JP7196848B2 - ポリエステルの製造方法 - Google Patents

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Description

本発明は、重合単位として３－ヒドロキシブチレート単位を少なくとも含むポリエステルの製造方法に関する。
多くの微生物はその生体内にエネルギー源・炭素源貯蔵物質としてポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）を蓄積する。炭素源が十分にあり、窒素、リン、硫黄、酸素、マグネシウム等の栄養素が制限されるとＰＨＡの蓄積が起きることがよく知られている。ＰＨＡは熱可塑性のポリエステルであり、生分解性・生体適合性のプラスチックとして注目され、多くの研究がなされてきた（非特許文献１）。ＰＨＡを構成するモノマーユニットは１００種類以上知られており、もっとも代表的なものは（Ｒ）－３－ヒドロキシブチレート（以下、３ＨＢと略す）からなるポリ－３－ヒドロキシブチレート（以下、Ｐ（３ＨＢ）と略す）である（非特許文献１）。非特許文献１においては、培養の後半においてはＰＨＡの分子量が低下することが一般的であることが示されている。
Ｐ（３ＨＢ）の製造研究に関する総説である非特許文献２においても、リンを制限した培養中において、Ｐ（３ＨＢ）の蓄積時に分子量が低下していくことが記載されている。
分子量を増大させる方法としては、ＰＨＡ合成系・分解系を持たない大腸菌 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１－ＢｌｕｅへＰ（３ＨＢ）合成細菌Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒから取り出したＰ（３ＨＢ）生合成遺伝子（ｐｈａＣＡＢ）を導入し、その遺伝子組換え菌をｐＨ６で培養し超高分子量Ｐ（３ＨＢ）を製造する方法がある（非特許文献３）。
Ｐ（３ＨＢ）を生産する野生株のＰ（３ＨＢ）の重量平均分子量Ｍｗは一般的には５０万～１５０万程度とも２０万～２００万程度、さらには１万～３００万程度ともいわれ、野生型の微生物では菌体内に多数の分解酵素を有するためＭｗ３００万以上になる超高分子量体Ｐ（３ＨＢ）の合成が難しいとされる。また、Ｐ（３ＨＢ）は微生物がエネルギー源・炭素源貯蔵物質として蓄積しているため、炭素源が枯渇した場合に分解して使用することは多くの微生物で調べられている。しかし、ＰＨＡの合成と分解が同時に起きていることを示す例も示されている。ＰＨＡの合成と分解が同時に起きていることの生理学的意義はまだ解明されていない。またＰＨＡ生産野生株ではＰＨＡの合成と分解がこのように同時に起こってしまうため、超高分子量体ＰＨＡ合成が難しい要因の一つである。
Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－４ＨＢ）の製造研究も多数行われており、Ｐ（３ＨＢ）生産野生株であるＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒに４－ヒドロキシブチレート（４ＨＢ）、γ－ブチロラクトン、１，４－ブタンジオール、１，６－ヘキサンジオール、１，８－オクタンジオール、１，１０－デカンジオール、１，１２－ドデカンジオールなどの炭素源を与えて培養することでＰ（３ＨＢ－ｃｏ－４ＨＢ）が生産される。
Ｐ（３ＨＢ）生産野生株ではなく、大腸菌を遺伝子組換えしてＰ（３ＨＢ－ｃｏ－４ＨＢ）やＰ（４ＨＢ）を生産する方法も報告されている。当初はアセチルＣｏＡからＰ（３ＨＢ）を生産するのに必要なＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ由来のβ－ケトチオラーゼ（ＰｈａＡ）、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＰｈａＢ）、ＰＨＡ重合酵素（ＰｈａＣ）の各遺伝子ｐｈａＡ，ｐｈａＢ，ｐｈａＣに加えて、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｋｌｕｙｖｅｒｉ由来のコハク酸分解経路の遺伝子（ｓｕｃＤ、４ｈｂＤ、ｏｒｆＺ）を導入することで、コハク酸から４ＨＢ－ＣｏＡを供給し、大腸菌にてグルコースを炭素源として分子量Ｍｗが約１８０万のＰ（３ＨＢ－ｃｏ－４ＨＢ）が生産されたが、ＰＨＡ中の４ＨＢ比率は１．３～１．５％と低いものであった（非特許文献４）。
また、Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－４ＨＢ）の生産にε－カプロラクトンまたはそのけん化物である６－ヒドロキシヘキサノエート（またはその塩）を利用した報告もある。ε－カプロラクトンを炭素源としてＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒを培養した場合、ＰＨＡ含量２６から３８％、４ＨＢ比率３０％から３６％のＰ（３ＨＢ－ｃｏ－４ＨＢ）を蓄積したという報告があるが（非特許文献５）、分子量の記載はない。
また、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒのＰＨＡ分解酵素欠損株にＡｅｒｏｍｏｎａｓ属のＰＨＡ重合酵素遺伝子を導入する遺伝子組み換え菌では、フラスコ培養において重量平均分子量Ｍｗ３００万以上の超高分子量体Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）が生産できるが、ジャーファーメンター培養ではＭｗ２００万程度にとどまることが示されている（特許文献１）。
さらに、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などのポリ乳酸の良溶媒を添加した培地において遺伝子組み換え細菌を培養することによって、乳酸と３ＨＢの共重合体の分子量が向上したことが知られている（特許文献２）。
さらに、特許文献３には、ＰＨＡを生産可能なＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属微生物の細胞中のＰＨＡ合成酵素の比活性を０．１Ｕ／ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ以下に制御することにより、分子量のＰＨＡを合成する微生物及び高分子のＰＨＡの製造方法が記載されている。特許文献３の微生物及び方法を用いることにより重量平均分子量４００万以上のＰＨＡを工業的に効率よく生産することができることが記載されている。特許文献４には、特定の微生物を、δ－バレロラクトンおよび／またはε－カプロラクトンを使用して培養すること、またはグリコール酸を使用して培養することにより、遊離のヒドロキシ基を有するＰＨＡを生産することが記載されている。特許文献３及び４においては、培養中において培養液の浸透圧および窒素原子濃度を制御することについては記載がない。また特許文献５には、５０～９９モル％のβ－ヒドロキシブチレート繰返し単位と１～５０モル％のβ－ヒドロキシバレレート繰返し単位とを含み、５０，０００以上の重量平均分子量を有するβ－ヒドロキシブチレート共重合体が記載されている。特許文献５においては、培養中において培養液の浸透圧を制御することについては記載がない。
国際公報ＷＯ２０１４／０６５２５３号 特開２０１７－２９０８２号公報 国際公報ＷＯ２０１２／１０２３７１号 国際公報ＷＯ２０１７／０３３６５２号 特開平５－１５３８３号公報
Ａｌｉｓｔａｉｒ Ｊ. Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｖｏｌ．５４，Ｎｏ．４，４５０－４７２，１９９０ Ｅｄｉｔｏｒｓ：Ｍ．Ｆｏｎｔａｎｉｌｌｅ，Ａ．Ｇｕｙｏｔ，Ｒｅｃｅｎｔ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｂｏｏｋ．ＮＡＴＯ ＡＳＩ Ｓｅｒｉｅｓ，Ｖｏｌ．２１５，２９３－３１４，１９８７ Ｓ．Ｋｕｓａｋａ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４７，１４０－１４３，１９９７ Ｈｅｎｒｙ Ｅ．Ｖａｌｅｎｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．５８，３３－３８，１９９７ Ｓｕｎｇ Ｃｈｕｌ Ｙｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｋｏｒｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．２，７１－７９，２０００
ＰＨＡの共重合体化と高分子量化はＰＨＡの物性を改善することが期待される。Ｐ（３ＨＢ）は硬くてもろい物性であるが、３－ヒドロキシバレレート（３ＨＶ）ユニットを共重合体化しても共結晶化してしまうために、あまり物性の改善は見込めない。しかし、４ＨＢユニットや３－ヒドロキシヘキサノエート（３ＨＨ）ユニットなど、３ＨＢユニットとは共結晶化しない第二成分ユニットからなる共重合ＰＨＡはその第二ユニット成分の比率を変化させることで大幅な物性の改善が見込める。特に、側鎖を持つ３ＨＢユニットや他の３－ヒドロキシアルカン酸からなるＰＨＡがリパーゼ分解性を示さないのに対して、３ＨＢと比較して側鎖を持たない４ＨＢユニットを共重合体化させたＰ（３ＨＢ－ｃｏ－４ＨＢ）は、ＰＨＡ分解酵素だけでなくリパーゼによる酵素分解も受けることが知られており、生体内での分解性の向上が見込まれ、医療材料として期待されている。しかし、従来からよく用いられてきた４ＨＢユニット前駆体である１，４－ブタンジオールやγ－ブチロラクトンや４ＨＢを使用したＰＨＡ生産野生株を使用した製造法では、重量平均分子量Ｍｗ１７１万を超えるＰ（３ＨＢ－ｃｏ－４ＨＢ）共重合体を得る方法は知られていない。
ＰＨＡ生産野生株は必要に応じて蓄積したＰＨＡを分解利用し細胞内にＰＨＡ分解酵素を持っているため、超高分子量ＰＨＡを合成することは難しいとされ、また培養期間を通してＰＨＡの分子量が次第に減少していくことは一般的な現象だと理解されている。
ＰＨＡを医療材料として用いる場合にはエンドトキシン除去を始めとする高度な精製技術が用いられるが、一般的に精製を高度に行うほどＰＨＡは分解し分子量は低下していく傾向がある。また加熱溶融など熱処理を加えることでも分子量低下は進行するため、精製後や製品化後ＰＨＡの分子量が高分子量体の必要が有る場合には、精製前の培養段階において十分に高分子量体であることが求められる。医療材料でなく一般工業品向けであっても、ある程度の精製工程は必ず必要であり、精製後ＰＨＡの物性向上にはより高分子量体であることが求められている。よって培養段階で従来よりも高分子量体ＰＨＡが得られる方法が求められてきた。
本発明は、重合単位として３－ヒドロキシブチレート単位を少なくとも含み、高分子量であり、かつ分子量分布が狭い（即ち、Ｍｗ／Ｍｎが小さい）ポリエステルの製造方法を提供することを解決すべき課題とする。
本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ポリエステルの生産能を有する微生物を培養することによってポリエステルを製造する際に、培養液の浸透圧を２００ｍＯｓｍｏｌ以上９００ｍＯｓｍ以下に維持し、培養液の窒素原子濃度を０．３０ｇ／Ｌ以上に維持することによって、重合単位として３－ヒドロキシブチレート単位を少なくとも含み、重量平均分子量が１００万以上であり、かつ分子量分布が狭いポリエステルを製造できることを見出した。本発明は、上記の知見に基づいて完成したものである。
すなわち、本発明によれば以下の発明が提供される。
（１） 重合単位として３－ヒドロキシブチレート単位を少なくとも含むポリエステルの生産能を有する微生物を、炭素源及び窒素源を含む培養液中において培養することを含む、ポリエステルの製造方法であって、
製造されるポリエステルが、ポリスチレン換算ゲル浸透クロマトグラフィー測定による重量平均分子量が１００万以上であり、重合単位として３－ヒドロキシブチレート単位を少なくとも含むポリエステルであり、
前記培養液のｐＨが４以上７．５以下であり、
培養が下記の条件（ａ）及び（ｂ）を満たす、上記方法。
（ａ）培養液の浸透圧が培養期間中２００ｍＯｓｍｏｌ以上９００ｍＯｓｍ以下に維持されている：
（ｂ）培養液の窒素原子濃度が培養期間中０．３０ｇ／Ｌ以上に維持されている：
（２） 前記微生物が、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属、Ｄｅｌｆｔｉａ属、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ属、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｐｈａｇａ属、 Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐａｒａｃｏｃｃｏｓ属、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ属、Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ属、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｅｃｔｏｔｈｉｏｒｈｏｄｏｓｐｉｒａ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｎｏｃａｒｄｉａ属、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ属、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ属、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属、Ｔｈｉｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｔｈｉｏｃｙｓｔｉｓ属、Ｖｉｂｒｉｏ属、及びＷａｕｔｅｒｓｉａ属からなる群から選択される微生物である、（１）に記載の方法。
（３） 前記微生物が、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒである、（１）又は（２）に記載の方法。
（４） 培養温度が、１５℃～４５℃である、（１）から（３）の何れか一に記載の方法。
（５） 培養が、流加培養又は連続培養である、（１）から（４）の何れか一に記載の方法。
（６） 前記炭素源が、ε－カプロラクトン、δ－バレロラクトン、δ－カプロラクトン若しくはそれらのけん化物、又はそれらの塩の少なくとも一種を含む、（１）から（５）の何れか一に記載の方法。
（７） 重合単位として３－ヒドロキシブチレート単位を少なくとも含むポリエステルの生産能を有する微生物を、炭素源及び窒素源を含む培養液中において培養することを含む、ポリエステルの製造方法であって、
製造されるポリエステルが、ポリスチレン換算ゲル浸透クロマトグラフィー測定による重量平均分子量が１００万以上であり、重合単位として３－ヒドロキシブチレート単位を少なくとも含むポリエステルであり、
前記培養液のｐＨが４以上７．５以下であり、
培養が、回分培養であり、
培養が下記の条件（ａ）及び（ｂ）を満たす、上記方法。
（ａ）培養開始時における培養液の浸透圧が２００ｍＯｓｍｏｌ以上９００ｍＯｓｍ以下である：
（ｂ）培養開始時における培養液の窒素原子濃度が０．３０ｇ／Ｌ以上である。
本発明によれば、重合単位として３－ヒドロキシブチレート単位を少なくとも含み、分子量が１００万以上であり、かつ分子量分布が狭い（即ち、Ｍｗ／Ｍｎが小さい）ポリエステルを製造することができる。
図１は、実施例１で製造したＰＨＡの分子量分布を示す。 図２は、比較例７で製造したＰＨＡの分子量分布を示す。 図３は、実施例４で製造したＰＨＡの分子量分布を示す。 図４は、実施例２で製造したＰＨＡの1Ｈ－ＮＭＲを示す。 図５は、実施例２で製造したＰＨＡの13Ｃ－ＮＭＲを示す。 図６は、実施例６で製造したＰ（３ＨＢ）の1Ｈ－ＮＭＲを示す。 図７は、図６の拡大図を示す。 図８は、比較例１７で得られた培養３日目の培養液から抽出精製したＰＥＧ化Ｐ（３ＨＢ）の1Ｈ－ＮＭＲを示す。 図９は、図８の拡大図を示す。 図１０は、比較例１７の５日目の培養液から抽出精製したＰＥＧ化Ｐ（３ＨＢ）の1Ｈ－ＮＭＲ拡大図を示す。
以下、本発明の実施の形態について説明する。
［ポリエステルの製造方法］
本発明において製造されるポリエステルは、ポリスチレン換算ゲル浸透クロマトグラフィー測定による重量平均分子量が１００万以上であり、重合単位として３－ヒドロキシブチレート単位を少なくとも含むポリエステルである。
本発明の特徴の一つは、上記の通り、製造されるポリエステルのポリスチレン換算ゲル浸透クロマトグラフィー測定による重量平均分子量（Ｍｗ）が１００万以上であるという高分子量であることにある。ポリスチレン換算ゲル浸透クロマトグラフィー測定による重量平均分子量は好ましくは１２５万以上であり、より好ましくは１３８万以上であり、よりさらに好ましくは１８０万以上であり、特に好ましくは１９０万以上である。ポリスチレン換算ゲル浸透クロマトグラフィー測定による重量平均分子量は、２００万以上、２１０万以上、２２０万以上、２３０万以上、２４０万以上、２５０万以上、２６０万以上、２７０万以上、２８０万以上、２９０万以上、３００万以上、３１０万以上、３２０万以上、３３０万以上、３４０万以上、３５０万以上、３６０万以上、３７０万以上、３８０万以上、３９０万以上、または４００万以上でもよい。ポリスチレン換算ゲル浸透クロマトグラフィー測定による重量平均分子量の上限は特に限定されないが、一般的には、２０００万以下であり、１０００万以下、８００万以下、７００万以下、６００万以下、または５００万以下でもよい。
ポリエステルは、好ましくは、ポリスチレン換算ゲル浸透クロマトグラフィー測定による数平均分子量（Ｍｎ）が３０万以上である。ポリスチレン換算ゲル浸透クロマトグラフィー測定による数平均分子量は、３５万以上、４０万以上、４５万以上、５０万以上、５５万以上、６０万以上、６５万以上、７０万以上、７５万以上、８０万以上、８５万以上、９０万以上、９５万以上、１００万以上、１１０万以上、１２０万以上、または１３０万以上でもよい。ポリスチレン換算ゲル浸透クロマトグラフィー測定による数平均分子量の上限は特に限定されないが、一般的には、１０００万以下であり、５００万以下、４００万以下、３００万以下、または２００万以下でもよい。
Ｍｎに対するＭｗの比率（Ｍｗ／Ｍｎ）は特に限定されないが、例えば１．０～１０．０、１．０～６．０、１．０～４．０であり、更に小さい方が好ましく、好ましくは１．０～３．３であり、より好ましくは１．０～３．０であり、さらに好ましくは１．０～２．９であり、１．０～２．５でもよい。
本発明においては、ＰＨＡ分解酵素を有するＰＨＡ生産野生株であっても、培養後半において顕著な分子量低下を引き起こさずに高分子量体かつ分子量分布の狭いＰＨＡを製造することができる。
ポリスチレン換算ゲル浸透クロマトグラフィー測定による重量平均分子量の測定は、後記する実施例に記載した方法と同様に行うことができる。
本発明において製造されるポリエステルは、重合単位として３－ヒドロキシブチレート単位を少なくとも含む。即ち、ポリエステルは、重合単位として３－ヒドロキシブチレート単位のみを含むものでもよいし、重合単位として３－ヒドロキシブチレート単位と、その他の重合単位とを含むものでもよい。３－ヒドロキシブチレート単位以外のその他の重合単位としては、例えば、４－ヒドロキシブチレート単位を挙げることができ、さらにラクテート（ＬＡ）、グリコレート（ＧＡ）、３－ヒドロキシプロピオネート（３ＨＰ）、３－ヒドロキシバレレート（３ＨＶ）、５－ヒドロキシバレレート（５ＨＶ）、５－ヒドロキシヘキサノエート（５ＨＨ）、６－ヒドロキシヘキサノエート（６ＨＨ）、又は３－ヒドロキシヘキサノエート（３ＨＨ）、あるいは炭素数７以上のヒドロキシアルカノエート等に由来する重合単位でもよい。
３－ヒドロキシブチレート単位以外と４－ヒドロキシブチレート単位とを含むポリエステルとしては、重合単位として３－ヒドロキシブチレート単位及び４－ヒドロキシブチレート単位のみを含むポリエステルでもよいし（即ち、重合単位は、３－ヒドロキシブチレート単位と４－ヒドロキシブチレート単位のみからなる）、あるいは、重合単位として３－ヒドロキシブチレート単位及び４－ヒドロキシブチレート単位を含み、さらに上記以外の別の重合単位を含んでいてもよい。上記した別の重合単位としては、ラクテート（ＬＡ）、グリコレート（ＧＡ）、３－ヒドロキシプロピオネート（３ＨＰ）、３－ヒドロキシバレレート（３ＨＶ）、５－ヒドロキシバレレート（５ＨＶ）、５－ヒドロキシヘキサノエート（５ＨＨ）、６－ヒドロキシヘキサノエート（６ＨＨ）、又は３－ヒドロキシヘキサノエート（３ＨＨ）、あるいは炭素数７以上のヒドロキシアルカノエート等を挙げることができる。
本発明において、３－ヒドロキシブチレート単位と４－ヒドロキシブチレート単位はそれぞれ次式で表される。
３－ヒドロキシブチレート単位：－ＯＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2Ｃ（＝Ｏ）－
４－ヒドロキシブチレート単位：－ＯＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2Ｃ（＝Ｏ）－
ポリエステルが、３－ヒドロキシブチレート単位と４－ヒドロキシブチレート単位とを含むポリエステルである場合、全モノマー単位に対する４－ヒドロキシブチレート単位の割合は特に限定されないが、好ましくは３モル％～４０モル％であり、より好ましくは１０モル％～４０モル％であり、さらに好ましくは１４モル％～４０モル％である。全モノマー単位に対する４－ヒドロキシブチレート単位の割合は、１５モル％以上、１６モル％以上、１７モル％以上、１８モル％以上、１９モル％以上、または２０モル％以上でもよい。２０．２モル％以上、２０．６モル％上、２１モル％以上、２２モル％以上、２３モル％以上、２４モル％以上、２５モル％以上、２６モル％以上、２７モル％以上、又は２８モル％以上でもよい。全モノマー単位に対する４－ヒドロキシブチレート単位の割合は、３５モル％以下、３４モル％以下、３３モル％以下、３２モル％以下、３１モル％以下、３０モル％以下、２９モル％以下、２８モル％以下、２７モル％以下、２７モル％以下、２６モル％以下、または２５モル％以下でもよい。
全モノマー単位に対する４－ヒドロキシブチレート単位の割合は、後記する実施例に記載した方法に準じて測定することができる。
ポリエステルは、ランダムポリマー、ブロックポリマー、交互ポリマー、またはグラフトポリマーの何れでもよいが、好ましくはランダムポリマーである。
Ｐ（３ＨＢ）生産能を有する微生物としては、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属、Ｄｅｌｆｔｉａ属、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ属、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｐｈａｇａ属、 Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐａｒａｃｏｃｃｏｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ属、Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ属、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｅｃｔｏｔｈｉｏｒｈｏｄｏｓｐｉｒａ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｎｏｃａｒｄｉａ属、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ属、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ属、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属、Ｔｈｉｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｔｈｉｏｃｙｓｔｉｓ属、Ｖｉｂｒｉｏ属、Ｗａｕｔｅｒｓｉａ属に属する微生物を使用することができる。上記の中でも、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属は好ましく、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒがより好ましい。一例としては、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６株（ＡＴＣＣ１７６９９）を使用することができる。
なお、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６株野生株では３ＨＢ、３ＨＶ、４ＨＢ、５ＨＶなどは十分ＰＨＡに取り込み可能であるが、基質特異性の異なるＰＨＡ重合酵素遺伝子を導入した遺伝子組換え菌を用いれば他のヒドロキシ酸もＰＨＡに重合可能である。従って、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６株野生株だけではなく、上記した通り、他のＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属、Ｄｅｌｆｔｉａ属、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ属、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｐｈａｇａ属、 Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐａｒａｃｏｃｃｏｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ属、Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ属、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｅｃｔｏｔｈｉｏｒｈｏｄｏｓｐｉｒａ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｎｏｃａｒｄｉａ属、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ属、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ属、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属、Ｔｈｉｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｔｈｉｏｃｙｓｔｉｓ属、Ｖｉｂｒｉｏ属、Ｗａｕｔｅｒｓｉａ属などＰＨＡを重合する能力を有する遺伝子組換え微生物を使用することも可能である。
本発明においては、Ｐ（３ＨＢ）の生産能を有する微生物を、炭素源及び窒素源を含む培養液中において培養する。
培養液のｐＨは４以上７．５以下である。ｐＨは７．０未満、６．５以下、６．４以下、６．３以下、６．１以下でもよく、４．５以上、５．０以上、５．１以上、５．２以上、５．３以上、５．４以上、５．５以上でもよい。
培養温度は、一般的には１５℃～４５℃であり、好ましくは２０℃～４０℃であり、より好ましくは２５℃～３８℃である。
培養方式は、回分培養、流加培養または連続培養のいずれでもよい。
本発明においては、培養条件は、下記の条件（ａ）及び（ｂ）を満たす。
（ａ）培養液の浸透圧が培養期間中２００ｍＯｓｍｏｌ以上９００ｍＯｓｍ以下に維持されている：
（ｂ）培養液の窒素原子濃度が培養期間中０．３０ｇ／Ｌ以上に維持されている：
条件（ａ）及び（ｂ）を満たす培養条件を採用することにより、高分子量であり、かつ分子量分布が狭い（即ち、Ｍｗ／Ｍｎが小さい）ポリエステルを製造できることが判明した。
「（ａ）培養液の浸透圧が培養期間中２００ｍＯｓｍｏｌ以上９００ｍＯｓｍ以下に維持されている」という記載、並びに「（ｂ）培養液の窒素原子濃度が培養期間中０．３０ｇ／Ｌ以上に維持されている」という記載における「維持されている」とは、培養期間中の大部分（例えば、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の期間において、培養液の浸透圧及び培養液の窒素原子濃度が上記した条件を満たしていればよく、必ずしも全ての培養期間（即ち、培養期間の１００％の時間）に渡って常に培養液の浸透圧及び培養液の窒素原子濃度が上記した条件を満たしていることを必要とするわけではない。例えば、培養期間のうちの短時間（例えば、６時間以内、５時間以内、４時間以内、３時間以内、２時間以内、１時間以内、３０分以内、２０分以内、１０分以内、または５分以内など）であれば、培養液の浸透圧、及び／又は培養液の窒素原子濃度は、上記した条件の範囲外になる状況が存在していてもよいものとする。また、培養液の浸透圧、及び／又は培養液の窒素原子濃度は、上記した条件の範囲外になる状況は、本発明の効果を損なわない限り、１回の培養工程の間に、複数回存在していてもよい。
培養期間中の培養液の浸透圧は、好ましくは２００ｍＯｓｍｏｌ以上９００ｍＯｓｍ以下であり、より好ましくは２００ｍＯｓｍｏｌ以上８００ｍＯｓｍ以下であり、さらに好ましくは２００ｍＯｓｍｏｌ以上７００ｍＯｓｍ以下であり、さらに一層好ましくは２００ｍＯｓｍｏｌ以上６００ｍＯｓｍ以下であり、特に好ましくは２００ｍＯｓｍｏｌ以上５００ｍＯｓｍ以下である。浸透圧の下限は、２００ｍＯｓｍｏｌ以上であればよく、２１０ｍＯｓｍｏｌ以上、２２０ｍＯｓｍｏｌ以上、２３０ｍＯｓｍｏｌ以上、２４０ｍＯｓｍｏｌ以上、２５０ｍＯｓｍｏｌ以上、又は３００ｍＯｓｍｏｌ以上でもよい。浸透圧の上限は、９００ｍＯｓｍ以下であればよく、８００ｍＯｓｍ以下、７００ｍＯｓｍ以下、６００ｍＯｓｍ以下、５００ｍＯｓｍ以下、又は４００ｍＯｓｍ以下でもよい。
培養期間中の培養液の窒素原子濃度は０．３０ｇ／Ｌ以上であり、好ましくは０．４０ｇ／Ｌ以上、０．４２ｇ／Ｌ以上、０．５０ｇ／Ｌ以上、０．５５ｇ／Ｌ以上、０．６３ｇ／Ｌ以上、又は０．７８ｇ／Ｌ以上でもよい。窒素原子濃度の上限は特に限定されないが、一般的には、１５．６ｇ／Ｌ以下、又は７．８ｇ／Ｌ以下である。
培養期間中の培養液のＮＨ4 +濃度としては、好ましくは０．３９ｇ／Ｌ以上であり、０．４０ｇ／Ｌ以上、０．５１ｇ／Ｌ以上、０．５４ｇ／Ｌ以上、０．６４ｇ／Ｌ以上、０．７０ｇ／Ｌ以上、０．８１ｇ／Ｌ以上、又は１．００ｇ／Ｌ以上でもよい。ＮＨ4 +濃度の上限は特に限定されないが、一般的には、２０．０ｇ／Ｌ以下、又は１０．０ｇ／Ｌ以下である。
本明細書中において後記する通り、本発明においては、浸透圧に関する上記条件（ａ）と窒素原子濃度に関する上記条件（ｂ）とを同時に満たすことにより、増殖連動的にＰＨＡを蓄積させることができ、これにより高分子量のＰＨＡを蓄積できることが判明した。浸透圧と窒素原子濃度を制御することにより、高分子量のＰＨＡを蓄積できたことは本発明により初めて見出された知見である。
浸透圧の測定方法は、特に限定されないが、後記する実施例に記載する氷点降下法により測定することができる。
培養液の窒素原子濃度の測定方法も特に限定されないが、後記する実施例に記載するアンモニウムイオン定量法により定量し、アンモニウムイオン濃度から、下記式により窒素原子濃度に換算すればよい。
アンモニウムイオン濃度（ｇ／Ｌ）×１４／１８＝窒素原子濃度（ｇ／Ｌ）
培地成分は、使用する微生物が資化し得る物質であれば特に制限はなく、ＰＨＡ重合の連鎖移動に寄与する物質以外の物質であることは好ましい。
炭素源としては、例えば、メタノール、エタノール、ブタノール、酢酸または酪酸などの有機炭素源、二酸化炭素などの無機炭素源、酵母エキス、糖蜜、ペプトンおよび肉エキスなどの天然物、アラビノース、グルコース、マンノース、フラクトースおよびガラクトースなどの糖類、またはソルビトール、マンニトールおよびイソシトールなどを使用することができる。なお、メタノール、エタノール又はブタノールなどの短鎖アルコール類は連鎖移動剤になる可能性があるので、炭素源としては、メタノール、エタノール及びブタノール以外のものが好ましい。
窒素源としては、例えば、アンモニア、アンモニウム塩（塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム）、硝酸塩などの無機窒素化合物および／または、たとえば、尿素、コーン・スティープ・リカー、カゼイン、ペプトン、酵母エキス、肉エキスなどの有機窒素含有物を使用することができる。
回分培養においては、炭素源が枯渇するより先に窒素源が枯渇して増殖非連動的なＰＨＡ生産に移行しなければよく、例えばフラスコ培養条件では硫酸アンモニウムを２ｇ／Ｌ以上で添加することが好ましい。また流加培養や連続培養においては、窒素原子濃度で０．３０ｇ／Ｌ以上（又は０．４２ｇ／Ｌ以上、又は０．５５ｇ／Ｌ以上）、浸透圧２００ｍＯｓｍ以上を維持することが望ましい。
また回分培養においては、炭素源他、硫酸アンモニウムや塩化ナトリウムなどの塩の添加により培養前の浸透圧は増加するが、培養開始時の浸透圧が２００ｍＯｓｍ以上あればよく、培養終了時に炭素源や他のミネラル成分の消費によって浸透圧が２００ｍＯｓｍ未満に低下していても良い。
無機成分としては、例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩、銅塩、モリブデン塩、コバルト塩、ニッケル塩、クロム塩、ホウ素化合物およびヨウ素化合物等からそれぞれ選択され、より具体的には、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。
そのほかの有機栄養源としては、例えばグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリン等のアミノ酸；ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ等のビタミン等が挙げられる。
本発明の好ましい態様によれば、炭素源は、ε－カプロラクトン、δ－バレロラクトン、δ－カプロラクトン若しくはそれらのけん化物、又はそれらの塩の少なくとも一種を含む。炭素源としてはさらに、糖、油脂、脂肪酸、アミノ酸およびペプチドの少なくとも一種を含んでいてもよい。
本発明においては、好ましくは、浸透圧を維持するために、ＮａＣｌなどの無機塩；（ＮＨ4）2ＳＯ4などの窒素含有無機塩；糖類又は短鎖脂肪酸などの炭素源；ε－カプロラクトンなどの資化性有機溶媒炭素源；ＤＭＳＯなどの有機溶媒など、水に可溶であり、浸透圧の増加に寄与し、後述する連鎖移動剤になりにくい成分を使用することが好ましい。
ε－カプロラクトンを培養に添加すると、ε－カプロラクトンは開環され、６－ヒドロキシヘキサノエート（６ＨＨ）になり、ＣｏＡが付加されて６ＨＨ－ＣｏＡとなり、β酸化系でアセチルＣｏＡが抜けて４ＨＢ－ＣｏＡが残り、ＰＨＡに取り込まれると４ＨＢユニットになる。ＰＨＡ重合酵素の基質特異性から６ＨＨ－ＣｏＡはＰＨＡには取り込まれにくく、Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－４ＨＢ）が蓄積される。
４ＨＢ－ＣｏＡもβ酸化を受ければ、アセチルＣｏＡも生成する。
伸長中のＰＨＡ重合酵素の酵素－Ｓ－ＰＨＡ複合体にヒドロキシ基を有する化合物が入り込み、酵素とＰＨＡポリマー鎖間のチオエステルを切断し、ＰＨＡポリマー鎖は酵素から連鎖移動剤に移動しＰＨＡ重合が停止する反応は、ラジカル重合に倣い連鎖移動反応と言われている。４ＨＢやジオール類はヒドロキシ基を持つ化合物であり、γ－ブチロラクトンも開環して４ＨＢになるため、これらヒドロキシ基を持つ化合物はＰＨＡ重合時の連鎖移動剤として働き、ＰＨＡの重合を停止させてしまう可能性がある。特にジオール類は末端の２つのヒドロキシ基のどちらでも連鎖移動に関与することが可能なため、特にＰＨＡ重合の停止を引き起こしやすく、高分子量体ＰＨＡが得られにくいと考えられる。
ε－カプロラクトンが開環すると６ＨＨが生成し、やはりヒドロキシ基をもつ化合物になる。４ＨＢ－ＣｏＡはＰＨＡ重合酵素の基質に容易になりえるが６ＨＨ－ＣｏＡは基質になりにくいのと同様に、６ＨＨの方が４ＨＢよりもおそらく連鎖移動剤としても働きにくいために、ε－カプロラクトンを使用した場合により高分子量体ＰＨＡが得られるものと考えられる。同様の理由により、δ－バレロラクトンやδ－カプロラクトンを用いた場合にもＰＨＡの組成や組成比は異なるが高分子量体ＰＨＡが得られるものと考えられる。
微生物による物質生産には、増殖連動的生産と増殖非連動的生産とがある。
増殖連動的なＰＨＡ生産では、ＰＨＡ以外の菌体成分が増殖していると同時にＰＨＡも蓄積する。増殖連動的ＰＨＡ生産では、アセチルＣｏＡはＰＨＡ合成と菌体増殖の両方で取り合いになり、アセチルＣｏＡは余剰になりにくい。増殖連動的ＰＨＡ生産の間は、ＰＨＡの分解による遊離のヒドロキシ酸の発生も抑えられ、連鎖移動反応も起きにくいと推測され、分子量が相対的に高くなるものと推測される。
増殖非連動的なＰＨＡ生産では、菌体成分の増殖が停止した後に、ＰＨＡの蓄積が起き、ＰＨＡ含量が増加していく。菌体増殖が停止しているため、過剰のアセチルＣｏＡはＰＨＡ生産に使用される。増殖非連動的なＰＨＡ生産の間では、一旦ＰＨＡの形に取り込まれた成分を再度分化して遊離ヒドロキシ酸を菌体内外に排出しているようである。培養の後半において窒素源が枯渇した場合、増殖連動的生産から増殖非連動的生産に移行し、連鎖移動反応も頻繁に起き、合成と分解が同時に起こりやすい状態（分子量が低下しやすい状態）になるものと推測される。
本発明においては、増殖連動的にＰＨＡを蓄積させた場合に、栄養制限状態で増殖非連動的にＰＨＡを蓄積させる場合よりも優位に高分子量のＰＨＡを蓄積することが発見された。即ち、本発明のポリエステルの製造においては、菌体の増殖とＰＨＡの蓄積を分けた栄養制限による増殖非連動的なＰＨＡ生産ではなく、菌体の増殖とＰＨＡの蓄積が同時に起きる増殖連動的なＰＨＡ生産であることが望ましい。
なお、本発明では、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒを窒素源が十分あり浸透圧を一定以上確保して培養する場合、増殖連動的なＰＨＡ生産が見られることを発見した。これまでＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６株（ＡＴＣＣ１７６９９）のＰ（３ＨＢ）やＰ（３ＨＢ－ｃｏ－４ＨＢ）の生産において、連鎖移動剤（例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ））を培地に添加した場合、ＰＨＡの分子量が低下することは知られていた。窒素制限などによる増殖非連動的なＰＨＡ生産において、４ＨＢを炭素源としたＰ（３ＨＢ－ｃｏ－４ＨＢ）生産へのＰＨＡカルボキシ末端へのＰＥＧの結合が観察された（Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ （１９９６），２９（１），１０－１７）。しかし、フルクトースを炭素源としたＰ（３ＨＢ）生産へのＰ（３ＨＢ）とＰＥＧとの結合を示すデータは得られておらず、ＰＥＧとＰＨＡ重合酵素が相互作用し、ＰＥＧではなく水による連鎖移動によってＰＨＡの重合停止頻度を増加させたためＰ（３ＨＢ）の分子量が低下したのかもしれないという主張があった（Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（１９９６），２９（２４），７７５３－７７５８）。
本発明において、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６株でＰＥＧ存在下に増殖連動的Ｐ（３ＨＢ）生産させた場合、Ｐ（３ＨＢ）とＰＥＧとの直接結合がＮＭＲ解析で判明した（本明細書の比較例１７、表２６、図８～図１０）。増殖非連動的なＰ（３ＨＢ）生産ではＰＥＧによる連鎖移動が起きていても、菌体内のＰＨＡ分解酵素等の影響によって末端のＰ（３ＨＢ）とＰＥＧ間のエステル結合が素早く切断され、結果としてＰＥＧ分子がＰ（３ＨＢ）末端に結合していない状態のみが観察されていたと推察されるが、連鎖移動剤を添加しなければ高分子量体が得られる増殖連動的なＰ（３ＨＢ）生産条件ではおそらくＰＨＡの分解が抑制され、連鎖移動剤であるＰＥＧ添加によって分子量低下が観察されると同時に、Ｐ（３ＨＢ）とＰＥＧとの結合が分解されずに残っているため1Ｈ－ＮＭＲで直接観察できたものと考えられる。
本発明の方法における培養時間は特に限定されないが、一般的には２４時間以上であり、４８時間以上、７２時間以上、９６時間以上、又は１２０時間以上である。培養時間の上限は特に限定されないが、一般的には、２４０時間以下であり、２１６時間以下、又は１９２時間以下でもよい。
本発明の方法に従って培養することにより得られた培養液から、ろ過及び遠心分離などの通常の固液分離手段によって菌体を分離回収し、この菌体を洗浄、乾燥して乾燥菌体を得ることができる。この乾燥菌体から、常法により、たとえば、クロロホルムのような有機溶剤で、生成されたポリエステルを抽出し、この抽出液に、例えば、ヘキサンのような貧溶媒を加えることによってポリエステルを沈澱させ、回収することができる。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により特に限定されるものではない。
［Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６株による共重合ポリエステルの製造］
＜実施例１＞
Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６株（ＡＴＣＣ１７６９９）を使用してＰＨＡを製造した。
ＫＨ2ＰＯ4 ２．７２ｇ／Ｌ、Ｎａ2ＨＰＯ4 ４．２６ｇ／Ｌ、ＮａＨＣＯ3 ０．３ｇ／Ｌ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ２ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．２ｇ／Ｌ、酵母エキス ０．２ｇ／Ｌ、ミネラル溶液３．５ｍＬからなる滅菌された培地１に、フルクトースを１４．２４ｇ／Ｌにて加えた培地にて試験管振とう培養を３０℃２４時間行い、前前培養液を得た。
ミネラル溶液：ＦｅＣ6Ｈ5Ｏ7・ｘＨ2Ｏ ６ｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２ｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ０．１ｇ／Ｌ、ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ １ｇ／Ｌ、ＫＩ ０．１ｇ／Ｌ、（ＮＨ4）6Ｍｏ7Ｏ24・４Ｈ2Ｏ ０．１ｇ／Ｌ、ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ ０．１ｇ／Ｌ、Ｈ3ＢＯ3 ０．２ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ４ｇ／Ｌを水に溶解させたもの。
上記培地１にフルクトースを１４．２４ｇ／Ｌにて加えた培地、あるいはフルクトース８．８６ｇ／Ｌとε－カプロラクトン５．３８ｇ／Ｌにて加えた培地１００ｍＬが入った５００ｍＬ容積の三角フラスコに上記の前前培養液１ｍＬを植菌し、３０℃、１５０ｒｐｍにて４８時間から９６時間培養し、培養主母（前培養液）とした。
上記培地１の（ＮＨ4）2ＳＯ4を１２．５ｇ／Ｌに変更した培地を３Ｌ容ジャーファーメンターに２Ｌ用意、滅菌し、培養主母１００ｍＬを植菌し、４２質量％フルクトース溶液にＮａＣｌを１２．４ｇ／Ｌにて溶解させた糖溶液とε－カプロラクトンを滅菌フィルター（ＰＴＦＥ ０．２μｍポア）を介して無菌的に流加開始した。炭素源の流加速度や流加比率は任意に設定することができるが、炭素源を菌体が消費しきれず培養槽内に過剰に残存し菌体増殖が停止するのを避けるために、糖溶液の流加速度は１～２ｇ／ｈ程度（０．５～１ｇ／ｈ・Ｌ）、ε－カプロラクトンの流加速度は０．２～０．５ｇ／ｈ（０．１～０．２５ｇ／ｈ・Ｌ）程度と低流速で培養開始し、菌体の増殖に合わせて段階的あるいは連続的に流加速度を増加させた。通気量は０．２～０．３Ｌ／ｍｉｎ、攪拌速度は５００～７００ｒｐｍ、培養温度は３６℃、培養ｐＨ下限は６．０にて制御し、１２．５％アンモニア水をｐＨ調整用アルカリに使用した。４ＨＢ前駆体炭素源（実施例１ではε－カプロラクトン）：フルクトースの重量比率は約０．５とした。培養開始後１４０．２時間で培養終了した。
培養中、あるいは培養後、菌体と培養上清を遠心分離により回収し、菌体は－２０℃にて凍結後、凍結乾燥に供した。
凍結乾燥菌体中はＰＨＡ組成分析、ＰＨＡ分子量解析に用いた。
ＰＨＡ組成分析は、メチルエステル化後にガスクロマトグラフィーにてＰＨＡを構成するモノマーユニットに由来するメチルエステル体等を分析することで行った。
ＰＨＡの分子量解析は凍結乾燥菌体からクロロホルム抽出したＰＨＡをゲルパーミエーションクロマトグラフィー法にて行った。実施例１のＰＨＡの分子量分布を図１に示す。
培養上清は浸透圧測定とアンモニア濃度測定に供した。
＜実施例２＞
ジャー培養での培地にＮａＣｌを２．５ｇ／Ｌで添加し、（ＮＨ4）2ＳＯ4を１０ｇ／Ｌに変更した培地を使用し、流加炭素源として４２質量％フルクトース溶液とε－カプロラクトンを使用し、培養時間を１４０．２時間とした以外は実施例１と同様に行った。
＜実施例３＞
ジャー培養における炭素源として４２質量％フルクトース溶液とε－カプロラクトンを使用し、培養時間を１００時間とした以外は実施例１と同様に行った。
＜比較例１＞
ジャー培養での培地で（ＮＨ4）2ＳＯ4を７．５ｇ／Ｌに変更した培地を使用し、培養時間を１２２．５時間とした以外は実施例３と同様に行った。
＜比較例２＞
ジャー培養での培地で（ＮＨ4）2ＳＯ4を４ｇ／Ｌに変更した培地を使用し、培養時間を１２５．５時間とした以外は実施例３と同様に行った。
＜比較例３＞
ジャー培養でのｐＨ調整用アルカリとして４Ｎ ＮａＯＨを使用し、培養時間を１７３．３．時間とした以外は実施例３と同様に行った。
＜比較例４＞
ジャー培養での培地で（ＮＨ4）2ＳＯ4を１０ｇ／Ｌに変更し、培養時間を１４０．５時間とした以外は比較例３と同様に行った。
＜比較例５＞
ジャー培養での培地で（ＮＨ4）2ＳＯ4を７．５ｇ／Ｌに変更し、培養時間を１６５．５時間とした以外は比較例３と同様に行った。
＜比較例６＞
ジャー培養でのｐＨ下限制御をｐＨ６．５に変更し、培養時間を１２２時間とした以外は比較例５と同様に行った。
＜比較例７＞
ジャー培養でのｐＨ下限制御をｐＨ７に変更し、培養時間を１３７．７時間とした以外は比較例５と同様に行った。比較例７のＰＨＡの分子量分布を図２に示す。
＜比較例８＞
ジャー培養でのｐＨ下限制御をｐＨ７．５に変更し、培養時間を１４９時間とした以外は比較例５と同様に行った。
＜参考例１＞
フラスコ前培養とジャー培養における炭素源として４２質量％フルクトース溶液とγ－ブチロラクトンを使用し、培養時間を１０５時間とした以外は実施例３と同様に行った。
＜参考例２＞
４ＨＢ前駆体（参考例２ではγ－ブチロラクトン）：フルクトースの重量比率は約０．６とした以外は参考例１と同様に行った。
＜比較例１１＞
ジャー培養での培地で（ＮＨ4）2ＳＯ4を７．５ｇ／Ｌに変更した培地を使用し、ｐＨ調整用アルカリとして２Ｎ ＮａＯＨを使用し、培養時間を１６５時間とした以外は参考例１と同様に行った。
＜比較例１２＞
フラスコ前培養とジャー培養における炭素源として４２質量％フルクトース溶液と１，４－ブタンジオールを使用し、４ＨＢ前駆体（比較例１２では１，４－ブタンジオール）：フルクトースの重量比率は約０．７とし、培養時間を２０８．５時間とした以外は実施例３と同様に行った。
＜比較例１３＞
４ＨＢ前駆体（比較例１３では１，４－ブタンジオール）：フルクトースの重量比率は約０．５とした以外は比較例１２と同様に行った。
＜比較例１４＞
ジャー培養での培地で（ＮＨ4）2ＳＯ4を７．５ｇ／Ｌに変更した培地を使用し、ｐＨ調整用アルカリとして２Ｎ ＮａＯＨを使用し、培養時間を１８９．５時間とした以外は比較例１３と同様に行った。
＜実施例４＞
フラスコ前培養とジャー培養における炭素源として４２質量％フルクトース溶液を使用し、培養時間を１８５．２時間とした以外は実施例１と同様に行った。実施例４のＰＨＡの分子量分布を図３に示す。
＜実施例５＞
フラスコ前培養とジャー培養における炭素源として４２質量％フルクトース溶液を使用し、培養時間を１８５．９時間とした以外は実施例２と同様に行った。
＜実施例６＞
フラスコ前培養とジャー培養における炭素源として４２質量％フルクトース溶液を使用し、培養時間を１５０時間とした以外は実施例３と同様に行った。
菌体からＰＨＡを抽出精製する方法は以下のように行った。スクリューキャップ付きガラス製三角フラスコにて、凍結乾燥菌体４～１０ｇ程度を４００ｍＬのクロロホルムに懸濁し、３０℃にて２４～４８時間抽出した。得られた粘調の溶液をろ紙にてろ過し、菌体残渣をとり除いた。得られた清澄液をエバポレーターにて１００～２００ｍＬ程度に濃縮し、５倍量の貧溶媒であるヘキサンにてＰＨＡを析出させた。得られた白色沈殿物をエタノールにて洗浄後、真空乾燥させ、精製ＰＨＡを得た。
＜比較例１５＞
フラスコ前培養とジャー培養における炭素源として４２質量％フルクトース溶液を使用し、培養時間を８４時間とした以外は比較例２と同様に行った。
＜比較例１６＞
フラスコ前培養とジャー培養における炭素源として４２質量％フルクトース溶液を使用し、ジャー培養での培地で（ＮＨ4）2ＳＯ4を４ｇ／Ｌに変更した培地を使用し、培養時間を９２．６時間とした以外は比較例５と同様に行った。
＜比較例１７（ＰＥＧ２００添加の培養：ＰＥＧ化Ｐ（３ＨＢ）の製造＞
フラスコ前培養とジャー培養における炭素源として４２質量％フルクトース溶液を使用し、ジャー培養での培地にＮａＣｌを２．５ｇ／Ｌ、ＰＥＧ２００を２０ｍｌ／Ｌで添加し、培養時間を１３０．９時間とした以外は実施例１と同様に行った。培養３日目の培養液と５日目の培養液を回収し、菌体を遠心分離により回収し、－２０℃にて凍結後、凍結乾燥に供した。
［分析方法の説明］
＜ＰＨＡ分子量測定（ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）法）＞
ＰＨＡ分子量の測定は以下のようにゲルパーミエーションクロマトグラフィー法により行った。
凍結乾燥菌体に由来するＰＨＡが約０．５ｍｇ／ｍｌとなるようにクロロホルムを加え、６０℃で４時間抽出溶解させた後、室温に戻し、孔径０．２μｍのＰＴＦＥフィルターでろ過して不溶物を除き、測定サンプルとした。ＧＰＣ条件は以下の通りである。
装置：島津製作所製 ＨＰＬＣ Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅシステム
カラム：昭和電工製 Ｓｈｏｄｅｘ Ｋ－８０６Ｌ（２本直列）
カラム温度：４０℃
移動相：クロロホルム（１ｍｌ／ｍｉｎ）
検出器：ＲＩ（４０℃）
スタンダード：Ｓｈｏｄｅｘポリスチレン分子量スタンダード（６８７万～１２７０）
注入量：６０μｌ
分析時間：３０分
＜ＰＨＡ組成分析（ＧＣ法）＞
菌体に含まれるＰＨＡの組成分析は以下のように行った。得られた乾燥菌体約１０ｍｇをスクリューキャップ付き試験管に量りとり、クロロホルム２ｍＬと内部標準入りメタノール硫酸混液（内部標準：安息香酸０．５ｇ／Ｌ、硫酸３．７質量％）２ｍＬを混合し、１２１℃、９０分加熱処理をして室温まで冷却し、ＰＨＡをメチルエステル化した。反応終了後純水を１ｍｌ加え、激しく撹拌した後、遠心分離を行い有機溶媒層を得た。この有機溶媒層を硫酸ナトリウムにて脱水後ガスクロマトグラフィーで分析することにより、ＰＨＡ成分含量を算出した。ＧＣ条件は以下の通りである。
ガスクロマトグラフィー分析条件
装置：島津ＧＣ－２０２５
キャピラリーカラム：ＤＢ－１ （０．２５ｍｍ（ｉｄ）×６０ｍ、Ｆｉｌｍ厚１μｍ）
キャリアガス：Ｈｅ（３．２３ｍｌ／ｍｉｎ）
カラム温度： １２５℃ ６．５ｍｉｎ － ｒａｔｅ２５℃／ｍｉｎ－２６０℃
メイクアップ流量：３０ｍＬ／ｍｉｎ
Ｈ２流量：４０ｍｌ／ｍｉｎ
Ａｉｒ流量：４００ｍｌ／ｍｉｎ
インジェクション：２５０℃
検出器：ＦＩＤ（２６０℃）
スプリット：１：２０
注入量：１μＬ
分析時間：２１．５分
＜アンモニウムイオン定量方法（ＣＥ法）＞
培養上清中のＮＨ4 +濃度定量は以下のように行った。培養液を遠心分離し得られた培養上清をそのまま、もしくは適切に希釈し、アジレントテクノロジー社製キャピラリー電気泳動装置７１００型にて、和光純薬工業社製陽イオン混合標準液ＩＩＩ（ＮＨ4 +濃度２５ｍｇ／Ｌ）を標品としてＮＨ4濃度を算出した。
＜浸透圧測定方法（氷点降下法）＞
培養上清の浸透圧は以下のように氷点降下法を利用した方法にて測定した。浸透圧測定装置（アドバンスインスツルメンツ社製。アドバンス浸透圧計３２５０）を使用して培養上清の浸透圧値（ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ2Ｏ、略してｍＯｓｍと記載する）を測定した。キャリブレーションは１００ｍＯｓｍ、１５００ｍＯｓｍ標準液にて行う、ローレンジモード（０～２０００ｍＯｓｍ用）で行った。
［ポリマーの分析］
＜1Ｈ－ＮＭＲおよび13Ｃ－ＮＭＲ＞
実施例６で得られた精製ＰＨＡ（Ｐ（３ＨＢ））の化学構造を核磁気共鳴分光装置（日本分光ＥＣＡ５００）を使用し解析した。精製したＰＨＡを１．５質量％濃度でＣＤＣｌ3に溶解し、測定サンプルとした。1Ｈ－ＮＭＲスペクトルは５００ＭＨｚにて室温で計測した。13Ｃ－ＮＭＲスペクトルは１２５ＭＨｚにて室温で計測した。
実施例２で製造したＰＨＡの1Ｈ－ＮＭＲを図４に示し、13Ｃ－ＮＭＲを図５に示す。
実施例６のＰ（３ＨＢ）だけの1Ｈ－ＮＭＲを図６に示し、図６の拡大図を図７に示す。
比較例１７で得られた培養３日目の培養液から抽出精製したＰＨＡの1Ｈ－ＮＭＲを図８及び図９に示す。図９は図８の拡大図である。同培養５日目の培養液から抽出精製したＰＨＡの1Ｈ－ＮＭＲ拡大図を図１０に示す。ＰＥＧ２００存在下でのＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６（ＡＴＣＣ１７６９９）野生株の増殖連動的なＰ（３ＨＢ）生産で得られたＰ（３ＨＢ）の1Ｈ－ＮＭＲ解析により、Ｐ（３ＨＢ）とＰＥＧとの直接結合を示す結果が得られた。
＜実施例７～２０（フラスコ培養）＞
Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６株（ＡＴＣＣ１７６９９）を使用してフラスコ培養にてＰＨＡを製造した。
上記培地１にフルクトース８．８６ｇ／Ｌとε－カプロラクトン５．３８ｇ／Ｌにて加えた培地（実施例７～１９、ただし硫酸アンモニウムと塩化ナトリウム濃度は表に記載の量）、又はフルクトース８．８６ｇ／Ｌとε－カプロラクトン６．４６ｇ／Ｌにて加えた培地（実施例２０、ただし硫酸アンモニウム濃度は表に記載の量）、それぞれ１００ｍＬが入った５００ｍＬ容積の三角フラスコに上記前培養培地１ｍＬを植菌し、３０℃、１５０ｒｐｍにて表に記載の時間で培養した。培養開始前のｐＨは６．８～７．５程度であり、培養終了時には５．７～６．２程度と弱酸性となっていた。培養中のｐＨは５．７～７．５程度であった。培養終了後、遠心分離にて菌体を回収し、凍結乾燥し、乾燥菌体重量を測定した。また、ＧＣ法によるＰＨＡの含量と組成分析の結果や浸透圧測定結果を合わせ下記表２７に示す。
実施例７～２０のフラスコ培養（回分培養）においては、培養開始時においては、培養液の浸透圧が２００ｍＯｓｍｏｌ以上９００ｍＯｓｍ以下であり、かつ培養液の窒素原子濃度が０．３０ｇ／Ｌ以上であるという条件を満たしている。培養液の浸透圧が２００ｍＯｓｍｏｌ以上９００ｍＯｓｍ以下であり、かつ培養液の窒素原子濃度が０．３０ｇ／Ｌ以上であるという条件を満たす培養期間においては、重量平均分子量が１００万以上であり、重合単位として３－ヒドロキシブチレート単位を少なくとも含むポリエステルが製造されている。また、実施例７～２０のフラスコ培養（回分培養）においては、培養開始時の浸透圧が２００ｍＯｓｍ以上である一方、培養終了時には炭素源や他のミネラル成分の消費によって浸透圧が２００ｍＯｓｍ未満に低下している場合も想定されるが、その場合においても重量平均分子量が１００万以上であり、重合単位として３－ヒドロキシブチレート単位を少なくとも含むポリエステルが製造される。
［結果］
上記した実施例１～６、比較例１～８及び１１～１６、参考例１及び２の分析結果を以下に示す。
Ｆｒｃ：フルクトース
ＥＣＬ：ε－カプロラクトン
ＧＢＬ：γ－ブチロラクトン
ＢＤ：１，４－ブタンジオール
Ｅ／Ｆ：ε－カプロラクトン／フルクトース比
Ｇ／Ｆ：γ－ブチロラクトン／フルクトース比
Ｂ／Ｆ：１，４－ブタンジオール／フルクトース比
Figure 0007196848000001
Figure 0007196848000002
Figure 0007196848000003
実施例１～６、比較例１～８及び１１～１７、参考例１及び２の培養時間毎の分析結果を以下に示す。
ＤＣＷ：Ｄｒｙ Ｃｅｌｌ Ｗｅｉｇｈｔ
ＲＢ： Ｒｅｓｉｄｕａｌ Ｂｉｏｍａｓｓ
Ｅ／Ｆ：ε－カプロラクトン／フルクトース比
Ｇ／Ｆ：γ－ブチロラクトン／フルクトース比
Ｂ／Ｆ：１，４－ブタンジオール／フルクトース比
Figure 0007196848000004
Figure 0007196848000005
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Figure 0007196848000026
Figure 0007196848000027
＜実施例２１＞
上記培地１にδ－バレロラクトンを５．５３ｇ／Ｌとフルクトースを８．８６ｇ／Ｌを加えた培地で３０℃、４日間、１５０ｐｍにてフラスコ培養した場合、Ｍｗ１００８万、Ｍｎ３２５万、Ｍｗ／Ｍｎ３．１のＰＨＡが得られた。
＜実施例２２＞
上記培地１にδ－カプロラクトンを５．２５ｇ／Ｌとフルクトース８．８６ｇ／Ｌを加えた培地で３０℃、４日間、１５０ｐｍにてフラスコ培養した場合、Ｍｗ６３０万、Ｍｎ２００万、Ｍｗ／Ｍｎ３．１のＰＨＡが得られた。

Claims (7)

  1. 重合単位として３－ヒドロキシブチレート単位を少なくとも含むポリエステルの生産能を有する微生物を、炭素源及び窒素源を含む培養液中において培養することを含む、ポリエステルの製造方法であって、
    製造されるポリエステルが、ポリスチレン換算ゲル浸透クロマトグラフィー測定による重量平均分子量が１００万以上であり、ポリスチレン換算ゲル浸透クロマトグラフィー測定による数平均分子量（Ｍｎ）に対するポリエステルのポリスチレン換算ゲル浸透クロマトグラフィー測定による重量平均分子量（Ｍｗ）の比率（Ｍｗ／Ｍｎ）が１．０～４．０であり、重合単位として３－ヒドロキシブチレート単位を少なくとも含むポリエステルであり、
    前記培養液のｐＨが４以上７．５以下であり、
    培養が下記の条件（ａ）及び（ｂ）を満たす、上記方法。
    （ａ）培養液の浸透圧が培養期間中２００ｍＯｓｍｏｌ以上５００ｍＯｓｍ以下に維持されている：
    （ｂ）培養液のＮＨ ４ 濃度が培養期間中１．２０ｇ／Ｌ以上４．０ｇ／Ｌ以下に維持されている：
  2. 前記微生物が、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属、Ｄｅｌｆｔｉａ属、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ属、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｐｈａｇａ属、 Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐａｒａｃｏｃｃｏｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ属、Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ属、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｅｃｔｏｔｈｉｏｒｈｏｄｏｓｐｉｒａ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｎｏｃａｒｄｉａ属、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ属、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ属、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属、Ｔｈｉｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｔｈｉｏｃｙｓｔｉｓ属、Ｖｉｂｒｉｏ属、及びＷａｕｔｅｒｓｉａ属からなる群から選択される微生物である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記微生物が、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒである、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 培養温度が、１５℃～４５℃である、請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
  5. 培養が、流加培養又は連続培養である、請求項１から４の何れか一項に記載の方法。
  6. 前記炭素源が、ε－カプロラクトン、δ－バレロラクトン、δ－カプロラクトン若しくはそれらのけん化物、又はそれらの塩の少なくとも一種を含む、請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
  7. 重合単位として３－ヒドロキシブチレート単位を少なくとも含むポリエステルの生産能を有する微生物を、炭素源及び窒素源を含む培養液中において培養することを含む、ポリエステルの製造方法であって、
    製造されるポリエステルが、ポリスチレン換算ゲル浸透クロマトグラフィー測定による重量平均分子量が１００万以上であり、ポリスチレン換算ゲル浸透クロマトグラフィー測定による数平均分子量（Ｍｎ）に対するポリエステルのポリスチレン換算ゲル浸透クロマトグラフィー測定による重量平均分子量（Ｍｗ）の比率（Ｍｗ／Ｍｎ）が１．０～４．０であり、重合単位として３－ヒドロキシブチレート単位を少なくとも含むポリエステルであり、
    前記培養液のｐＨが４以上７．５以下であり、
    培養が、回分培養であり、
    培養が下記の条件（ａ）及び（ｂ）を満たす、上記方法。
    （ａ）培養開始時における培養液の浸透圧が２００ｍＯｓｍｏｌ以上７００ｍＯｓｍ以下である：
    （ｂ）培養開始時における培養液のＮＨ ４ 濃度が０．５５ｇ／Ｌ以上４．７８ｇ／Ｌ以下である。
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