CN102226206A - 一种聚羟基丁酸酯的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种聚羟基丁酸酯的制备方法，是利用保藏编号为CGMCC No.4815的贪铜菌菌株sh-1作为制备聚羟基丁酸酯的菌种，该方法是将菌种接种于斜面培养基，30℃下培养24h；取斜面培养物接种至装有种子培养基的三角瓶中，摇瓶转速180r/min、30℃下培养24h～36h；按10％的接种量将得到的种子液接入发酵培养基中，搅拌转速300～500r/min，通气量50～200L/min，发酵温度28℃～35℃，发酵至72小时停止；在发酵过程中，当发酵液中的溶氧量升至饱和溶氧量的80％时，向发酵液中补加浓度为10～300g/L葡萄糖溶液，当溶氧降至50％时停止。本发明可以实现高密度发酵和高产PHB。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及用贪铜菌(Cupriavidus sp.)菌株sh-1制备PHB的方法。
背景技术
聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates，简称PHA)是一种可由很多种微生物合成的包内聚酯，在微生物细胞内作为一种碳源和能源的储备物质。在营养匮乏的情况下，微生物降解PHA作为碳源和能源使用。PHA是一种可以生物合成和生物降解的高分子聚合物。PHA与传统的、以石油为原料合成的塑料如聚乙烯、聚丙烯等有相似的材料学性质，但可以用可再生的能源(如植物光合作用产生的碳水化合物、脂肪酸等)合成，并且可以完全降解进入自然界的生态循环，因此被认为是一种“绿色塑料”，可以替代不可降解的传统塑料，而引起世界各国科学界和产业界的广泛重视。自上个世纪八十年代起，关于PHA的研究越来越多，涉及到的学科领域也越来越广。近年来，研究表明，PHA具有一定的生物相容性，是有潜力的生物医学材料。
式1.PHA的结构通式
PHA的结构通式如式1所示。其中n＝1、2、3或4；通常n＝1，即为聚-3-羟基脂肪酸酯。m表示聚合度，决定分子量的大小。R是可变基团，可为饱和或不饱和、直链或含侧链及取代基的烷基。
PHA的单体大多数是链长3～14个碳原子的3-羟基脂肪酸，还有4-羟基和5-羟基脂肪酸。侧链R是高度可变的基团，大部分是直链的烷基，有些含有侧链；多数为饱和键，也有不饱和键；此外，有些R基团还有苯环、卤素、氰基等取代基团。
根据单体的碳原子数，可将PHA分为两类：短链(short-chain-length，scl)PHA，其单体由3-5个碳原子组成，如聚羟基丁酸酯(poly-hydroxybutyrate，简称PHB)、聚羟基戊酸酯(polyhydroxyvalerate，简称PHV)等；中长链(medium-chain-length，mcl)PHA，其单体由6-14个碳原子组成，如聚羟基己酸酯(polyhydroxyhexanoate，简称PHHx)、聚羟基辛酸酯(polyhydroxyoctanoate，简称PHO)等。
根据单体的种类，可将PHA分为同聚物(homopolymer)和共聚物(copolymer)两类：
(1)只有一种单体，如PHB、PHV等；
(2)含有两种或两种以上的单体，如PHBHHx、以3HB和3HV为单体的聚羟基丁酸羟基戊酸酯[poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate)，简称PHBV]等。
其中，PHB是由细菌合成的一种生物聚酯，在细菌胞内以内含物形式呈颗粒状存在。已有的生产菌株包括罗氏真养菌，巨大产碱菌，维氏固氮菌等，都能用于PHB的工业生产，但是生产的经济效益较低。
本发明的目的在于，寻找一株新的在相似的生产条件下，产量较高的PHB生产菌，从而降低PHB的生产成本。
发明内容
本发明的目的是提供一种用贪铜菌菌株sh-1制备聚羟基丁酸酯的方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种聚羟基丁酸酯的制备方法，其特征在于，所述的制备方法是利用贪铜菌菌株sh-1作为制备聚羟基丁酸酯的菌种，所述贪铜菌菌株sh-1的保藏编号为CGMCC No.4815。
上述贪铜菌(Cupriavidus sp.)菌株sh-1，已于2011年4月29日保藏于中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏单位地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.4815。
如上所述的聚羟基丁酸酯的制备方法，其中，
所述的制备方法的步骤为：
a.将所述贪铜菌菌株sh-1的菌种接种于斜面培养基，在30℃下培养24h；
b.取生长良好的斜面培养物接种至装有100mL种子培养基的500mL三角瓶中，在摇瓶转速为180r/min、培养温度30℃的条件下，培养24h～36h；
c.将步骤b中得到的种子液接种至装有发酵培养基的2L发酵罐中发酵，其中，发酵罐的装液量为1～1.8L，接种的种子液体积为加入后总体积的10％(即接种量为10％)，搅拌转速为300～500r/min，通气量为50～200L/min，发酵温度为28℃～35℃；
d.发酵至72小时左右，停止发酵；
在所述发酵过程中，当发酵液中的溶氧量升至饱和溶氧量的80％时，向发酵液中补加浓度为10～300g/L葡萄糖溶液，当溶氧降至50％时停止流加葡萄糖溶液；
所述饱和溶氧量是指所述发酵培养基在未接种种子液的情况下，在通气搅拌15min后，发酵培养基中的溶氧量，将其定义为100％。
如上所述的聚羟基丁酸酯的制备方法，其中，所述斜面培养基的配方为：酵母膏5～15g/L，蛋白胨5～15g/L，(NH4)2SO45g/L，琼脂15g/L，pH6～8；
所述种子培养基的配方为：酵母膏5～15g/L，蛋白胨5～15g/L，(NH4)2SO45g/L，pH6～8；
所述发酵培养基的配方为：Na2HPO4·7H2O 1～10g/L，KH2PO4 1～5g/L，MgSO4.7H2O 0.01～1g/L，柠檬酸铁铵20～100mg/L，CaCl2·2H2O 10～30mg/L，(NH4)2SO4 1～10g/L，葡萄糖10～100g/L，pH 6～8。
如上所述的聚羟基丁酸酯的制备方法，其中，所述斜面培养基的配方优选为：酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，(NH4)2SO4 5g/L，琼脂15g/L，pH7；
所述种子培养基的配方优选为：酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，(NH4)2SO45g/L，pH7；
所述发酵培养基的配方优选为：发酵培养基：Na2HPO4·7H2O 6g/L，KH2PO44g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，柠檬酸铁铵75mg/L，CaCl2·2H2O 25mg/L，(NH4)2SO47g/L，葡萄糖100g/L，pH7。
一种用于制备聚羟基丁酸酯的贪铜菌菌株sh-1，所述贪铜菌菌株sh-1的保藏编号为CGMCC No.4815。
所述菌株是从高碑店污水处理厂的活性污泥中按照下述方法分离得到：
a.细菌的富集
将50mL细菌培养基加入250mL三角瓶中，再加入1g含有细菌的活性污泥，30℃下摇瓶培养24h；
b.细菌的分离纯化
吸取富集后的培养物0.5mL，经生理盐水梯度稀释后，从稀释度为10-4，10-5，10-6的稀释液中，分别取0.1mL均匀涂布于固体细菌培养基平板上，放入恒温箱。30℃培养24h后，挑取单菌落，接种于固体细菌培养基。30℃培养24h后，镜检，若为单一形态的菌落则放入冰箱保存，若不纯，则再进行划线、分离，反复几次后得到纯培养菌种；
c.产PHA菌株的筛选
将细菌接种至筛选培养基，30℃下培养48h，经苏丹黑染色液染色后，用显微镜观察。若细胞内有蓝黑色颗粒，即为产PHA菌株。将筛选标准定为：显微镜视野中60％以上的细胞内含有蓝黑色颗粒的菌株入选；
d.利用气相色谱鉴定菌株所产PHA的种类，挑选所产PHA为PHB且产量较高的菌株，得到本发明的贪铜菌菌株sh-1；
其中，所述细菌培养基的配方为：牛肉膏0.5％，蛋白胨1.0％，NaCl 0.5％，pH7.0；
所述固体细菌培养基的配方为：牛肉膏0.5％，蛋白胨1.0％，NaCl 0.5％，琼脂粉1.5％，pH7.0；
所述筛选培养基的配方为：牛肉膏0.5％，蛋白胨1.0％，NaCl 0.5％，葡萄糖0.5％，pH7.0～7.2。
如上所述的贪铜菌菌株sh-1用于制备聚羟基丁酸酯的用途。
如上所述的聚羟基丁酸酯的制备方法，在停止发酵后，从发酵液中提取聚羟基丁酸酯的方法如下：
离心发酵液，去除上清，取沉淀部分的湿细胞，加入等重量的丙酮，在常温下搅拌3～5分钟，加入异戊醇，所加异戊醇的体积为加入丙酮搅拌后液体体积的4倍，50℃下搅拌30分钟后，90℃充分搅拌3小时，保温、静止分层，取上清液，冷却至4℃，离心取沉淀的PHB，加入无水乙醇洗涤，干燥后得到PHB。
如上所述的聚羟基丁酸酯的制备方法，聚羟基丁酸酯的分析方法如下：
发酵停止后离心收集菌体，冰冻干燥，计算细胞干重(CDW)。取80mg左右的干细胞于酯化管中，加入2mL酯化液及2mL氯仿，加盖密闭；所述酯化液是以1g/L苯甲酸作为内标，溶解于97％体积的甲醇和3％体积的浓硫酸中。在烘箱中100℃酯化4h。冷却至室温后，加入1mL蒸馏水，充分振荡混匀，静置分层。待氯仿相与水相完全分离后，取氯仿相进行气相色谱分析。
设定柱温为200℃，进样器温度为200℃，检测器温度为220℃，柱头压力为0.25MPa。程序升温条件为：80℃保持1.5min，以30℃/min的速度升温至140℃，以40℃/min的速度升温至220℃并保温0.5min。气相色谱柱长30m，固定相厚度为0.25μm，初始柱压为10psi，停留1.5min后，以2.5psi/min的速度升压至20psi，停留0.5min。样品的进样量为1μL。
本发明的有益效果如下：
经过本发明方法发酵后，发酵液中的细胞干重最高可达41.5g/L，PHB重量可达35.1g/L，达到细胞干重的84.7％，经过提取后，可得到29g/L的PHB，提取率达83％。该产量达到国内先进水平。
附图说明
图1为本发明实施例1所得到的聚羟基丁酸酯的气相色谱图。
图2为本发明实施例2所得到的聚羟基丁酸酯的气相色谱图。
具体实施方式
本中所使用的菌种为贪铜菌(Cupriavidus sp.)菌株sh-1，于2011年4月29日保藏于中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏单位地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.4815。
所述菌株是从高碑店污水处理厂的活性污泥中分离得到。
所述菌株分离培养过程中所使用培养基的配方为：
细菌培养基：牛肉膏0.5％，蛋白胨1.0％，NaCl 0.5％，pH7.0；
固体细菌培养基：牛肉膏0.5％，蛋白胨1.0％，NaCl 0.5％，琼脂粉1.5％，pH7.0；
筛选培养基：牛肉膏0.5％，蛋白胨1.0％，NaCl 0.5％，葡萄糖0.5％，pH7.0～7.2。
所述菌株的获得方法为：
a.细菌的富集
将50mL细菌培养基加入250mL三角瓶中，再加入1g含有细菌的活性污泥，30℃下摇瓶培养24h。
b.细菌的分离纯化
吸取富集后的培养物0.5mL，经生理盐水梯度稀释后，从稀释度为10-4，10-5，10-6的稀释液中，分别取0.1mL均匀涂布于固体细菌培养基平板上，放入恒温箱。30℃培养24h后，挑取单菌落，接种于固体细菌培养基。30℃培养24h后，镜检，若为单一形态的菌落则放入冰箱保存，若不纯，则再进行划线、分离，反复几次后得到纯培养菌种。
c.产PHA菌株的筛选
将细菌接种至筛选培养基，30℃下培养48h，经苏丹黑染色液染色后，用显微镜观察。若细胞内有蓝黑色颗粒，即为产PHA菌株。将筛选标准定为：显微镜视野中60％以上的细胞内含有蓝黑色颗粒的菌株入选。
d.利用气相色谱鉴定菌株所产PHA的种类，挑选所产PHA为PHB且产量较高的菌株，得到本发明的贪铜菌菌株sh-1。
实施例1
本实施例中所使用培养基的配方为：
斜面培养基：酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，(NH4)2SO45g/L，琼脂15g/L，pH7。
种子培养基：酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，(NH4)2SO45g/L，pH7。
发酵培养基：Na2HPO4·7H2O 2g/L，KH2PO42g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，柠檬酸铁铵50mg/L，CaCl2·2H2O 10mg/L，(NH4)2SO4 2g/L，葡萄糖60g/L，pH7。
一、PHB的生产：
a.将菌种接种于斜面培养基，在30℃下培养24h；
b.接种一环生长良好的斜面培养物至装有100mL种子培养基的500mL三角瓶中，摇瓶转速为180r/min，温度30℃下，培养24h；
c.按10％的接种量接入发酵培养基中，发酵罐容量为2L，装液量为1.5L，发酵罐中搅拌转速为400r/min，通气量为100L/min，发酵温度为30℃；
d.发酵至72小时，停止发酵。
在发酵过程中，利用溶氧控制葡萄糖的流加，当发酵液溶氧升至饱和溶氧的80％时，向发酵液中补加浓度为250g/L葡萄糖溶液，当溶氧降至50％时停止流加葡萄糖溶液。所述饱和溶氧量是指所述发酵培养基在未接种种子液的情况下，在通气搅拌15min后，发酵培养基中的溶氧量，将其定义为100％。
二、PHB的提取：
以8000r/min的转速离心发酵液5分钟，取沉淀部分的湿细胞，称重后加入等重量丙酮，常温搅拌3～5分钟，之后加入液体4倍体积的异戊醇，50℃下搅拌30分钟后，90℃充分搅拌提取3小时，保温、静止分层，取上清液，冷却至4℃保持30分钟，8000r/min离心5分钟，收集沉淀PHB，加入与沉淀等体积的无水乙醇，混匀，8000r/min离心5分钟，去上清，干燥得到PHB。
三、PHB的分析：
采用Agilent公司的GC6820气相色谱仪对PHB进行分析。
发酵停止后离心收集菌体，冰冻干燥，计算细胞干重(CDW)。取80mg左右的干细胞于酯化管中，加入2mL酯化液及2mL氯仿，加盖密闭；所述酯化液是以1g/L苯甲酸作为内标，溶解于97％体积的甲醇和3％体积的浓硫酸中。在烘箱中100℃酯化4h。冷却至室温后，加入1mL蒸馏水，充分振荡混匀，静置分层。待氯仿相与水相完全分离后，取氯仿相进行气相色谱分析。
用电子天平精确称量并记录约10mg左右的PHB标样(Sigma)，加入2mL酯化液及2mL氯仿，加盖密闭。在烘箱中100℃酯化4h。冷却至室温后，加入1mL蒸馏水，充分振荡混匀，静置分层。待氯仿相与水相完全分离后，取氯仿相进行气相色谱分析。
依照Agilent公司GC6820气相色谱仪的说明书操作气相色谱仪。设定柱温为200℃，进样器温度为200℃，检测器温度为220℃，柱头压力为0.25MPa。程序升温条件为：80℃保持1.5min，以30℃/min的速度升温至140℃，以40℃/min的速度升温至220℃并在此温度保持0.5min。气相色谱柱长30m，固定相厚度为0.25μm，初始柱压为10psi，停留1.5min后，以2.5psi/min的速度升压至20psi，停留0.5min。样品的进样量为1μL，进样时使用Agilent微量进样器。
如图1所示的气相色谱图，第一个峰为溶剂氯仿的峰，第二个峰为PHB单体甲酯化后得到的3-羟基丁酸甲酯(3HB)的峰，第三个峰为苯甲酸甲酯的峰。
以苯甲酸作为内标来定量PHB标准品，可以得到PHB的单体3-羟基丁酸甲酯化后色谱峰面积相对于苯甲酸甲酯化后峰面积的相对校正因子。经气相色谱工作站计算后得到样品中PHB的含量。
发酵液中的细胞干重为34.5g/L，PHB重量可达28.2g/L，经过提取后，可得到23.2g/L的PHB。
实施例2
本实施例中所使用培养基的配方为：
斜面培养基：酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，(NH4)2SO45g/L，琼脂15g/L，pH7。
种子培养基：酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，(NH4)2SO4 5g/L，pH7。
发酵培养基：Na2HPO4·7H2O 6g/L，KH2PO4 4g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，柠檬酸铁铵75mg/L，CaCl2·2H2O 25mg/L，(NH4)2SO4 7g/L，葡萄糖100g/L，pH7。
一、PHB的生产：
a.将菌种接种于斜面培养基，在30℃下培养24h；
b.接种一环生长良好的斜面培养物至装有100mL种子培养基的500mL三角瓶中，摇瓶转速为180r/min，温度30℃下，培养24h；
c.按10％的接种量接入发酵培养基中，发酵罐容量为2L，装液量为1.5L，发酵罐中搅拌转速为400r/min，通气量为180L/min，发酵温度为28℃；
d.发酵至72小时，停止发酵。
在发酵过程中，利用溶氧控制葡萄糖的流加，当发酵液溶氧升至饱和溶氧的80％时，向发酵液中补加浓度为200g/L葡萄糖溶液，当溶氧降至50％时停止流加葡萄糖溶液。
二、PHB的提取：
PHB的提取方法同实施例1。
三、PHB的分析：
PHB的分析方法同实施例1。
如图2所示的气相色谱图，第一个峰为溶剂氯仿的峰，第二个峰为PHB单体甲酯化后得到的3-羟基丁酸甲酯(3HB)的峰，第三个峰为苯甲酸甲酯的峰。
以苯甲酸作为内标来定量PHB标准品，可以得到PHB的单体3-羟基丁酸甲酯化后色谱峰面积相对于苯甲酸甲酯化后峰面积的相对校正因子。经气相色谱工作站计算后得到样品中PHB的含量。
发酵液中的细胞干重为41.5g/L，PHB重量可达35.1g/L，达到细胞干重的84.7％；经过提取后，可得到29g/L的PHB，提取率可达83％。
Claims (6)
1.一种聚羟基丁酸酯的制备方法，其特征在于，所述的制备方法是利用贪铜菌菌株sh-1作为制备聚羟基丁酸酯的菌种，所述贪铜菌菌株sh-1的保藏编号为CGMCC No.4815。
2.如权利要求1所述的聚羟基丁酸酯的制备方法，其特征在于，
所述的制备方法的步骤为：
a.将所述贪铜菌菌株sh-1的菌种接种于斜面培养基，在30℃下培养24h；
b.取斜面培养物接种至装有100mL种子培养基的500mL三角瓶中，在摇瓶转速为180r/min、培养温度30℃的条件下，培养24h～36h；
c.将步骤b中得到的种子液接种至装有发酵培养基的2L发酵罐中发酵，其中，发酵罐的装液量为1～1.8L，接种的种子液体积为加入后总体积的10％，搅拌转速为300～500r/min，通气量为50～200L/min，发酵温度为28℃～35℃；
d.发酵至72小时，停止发酵；
在所述发酵过程中，当发酵液中的溶氧量升至饱和溶氧量的80％时，向发酵液中补加浓度为10～300g/L葡萄糖溶液，当溶氧降至50％时停止流加葡萄糖溶液；
所述饱和溶氧量为：所述发酵培养基在未接种种子液的情况下通气搅拌15min后，发酵培养基中的溶氧量。
3.如权利要求2所述的聚羟基丁酸酯的制备方法，其特征在于，所述斜面培养基的配方为：酵母膏5～15g/L，蛋白胨5～15g/L，(NH4)2SO45g/L，琼脂15g/L，pH6～8；
所述种子培养基的配方为：酵母膏5～15g/L，蛋白胨5～15g/L，(NH4)2SO45g/L，pH6～8；
所述发酵培养基的配方为：Na2HPO4·7H2O 1～10g/L，KH2PO41～5g/L，MgSO4.7H2O 0.01～1g/L，柠檬酸铁铵20～100mg/L，CaCl2·2H2O 10～30mg/L，(NH4)2SO41～10g/L，葡萄糖10～100g/L，pH 6～8。
4.如权利要求2所述的聚羟基丁酸酯的制备方法，其特征在于，所述斜面培养基的配方为：酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，(NH4)2SO45g/L，琼脂15g/L，pH7；
所述种子培养基的配方为：酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，(NH4)2SO45g/L，pH7；
所述发酵培养基的配方为：发酵培养基：Na2HPO4·7H2O 6g/L，KH2PO44g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，柠檬酸铁铵75mg/L，CaCl2·2H2O 25mg/L，(NH4)2SO47g/L，葡萄糖100g/L，pH7。
5.一种用于制备聚羟基丁酸酯的贪铜菌菌株sh-1，其特征在于，所述贪铜菌菌株sh-1的保藏编号为CGMCC No.4815。
6.权利要求5所述的贪铜菌菌株sh-1用于制备聚羟基丁酸酯的用途。
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