ttaagtagac 840
cgcctgggga gtacggccgc aaggttaaaa ctcaaatgaa ttgacggggg cccgcacaag 900
cggtggagca tgtggtttaa ttcgatgcaa cgcgaagaac cttacctact cttgacatcc 960
acggaagaga ccagagatgg acttgtgcct tcgggaactg tgagacaggt gctgcatggc1020
tgtcgtcagc tcgtgttgtg aaatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccctatc1080
cttatttgcc agcacgtaat ggtgggaact ctagggagac tgccggtgat aaaccggagg1140
aaggtgggga cgacgtcaag tcatcatggc ccttacgagt agggctacac acgtgctaca1200
atggcgagta cagagggttg caaagccgcg aggtggagct aatctcacaa agctcgtcgt1260
agtccggatt ggagtctgca actcgactcc atgaagtcgg aatcgctagt aatcgtggat1320
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gtaagt 1446
<210> 2
<211> 37
<212> DNA
<213> artificially synthesized
<400> 2
ggctcgagcg gccgcccggg ttaccttgtt acgactt 37
<210> 3
<211> 39
<212> DNA
<213> artificially synthesized
<400> 3
gcggatccgc ggccgctgca gagtttgatc ctggctcag 39
序列表
<110>山东省科学院生态研究所(山东省科学院中日友好生物技术研究中心)
<120>一种希瓦氏菌及其在控制菜地土壤氮素污染中的应用
<130> 19-1-010
<141>
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1446
<212> DNA
<213> Shewanella sp. A0B14
<400> 1
gactggcgcg gctaccatgc agtcgagcgg cagcacaagg gagtttactc ctgaggtggc 60
gagcggcgga cgggtgagta atgcctaggg atctgcccag tcgaggggga taacagttgg 120
aaacgactgc taataccgca tacgccctac gggggaaaga gggggacctt cgggcctctc 180
gcgattggat gaacctaggt gggattagct agttggtgag gtaatggctc accaaggcga 240
cgatccctag ctgttctgag aggatgatca gccacactgg gactgagaca cggcccagac 300
tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg cacaatgggg gaaaccctga tgcagccatg 360
ccgcgtgtgt gaagaaggcc ttcgggttgt aaagcacttt cagtagggag gaaagggtga 420
gtcttaatac ggctcatctg tgacgttacc tacagaagaa ggaccggcta actccgtgcc 480
agcagccgcg gtaatacgga gggtccgagc gttaatcgga attactgggc gtaaagcgtg 540
cgcaggcggt ttgttaagcg agatgtgaaa gccctgggct caacctagga atagcatttc 600
gaactggcga actagagtct tgtagagggg ggtagaattc caggtgtagc ggtgaaatgc 660
gtagagatct ggaggaatac cggtggcgaa ggcggccccc tggacaaaga ctgacgctca 720
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cggtggagca tgtggtttaa ttcgatgcaa cgcgaagaac cttacctact cttgacatcc 960
acggaagaga ccagagatgg acttgtgcct tcgggaactg tgagacaggt gctgcatggc 1020
tgtcgtcagc tcgtgttgtg aaatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccctatc 1080
cttatttgcc agcacgtaat ggtgggaact ctagggagac tgccggtgat aaaccggagg 1140
aaggtgggga cgacgtcaag tcatcatggc ccttacgagt agggctacac acgtgctaca 1200
atggcgagta cagagggttg caaagccgcg aggtggagct aatctcacaa agctcgtcgt 1260
agtccggatt ggagtctgca actcgactcc atgaagtcgg aatcgctagt aatcgtggat 1320
cagaatgcca cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccatggga 1380
gtgggctgca aaagaagtgg gtagcttaac cttcgggggg gcgctcacca ctttggttca 1440
gtaagt 1446
<210> 2
<211> 37
<212> DNA
<213> artificially synthesized
<400> 2
ggctcgagcg gccgcccggg ttaccttgtt acgactt 37
<210> 3
<211> 39
<212> DNA
<213> artificially synthesized
<400> 3
gcggatccgc ggccgctgca gagtttgatc ctggctcag 39

Claims (8)

1.一种希瓦氏菌（Shewanella sp.），其特征在于，保藏编号为CGMCC No. 16843，保藏日期为2018年11月30日。
2.如权利要求1所述的希瓦氏菌在控制菜地土壤氮素污染中的应用，其特征在于，用于降低菜地土壤中氮素含量。
3.如权利要求2所述的希瓦氏菌在控制菜地土壤氮素污染中的应用，其特征在于，所述的希瓦氏菌具有促进植物生长的应用。
4.如权利要求2所述的希瓦氏菌在控制菜地土壤氮素污染中的应用，其特征在于，菌体浸种提高作物根系长度和植株高度。
5.如权利要求2所述的希瓦氏菌在控制菜地土壤氮素污染中的应用，其特征在于，该希瓦氏菌用于制备菜地土壤氮素污染控制菌剂。
6.如权利要求2所述的希瓦氏菌在控制菜地土壤氮素污染中的应用，其特征在于，所述的菜地土壤氮素污染控制菌剂为如权利要求1所述的希瓦氏菌或其发酵液。
7.如权利要求6所述的希瓦氏菌在控制菜地土壤氮素污染中的应用，其特征在于，所述的希瓦氏菌发酵液由以下制备方法制备：
（1）种子培养
一级种子的制备：使用培养基为LB培养基，成分为蛋白胨10g，氯化钠10g，酵母提取物5g，琼脂10g，pH调整至7.0-7.2，加水定容至1000 mL，121℃灭菌15min备用；A0B14接种到上述LB培养基200ml后，180rpm/min、30℃培养过夜至OD600为0.6-0.8，上述培养液作为一级种子；
二级种子的制备：使用培养基为LB培养基，成分为蛋白胨10g，氯化钠10g，酵母提取物5g，琼脂10g，pH调整至7.0-7.2，加水定容至1000 mL，121℃灭菌15min备用；一级种子10ml接种到上述LB培养基100ml后，180rpm/min、30℃培养过夜至OD600为0.8以上，上述培养液作为二级种子；
（2）发酵培养
使用大豆粉10重量份、玉米粉6重量份、葡萄糖4重量份、酵母粉5重量份、水275份混匀后灭菌制成培养基，将二级种子接种到上述培养基中，接种量10%，180rpm/min、30℃培养发酵5天后得发酵液。
8.如权利要求5所述的希瓦氏菌在控制菜地土壤氮素污染中的应用，其特征在于，该菜地土壤氮素污染控制菌剂作为肥料施用。
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