TW201920651A - 聚酯之製造方法 - Google Patents

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Abstract

本發明之課題為提供至少包含3-羥基丁酸單位作為聚合單位，高分子量且分子量分布窄(亦即，Mw/Mn小)的聚酯之製造方法。 　　其解決手段為一種方法，其係包含將微生物於含有碳源及氮源之培養液中培養的聚酯之製造方法，其中前述聚酯為重量平均分子量100萬以上，且至少包含3-羥基丁酸單位作為聚合單位的聚酯，作為培養條件，係將培養液之滲透壓於培養期間中維持於200mOsmol以上且900mOsm以下，且於培養期間中，培養液之氮原子濃度係維持於0.30g/L以上。

Description

聚酯之製造方法
本發明係關於至少包含3-羥基丁酸單位作為聚合單位的聚酯之製造方法。
多數微生物於其生體內會累積聚羥基烷酸酯(PHA)，作為能源/碳源儲存物質。碳源充分，氮、磷、硫、氧、鎂等之營養素受限制時，會引起PHA累積一事已廣為人知。PHA為熱可塑性之聚酯，作為生物分解性/生體相容性之塑膠受到注目，而有許多的研究(非專利文獻1)。構成PHA之單體單元已知有100種以上，最具代表性者係由(R)-3-羥基丁酸(以下略稱為3HB)所構成的聚-3-羥基丁酸(以下略稱為P(3HB))(非專利文獻1)。非專利文獻1中，揭示了一般而言於培養的後半，PHA之分子量會降低。
於關於P(3HB)之製造研究的概要之非專利文獻2中，亦記載於限制了磷的培養中，P(3HB)累積時分子量會降低。
作為使分子量增大之方法，係有對不具備PHA合成系/分解系之大腸菌Escherichia coli XL1-Blue導入自P(3HB)合成細菌Cupriavidus necator取出的P(3HB)生合成基因(PHACAB)，將該基因重組菌於pH6培養，製造超高分子量P(3HB)之方法(非專利文獻3)。
生產P(3HB)之野生株的P(3HB)之重量平均分子量Mw一般而言據稱為50萬~150萬左右，亦據稱為20萬~200萬左右、進而1萬~300萬左右，野生型之微生物中，由於菌體內具有多數的分解酵素，因此Mw300萬以上之超高分子量體P(3HB)的合成被認為係困難。又，由於微生物將P(3HB)作為能源/碳源儲存物質而累積，故於多數微生物中係調查到在碳源耗竭時分解來使用。但是，亦顯示有顯示出PHA之合成與分解同時發生的例子。PHA之合成與分解同時發生之生理學的意義尚未被解明。又，生產PHA之野生株中，PHA之合成與分解係如此地同時發生，因此為超高分子量體PHA合成困難的要因之一。
P(3HB-co-4HB)之製造研究亦有多數進行，藉由對生產P(3HB)之野生株Cupriavidus necator給予4-羥基丁酸(4HB)、γ-丁內酯、1,4-丁二醇、1,6-己二醇、1,8-辛二醇、1,10-癸二醇、1,12-十二烷二醇等之碳源來培養，而生產P(3HB-co-4HB)。
亦報告有將大腸菌基因重組，來生產P(3HB-co-4HB)或P(4HB)之方法，而非生產P(3HB)之野生株。當初係藉由導入由乙醯基CoA生產P(3HB)所必要的來自Cupriavidus necator之β-酮硫解酶(PhaA)、乙醯乙醯基CoA還原酶(PhaB)、PHA聚合酵素(PhaC)之各基因phaA、phaB、phaC，以及來自Clostridium kluyveri之琥珀酸分解路徑的基因(sucD、4hbD、orfZ)，由琥珀酸供給4HB-CoA，於大腸菌以葡萄糖為碳源，生產分子量Mw約180萬之P(3HB-co-4HB)，但PHA中之4HB比率係1.3~1.5%而為低者(非專利文獻4)。
又，亦有利用ε-己內酯或其皂化物之6-羥基己酸(或其鹽)於P(3HB-co-4HB)之生產的報告。以ε-己內酯為碳源來培養Cupriavidus necator時，係有PHA含量由26至38%、4HB比率由30%至36%之累積了P(3HB-co-4HB)的報告(非專利文獻5)，但無分子量之記載。
又，有揭示對Cupriavidus necator之PHA分解酵素缺損株導入了Aeromonas屬之PHA聚合酵素基因之基因重組菌中，於燒瓶培養中可生產重量平均分子量Mw300萬以上之超高分子量體P(3HB-co-3HH)，但缸式發酵槽(jar fermenter)培養中僅有Mw200萬左右(專利文獻1)。 　　進一步地，已知藉由於添加了二甲基亞碸(DMSO)等之聚乳酸的良溶劑之培養基中培養基因重組細菌，乳酸與3HB之共聚物的分子量會提高(專利文獻2)。
進一步地，專利文獻3中，記載藉由將可生產PHA之Cupriavidus屬微生物的細胞中之PHA合成酵素之比活性控制為0.1U/mg-protein以下，而合成分子量之PHA的微生物及高分子之PHA的製造方法。其記載藉由使用專利文獻3之微生物及方法，可工業上效率良好地生產重量平均分子量400萬以上之PHA。專利文獻4中，記載藉由使用δ-戊內酯及/或ε-己內酯培養特定之微生物，或使用甘醇酸培養特定之微生物，來生產具有游離羥基之PHA。專利文獻3及4中，並無記載於培養中控制培養液之滲透壓及氮原子濃度。又專利文獻5中，記載包含50~99莫耳%之β-羥基丁酸重複單位與1~50莫耳%之β-羥基戊酸重複單位，且具有50,000以上之重量平均分子量的β-羥基丁酸共聚物。專利文獻5中，並無記載於培養中控制培養液之滲透壓。 [先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1] 國際公報WO2014/065253號 　　[專利文獻2] 日本特開2017-29082號公報 　　[專利文獻3] 國際公報WO2012/102371號 　　[專利文獻4] 國際公報WO2017/033652號 　　[專利文獻5] 日本特開平5-15383號公報 [非專利文獻]
[非專利文獻1] Alistair J. Anderson et al., Microbiological Reviews,Vol.54,No.4,450-472,1990 　　[非專利文獻2] Editors：M.Fontanille,A.Guyot,Recent Advances in Mechanistic and Synthetic Aspects of Polymerization. Book. NATO ASI Series, Vol. 215, 293-314, 1987 　　[非專利文獻3] S.Kusaka et al.,Applied Microbiology and Biotechnology,Vol.47,140-143,1997 　　[非專利文獻4] Henry E.Valentin et al.,Journal of Biotechnology Vol.58,33-38,1997 　　[非專利文獻5] Sung Chul Yoon et al.,Korean Journal of Applied Microbiology and Biotechnology, Vol. 28, No.2, 71-79,2000
[發明所欲解決之課題]
PHA之共聚物化與高分子量化，被期待會改善PHA之物性。P(3HB)係為硬且脆的物性，即使將3-羥基戊酸(3HV)單元予以共聚物化，亦會共結晶化，故幾乎無法期待物性的改善。但是，由4HB單元或3-羥基己酸(3HH)單元等，不會與3HB單元共結晶化之第二成分單元所構成的共聚合PHA，藉由變更其第二單元成分之比率，可預期大幅之物性改善。特別是由具備側鏈之3HB單元或其他3-羥基烷酸所構成的PHA不顯示脂肪酶分解性，相對於此，已知使不具側鏈之4HB單元共聚物化而得的P(3HB-co-4HB)，與3HB比較，不僅是PHA分解酵素，亦會受到脂肪酶之酵素分解，預期於生體內之分解性提高，作為醫療材料而受到期待。但是，使用利用了自以往即常用之4HB單元前驅體即1,4-丁二醇或γ-丁內酯或4HB的生產PHA之野生株的製造法中，尚未得知得到重量平均分子量Mw超過171萬的P(3HB-co-4HB)共聚物之方法。
生產PHA之野生株係依需要分解利用累積的PHA，於細胞內具有PHA分解酵素，因此合成超高分子量PHA被認為係困難，且隨培養期間經過，PHA之分子量逐漸減少，係被理解為一般的現象。
使用PHA作為醫療材料時，以內毒素去除為始，係使用高度的純化技術，但一般而言，純化越高度進行，PHA會分解，而有分子量越降低的傾向。又，於施加加熱熔融等熱處理，分子量降低亦會進行，因此純化後或產品化後PHA之分子量必需為高分子量體時，係要求於純化前之培養階段即充分地為高分子量體。即使非醫療材料而為一般工業品用途，某種程度的純化步驟亦絕對必要，對於純化後PHA之物性提高，係要求為更高分子量體。因而，於培養階段得到較以往更高分子量體PHA之方法係受到需求。
本發明所欲解決之課題為提供至少包含3-羥基丁酸單位作為聚合單位，高分子量且分子量分布窄(亦即，Mw/Mn小)之聚酯之製造方法。 [用以解決課題之手段]
本發明者為了解決上述課題而深入探討的結果，發現於藉由培養具有聚酯生產能力之微生物來製造聚酯時，藉由將培養液之滲透壓維持為200mOsmol以上且900mOsm以下，且將培養液之氮原子濃度維持為0.30g/L以上，可製造至少包含3-羥基丁酸單位作為作為聚合單位，重量平均分子量100萬以上，且分子量分布窄的聚酯。本發明係基於上述見解而完成者。
亦即，依照本發明，係提供以下之發明。 　　(1)一種方法，其係包含將具有至少包含3-羥基丁酸單位作為聚合單位之聚酯的生產能力之微生物，於含有碳源及氮源之培養液中培養的聚酯之製造方法，其中 　　所製造之聚酯，為以聚苯乙烯換算之凝膠滲透層析測定而得之重量平均分子量為100萬以上，且至少包含3-羥基丁酸單位作為聚合單位的聚酯， 　　前述培養液之pH為4以上且7.5以下， 　　培養滿足下述之條件(a)及(b)； 　　(a)於培養期間中，培養液之滲透壓係維持於200 mOsmol以上且900mOsm以下： 　　(b)於培養期間中，培養液之氮原子濃度係維持於0.30g/L以上。
(2)如(1)之方法，其中其中前述微生物，為選自由Cupriavidus屬、Alcaligenes屬、Ralstonia屬、 Delftia屬、Comamonas屬、HydrogenoPHAga屬、 Burkholderia屬、Escherichia屬、Azotobacter屬、 Methylobacterium屬、Paracoccos屬、Acinetobacter屬、 Aeromonas屬、Allochromatium屬、Azorhizobium屬、 Bacillus屬、Caulobacter屬、Chromobacterium屬、 Ectothiorhodospira屬、Klebsiella屬、Nocardia屬、 Rhodobacter屬、Rhodococcus屬、Rhodospirillum屬、 Rickettsia屬、Sinorhizobium屬、Sphingomonas屬、 Synechocystis屬、Thiococcus屬、Thiocystis屬、Vibrio屬，及Wautersia屬所成之群的微生物。 　　(3)如(1)或(2)之方法，其中前述微生物為Cupriavidus necator。 　　(4)如(1)至(3)中任一項之方法，其中培養溫度為15℃~45℃。 　　(5)如(1)至(4)中任一項之方法，其中培養為饋料批式培養或連續培養。 　　(6)如(1)至(5)中任一項之方法，其中前述碳源，包含ε-己內酯、δ-戊內酯、δ-己內酯或該等之皂化物，或該等之鹽的至少一種。 　　(7)一種方法，其係包含將具有至少包含3-羥基丁酸單位作為聚合單位之聚酯的生產能力之微生物，於含有碳源及氮源之培養液中培養的聚酯之製造方法，其中 　　所製造之聚酯，為以聚苯乙烯換算之凝膠滲透層析測定而得之重量平均分子量為100萬以上，且至少包含3-羥基丁酸單位作為聚合單位的聚酯， 　　前述培養液之pH為4以上且7.5以下， 　　培養為批式培養， 　　培養滿足下述之條件(a)及(b)； 　　(a)於培養開始時之培養液之滲透壓為200mOsmol以上且900mOsm以下： 　　(b)於培養開始時之培養液之氮原子濃度為0.30g/L以上。 [發明之效果]
依照本發明，可製造至少包含3-羥基丁酸單位作為聚合單位，分子量為100萬以上，且分子量分布窄(亦即，Mw/Mn小)的聚酯。
以下，說明本發明之實施形態。 [聚酯之製造方法] 　　本發明中所製造之聚酯，為以聚苯乙烯換算之凝膠滲透層析測定而得到的重量平均分子量為100萬以上，至少包含3-羥基丁酸單位作為聚合單位的聚酯。
本發明之特徵之一，如上所述，係所製造之聚酯之以聚苯乙烯換算之凝膠滲透層析測定而得到的重量平均分子量(Mw)為100萬以上之高分子量。以聚苯乙烯換算之凝膠滲透層析測定而得到的重量平均分子量較佳為125萬以上、更佳為138萬以上、又更佳為180萬以上、特佳為190萬以上。以聚苯乙烯換算之凝膠滲透層析測定而得到的重量平均分子量，亦可為200萬以上、210萬以上、220萬以上、230萬以上、240萬以上、250萬以上、260萬以上、270萬以上、280萬以上、290萬以上、300萬以上、310萬以上、320萬以上、330萬以上、340萬以上、350萬以上、360萬以上、370萬以上、380萬以上、390萬以上，或400萬以上。以聚苯乙烯換算之凝膠滲透層析測定而得到的重量平均分子量之上限並無特殊限定，一般而言，係2000萬以下，亦可為1000萬以下、800萬以下、700萬以下、600萬以下，或500萬以下。
聚酯，較佳為以聚苯乙烯換算之凝膠滲透層析測定而得到的數平均分子量(Mn)為30萬以上。以聚苯乙烯換算之凝膠滲透層析測定而得到的數平均分子量，亦可為35萬以上、40萬以上、45萬以上、50萬以上、55萬以上、60萬以上、65萬以上、70萬以上、75萬以上、80萬以上、85萬以上、90萬以上、95萬以上、100萬以上、110萬以上、120萬以上，或130萬以上。以聚苯乙烯換算之凝膠滲透層析測定而得到的數平均分子量之上限並無特殊限定，一般而言，係1000萬以下，亦可為500萬以下、400萬以下、300萬以下，或200萬以下。
相對於Mn而言，Mw之比率(Mw/Mn)並無特殊限定，例如係1.0~10.0、1.0~6.0、1.0~4.0，更小者為佳，較佳為1.0~3.3、更佳為1.0~3.0、又更佳為1.0~2.9，亦可為1.0~2.5。 　　本發明中，即使為具有PHA分解酵素的生產PHA之野生株，亦可於培養後半不引起顯著之分子量降低地，製造高分子量體且分子量分布窄的PHA。
以聚苯乙烯換算之凝膠滲透層析測定而得到的重量平均分子量之測定，可與後述實施例記載的方法同樣地進行。
本發明中所製造之聚酯，至少包含3-羥基丁酸單位作為聚合單位。亦即，聚酯可僅包含3-羥基丁酸單位作為聚合單位，亦可包含3-羥基丁酸單位與其他聚合單位作為聚合單位。3-羥基丁酸單位以外之其他聚合單位，例如可列舉4-羥基丁酸單位，進而亦可為乳酸(LA)、甘醇酸(GA)、3-羥基丙酸(3HP)、3-羥基戊酸(3HV)、5-羥基戊酸(5HV)、5-羥基己酸(5HH)、6-羥基己酸(6HH)，或3-羥基己酸(3HH)，或源自碳數7以上之羥基烷酸酯等的聚合單位。
包含3-羥基丁酸單位以外與4-羥基丁酸單位之聚酯，可為僅包含3-羥基丁酸單位及4-羥基丁酸單位作為聚合單位的聚酯(亦即，聚合單位僅由3-羥基丁酸單位與4-羥基丁酸單位所構成)，或亦可包含3-羥基丁酸單位及4-羥基丁酸單位，且進一步包含上述以外之別的聚合單位作為聚合單位。上述之別的聚合單位，可列舉乳酸(LA)、甘醇酸(GA)、3-羥基丙酸(3HP)、3-羥基戊酸(3HV)、5-羥基戊酸(5HV)、5-羥基己酸(5HH)、6-羥基己酸(6HH)，或3-羥基己酸(3HH)，或碳數7以上之羥基烷酸酯等。
本發明中，3-羥基丁酸單位與4-羥基丁酸單位係分別以下式表示。 　　3-羥基丁酸單位：-OCH(CH3 )CH2 C(=O)- 　　4-羥基丁酸單位：-OCH2 CH2 CH2 C(=O)-
聚酯為包含3-羥基丁酸單位與4-羥基丁酸單位之聚酯時，相對於全部單體單位而言，4-羥基丁酸單位之比例並無特殊限定，較佳為3莫耳%~40莫耳%、更佳為10莫耳%~40莫耳%、又更佳為14莫耳%~40莫耳%。相對於全部單體單位而言，4-羥基丁酸單位之比例，亦可為15莫耳%以上、16莫耳%以上、17莫耳%以上、18莫耳%以上、19莫耳%以上，或20莫耳%以上。亦可為20.2莫耳%以上、20.6莫耳%上、21莫耳%以上、22莫耳%以上、23莫耳%以上、24莫耳%以上、25莫耳%以上、26莫耳%以上、27莫耳%以上，或28莫耳%以上。相對於全部單體單位而言，4-羥基丁酸單位之比例，亦可為35莫耳%以下、34莫耳%以下、33莫耳%以下、32莫耳%以下、31莫耳%以下、30莫耳%以下、29莫耳%以下、28莫耳%以下、27莫耳%以下、27莫耳%以下、26莫耳%以下，或25莫耳%以下。
相對於全部單體單位而言，4-羥基丁酸單位之比例，可根據後述實施例記載的方法測定。
聚酯，係隨機聚合物、嵌段聚合物、交替聚合物，或接枝聚合物均可，較佳為隨機聚合物。
具有P(3HB)生產能力之微生物，可使用屬於Cupriavidus屬、Alcaligenes屬、Ralstonia屬、Delftia屬、 Comamonas屬、HydrogenoPHAga屬、Burkholderia屬、 Escherichia屬、Azotobacter屬、Methylobacterium屬、 Paracoccos屬、Pseudomonas屬、Acinetobacter屬、 Aeromonas屬、Allochromatium屬、Azorhizobium屬、 Bacillus屬、Caulobacter屬、Chromobacterium屬、 Ectothiorhodospira屬、Klebsiella屬、Nocardia屬、 Rhodobacter屬、Rhodococcus屬、Rhodospirillum屬、 Rickettsia屬、Sinorhizobium屬、Sphingomonas屬、 Synechocystis屬、Thiococcus屬、Thiocystis屬、Vibrio屬、Wautersia屬之微生物。上述之中，尤以Cupriavidus屬較佳，更佳為Cupriavidus necator。作為一例，可使用Cupriavidus necator H16株(ATCC17699)。
再者，Cupriavidus necator H16株野生株中，3HB、3HV、4HB、5HV等可充分攝入PHA中，但若使用導入了基質特異性不同的PHA聚合酵素基因之基因重組菌，則其他羥基酸亦可聚合為PHA。因此，不僅Cupriavidus necator H16株野生株，如上述之其他的Cupriavidus屬、Alcaligenes屬、Ralstonia屬、Delftia屬、 Comamonas屬、HydrogenoPHAga屬、Burkholderia屬、 Escherichia屬、Azotobacter屬、Methylobacterium屬、 Paracoccos屬、Pseudomonas屬、Acinetobacter屬、 Aeromonas屬、Allochromatium屬、Azorhizobium屬、 Bacillus屬、Caulobacter屬、Chromobacterium屬、 Ectothiorhodospira屬、Klebsiella屬、Nocardia屬、 Rhodobacter屬、Rhodococcus屬、Rhodospirillum屬、 Rickettsia屬、Sinorhizobium屬、Sphingomonas屬、 Synechocystis屬、Thiococcus屬、Thiocystis屬、Vibrio屬、Wautersia屬等具有使PHA聚合之能力的基因重組微生物亦可使用。
本發明中，係將具有P(3HB)生產能力之微生物，於含有碳源及氮源之培養液中培養。 　　培養液之pH係4以上且7.5以下。pH亦可為未達7.0、6.5以下、6.4以下、6.3以下、6.1以下，亦可為4.5以上、5.0以上、5.1以上、5.2以上、5.3以上、5.4以上、5.5以上。
培養溫度一般而言為15℃~45℃、較佳為20℃~40℃、更佳為25℃~38℃。 　　培養方式係批式培養、饋料批式培養或連續培養均可。
本發明中，培養條件係滿足下述條件(a)及(b)。 　　(a)於培養期間中，培養液之滲透壓係維持於200 mOsmol以上且900mOsm以下： 　　(b)於培養期間中，培養液之氮原子濃度係維持於0.30g/L以上： 　　藉由採用滿足條件(a)及(b)之培養條件，得知可製造高分子量且分子量分布窄(亦即，Mw/Mn小)的聚酯。
「(a)於培養期間中，培養液之滲透壓係維持於200mOsmol以上且900mOsm以下」之記載，以及「(b)於培養期間中，培養液之氮原子濃度係維持於0.30g/L以上」之記載中的「維持」，只要係培養期間中之大部分(例如95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上)的期間中，培養液之滲透壓及培養液之氮原子濃度滿足上述條件即可，不一定要全部的培養期間(亦即培養期間之100%的時間)均經常地使培養液之滲透壓及培養液之氮原子濃度滿足上述條件。例如，若為培養期間當中的短時間(例如6小時以內、5小時以內、4小時以內、3小時以內、2小時以內、1小時以內、30分鐘以內、20分鐘以內、10分鐘以內，或5分鐘以內等)，則培養液之滲透壓，及/或培養液之氮原子濃度，可存在有成為上述條件之範圍外的狀況。又，只要不損及本發明之效果，則於1次培養步驟之間，培養液之滲透壓，及/或培養液之氮原子濃度，成為上述條件之範圍外的狀況，亦可存在有複數次。
培養期間中之培養液的滲透壓，較佳為200 mOsmol以上且900mOsm以下、更佳為200mOsmol以上且800mOsm以下、又更佳為200mOsmol以上且700mOsm以下、又再更佳為200mOsmol以上且600mOsm以下、特佳為200mOsmol以上且500mOsm以下。滲透壓之下限，只要係200mOsmol以上即可，亦可為210mOsmol以上、220 mOsmol以上、230mOsmol以上、240mOsmol以上、250 mOsmol以上，或300mOsmol以上。滲透壓之上限，只要係900mOsm以下即可，亦可為800mOsm以下、700mOsm以下、600mOsm以下、500mOsm以下，或400mOsm以下。
培養期間中之培養液的氮原子濃度係0.30 g/L以上、較佳為0.40g/L以上，亦可為0.42g/L以上、0.50g/L以上、0.55g/L以上、0.63g/L以上，或0.78g/L以上。氮原子濃度之上限並無特殊限定，一般而言，係15.6g/L以下，或7.8g/L以下。 　　培養期間中之培養液的NH4 + 濃度，較佳為0.39g/L以上，亦可為0.40g/L以上、0.51g/L以上、0.54g/L以上、0.64g/L以上、0.70g/L以上、0.81g/L以上，或1.00g/L以上。NH4 + 濃度之上限並無特殊限定，一般而言，係20.0 g/L以下，或10.0g/L以下。
本說明書中係如後述，本發明中，得知了藉由同時滿足關於滲透壓之上述條件(a)與關於氮原子濃度之上述條件(b)，可增殖連動性地使PHA累積，藉此可累積高分子量之PHA。藉由控制滲透壓與氮原子濃度，可累積高分子量之PHA，乃是本發明首次發現的見解。
滲透壓之測定方法並無特殊限定，可藉由後述實施例記載之冰點降低法(cryoscopic method)測定。 　　培養液之氮原子濃度的測定方法亦無特殊限定，只要由後述實施例記載之銨離子定量法定量，藉由下述式，由銨離子濃度換算為氮原子濃度即可。 　　銨離子濃度(g/L)×14/18=氮原子濃度(g/L)
培養基成分，只要係所使用之微生物可予以利用的物質則無特殊限制，較佳為有助於PHA聚合之鏈轉移的物質以外之物質。 　　碳源例如可使用甲醇、乙醇、丁醇、乙酸或丁酸等之有機碳源；二氧化碳等之無機碳源；酵母萃取物、糖蜜、蛋白腖及肉萃取物等之天然物；阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖、果糖及半乳糖等之糖類，或山梨醇、甘露醇及肌醇等。再者，甲醇、乙醇或丁醇等之短鏈醇類係有成為鏈轉移劑的可能性，因此作為碳源，較佳為甲醇、乙醇及丁醇以外者。
氮源例如可使用氨、銨鹽(氯化銨、硫酸銨、磷酸銨)、硝酸鹽等之無機氮化合物及/或例如尿素、玉米浸液、酪蛋白、蛋白腖、酵母萃取物、肉萃取物等之有機氮含有物。
批式培養中，只要氮源不較碳源耗竭先耗竭而轉移至增殖非連動性的PHA生產即可，例如燒瓶培養條件中較佳為添加硫酸銨2g/L以上。又，饋料批式培養或連續培養中，較期望氮原子濃度維持0.30g/L以上(或0.42g/L以上，或0.55g/L以上)、滲透壓維持200mOsm以上。 　　又，批式培養中，除了碳源以外，藉由添加硫酸銨或氯化鈉等之鹽，培養前之滲透壓會增加，培養開始時之滲透壓只要200mOsm以上即可，培養結束時因碳源或其他礦物質成分的消耗，滲透壓亦可降低至未達200mOsm。
無機成分例如分別由鈣鹽、鎂鹽、鉀鹽、鈉鹽、磷酸鹽、錳鹽、鋅鹽、鐵鹽、銅鹽、鉬鹽、鈷鹽、鎳鹽、鉻鹽、硼化合物及碘化合物等中選擇，更具體而言可列舉磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉等。
其他之有機營養源，例如可列舉甘胺酸、丙胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、脯胺酸等之胺基酸；維生素B1、維生素B12、維生素C等之維生素等。
依照本發明之較佳態樣，碳源包含ε-己內酯、δ-戊內酯、δ-己內酯或該等之皂化物，或該等之鹽的至少一種。碳源亦可進一步包含糖、油脂、脂肪酸、胺基酸及胜肽之至少一種。 　　本發明中，為了維持滲透壓，較佳為使用NaCl等之無機鹽；(NH4 )2 SO4 等之含氮無機鹽；糖類或短鏈脂肪酸等之碳源；ε-己內酯等之微生物利用性有機溶劑碳源；DMSO等之有機溶劑等對水可溶，有助於滲透壓之增加，且不易成為後述之鏈轉移劑的成分為佳。
於培養中添加ε-己內酯時，ε-己內酯會開環，成為6-羥基己酸(6HH)，加成CoA而成為6HH-CoA，於β氧化系會去掉乙醯基CoA而留下4HB-CoA，若被攝入於PHA中則成為4HB單元。由於PHA聚合酵素之基質特異性，6HH-CoA不易被攝入PHA中，係累積P(3HB-co-4HB)。 　　若4HB-CoA亦受β氧化，則亦生成乙醯基CoA。
具有羥基之化合物進入伸長中之PHA聚合酵素之酵素-S-PHA複合體，將酵素與PHA聚合物鏈間之硫酯切斷，PHA聚合物鏈自酵素移動至鏈轉移劑而停止PHA聚合的反應，係仿效自由基聚合而稱為鏈轉移反應。4HB或二醇類為具備羥基之化合物，γ-丁內酯亦開環而成為4HB，因此此等具備羥基之化合物係作為PHA聚合時之鏈轉移劑而作用，有使PHA之聚合停止的可能性。特別是二醇類其末端之2個羥基均可與鏈轉移相關，因此可認為特別容易引起PHA聚合的停止，不易得到高分子量體PHA。
ε-己內酯若開環時則生成6HH，仍成為具備羥基之化合物。與4HB-CoA可容易地成為PHA聚合酵素之基質但6HH-CoA不易成為基質同樣地，很可能6HH較4HB亦更不易作為鏈轉移劑而作用，因此可認為使用ε-己內酯時可得到更高分子量體PHA。依同樣的理由，可認為使用δ-戊內酯或δ-己內酯時雖PHA之組成或組成比不同但亦可得到高分子量體PHA。
以微生物生產物質，係有增殖連動性的生產與增殖非連動性的生產。 　　於增殖連動性的PHA生產中，PHA以外之菌體成分增殖的同時PHA亦會累積。於增殖連動性的PHA生產中，PHA合成與菌體增殖兩方會競爭乙醯基CoA，乙醯基CoA不易變得多餘。於增殖連動性的PHA生產之間，推測PHA之分解所致之游離羥基酸的產生亦受抑制，亦不易引起鏈轉移反應，而推測分子量成為相對高。
於增殖非連動性的PHA生產中，係於菌體成分之增殖停止之後，發生PHA之累積，PHA含量增加。由於菌體增殖停止，故過剩的乙醯基CoA係被使用於PHA生產。於增殖非連動性的PHA生產之間，似乎是將一時被攝入為PHA形態的成分再度分化，而將游離羥基酸排出於菌體外。於培養之後半氮源耗竭時，推測係由增殖連動性的生產轉移至增殖非連動性的生產，鏈轉移反應亦頻繁地發生，成為容易同時發生合成與分解的狀態(分子量容易降低的狀態)。
本發明中，發現增殖連動性地使PHA累積時，相較於在營養限制狀態下增殖非連動性地使PHA累積的情況，會更優勢地使高分子量之PHA累積。亦即，本發明之聚酯之製造中，較期望為菌體之增殖與PHA之累積同時發生的增殖連動性的PHA生產，而非為菌體之增殖與PHA之累積分開的以營養限制來進行之增殖非連動性的PHA生產。
再者，本發明中，發現將Cupriavidus necator在氮源充分且確保一定以上之滲透壓來培養時，可見增殖連動性的PHA生產。至今為止於Cupriavidus necator H16株(ATCC17699)之P(3HB)或P(3HB-co-4HB)之生產中，於培養基中添加鏈轉移劑(例如聚乙二醇(PEG))時，已知PHA之分子量會降低。於以氮限制等所進行的增殖非連動性的PHA生產中，對於以4HB為碳源之P(3HB-co-4HB)生產，觀察到PEG鍵結於PHA羧基末端( Macromolecules (1996), 29(1), 10-17)。但是，對於以果糖為碳源之P(3HB)生產，未得到顯示P(3HB)與PEG鍵結的數據，係有以下的主張：或許由於PEG與PHA聚合酵素相互作用，藉由以水而非PEG所進行的鏈轉移，PHA之聚合停止頻率增加，故P(3HB)之分子量降低(Macromolecules (1996), 29(24), 7753-7758)。
本發明中，於PEG存在下以Cupriavidus necator H16株增殖連動性地生產P(3HB)時，於NMR解析中得知P(3HB)與PEG直接鍵結(本說明書之比較例17、表26、圖8~圖10)。推測即使增殖非連動性的P(3HB)生產中發生PEG所致之鏈轉移，亦因菌體內之PHA分解酵素等之影響使末端之P(3HB)與PEG間之酯鍵迅速被切斷，結果僅觀察到PEG分子未鍵結於P(3HB)末端的狀態，但若未添加鏈轉移劑，可認為於得到高分子量體之增殖連動性的P(3HB)生產條件中，很可能PHA之分解被抑制，藉由添加鏈轉移劑PEG，觀察到分子量降低，同時P(3HB)與PEG之鍵結不被分解而殘留，故可由1 H-NMR直接觀察。
本發明之方法中之培養時間並無特殊限定，一般而言為24小時以上、48小時以上、72小時以上、96小時以上，或120小時以上。培養時間之上限並無特殊限定，一般而言為240小時以下，亦可為216小時以下，或192小時以下。
可由藉由遵照本發明之方法培養所得的培養液，以過濾及離心分離等之通常的固液分離手段分離回收菌體，將該菌體洗淨、乾燥而得到乾燥菌體。可藉由常規方法例如以如氯仿之有機溶劑由該乾燥菌體萃取所生成的聚酯，且對該萃取液例如添加如己烷之不良溶劑，藉以使聚酯沈澱並回收。
藉由以下之實施例以更具體說明本發明，但本發明不特別受以下實施例的限定。 [實施例]
[以Cupriavidus necator H16株製造共聚合聚酯] ＜實施例1＞ 　　使用Cupriavidus necator H16株(ATCC17699)來製造PHA。 　　以於由KH2 PO4 2.72g/L、Na2 HPO4 4.26g/L、NaHCO3 0.3g/L、(NH4 )2 SO4 2g/L、MgSO4 ･7H2 O 0.2g/L、酵母萃取物 0.2g/L、礦物質溶液3.5mL所構成的經滅菌之培養基1中添加果糖14.24g/L的培養基，於30℃進行試管振盪培養24小時，得到前前培養液。
礦物質溶液：將FeC6 H5 O7 ･xH2 O 6g/L、ZnSO4 ･7H2 O 2g/L、CuSO4 ･5H2 O 0.1g/L、MnCl2 ･4H2 O 1g/L、KI 0.1g/L、(NH4 )6 Mo7 O24 ･4H2 O 0.1g/L、CoCl2 ･6H2 O 0.1g/L、H3 BO3 0.2g/L、NaCl 5g/L、CaCl2 ･2H2 O 4g/L溶解於水者。
於置入有在上述培養基1添加果糖14.24g/L的培養基，或添加果糖8.86g/L與ε-己內酯5.38g/L之培養基100mL的500mL容積之三角燒瓶中，將上述之前前培養液1mL進行植菌，於30℃以150rpm培養48小時至96小時，作為培養種母(前培養液)。
於3L容積缸式發酵槽中準備2L之將上述培養基1之(NH4 )2 SO4 變更為12.5g/L的培養基並滅菌，將培養種母100mL進行植菌，將於42質量%果糖溶液溶解有NaCl 12.4g/L的糖溶液與ε-己內酯透過滅菌濾器(PTFE 0.2μm孔隙)開始無菌性饋料批次(fed-batch)。碳源之饋料批次速度或饋料批次比率可任意設定，但為了避免菌體消耗不完碳源而於培養槽內過剩地殘存，使菌體增殖停止，係以糖溶液之饋料批次速度為1~2g/h左右(0.5~1g/h･L)、ε-己內酯之饋料批次速度為0.2~0.5g/h(0.1~0.25g/h･L)左右的低流速開始培養，配合菌體之增殖，階段性或連續性地增加饋料批次速度。通氣量係控制為0.2~0.3L/min、攪拌速度控制為500~700rpm、培養溫度控制為36℃、培養pH下限控制為6.0，使用12.5%氨水作為pH調整用鹼。4HB前驅體碳源(實施例1中為ε-己內酯)：果糖之重量比率為約0.5。於培養開始後140.2小時結束培養。
於培養中，或培養後，將菌體與培養上清液藉由離心分離回收，將菌體於-20℃冷凍後，進行冷凍乾燥。 　　冷凍乾燥菌體中係用於PHA組成分析、PHA分子量解析。 　　PHA組成分析，係藉由於甲基酯化後以氣相層析將源自構成PHA之單體單元的甲基酯體等予以分析來進行。 　　PHA之分子量解析係將由冷凍乾燥菌體以氯仿萃取之PHA以凝膠滲透層析法來進行。實施例1之PHA的分子量分布示於圖1。 　　培養上清液係供滲透壓測定與氨濃度測定。
＜實施例2＞ 　　除了使用於培養缸培養之培養基中添加NaCl 2.5g/L，且將(NH4 )2 SO4 變更為10g/L的培養基，使用42質量%果糖溶液與ε-己內酯作為饋料批次碳源，且使培養時間成為140.2小時以外，係與實施例1同樣地進行。
＜實施例3＞ 　　除了使用42質量%果糖溶液與ε-己內酯作為培養缸培養中之碳源，且使培養時間成為100小時以外，係與實施例1同樣地進行。
＜比較例1＞ 　　除了使用於培養缸培養之培養基將(NH4 )2 SO4 變更為7.5g/L的培養基，且使培養時間成為122.5小時以外，係與實施例3同樣地進行。
＜比較例2＞ 　　除了使用於培養缸培養之培養基將(NH4 )2 SO4 變更為4g/L的培養基，且使培養時間成為125.5小時以外，係與實施例3同樣地進行。
＜比較例3＞ 　　除了使用4N NaOH作為於培養缸培養之pH調整用鹼，且使培養時間成為173.3.小時以外，係與實施例3同樣地進行。
＜比較例4＞ 　　除了於培養缸培養之培養基將(NH4 )2 SO4 變更為10g/L，且使培養時間成為140.5小時以外，係與比較例3同樣地進行。
＜比較例5＞ 　　除了於培養缸培養之培養基將(NH4 )2 SO4 變更為7.5g/L，且使培養時間成為165.5小時以外，係與比較例3同樣地進行。
＜比較例6＞ 　　除了於培養缸培養之pH下限控制變更為pH6.5，且使培養時間成為122小時以外，係與比較例5同樣地進行。
＜比較例7＞ 　　除了於培養缸培養之pH下限控制變更為pH7，且使培養時間成為137.7小時以外，係與比較例5同樣地進行。比較例7之PHA的分子量分布示於圖2。
＜比較例8＞ 　　除了於培養缸培養之pH下限控制變更為pH7.5，且使培養時間成為149小時以外，係與比較例5同樣地進行。
＜參考例1＞ 　　除了使用42質量%果糖溶液與γ-丁內酯作為燒瓶前培養與培養缸培養中之碳源，且使培養時間成為105小時以外，係與實施例3同樣地進行。
＜參考例2＞ 　　除了使4HB前驅體(參考例2中為γ-丁內酯)：果糖之重量比率為約0.6以外係與參考例1同樣地進行。
＜比較例11＞ 　　除了使用於培養缸培養之培養基將(NH4 )2 SO4 變更為7.5g/L的培養基，使用2N NaOH作為pH調整用鹼，且使培養時間成為165小時以外，係與參考例1同樣地進行。
＜比較例12＞ 　　除了使用42質量%果糖溶液與1,4-丁二醇作為燒瓶前培養與培養缸培養中之碳源，使4HB前驅體(比較例12中為1,4-丁二醇)：果糖之重量比率為約0.7，且使培養時間成為208.5小時以外，係與實施例3同樣地進行。
＜比較例13＞ 　　除了使4HB前驅體(比較例13中為1,4-丁二醇)：果糖之重量比率為約0.5以外，係與比較例12同樣地進行。
＜比較例14＞ 　　除了使用於培養缸培養之培養基將(NH4 )2 SO4 變更為7.5g/L的培養基，使用2N NaOH作為pH調整用鹼，且使培養時間成為189.5小時以外，係與比較例13同樣地進行。
＜實施例4＞ 　　除了使用42質量%果糖溶液作為燒瓶前培養與培養缸培養中之碳源，且使培養時間成為185.2小時以外，係與實施例1同樣地進行。實施例4之PHA的分子量分布示於圖3。
＜實施例5＞ 　　除了使用42質量%果糖溶液作為燒瓶前培養與培養缸培養中之碳源，且使培養時間成為185.9小時以外，係與實施例2同樣地進行。
＜實施例6＞ 　　除了使用42質量%果糖溶液作為燒瓶前培養與培養缸培養中之碳源，且使培養時間成為150小時以外，係與實施例3同樣地進行。 　　由菌體將PHA萃取純化的方法係如以下般進行。於附螺帽之玻璃製三角燒瓶，將冷凍乾燥菌體4~10g左右懸浮於400mL之氯仿，於30℃萃取24~48小時。將所得之黏稠溶液以濾紙過濾，去除菌體殘渣。將所得之澄清液以蒸發器濃縮至100~200mL左右，以5倍量之不良溶劑的己烷使PHA析出。將所得之白色沈澱物以乙醇洗淨後，真空乾燥而得到純化PHA。
＜比較例15＞ 　　除了使用42質量%果糖溶液作為燒瓶前培養與培養缸培養中之碳源，且使培養時間成為84小時以外，係與比較例2同樣地進行。
＜比較例16＞ 　　除了使用42質量%果糖溶液作為燒瓶前培養與培養缸培養中之碳源，且使用於培養缸培養之培養基將(NH4 )2 SO4 變更為4g/L的培養基，使培養時間成為92.6小時以外，係與比較例5同樣地進行。
＜比較例17(PEG200添加之培養：PEG化P(3HB)之製造＞ 　　除了使用42質量%果糖溶液作為燒瓶前培養與培養缸培養中之碳源，於培養缸培養之培養基中添加2.5g/L之NaCl、20ml/L之PEG200，且使培養時間成為130.9小時以外，係與實施例1同樣地進行。回收培養第3日之培養液與第5日之培養液，將菌體藉由離心分離回收，於-20℃冷凍後，進行冷凍乾燥。
[分析方法之說明] ＜PHA分子量測定(凝膠滲透層析(GPC)法)＞ 　　PHA分子量之測定係如以下般藉由凝膠滲透層析法進行。 　　添加氯仿，使源自冷凍乾燥菌體之PHA成為約0.5 mg/ml，於60℃萃取溶解4小時後，回到室溫，以孔徑0.2 μm之PTFE濾器過濾而去除不溶物，作為測定樣品。GPC條件如以下所述。
裝置：島津製作所製 HPLC Prominence系統 　　管柱：昭和電工製 Shodex K-806L(2支直列) 　　管柱溫度：40℃ 　　移動相：氯仿(1ml/min) 　　檢測器：RI(40℃) 　　標準品：Shodex聚苯乙烯分子量標準品(687萬~1270) 　　注入量：60μl 　　分析時間：30分鐘
＜PHA組成分析(GC法)＞ 　　菌體中所含的PHA之組成分析係如以下般進行。將所得之乾燥菌體約10mg秤取至附螺帽之試管中，混合氯仿2mL與含內部標準的甲醇硫酸混合液(內部標準：安息香酸0.5g/L、硫酸3.7質量%)2mL，於121℃加熱處理90分鐘，冷卻至室溫，使PHA甲基酯化。反應結束後添加純水1ml，劇烈攪拌後，進行離心分離，得到有機溶劑層。將該有機溶劑層以硫酸鈉脫水後以氣相層析分析，藉以算出PHA成分含量。GC條件係如以下所述。
氣相層析分析條件 　　裝置：島津GC-2025 　　毛細管管柱：DB-1(0.25mm(id)×60m、Film厚1μm) 　　載流氣體：He(3.23ml/min) 　　管柱溫度：125℃ 6.5min-rate25℃/min-260℃ 　　輔助氣體(makeup)流量：30mL/min 　　H2流量：40ml/min 　　Air流量：400ml/min 　　注射：250℃ 　　檢測器：FID(260℃) 　　分流：1:20 　　注入量：1μL 　　分析時間：21.5分鐘
＜銨離子定量方法(CE法)＞ 　　培養上清液中之NH4 + 濃度定量係如以下般進行。將使培養液離心分離所得之培養上清液直接或適當稀釋，以Agilent Technologies公司製毛細管電泳裝置7100型，以和光純藥工業公司製陽離子混合標準液III(NH4 + 濃度25mg/L)為標準品算出NH4 濃度。
＜滲透壓測定方法(冰點降低法)＞ 　　培養上清液之滲透壓係如以下般以利用冰點降低法之方法測定。使用滲透壓測定裝置(Advance Instruments公司製。Advance滲透壓計3250)測定培養上清液之滲透壓值(mOsm/kg H2 O，縮寫為mOsm)。校正係使用100mOsm、1500mOsm標準液進行之低範圍模式(0~2000mOsm用)來進行。
[聚合物之分析] ＜1 H-NMR及13 C-NMR＞ 　　使用核磁共振分光裝置(日本分光ECA500)解析實施例6中得到之純化PHA(P(3HB))之化學構造。將純化之PHA以1.5質量%濃度溶解於CDCl3 ，作為測定樣品。1 H-NMR光譜係以500MHz於室溫計測。13 C-NMR光譜係以125MHz於室溫計測。
實施例2中製造之PHA的1 H-NMR示於圖4，13 C-NMR示於圖5。 　　實施例6之僅P(3HB)之1 H-NMR示於圖6，圖6之擴大圖示於圖7。 　　將自比較例17中得到之培養第3日的培養液中萃取純化之PHA的1 H-NMR示於圖8及圖9。圖9為圖8之擴大圖。將自同一培養第5日的培養液中萃取純化之PHA的1 H-NMR擴大圖示於圖10。藉由於PEG200存在下之Cupriavidus necator H16(ATCC17699)野生株之增殖連動性的P(3HB)生產中得到之P(3HB)的1 H-NMR解析，得到顯示P(3HB)與PEG之直接鍵結的結果。
＜實施例7~20(燒瓶培養)＞ 　　使用Cupriavidus necator H16株(ATCC17699)以燒瓶培養製造PHA。 　　於分別置入有100mL之於上述培養基1添加果糖8.86 g/L與ε-己內酯5.38g/L的培養基(實施例7~19，惟硫酸銨與氯化鈉濃度為表所記載之量)，或添加果糖8.86g/L與ε-己內酯6.46g/L的培養基(實施例20，惟硫酸銨濃度為表所記載之量)之500mL容積之三角燒瓶中，將上述前培養培養基1mL進行植菌，於30℃、150rpm培養表中記載的時間。培養開始前之pH為6.8~7.5左右，培養結束時係成為5.7~6.2左右的弱酸性。培養中之pH為5.7~7.5左右。培養結束後，以離心分離回收菌體，冷凍乾燥，測定乾燥菌體重量。又，以GC法之PHA之含量與組成分析的結果或滲透壓測定結果一併示於下述表27。
於實施例7~20之燒瓶培養(批式培養)中，於培養開始時，滿足培養液之滲透壓為200mOsmol以上且900mOsm以下，且培養液之氮原子濃度為0.30g/L以上之條件。於滿足培養液之滲透壓為200mOsmol以上且900 mOsm以下，且培養液之氮原子濃度為0.30g/L以上之條件的培養期間中，係製造出重量平均分子量為100萬以上，且至少包含3-羥基丁酸單位作為聚合單位的聚酯。又，於實施例7~20之燒瓶培養(批式培養)中，亦假定於培養開始時之滲透壓為200mOsm以上，另一方面培養結束時因碳源或其他礦物質成分之消耗使滲透壓降低為未達200mOsm的情況，但此情況時亦製造出重量平均分子量為100萬以上，且至少包含3-羥基丁酸單位作為聚合單位的聚酯。
[結果] 　　上述實施例1~6、比較例1~8及11~16、參考例1及2之分析結果如以下所示。 　　Frc：果糖 　　ECL：ε-己內酯 　　GBL：γ-丁內酯 　　BD：1,4-丁二醇 　　E/F：ε-己內酯/果糖比 　　G/F：γ-丁內酯/果糖比 　　B/F：1,4-丁二醇/果糖比
實施例1~6、比較例1~8及11~17、參考例1及2之各培養時間的分析結果如以下所示。 　　DCW：Dry Cell Weight 　　RB：Residual Biomass 　　E/F：ε-己內酯/果糖比 　　G/F：γ-丁內酯/果糖比 　　B/F：1,4-丁二醇/果糖比
＜實施例21＞ 　　以於上述培養基1添加δ-戊內酯5.53g/L與果糖8.86g/L的培養基於30℃、150pm燒瓶培養4日時，得到Mw1008萬、Mn325萬、Mw/Mn3.1之PHA。
＜實施例22＞ 　　以於上述培養基1添加δ-己內酯5.25g/L與果糖8.86g/L的培養基於30℃、150pm燒瓶培養4日時，得到Mw630萬、Mn200萬、Mw/Mn3.1之PHA。
[圖1] 圖1係顯示實施例1中製造之PHA的分子量分布。 　　[圖2] 圖2係顯示比較例7中製造之PHA的分子量分布。 　　[圖3] 圖3係顯示實施例4中製造之PHA的分子量分布。 　　[圖4] 圖4係顯示實施例2中製造之PHA的1 H-NMR。 　　[圖5] 圖5係顯示實施例2中製造之PHA的13 C-NMR。 　　[圖6] 圖6係顯示實施例6中製造之P(3HB)的1 H-NMR。 　　[圖7] 圖7係顯示圖6之擴大圖。 　　[圖8] 圖8係顯示自比較例17中所得之培養第3日之培養液中萃取純化的PEG化P(3HB)之1 H-NMR。 　　[圖9] 圖9係顯示圖8之擴大圖。 　　[圖10] 圖10係顯示自比較例17之第5日之培養液中萃取純化的PEG化P(3HB)之1 H-NMR擴大圖。

Claims (7)

  1. 一種方法，其係包含將具有至少包含3-羥基丁酸單位作為聚合單位之聚酯的生產能力之微生物，於含有碳源及氮源之培養液中培養的聚酯之製造方法，其中 　　所製造之聚酯，為以聚苯乙烯換算之凝膠滲透層析測定而得之重量平均分子量為100萬以上，且至少包含3-羥基丁酸單位作為聚合單位的聚酯， 　　前述培養液之pH為4以上且7.5以下，且 　　培養滿足下述之條件(a)及(b)： 　　(a)於培養期間中，培養液之滲透壓係維持於200 mOsmol以上且900mOsm以下， 　　(b)於培養期間中，培養液之氮原子濃度係維持於0.30g/L以上。
  2. 如請求項1之方法，其中前述微生物，為選自由Cupriavidus屬、Alcaligenes屬、Ralstonia屬、Delftia屬、Comamonas屬、Hydrogenophaga屬、Burkholderia屬、 Escherichia屬、Azotobacter屬、Methylobacterium屬、 Paracoccos屬、Pseudomonas屬、Acinetobacter屬、 Aeromonas屬、Allochromatium屬、Azorhizobium屬、 Bacillus屬、Caulobacter屬、Chromobacterium屬、 Ectothiorhodospira屬、Klebsiella屬、Nocardia屬、 Rhodobacter屬、Rhodococcus屬、Rhodospirillum屬、 Rickettsia屬、Sinorhizobium屬、Sphingomonas屬、 Synechocystis屬、Thiococcus屬、Thiocystis屬、Vibrio屬，及Wautersia屬所成之群的微生物。
  3. 如請求項1之方法，其中前述微生物為Cupriavidus necator。
  4. 如請求項1至3中任一項之方法，其中培養溫度為15℃~45℃。
  5. 如請求項1至3中任一項之方法，其中培養為饋料批式培養或連續培養。
  6. 如請求項1至3中任一項之方法，其中前述碳源，包含ε-己內酯、δ-戊內酯、δ-己內酯或該等之皂化物，或該等之鹽的至少一種。
  7. 一種方法，其係包含將具有至少包含3-羥基丁酸單位作為聚合單位之聚酯的生產能力之微生物，於含有碳源及氮源之培養液中培養的聚酯之製造方法，其中 　　所製造之聚酯，為以聚苯乙烯換算之凝膠滲透層析測定而得之重量平均分子量為100萬以上，且至少包含3-羥基丁酸單位作為聚合單位的聚酯， 　　前述培養液之pH為4以上且7.5以下， 　　培養為批式培養，且 　　培養滿足下述之條件(a)及(b)： 　　(a)於培養開始時之培養液之滲透壓為200mOsmol以上且900mOsm以下， 　　(b)於培養開始時之培養液之氮原子濃度為0.30g/L以上。
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