CN111032876A - 聚酯的制造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种聚酯的制造方法,该聚酯至少含有3-羟基丁酸酯单元作为聚合单元,高分子量,并且分子量分布窄(即,Mw/Mn小)。上述聚酯的制造方法包括将微生物在含有碳源和氮源的培养液中培养的步骤,上述聚酯是重均分子量为100万以上且至少含有3-羟基丁酸酯单元作为聚合单元的聚酯,作为培养条件,培养液的渗透压在培养期间中维持为200mOsmol以上900mOsm以下,并且培养液的氮原子浓度在培养期间中维持为0.30g/L以上。
Description
技术领域
本发明涉及一种至少含有3-羟基丁酸酯单元作为聚合单元的聚酯的制造方法。
背景技术
大多微生物在其生物体内积累聚羟基脂肪酸酯(PHA)作为能量源、碳源储藏物质。已知在碳源充分而氮、磷、硫、氧、镁等营养元素受限时,会发生PHA的积累。PHA是热塑性的聚酯,作为生物分解性、生物体适应性的塑料受到瞩目,已进行大量的研究(非专利文献1)。构成PHA的单体单元已知有100种以上,最有代表性的物质为由(R)-3-羟基丁酸酯(以下,简称为3HB)构成的聚-3-羟基丁酸酯(以下,简称为P(3HB))(非专利文献1)。在非专利文献1中,示出了一般在培养的后段PHA的分子量降低。
在作为关于P(3HB)的制造研究的综述的非专利文献2中,记载了在限制磷的培养中,在P(3HB)的积累时分子量逐渐降低。
作为增大分子量的方法,有向不具有PHA合成系、分解系的大肠杆菌Escherichiacoli XL1-Blue导入取自P(3HB)合成细菌杀虫贪铜菌(Cupriavidus necator)的P(3HB)生物合成基因(phaCAB),将该基因重组菌在pH6培养来制造超高分子量P(3HB)的方法(非专利文献3)。
生产P(3HB)的野生株的P(3HB)的重均分子量Mw一般为50万~150万左右、20万~200万左右、进而1万~300万左右,野生型的微生物由于在菌体内具有大量的分解酶,因此难以合成达到Mw300万以上的超高分子量体P(3HB)。另外,P(3HB)被微生物作为能量源、碳源储藏物质积累,因此,在很多微生物中已发现当碳源耗尽时会将其分解使用。但是,也示出了显示同时发生PHA的合成和分解的例子。同时发生PHA的合成和分解的现象的生理学意义尚未得到阐明。另外,生产PHA的野生株中,由于这样同时发生PHA的合成和分解,因此,成为难以合成超高分子量体PHA的原因之一。
也大量进行了P(3HB-co-4HB)的制造研究,在作为生产P(3HB)的野生株的杀虫贪铜菌(Cupriavidus necator)中,通过赋予4-羟基丁酸酯(4HB)、γ-丁内酯、1,4-丁二醇、1,6-己二醇、1,8-辛二醇、1,10-癸二醇、1,12-十二烷二醇等的碳源进行培养,产生P(3HB-co-4HB)。
还报道有不使用生产P(3HB)的野生株,而是将大肠杆菌基因重组而生产P(3HB-co-4HB)、P(4HB)的方法。最初,导入从乙酰CoA生产P(3HB)所必需的来自杀虫贪铜菌(Cupriavidus necator)的β-酮硫解酶(PhaA)、乙酰乙酰CoA还原酶(PhaB)、PHA聚合酶(PhaC)的各基因phaA、phaB、phaC,并且导入来自克氏梭菌(Clostridium kluyveri)的琥珀酸分解途径的基因(sucD、4hbD、orfZ),由此,能够从琥珀酸提供4HB-CoA,在大肠杆菌中以葡萄糖为碳源生产分子量Mw为约180万的P(3HB-co-4HB),但是,PHA中的4HB比率低至1.3~1.5%(非专利文献4)。
另外,还报道有在P(3HB-co-4HB)的生产中利用ε-己内酯或作为其皂化物的6-羟基己酸酯(或其盐)。有报道称在将ε-己内酯作为碳源培养杀虫贪铜菌(Cupriavidusnecator)时,积累了PHA含量为26%至38%、4HB比率为30%至36%的P(3HB-co-4HB)(非专利文献5),但是没有分子量的记载。
另外,在杀虫贪铜菌(Cupriavidus necator)的PHA分解酶缺陷株中导入气单胞菌属(Aeromonas属)的PHA聚合酶基因的基因重组菌显示在烧瓶培养中能够生产重均分子量Mw300万以上的超高分子量体P(3HB-co-3HH),但是在发酵罐培养中停留于Mw200万左右(专利文献1)。
此外,已知通过在添加了二甲基亚砜(DMSO)等的聚乳酸的良溶剂的培养基中培养基因重组细菌,乳酸和3HB的共聚物的分子量提高(专利文献2)。
此外,在专利文献3中,记载了通过将能够生产PHA的贪铜菌属(Cupriavidus属)微生物的细胞中的PHA合成酶的比活性控制在0.1U/mg-protein以下,来合成分子量的PHA的微生物和制造高分子的PHA的方法。记载了通过使用专利文献3的微生物和方法能够在工业上高效地生产重均分子量400万以上的PHA。在专利文献4中,记载了通过将特定的微生物使用δ-戊内酯和/或ε-己内酯进行培养、或使用乙醇酸进行培养,生产具有游离的羟基的PHA。在专利文献3和4中,关于在培养中控制培养液的渗透压和氮原子浓度没有记载。另外,在专利文献5中,记载了含有50~99摩尔%的β-羟基丁酸酯重复单元和1~50摩尔%的β-羟基戊酸酯重复单元、且具有50,000以上的重均分子量的β-羟基丁酸酯共聚物。在专利文献5中,对于在培养中控制培养液的渗透压没有记载。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:国际公报WO2014/065253号
专利文献2:日本特开2017-29082号公报
专利文献3:国际公报WO2012/102371号
专利文献4:国际公报WO2017/033652号
专利文献5:日本特开平5-15383号公报
非专利文献
非专利文献1:Alistair J.Anderson et al.,Microbiological Reviews,Vol.54,No.4,450-472,1990
非专利文献2:Editors:M.Fontanille,A.Guyot,Recent Advances inMechanistic and Synthetic Aspects of Polymerization.Book.NATOASI Series,Vol.215,293-314,1987
非专利文献3:S.Kusakaet al.,Applied Microbiology and Biotechnology,Vol.47,140-143,1997
非专利文献4:Henry E.Valentin et al.,Journal of Biotechnology Vol.58,33-38,1997
非专利文献5:Sung Chul Yoon et al.,Korean Journal of AppliedMicrobiology and Biotechnology,Vol.28,No.2,71-79,2000
发明内容
发明要解决的技术问题
通过PHA的共聚物化和高分子量化,能够期待改善PHA的物性。P(3HB)具有硬且脆的物性,即使与3-羟基戊酸酯(3HV)单元共聚化也会发生共结晶化,因此,几乎无法期待物性的改善。但是,包含4HB单元、3-羟基己酸酯(3HH)单元等与3HB单元不共结晶化的第二成分单元的共聚PHA通过使其第二单元成分的比率发生变化则可以预期大幅改善物性。特别是,包含具有侧链的3HB单元、其它的3-羟基烷酸的PHA不显示脂肪酶分解性,相对于此,使与3HB相比不具有侧链的4HB单元共聚物化得到的P(3HB-co-4HB)已知不仅被PHA分解酶酶解而且也被脂肪酶酶解,被期待在生物体内的降解性提高,作为医疗材料备受期待。但是,在利用使用以往常用的4HB单元前体1,4-丁二醇、γ-丁内酯、4HB的PHA生产野生株的制造法中,仍未知获得重均分子量超过Mw171万的P(3HB-co-4HB)共聚物的方法。
PHA生产野生株根据需要分解利用所积累的PHA,在细胞内具有PHA分解酶,因此,难以合成超高分子量PHA,另外,可以理解,经过培养期间,PHA的分子量逐渐减少是一般的现象。
在将PHA用作医疗材料时,使用以除去内毒素为代表的高度的纯化技术,但一般而言,越高度进行纯化,存在PHA越分解、分子量越降低的趋势。另外,通过施加加热熔融等热处理,也会发生分子量降低,因此,在纯化后或制品化后PHA的分子量需要为高分子量的情况下,要求在纯化前的培养阶段中具有充分高的分子量。即使不作为医疗材料而用作一般工业品时,也必须进行某种程度的纯化工序,为了提高纯化后PHA的物性,要求具有更高的分子量。因此,需求在培养阶段能够得到比现有技术分子量高的PHA的方法。
本发明的课题在于提供一种聚酯的制造方法,该聚酯至少含有3-羟基丁酸酯单元作为聚合单元,高分子量,并且分子量分布窄(即,Mw/Mn小)。
用于解决技术问题的技术方案
本发明的发明人为了解决上述课题,进行了深入研究,结果发现,在通过培养具有生产聚酯的能力的微生物来制造聚酯时,通过将培养液的渗透压维持在200mOsmol以上900mOsm以下、将培养液的氮原子浓度维持在0.30g/L以上,能够制造至少含有3-羟基丁酸酯单元作为聚合单元、重均分子量为100万以上、且分子量分布窄的聚酯。本发明是鉴于上述见解完成的。
即,根据本发明,提供以下的发明。
(1)一种聚酯的制造方法,其包括将具有生产至少含有3-羟基丁酸酯单元作为聚合单元的聚酯的能力的微生物在含有碳源和氮源的培养液中培养的步骤,
所制造的聚酯是通过凝胶渗透色谱分析测得的以聚苯乙烯换算的重均分子量为100万以上、且至少含有3-羟基丁酸酯单元作为聚合单元的聚酯,
上述培养液的pH为4以上7.5以下,
培养满足下述的条件(a)和(b):
(a)培养液的渗透压在培养期间中维持为200mOsmol以上900mOsm以下;
(b)培养液的氮原子浓度在培养期间中维持为0.30g/L以上。
(2)如(1)所述的方法,其中,上述微生物为选自贪铜菌属(Cupriavidus属)、产碱菌属(Alcaligenes属)、罗尔斯通氏菌属(Ralstonia属)、戴尔福特菌属(Delftia属)、丛毛单胞菌属(Comamonas属)、氢噬胞菌属(Hydrogenophaga属)、伯克氏菌属(Burkholderia属)、埃希氏菌属(Escherichia属)、固氮菌属(Azotobacter属)、甲基杆菌属(Methylobacterium属)、副球菌属(Paracoccus属)、不动杆菌属(Acinetobacter属)、气单胞菌属(Aeromonas属)、异着色菌属(Allochromatium属)、固氮根瘤菌属(Azorhizobium属)、芽孢杆菌属(Bacillus属)、柄杆菌属(Caulobacter属)、色杆菌属(Chromobacterium属)、外硫红螺菌属(Ectothiorhodospira属)、克雷伯氏菌属(Klebsiella属)、诺卡氏菌属(Nocardia属)、红细菌属(Rhodobacter属)、红球菌属(Rhodococcus属)、红螺菌属(Rhodospirillum属)、立克次氏体属(Rickettsia属)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium属)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas属)、集胞藻菌属(Synechocystis属)、硫球菌属(Thiococcus属)、囊硫菌属(Thiocystis属)、弧菌属(Vibrio属)和沃特氏菌属(Wautersia属)的微生物。
(3)如(1)或(2)所述的方法,其中,上述微生物为杀虫贪铜菌(Cupriavidusnecator)。
(4)如(1)~(3)中任一项所述的方法,其中,培养温度为15℃~45℃。
(5)如(1)~(4)中任一项所述的方法,其中,培养为流加培养或连续培养。
(6)如(1)~(5)中任一项所述的方法,其中,上述碳源包含ε-己内酯、δ-戊内酯、δ-己内酯或它们的皂化物、或它们的盐中的至少一种。
(7)一种聚酯的制造方法,其包括将具有生产至少含有3-羟基丁酸酯单元作为聚合单元的聚酯的能力的微生物在含有碳源和氮源的培养液中培养的步骤,
所制造的聚酯是通过凝胶渗透色谱分析测得的以聚苯乙烯换算的重均分子量为100万以上、且至少含有3-羟基丁酸酯单元作为聚合单元的聚酯,
上述培养液的pH为4以上7.5以下,
培养为分批培养,
培养满足下述的条件(a)和(b):
(a)培养开始时的培养液的渗透压为200mOsmol以上900mOsm以下;
(b)培养开始时的培养液的氮原子浓度为0.30g/L以上。
发明的效果
根据本发明,能够制造至少含有3-羟基丁酸酯单元作为聚合单元、分子量为100万以上且分子量分布窄(即,Mw/Mn小)的聚酯。
附图说明
图1表示实施例1中制造的PHA的分子量分布。
图2表示比较例7中制造的PHA的分子量分布。
图3表示实施例4中制造的PHA的分子量分布。
图4表示实施例2中制造的PHA的1H-NMR。
图5表示实施例2中制造的PHA的13C-NMR。
图6表示实施例6中制造的P(3HB)的1H-NMR。
图7表示图6的放大图。
图8表示从比较例17中得到的培养第三天的培养液提取纯化的PEG化P(3HB)的1H-NMR。
图9表示图8的放大图。
图10表示从比较例17中得到的培养第五天的培养液提取纯化的PEG化P(3HB)的1H-NMR放大图。
具体实施方式
以下,对本发明的实施方式进行说明。
[聚酯的制造方法]
在本发明中制造的聚酯是通过凝胶渗透色谱分析测得的以聚苯乙烯换算的重均分子量为100万以上、且至少含有3-羟基丁酸酯单元作为聚合单元的聚酯。
本发明的特征之一在于,如上所述,所制造的聚酯的通过凝胶渗透色谱分析测得的以聚苯乙烯换算的重均分子量(Mw)为100万以上这样的高分子量。通过凝胶渗透色谱分析测得的以聚苯乙烯换算的重均分子量优选为125万以上,更优选为138万以上,更进一步优选为180万以上,特别优选为190万以上。通过凝胶渗透色谱分析测得的以聚苯乙烯换算的重均分子量可以为200万以上、210万以上、220万以上、230万以上、240万以上、250万以上、260万以上、270万以上、280万以上、290万以上、300万以上、310万以上、320万以上、330万以上、340万以上、350万以上、360万以上、370万以上、380万以上、390万以上或400万以上。通过凝胶渗透色谱分析测得的以聚苯乙烯换算的重均分子量的上限没有特别限定,一般为2000万以下,可以为1000万以下、800万以下、700万以下、600万以下或500万以下。
聚酯的通过凝胶渗透色谱分析测得的以聚苯乙烯换算的数均分子量(Mn)优选为30万以上。通过凝胶渗透色谱分析测得的以聚苯乙烯换算的数均分子量可以为35万以上、40万以上、45万以上、50万以上、55万以上、60万以上、65万以上、70万以上、75万以上、80万以上、85万以上、90万以上、95万以上、100万以上、110万以上、120万以上或130万以上。通过凝胶渗透色谱分析测得的以聚苯乙烯换算的数均分子量的上限没有特别限定,一般而言为1000万以下,可以为500万以下、400万以下、300万以下或200万以下。
Mw相对于Mn的比率(Mw/Mn)没有特别限定,例如为1.0~10.0、1.0~6.0、1.0~4.0,优选为更小的值,优选为1.0~3.3,更优选为1.0~3.0,进一步优选为1.0~2.9,可以为1.0~2.5。
在本发明中,即使是具有PHA分解酶的PHA生产野生株,也能够在培养后段不发生显著的分子量降低地制造高分子量体且分子量分布窄的PHA。
通过凝胶渗透色谱分析测得的以聚苯乙烯换算的重均分子量的测定,能够与后述的实施例中记载的方法同样地进行。
本发明所制造的聚酯至少含有3-羟基丁酸酯单元作为聚合单元。即,聚酯可以仅含有3-羟基丁酸酯单元作为聚合单元,也可以含有3-羟基丁酸酯单元和其它的聚合单元作为聚合单元。作为3-羟基丁酸酯单元以外的其它聚合单元,例如,可以列举4-羟基丁酸酯单元,还可以为来自乳酸酯(LA)、乙醇酸酯(GA)、3-羟基丙酸酯(3HP)、3-羟基戊酸酯(3HV)、5-羟基戊酸酯(5HV)、5-羟基己酸酯(5HH)、6-羟基己酸酯(6HH)、或3-羟基己酸酯(3HH)、或者碳原子数7以上的羟基脂肪酸酯等的聚合单元。
作为含有3-羟基丁酸酯单元以外和4-羟基丁酸酯单元的聚酯,可以是仅含有3-羟基丁酸酯单元和4-羟基丁酸酯单元作为聚合单元的聚酯(即,聚合单元仅由3-羟基丁酸酯单元和4-羟基丁酸酯单元构成),或者,也可以含有3-羟基丁酸酯单元和4-羟基丁酸酯单元作为聚合单元、还含有上述以外的别的聚合单元。作为上述的别的聚合单元,可以列举乳酸酯(LA)、乙醇酸酯(GA)、3-羟基丙酸酯(3HP)、3-羟基戊酸酯(3HV)、5-羟基戊酸酯(5HV)、5-羟基己酸酯(5HH)、6-羟基己酸酯(6HH)、或3-羟基己酸酯(3HH)、或者碳原子数7以上的羟基脂肪酸酯等。
在本发明中,3-羟基丁酸酯单元和4-羟基丁酸酯单元分别以下式表示。
3-羟基丁酸酯单元:-OCH(CH3)CH2C(=O)-
4-羟基丁酸酯单元:-OCH2CH2CH2C(=O)-
聚酯为含有3-羟基丁酸酯单元和4-羟基丁酸酯单元的聚酯时,4-羟基丁酸酯单元相对于全部单体单元的比例没有特别限定,优选为3摩尔%~40摩尔%,更优选为10摩尔%~40摩尔%,进一步优选为14摩尔%~40摩尔%。4-羟基丁酸酯单元相对于全部单体单元的比例可以为15摩尔%以上、16摩尔%以上、17摩尔%以上、18摩尔%以上、19摩尔%以上或20摩尔%以上。可以为20.2摩尔%以上、20.6摩尔%上、21摩尔%以上、22摩尔%以上、23摩尔%以上、24摩尔%以上、25摩尔%以上、26摩尔%以上、27摩尔%以上或28摩尔%以上。4-羟基丁酸酯单元相对于全部单体单元的比例可以为35摩尔%以下、34摩尔%以下、33摩尔%以下、32摩尔%以下、31摩尔%以下、30摩尔%以下、29摩尔%以下、28摩尔%以下、27摩尔%以下、27摩尔%以下、26摩尔%以下或25摩尔%以下。
4-羟基丁酸酯单元相对于全部单体单元的比例能够根据后述实施例中记载的方法进行测定。
聚酯可以为无规聚合物、嵌段聚合物、交替聚合物或接枝共聚物的任一种,优选为无规聚合物。
作为具有生产P(3HB)的能力的微生物,能够使用属于贪铜菌属(Cupriavidus属)、产碱菌属(Alcaligenes属)、罗尔斯通氏菌属(Ralstonia属)、戴尔福特菌属(Delftia属)、丛毛单胞菌属(Comamonas属)、氢噬胞菌属(Hydrogenophaga属)、伯克氏菌属(Burkholderia属)、埃希氏菌属(Escherichia属)、固氮菌属(Azotobacter属)、甲基杆菌属(Methylobacterium属)、副球菌属(Paracoccus属)、假单胞菌属(Pseudomonas属)、不动杆菌属(Acinetobacter属)、气单胞菌属(Aeromonas属)、异着色菌属(Allochromatium属)、固氮根瘤菌属(Azorhizobium属)、芽孢杆菌属(Bacillus属)、柄杆菌属(Caulobacter属)、色杆菌属(Chromobacterium属)、外硫红螺菌属(Ectothiorhodospira属)、克雷伯氏菌属(Klebsiella属)、诺卡氏菌属(Nocardia属)、红细菌属(Rhodobacter属)、红球菌属(Rhodococcus属)、红螺菌属(Rhodospirillum属)、立克次氏体属(Rickettsia属)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium属)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas属)、集胞藻菌属(Synechocystis属)、硫球菌属(Thiococcus属)、囊硫菌属(Thiocystis属)、弧菌属(Vibrio属)和沃特氏菌属(Wautersia属)的微生物。上述之中,优选贪铜菌属(Cupriavidus属),更优选杀虫贪铜菌(Cupriavidus necator)。作为一例,能够使用杀虫贪铜菌(Cupriavidusnecator)H16株(ATCC17699)。
此外,杀虫贪铜菌(Cupriavidus necator)H16株野生株中,3HB、3HV、4HB、5HV等能够充分组合入PHA中,但如果使用导入了底物特异性不同的PHA聚合酶基因的基因重组菌,其它的羟基酸也能够与PHA聚合。因此,不仅是杀虫贪铜菌(Cupriavidus necator)H16株,如上所述,也能够使用其它的贪铜菌属(Cupriavidus属)、产碱菌属(Alcaligenes属)、罗尔斯通氏菌属(Ralstonia属)、戴尔福特菌属(Delftia属)、丛毛单胞菌属(Comamonas属)、氢噬胞菌属(Hydrogenophaga属)、伯克氏菌属(Burkholderia属)、埃希氏菌属(Escherichia属)、固氮菌属(Azotobacter属)、甲基杆菌属(Methylobacterium属)、副球菌属(Paracoccus属)、假单胞菌属(Pseudomonas属)、不动杆菌属(Acinetobacter属)、气单胞菌属(Aeromonas属)、异着色菌属(Allochromatium属)、固氮根瘤菌属(Azorhizobium属)、芽孢杆菌属(Bacillus属)、柄杆菌属(Caulobacter属)、色杆菌属(Chromobacterium属)、外硫红螺菌属(Ectothiorhodospira属)、克雷伯氏菌属(Klebsiella属)、诺卡氏菌属(Nocardia属)、红细菌属(Rhodobacter属)、红球菌属(Rhodococcus属)、红螺菌属(Rhodospirillum属)、立克次氏体属(Rickettsia属)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium属)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas属)、集胞藻菌属(Synechocystis属)、硫球菌属(Thiococcus属)、囊硫菌属(Thiocystis属)、弧菌属(Vibrio属)和沃特氏菌属(Wautersia属)等具有聚合PHA的能力的基因重组微生物。
在本发明中,将具有生产P(3HB)的能力的微生物在含有碳源和氮源的培养液中进行培养。
培养液的pH为4以上7.5以下。pH可以低于7.0、可以为6.5以下、6.4以下、6.3以下、6.1以下,可以为4.5以上、5.0以上、5.1以上、5.2以上、5.3以上、5.4以上、5.5以上。
培养温度一般为15℃~45℃,优选为20℃~40℃,更优选为25℃~38℃。
培养方式可以为分批培养、流加培养或连续培养的任意种。
在本发明中,培养条件满足下述的条件(a)和(b)。
(a)培养液的渗透压在培养期间中维持为200mOsmol以上900mOsm以下,
(b)培养液的氮原子浓度在培养期间中维持为0.30g/L以上,
判明了通过采用满足条件(a)和(b)的培养条件,能够制造高分子量且分子量分布窄(即,Mw/Mn小)的聚酯。
“(a)培养液的渗透压在培养期间中维持为200mOsmol以上900mOsm以下”这样的记载以及“(b)培养液的氮原子浓度在培养期间中维持为0.30g/L以上”这样的记载中的所谓“维持为”,只要是在培养期间中的大部分(例如,95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上)的期间中培养液的渗透压和培养液的氮原子浓度满足上述的条件即可,并不是需要一定要遍及全部的培养期间(即,培养期间的100%的时间)时常使培养液的渗透压和培养液的氮原子浓度满足上述的条件。例如,只要是培养期间之中的短时间(例如,6小时以内、5小时以内、4小时以内、3小时以内、2小时以内、1小时以内、30分钟以内、20分钟以内、10分钟以内或5分钟以内等),也可以存在培养液的渗透压、和/或培养液的氮原子浓度处于上述条件的范围外的情况。另外,培养液的渗透压、和/或培养液的氮原子浓度处于上述条件的范围外的情况,只要不损及本发明的效果,在1次培养工序期间,可以存在多次。
培养期间中的培养液的渗透压优选为200mOsmol以上900mOsm以下,更优选为200mOsmol以上800mOsm以下,进一步优选为200mOsmol以上700mOsm以下,更进一步优选为200mOsmol以上600mOsm以下,特别优选为200mOsmol以上500mOsm以下。渗透压的下限为200mOsmol以上即可,可以为210mOsmol以上、220mOsmol以上、230mOsmol以上、240mOsmol以上、250mOsmol以上、或300mOsmol以上。渗透压的上限为900mOsm以下即可,可以为800mOsm以下、700mOsm以下、600mOsm以下、500mOsm以下、或400mOsm以下。
培养期间中的培养液的氮原子浓度为0.30g/L以上,可以优选为0.40g/L以上、0.42g/L以上、0.50g/L以上、0.55g/L以上、0.63g/L以上或0.78g/L以上。氮原子浓度的上限没有特别限定,一般而言为15.6g/L以下或7.8g/L以下。
作为培养期间中的培养液的NH4 +浓度,优选为0.39g/L以上,可以为0.40g/L以上、0.51g/L以上、0.54g/L以上、0.64g/L以上、0.70g/L以上、0.81g/L以上或1.00g/L以上。NH4 +浓度的上限没有特别限定,一般而言为20.0g/L以下或10.0g/L以下。
在本说明书中,如后所述,判明了:在本发明中,通过同时满足关于渗透压的上述条件(a)和关于氮原子浓度的上述条件(b),能够增殖联动地积累PHA,由此能够积累高分子量的PHA。通过控制渗透压和氮原子浓度能够积累高分子量的PHA这一点是由本发明首次发现的见解。
渗透压的测定方法没有特别限定,能够通过后述实施例中记载的冰点降低法进行测定。
培养液的氮原子浓度的测定方法也没有特别限定,通过后述实施例中记载的铵离子定量法进行定量,从铵离子浓度根据下述式换算为氮原子浓度即可。
铵离子浓度(g/L)×14/18=氮原子浓度(g/L)
培养基成分只要是使用的微生物能够利用(同化)的物质即可,没有特别限定,优选为参与PHA聚合的链转移的物质以外的物质。
作为碳源,例如,能够使用甲醇、乙醇、丁醇、乙酸或丁酸等有机碳源、二氧化碳等无机碳源、酵母提取物、糖蜜、蛋白胨和肉提取物等的天然物、阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖、果糖和半乳糖等的糖类、或山梨糖醇、甘露醇和肌醇等。此外,由于甲醇、乙醇或丁醇等短链醇类有可能成为链转移剂,因此,作为碳源,优选为除甲醇、乙醇和丁醇以外的物质。
作为氮源,例如,能够使用氨、铵盐(氯化铵、硫酸铵、磷酸铵)、硝酸盐等的无机氮化合物、和/或例如尿素、玉米浆、酪蛋白、蛋白胨、酵母提取物、肉提取物等有机含氮物。
在分批培养中,只要不在碳源耗尽之前氮源先耗尽而转移至非增殖联动的PHA生产即可,例如,在烧瓶培养条件中,优选以2g/L以上添加硫酸铵。另外,在流加培养、连续培养中,优选维持为以氮原子浓度计0.30g/L以上(或0.42g/L以上或0.55g/L以上)、渗透压200mOsm以上。
另外,在分批培养中,除了碳源以外,由于硫酸铵、氯化钠等盐的添加,培养前的渗透压增加,但是,只要培养开始时的渗透压为200mOsm以上即可,在培养结束时由于碳源、其它矿物质成分的消耗,渗透压可以降低至低于200mOsm。
作为无机成分,例如,可以分别选自钙盐、镁盐、钾盐、钠盐、磷酸盐、锰盐、锌盐、铁盐、铜盐、钼盐、钴盐、镍盐、铬盐、硼化合物和碘化合物等,更具体可以列举磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠等。
作为除此以外的有机营养源,例如,可以列举甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸等的氨基酸;维生素B1、维生素B12、维生素C等的维生素等。
根据本发明的优选的方式,碳源含有ε-己内酯、δ-戊内酯、δ-己内酯或这些的皂化物、或它们的盐中的至少一种。作为碳源,还可以含有糖、油脂、脂肪酸、氨基酸和肽中的至少一种。
在本发明中,为了维持渗透压,优选使用NaCl等的无机盐;(NH4)2SO4等的含氮无机盐;糖类或短链脂肪酸等的碳源;ε-己内酯等的可利用性有机溶剂碳源;DMSO等的有机溶剂等、可溶于水、有助于渗透压的增加且不易成为后述的链转移剂的成分。
在培养中添加ε-己内酯时,ε-己内酯开环,成为6-羟基己酸酯(6HH),加成CoA而成为6HH-CoA,在β氧化系除去乙酰CoA剩下4HB-CoA,组合入PHA则成为4HB单元。由于PHA聚合酶的底物特异性,6HH-CoA难以被组合入PHA中,积累P(3HB-co-4HB)。
4HB-CoA受到β氧化时,也生成乙酰CoA。
在伸长中的PHA聚合酶的酶-S-PHA复合体中进入具有羟基的化合物,将酶与PHA聚合物链间的硫酯键切断,PHA聚合物链从酶移动到链转移剂,PHA聚合停止,这样的反应称为仿效自由基聚合的链转移反应。4HB、二元醇类是具有羟基的化合物,γ-丁内酯也开环成为4HB,因此,这些具有羟基的化合物作为PHA聚合时的链转移剂发挥作用,有可能导致PHA的聚合停止。特别是二元醇类的末端的2个羟基的任一个均能够参与链转移,因此特别容易引发PHA聚合的停止,认为难以得到高分子量体PHA。
ε-己内酯开环则生成6HH,也成为具有羟基的化合物。4HB-CoA可以容易地成为PHA聚合酶的底物而6HH-CoA难以成为底物,与此同样,6HH与4HB相比很有可能也更难以作为链转移剂发挥作用,因此,可以认为使用ε-己内酯时,能够得到更高分子量的PHA。出于同样的理由,可以认为使用δ-戊内酯、δ-己内酯时,也可以得到PHA的组成、组成比不同但是分子量高的PHA。
在利用微生物的物质生产中,有增殖联动生产和非增殖联动生产。
增殖联动的PHA生产中,PHA以外的菌体成分增殖,同时也积累PHA。增殖联动的PHA生产中,乙酰CoA被PHA合成和菌体增殖的双方争夺,乙酰CoA不易剩余。增殖联动的PHA生产期间,也抑制由于PHA的分解产生游离的羟基酸,推测也不易发生链转移反应,推测分子量变得相对较高。
非增殖联动的PHA生产中,在菌体成分的增殖停止之后,发生PHA的积累,PHA含量增加。由于菌体增殖停止,过剩的乙酰CoA用于PHA生产。非增殖联动的PHA生产期间,暂时组合入PHA的成分再度分化,将游离的羟基酸排到菌体内外。在培养的后段,在氮源耗尽时,从增殖联动生产转移至非增殖联动生产,也频繁发生链转移反应,推测成为容易同时发生合成和分解的状态(分子量容易降低的状态)。
在本发明中发现,增殖联动地积累PHA时,与在营养限制状态下非增殖联动地积累PHA时相比,优先积累高分子量的PHA。即,在本发明的聚酯的制造中,期望不是分为菌体的增殖和PHA的积累的营养限制下的非增殖联动的PHA生产,而是同时发生菌体的增殖和PHA的积累的增殖联动的PHA生产。
此外,本发明中,发现在氮源充分且将渗透压确保为一定以上来培养杀虫贪铜菌(Cupriavidus necator)时,可见增殖联动的PHA生产。以往,已知在杀虫贪铜菌(Cupriavidus necator)H16株(ATCC17699)的P(3HB)、P(3HB-co-4HB)的生产中,在培养基中添加链转移剂(例如聚乙二醇(PEG))时,PHA的分子量降低。在通过限制氮等进行非增殖联动的PHA生产中,观察到将4HB作为碳源的P(3HB-co-4HB)生产中PEG结合到PHA羧基末端(Macromolecules(1996),29(1),10-17)。但是,没有得到将果糖作为碳源的P(3HB)生产中显示P(3HB)与PEG的结合的数据,有主张称可能是由于PEG和PHA聚合酶相互作用,通过不是利用PEG而是利用水的链转移,PHA的聚合停止频度增加,因此,P(3HB)的分子量降低(Macromolecules(1996),29(24),7753-7758)。
在本发明中,通过NMR解析判明了用杀虫贪铜菌(Cupriavidus necator)H16株在PEG存在下增殖联动地生产P(3HB)时P(3HB)与PEG的直接结合(本说明书的比较例17、表26、图8~图10)。推测,非增殖联动的P(3HB)生产中即使发生由于PEG的链转移,由于菌体内的PHA分解酶等的影响,末端的P(3HB)和PEG间的酯键被早早地切断,作为结果,仅观察到PEG分子不与P(3HB)末端结合的状态,而在不添加链转移剂则能够得到高分子量体的增殖联动的P(3HB)生产条件中,可以认为有可能PHA的分解被抑制,通过添加作为链转移剂的PEG而观察到分子量降低,同时,由于P(3HB)与PEG的结合不被分解而残留,因此能够以1H-NMR直接观察到。
本发明的方法中的培养时间没有特别限定,一般而言为24小时以上,为48小时以上、72小时以上、96小时以上或120小时以上。培养时间的上限没有特别限定,一般而言为240小时以下,可以为216小时以下或192小时以下。
从根据本发明的方法进行培养得到的培养液,通过过滤和离心分离等通常的固液分离方法分离回收菌体,清洗该菌体,进行干燥,能够得到干燥菌体。从该干燥菌体通过常规方法、例如用氯仿这样的有机溶剂提取所生成的聚酯,向该提取液中,例如添加己烷这样的贫溶剂,由此,能够使聚酯沉淀,进行回收。
利用以下的实施例对本发明进行进一步具体的说明,但是本发明不特别限定于以下的实施例。
实施例
[利用杀虫贪铜菌(Cupriavidus necator)H16株的共聚聚酯的制造]<实施例1>
使用杀虫贪铜菌(Cupriavidus necator)H16株(ATCC17699),制造PHA。
在含有KH2PO4 2.72g/L、Na2HPO4 4.26g/L、NaHCO3 0.3g/L、(NH4)2SO4 2g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L、酵母提取物0.2g/L、矿物质溶液3.5mL的灭菌后的培养基1中,添加果糖14.24g/L,用所得到的培养基在30℃进行24小时试验管振动培养,得到前前培养液。
矿物质溶液:在水中溶解有FeC6H5O7·xH2O 6g/L、ZnSO4·7H2O 2g/L、CuSO4·5H2O0.1g/L、MnCl2·4H2O 1g/L、KI 0.1g/L、(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.1g/L、CoCl2·6H2O 0.1g/L、H3BO3 0.2g/L、NaCl 5g/L、CaCl2·2H2O 4g/L的溶液。
在装有向上述培养基1中添加了果糖14.24g/L的培养基、或者添加了果糖8.86g/L和ε-己内酯5.38g/L的培养基100mL的500mL容积的三角烧瓶中,接种上述前前培养液1mL,在30℃、150rpm培养48小时至96小时,得到培养主母(前培养液)。
在3L容积的发酵罐中准备将上述培养基1的(NH4)2SO4变更为12.5g/L的培养基2L并进行灭菌,接种培养主母100mL,经由灭菌过滤器(PTFE 0.2μm孔)将在42质量%果糖溶液中溶解有12.4g/L的NaCl的糖溶液和ε-己内酯无菌地开始流加。碳源的流加速度和流加比率能够任意设定,但是,为了避免碳源被菌体消耗不完而过剩地残留于培养槽内使得菌体增殖停止的情况,以糖溶液的流加速度为1~2g/h左右(0.5~1g/h·L)、ε-己内酯的流加速度为0.2~0.5g/h(0.1~0.25g/h·L)左右这样的低流速开始培养,根据菌体的增殖而阶段性或者连续性地增加流加速度。控制通气量为0.2~0.3L/min、搅拌速度为500~700rpm、培养温度为36℃、培养pH下限为6.0,将12.5%氨水用作pH调整用碱。4HB前体碳源(实施例1中为ε-己内酯):果糖的重量比率设为约0.5。在培养开始后140.2小时结束培养。
在培养中或培养后,通过离心分离回收菌体和培养上清液,菌体在-20℃冻结后,供于冻结干燥。
冻结干燥菌体中用于PHA组成分析、PHA分子量解析。
关于PHA组成分析,通过在甲酯化后使用气相色谱法分析来自构成PHA的单体单元的甲酯体等,从而进行。
关于PHA的分子量解析,对从冻结干燥菌体用氯仿提取的PHA利用凝胶渗透色谱法进行。在图1表示实施例1的PHA的分子量分布。
培养上清液供于渗透压测定和氨浓度测定。
<实施例2>
使用在罐体培养中的培养基中添加NaCl 2.5g/L、将(NH4)2SO4变更为10g/L的培养基,作为流加碳源使用42质量%果糖溶液和ε-己内酯,使培养时间为140.2小时,除此以外,与实施例1同样进行。
<实施例3>
作为罐体培养中的碳源使用42质量%果糖溶液和ε-己内酯,使培养时间为100小时,除此以外,与实施例1同样进行。
<比较例1>
使用在罐体培养中的培养基中将(NH4)2SO4变更为7.5g/L的培养基,使培养时间为122.5小时,除此以外,与实施例3同样进行。
<比较例2>
使用在罐体培养中的培养基中将(NH4)2SO4变更为4g/L的培养基,使培养时间为125.5小时,除此以外,与实施例3同样进行。
<比较例3>
作为罐体培养中的pH调整用碱使用4N NaOH,使培养时间为173.3.小时,除此以外,与实施例3同样进行。
<比较例4>
在罐体培养中的培养基中将(NH4)2SO4变更为10g/L,使培养时间为140.5小时,除此以外,与比较例3同样进行。
<比较例5>
在罐体培养中的培养基中将(NH4)2SO4变更为7.5g/L,使培养时间为165.5小时,除此以外,与比较例3同样进行。
<比较例6>
将罐体培养中的pH下限控制变更为pH6.5,使培养时间为122小时,除此以外,与比较例5同样进行。
<比较例7>
将罐体培养中的pH下限控制变更为pH7,使培养时间为137.7小时,除此以外,与比较例5同样进行。在图2中表示比较例7的PHA的分子量分布。
<比较例8>
将罐体培养中的pH下限控制变更为pH7.5,使培养时间为149小时,除此以外,与比较例5同样进行。
<参考例1>
作为烧瓶前培养和罐体培养中的碳源使用42质量%果糖溶液和γ-丁内酯,使培养时间为105小时,除此以外,与实施例3同样进行。
<参考例2>
除了使4HB前体(参考例2中为γ-丁内酯):果糖的重量比率为约0.6以外,与参考例1同样进行。
<比较例11>
使用在罐体培养中的培养基中将(NH4)2SO4变更为7.5g/L的培养基,作为pH调整用碱使用2N NaOH,使培养时间为165小时,除此以外,与参考例1同样进行。
<比较例12>
作为烧瓶前培养和罐体培养中的碳源使用42质量%果糖溶液和1,4-丁二醇,使4HB前体(比较例12中为1,4-丁二醇):果糖的重量比率为约0.7、培养时间为208.5小时,除此以外,与实施例3同样进行。
<比较例13>
除了使4HB前体(比较例13中为1,4-丁二醇):果糖的重量比率为约0.5以外,与比较例12同样进行。
<比较例14>
使用在罐体培养中的培养基中将(NH4)2SO4变更为7.5g/L的培养基,作为pH调整用碱使用2N NaOH,使培养时间为189.5小时,除此以外,与比较例13同样进行。
<实施例4>
作为烧瓶前培养和罐体培养中的碳源使用42质量%果糖溶液,使培养时间为185.2小时,除此以外,与实施例1同样进行。在图3中表示实施例4的PHA的分子量分布。
<实施例5>
作为烧瓶前培养和罐体培养中的碳源使用42质量%果糖溶液,使培养时间为185.9小时,除此以外,与实施例2同样进行。
<实施例6>
作为烧瓶前培养和罐体培养中的碳源使用42质量%果糖溶液,使培养时间为150小时,除此以外,与实施例3同样进行。
从菌体提取纯化PHA的方法如下所述进行。在带螺纹盖的玻璃制三角烧瓶中,使冻结干燥菌体4~10g左右悬浮在400mL氯仿中,在30℃提取24~48小时。将所得到的粘稠的溶液用滤纸过滤,除去菌体残渣。将所得到的澄清液用蒸发器浓缩至100~200mL左右,用5倍量的作为贫溶剂的己烷使PHA析出。用乙醇清洗所得到的白色沉淀物之后,使其真空干燥,得到纯化PHA。
<比较例15>
作为烧瓶前培养和罐体培养中的碳源使用42质量%果糖溶液,使培养时间为84小时,除此以外,与比较例2同样进行。
<比较例16>
作为烧瓶前培养和罐体培养中的碳源使用42质量%果糖溶液,使用在罐体培养中的培养基中将(NH4)2SO4变更为4g/L的培养基,使培养时间为92.6小时,除此以外,与比较例5同样进行。
<比较例17(添加PEG200的培养:PEG化P(3HB)的制造>
作为烧瓶前培养和罐体培养中的碳源使用42质量%果糖溶液,在罐体培养中的培养基中添加NaCl 2.5g/L、PEG200 20ml/L,使培养时间为130.9小时,除此以外,与实施例1同样进行。回收培养第3天的培养液和第5天的培养液,通过离心分离回收菌体,在-20℃冻结后,供于冻结干燥。
[分析方法的说明]
<PHA分子量测定(凝胶渗透色谱(GPC)法)>
PHA分子量的测定如下所述通过凝胶渗透色谱法进行。
以来自冻结干燥菌体的PHA达到约0.5mg/ml的方式,添加氯仿,在60℃进行4小时提取溶解后,恢复室温,用孔径0.2μm的PTFE过滤器过滤,除去不溶物,作为测定样品。GPC条件如下所述。
装置:岛津制作所制造HPLC Prominence系统
色谱柱:昭和电工制造Shodex K-806L(2根串联)
柱温度:40℃
移动相:氯仿(1ml/min)
检测器:RI(40℃)
标准:Shodex聚苯乙烯分子量标准(687万~1270)
注入量:60μl
分析时间:30分钟
<PHA组成分析(GC法)>
菌体所含的PHA的组成分析如下所述进行。在带螺纹盖的试验管中量取所得到的干燥菌体约10mg,混合氯仿2mL和加有内部标准的甲醇硫酸混合液(内部标准:苯甲酸0.5g/L、硫酸3.7质量%)2mL,在121℃进行90分钟加热处理,冷却至室温,将PHA甲酯化。反应结束后添加1ml纯水,剧烈搅拌后,进行离心分离,得到有机溶剂层。将该有机溶剂层用硫酸钠脱水后,利用气相色谱法进行分析,算出PHA成分含量。GC条件如下所述。
气相色谱法分析条件
装置:岛津GC-2025
毛细管柱:DB-1(0.25mm(id)×60m、膜厚1μm)
载气:He(3.23ml/min)
柱温度:125℃6.5min-rate25℃/min-260℃
尾吹气流量:30mL/min
H2流量:40ml/min
空气流量:400ml/min
进样温度:250℃
检测器:FID(260℃)
狭缝:1:20
注入量:1μL
分析时间:21.5分钟
<铵离子定量方法(CE法)>
培养上清液中的NH4 +浓度定量如下所述进行。将对培养液进行离心分离而得到的培养上清液直接或适当稀释后用Agilent Technologies公司制造的毛细管电泳装置7100型,以和光纯药工业公司制造的阳离子混合标准液III(NH4 +浓度25mg/L)作为标准品算出NH4浓度。
<渗透压测定方法(冰点降低法)>
培养上清液的渗透压如下所述通过利用冰点降低法的方法测定。使用渗透压测定装置(ADVANCE INSTRUMENTS公司制造。Advance渗透压计3250),测定培养上清液的渗透压值(mOsm/kg H2O,简记为mOsm)。校准使用100mOsm、1500mOsm标准液进行,使用Low range模式(0~2000mOsm用)进行。
[聚合物的分析]
<1H-NMR和13C-NMR>
实施例6中得到的纯化PHA(P(3HB))的化学结构使用核磁共振分光装置(日本分光ECA500)来解析。将纯化的PHA以1.5质量%浓度溶解于CDCl3,制成测定样品。1H-NMR图谱以500MHz在室温测量。13C-NMR图谱以125MHz在室温测量。
在图4中表示实施例2中制造的PHA的1H-NMR,在图5中表示13C-NMR。
在图6中表示实施例6的仅P(3HB)的1H-NMR,在图7表示图6的放大图。
在图8和图9表示从比较例17中得到的培养第三天的培养液中提取纯化的PHA的1H-NMR。图9为图8的放大图。在图10表示从同培养第五天的培养液提取纯化的PHA的1H-NMR放大图。通过在PEG200存在下的杀虫贪铜菌(Cupriavidus necator)H16(ATCC17699)野生株的增殖联动的P(3HB)生产中得到的P(3HB)的1H-NMR解析,得到了显示P(3HB)与PEG的直接结合的结果。
<实施例7~20(烧瓶培养)>
使用杀虫贪铜菌(Cupriavidus necator)H16株(ATCC17699)通过烧瓶培养制造PHA。
在装有向上述培养基1中添加果糖8.86g/L和ε-己内酯5.38g/L的培养基(实施例7~19,其中硫酸铵和氯化钠浓度为表中记载的量)、或添加果糖8.86g/L和ε-己内酯6.46g/L的培养基(实施例20,其中硫酸铵浓度为表中记载的量)各100mL的500mL容积的三角烧瓶中,接种上述前培养培养基1mL,以30℃、150rpm培养表中记载的时间。培养开始前的pH为6.8~7.5左右,培养结束时成为5.7~6.2左右的弱酸性。培养中的pH为5.7~7.5左右。培养结束后,通过离心分离回收菌体,进行冻结干燥,测定干燥菌体重量。另外,在下述表27中一并表示利用GC法得到的PHA的含量和组成分析的结果以及渗透压测定结果。
在实施例7~20的烧瓶培养(分批培养)中,在培养开始时,满足培养液的渗透压为200mOsmol以上900mOsm以下、并且培养液的氮原子浓度为0.30g/L以上的条件。在满足培养液的渗透压为200mOsmol以上900mOsm以下、并且培养液的氮原子浓度为0.30g/L以上的条件的培养期间中,制得了重均分子量为100万以上且至少含有3-羟基丁酸酯单元作为聚合单元的聚酯。另外,在实施例7~20的烧瓶培养(分批培养)中,虽然也可以预想培养开始时的渗透压为200mOsm以上而培养结束时由于碳源和其它矿物质成分的消耗而导致渗透压降低至低于200mOsm的情况,但在该情况下也制得了重均分子量为100万以上且至少含有3-羟基丁酸酯单元作为聚合单元的聚酯。
[结果]
在以下表示上述的实施例1~6、比较例1~8和11~16、参考例1和2的分析结果。
Frc:果糖
ECL:ε-己内酯
GBL:γ-丁内酯
BD:1,4-丁二醇
E/F:ε-己内酯/果糖比
G/F:γ-丁内酯/果糖比
B/F:1,4-丁二醇/果糖比
在以下表示实施例1~6、比较例1~8和11~17、参考例1和2的各培养时间的分析结果。
DCW:干燥细胞重量(Dry Cell Weight)
RB:剩余生物质(Residual Biomass)
E/F:ε-己内酯/果糖比
G/F:γ-丁内酯/果糖比
B/F:1,4-丁二醇/果糖比
[表4]
实施例1:
[表5]
实施例2:
[表6]
实施例3:
[表7]
比较例1:
[表8]
比较例2:
[表9]
比较例3:
[表10]
比较例4:
[表11]
比较例5:
[表12]
比较例6:
[表13]
比较例7:
[表14]
比较例8:
[表15]
参考例1:
[表16]
参考例2:
[表17]
比较例11:
[表18]
比较例12:
[表19]
比较例13:
[表20]
比较例14:
[表21]
实施例4:
[表22]
实施例5:
[表23]
实施例6:
[表24]
比较例15:
[表25]
比较例16:
[表26]
比较例17:
从*D3、*D5的培养液中提取PHA,测定1H-NMR。
<实施例21>
用在上述培养基1中添加δ-戊内酯5.53g/L和果糖8.86g/L得到的培养基以30℃、4天、150pm进行烧瓶培养时,得到Mw1008万、Mn325万、Mw/Mn3.1的PHA。
<实施例22>
用在上述培养基1中添加δ-戊内酯5.25g/L和果糖8.86g/L得到的培养基以30℃、4天、150pm进行烧瓶培养时,得到Mw630万、Mn200万、Mw/Mn3.1的PHA。
Claims (7)
1.一种聚酯的制造方法,其特征在于:
包括将具有生产至少含有3-羟基丁酸酯单元作为聚合单元的聚酯的能力的微生物在含有碳源和氮源的培养液中培养的步骤,
所制造的聚酯是通过凝胶渗透色谱分析测得的以聚苯乙烯换算的重均分子量为100万以上且至少含有3-羟基丁酸酯单元作为聚合单元的聚酯,
所述培养液的pH为4以上7.5以下,
培养满足下述的条件(a)和(b):
(a)培养液的渗透压在培养期间中维持为200mOsmol以上900mOsm以下;
(b)培养液的氮原子浓度在培养期间中维持为0.30g/L以上。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于:
所述微生物为选自贪铜菌属(Cupriavidus属)、产碱菌属(Alcaligenes属)、罗尔斯通氏菌属(Ralstonia属)、戴尔福特菌属(Delftia属)、丛毛单胞菌属(Comamonas属)、氢噬胞菌属(Hydrogenophaga属)、伯克氏菌属(Burkholderia属)、埃希氏菌属(Escherichia属)、固氮菌属(Azotobacter属)、甲基杆菌属(Methylobacterium属)、副球菌属(Paracoccus属)、假单胞菌属(Pseudomonas属)、不动杆菌属(Acinetobacter属)、气单胞菌属(Aeromonas属)、异着色菌属(Allochromatium属)、固氮根瘤菌属(Azorhizobium属)、芽孢杆菌属(Bacillus属)、柄杆菌属(Caulobacter属)、色杆菌属(Chromobacterium属)、外硫红螺菌属(Ectothiorhodospira属)、克雷伯氏菌属(Klebsiella属)、诺卡氏菌属(Nocardia属)、红细菌属(Rhodobacter属)、红球菌属(Rhodococcus属)、红螺菌属(Rhodospirillum属)、立克次氏体属(Rickettsia属)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium属)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas属)、集胞藻菌属(Synechocystis属)、硫球菌属(Thiococcus属)、囊硫菌属(Thiocystis属)、弧菌属(Vibrio属)和沃特氏菌属(Wautersia属)的微生物。
3.如权利要求1或2所述的方法,其特征在于:
所述微生物为杀虫贪铜菌(Cupriavidus necator)。
4.如权利要求1~3中任一项所述的方法,其特征在于:
培养温度为15℃~45℃。
5.如权利要求1~4中任一项所述的方法,其特征在于:
培养为流加培养或连续培养。
6.如权利要求1~5中任一项所述的方法,其特征在于:
所述碳源包含ε-己内酯、δ-戊内酯、δ-己内酯或它们的皂化物、或它们的盐中的至少一种。
7.一种聚酯的制造方法,其特征在于:
包括将具有生产至少含有3-羟基丁酸酯单元作为聚合单元的聚酯的能力的微生物在含有碳源和氮源的培养液中培养的步骤,
所制造的聚酯是通过凝胶渗透色谱分析测得的以聚苯乙烯换算的重均分子量为100万以上、且至少含有3-羟基丁酸酯单元作为聚合单元的聚酯,
所述培养液的pH为4以上7.5以下,
培养为分批培养,
培养满足下述的条件(a)和(b):
(a)培养开始时的培养液的渗透压为200mOsmol以上900mOsm以下;
(b)培养开始时的培养液的氮原子浓度为0.30g/L以上。
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