KR20200046052A - 폴리에스테르의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

중합 단위로서 3-하이드록시부티레이트 단위를 적어도 포함하고, 고분자량이며, 또한 분자량 분포가 좁은(즉, Mw/Mn이 작은) 폴리에스테르의 제조방법을 제공하는 것이다. 미생물을 탄소원 및 질소원을 포함하는 배양액 중에 있어서 배양하는 것을 포함하는 폴리에스테르의 제조방법으로서, 상기 폴리에스테르는, 중량평균 분자량이 100만 이상이며, 중합 단위로서 3-하이드록시부티레이트 단위를 적어도 포함하는 폴리에스테르이며, 배양조건으로서, 배양액의 침투압이 배양기간 중 200mOsmol 이상 900mOsm 이하로 유지되고, 또한 배양액의 질소원자 농도가 배양기간 중 0.30g/L 이상으로 유지되어 있는, 방법이다.

Description

폴리에스테르의 제조방법
본 발명은, 중합 단위로서 3-하이드록시부티레이트 단위를 적어도 포함하는 폴리에스테르의 제조방법에 관한 것이다.
많은 미생물은 그 생체 내에 에너지원·탄소원저장물질로서 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)를 축적한다. 탄소원이 충분하고, 질소, 인, 황, 산소, 마그네슘 등의 영양소가 제한되면 PHA의 축적이 일어나는 것이 잘 알려져 있다. PHA는 열가소성의 폴리에스테르이며, 생분해성·생체적합성의 플라스틱으로서 주목받아, 많은 연구가 이루어져 왔다(비특허문헌 1). PHA를 구성하는 모노머유닛은 100종류 이상 알려져 있고, 가장 대표적인 것은 (R)-3-하이드록시부티레이트(이하, 3HB라고 약칭한다)로 이루어지는 폴리-3-하이드록시부티레이트(이하, P(3HB)라고 약칭한다)이다(비특허문헌 1). 비특허문헌 1에 있어서는, 배양의 후반에 있어서는 PHA의 분자량이 저하되는 것이 일반적인 것이 나타나 있다.
P(3HB)의 제조연구에 관한 총설인 비특허문헌 2에 있어서도, 인을 제한한 배양 중에 있어서, P(3HB)의 축적시에 분자량이 저하되어가는 것이 기재되어 있다.
분자량을 증대시키는 방법으로는, PHA합성계·분해계를 갖지 않는 대장균 에세리키아(Escherichia) coli XL1-Blue에 P(3HB)합성세균 커프리아비더스 네케이터(Cupriavidus necator)로부터 취출한 P(3HB)생합성유전자(phaCAB)를 도입하고, 그 유전자변형균을 pH 6으로 배양하고 초고분자량 P(3HB)를 제조하는 방법이 있다(비특허문헌 3).
P(3HB)를 생산하는 야생주(野生株)의 P(3HB)의 중량평균 분자량 Mw은 일반적으로는 50만~150만 정도라고도 20만~200만 정도, 더 나아가 1만~300만 정도라고도 하며, 야생형의 미생물에서는 균체 내에 다수의 분해효소를 가지므로 Mw 300만 이상이 되는 초고분자량체 P(3HB)의 합성이 어렵다고 여겨진다. 또한, P(3HB)는 미생물이 에너지원·탄소원저장물질로서 축적되어 있으므로, 탄소원이 고갈된 경우에 분해하여 사용되는 것은 많은 미생물에서 조사되고 있다. 그러나, PHA의 합성과 분해가 동시에 일어나고 있는 것을 나타내는 예도 개시되어 있다. PHA의 합성과 분해가 동시에 일어나고 있는 것의 생리학적 의의는 아직 해명되지 않았다. 또한 PHA 생산 야생주에서는 PHA의 합성과 분해가 이와 같이 동시에 일어나므로, 초고분자량체 PHA 합성이 어려운 요인 중 하나이다.
P(3HB-co-4HB)의 제조연구도 다수 행해지고 있으며, P(3HB) 생산 야생주인 커프리아비더스 네케이터(Cupriavidus necator)에 4-하이드록시부티레이트(4HB), γ-부티로락톤, 1,4-부탄디올, 1,6-헥산디올, 1,8-옥탄디올, 1,10-데칸디올, 1,12-도데칸디올 등의 탄소원을 주고 배양함으로써 P(3HB-co-4HB)가 생산된다.
P(3HB) 생산 야생주가 아니라, 대장균을 유전자변형하여 P(3HB-co-4HB)나 P(4HB)를 생산하는 방법도 보고되어 있다. 당초는 아세틸CoA로부터 P(3HB)를 생산하기에 필요한 커프리아비더스 네케이터(Cupriavidus necator) 유래의 β-케토티올라아제(PhaA), 아세토아세틸CoA리덕타아제(PhaB), PHA중합효소(PhaC)의 각 유전자 phaA, phaB, phaC에 더하여, 클로스트리듐 클루이베리(Clostridium kluyveri) 유래의 석신산분해경로의 유전자(sucD, 4hbD, orfZ)를 도입함으로써, 석신산으로부터 4HB-CoA를 공급하고, 대장균으로 글루코오스를 탄소원으로 하여 분자량 Mw이 약 180만인 P(3HB-co-4HB)가 생산되었으나, PHA 중의 4HB 비율은 1.3~1.5%로 낮은 것이었다(비특허문헌 4).
또한, P(3HB-co-4HB)의 생산에 ε-카프로락톤 또는 그의 감화물인 6-하이드록시헥사노에이트(또는 그의 염)를 이용한 보고도 있다. ε-카프로락톤을 탄소원으로 하여 커프리아비더스 네케이터(Cupriavidus necator)를 배양한 경우, PHA함량 26 내지 38%, 4HB 비율 30% 내지 36%의 P(3HB-co-4HB)를 축적했다고 하는 보고도 있는데(비특허문헌 5), 분자량의 기재는 없다.
또한, 커프리아비더스 네케이터(Cupriavidus necator)의 PHA분해효소 결손주에 에로모나스(Aeromonas)속의 PHA중합효소 유전자를 도입하는 유전자변형균에서는, 플라스크배양에 있어서 중량평균 분자량 Mw 300만 이상의 초고분자량체 P(3HB-co-3HH)가 생산가능하나, 자 퍼멘터(ジャ―ファ―メンタ―) 배양에서는 Mw 200만 정도로 그치는 것이 개시되어 있다(특허문헌 1).
게다가, 디메틸설폭사이드(DMSO) 등의 폴리유산의 양용매를 첨가한 배지에 있어서 유전자변형세균을 배양함으로써, 유산과 3HB의 공중합체의 분자량이 향상된 것이 알려져 있다(특허문헌 2).
또한, 특허문헌 3에는, PHA를 생산가능한 커프리아비더스Cupriavidus)속 미생물의 세포 중의 PHA합성효소의 비(比)활성을 0.1U/mg-protein 이하로 제어함으로써, 분자량의 PHA를 합성하는 미생물 및 고분자의 PHA의 제조방법이 기재되어 있다. 특허문헌 3의 미생물 및 방법을 이용함으로써 중량평균 분자량 400만 이상의 PHA를 공업적으로 효율좋게 생산할 수 있는 것이 기재되어 있다. 특허문헌 4에는, 특정의 미생물을, δ-발레로락톤 및/또는 ε-카프로락톤을 사용하여 배양하는 것, 또는 글리콜산을 사용하여 배양함으로써, 유리의 하이드록시기를 갖는 PHA를 생산하는 것이 기재되어 있다. 특허문헌 3 및 4에 있어서는, 배양 중에 있어서 배양액의 침투압 및 질소원자 농도를 제어하는 것에 대해서는 기재가 없다. 또한 특허문헌 5에는, 50~99몰%의 β-하이드록시부티레이트 반복 단위와 1~50몰%의 β-하이드록시발레레이트 반복 단위를 포함하고, 50,000 이상의 중량평균 분자량을 갖는 β-하이드록시부티레이트 공중합체가 기재되어 있다. 특허문헌 5에 있어서는, 배양 중에 있어서 배양액의 침투압을 제어하는 것에 대해서는 기재가 없다.
국제공보 WO2014/065253호 일본특허공개 2017-29082호 공보 국제공보 WO2012/102371호 국제공보 WO2017/033652호 일본특허공개 H5-15383호 공보
Alistair J. Anderson et al., Microbiological Reviews, Vol.54, No.4, 450-472, 1990 Editors: M.Fontanille, A.Guyot, Recent Advances in Mechanistic and Synthetic Aspects of Polymerization. Book. NATO ASI Series, Vol.215, 293-314, 1987 S.Kusaka et al., Applied Microbiology and Biotechnology, Vol.47, 140-143, 1997 Henry E.Valentin et al., Journal of Biotechnology Vol.58, 33-38, 1997 Sung Chul Yoon et al., Korean Journal of Applied Microbiology and Biotechnology, Vol.28, No.2, 71-79, 2000
PHA의 공중합체화와 고분자량화는 PHA의 물성을 개선하는 것이 기대된다. P(3HB)는 딱딱하고 무른 물성인데, 3-하이드록시발레레이트(3HV)유닛을 공중합체화해도 공결정화되므로, 그다지 물성의 개선은 예상되지 않는다. 그러나, 4HB유닛이나 3-하이드록시헥사노에이트(3HH)유닛 등, 3HB유닛과는 공결정화되지 않는 제2 성분유닛으로 이루어지는 공중합 PHA는 그 제2 유닛성분의 비율을 변화시킴으로써 대폭적인 물성의 개선이 예상된다. 특히, 측쇄를 갖는 3HB유닛이나 다른 3-하이드록시알칸산으로 이루어지는 PHA가 리파아제분해성을 나타내지 않는 것에 반해, 3HB와 비교하여 측쇄를 갖지 않는 4HB유닛을 공중합체화시킨 P(3HB-co-4HB)는, PHA분해효소뿐만 아니라 리파아제에 의한 효소분해도 받는 것이 알려져 있어, 생체 내에서의 분해성의 향상이 예상되고, 의료재료로서 기대되고 있다. 그러나, 종래부터 잘 이용되어 온 4HB유닛 전구체인 1,4-부탄디올이나 γ-부티로락톤이나 4HB를 사용한 PHA 생산 야생주를 사용한 제조법에서는, 중량평균 분자량 Mw 171만을 초과하는 P(3HB-co-4HB)공중합체를 얻는 방법은 알려져 있지 않다.
PHA 생산 야생주는 필요에 따라 축적한 PHA를 분해이용하고 세포 내에 PHA분해효소를 갖고 있으므로, 초고분자량 PHA를 합성하는 것은 어렵다고 여겨지고, 또한 배양기간을 통해 PHA의 분자량이 점차 감소되어가는 것은 일반적인 현상으로 이해되고 있다.
PHA를 의료재료로서 이용하는 경우에는 엔도톡신 제거를 비롯한 고도의 정제기술이 이용되는데, 일반적으로 정제를 고도로 행할수록 PHA는 분해되고 분자량은 저하되어가는 경향이 있다. 또한 가열용융 등 열처리를 가하는 것으로도 분자량 저하는 진행되므로, 정제 후나 제품화 후 PHA의 분자량이 고분자량체일 필요가 있는 경우에는, 정제 전의 배양단계에 있어서 충분히 고분자량체일 것이 요구된다. 의료재료가 아니라 일반공업품용이어도, 어느 정도의 정제공정은 반드시 필요하며, 정제 후 PHA의 물성향상에는 보다 고분자량체일 것이 요구되고 있다. 따라서 배양단계에서 종래보다 고분자량체 PHA가 얻어지는 방법이 요구되어 왔다.
본 발명은, 중합 단위로서 3-하이드록시부티레이트 단위를 적어도 포함하고, 고분자량이며, 또한 분자량 분포가 좁은(즉, Mw/Mn이 작은) 폴리에스테르의 제조방법을 제공하는 것을 해결해야 하는 과제로 한다.
본 발명자는 상기 과제를 해결하기 위해 예의 검토한 결과, 폴리에스테르의 생산능을 갖는 미생물을 배양함으로써 폴리에스테르를 제조할 때에, 배양액의 침투압을 200mOsmol 이상 900mOsm 이하로 유지하고, 배양액의 질소원자 농도를 0.30g/L 이상으로 유지함으로써, 중합 단위로서 3-하이드록시부티레이트 단위를 적어도 포함하고, 중량평균 분자량이 100만 이상이며, 또한 분자량 분포가 좁은 폴리에스테르를 제조할 수 있는 것을 발견하였다. 본 발명은, 상기의 지견에 기초하여 완성한 것이다.
즉, 본 발명에 따르면 이하의 발명이 제공된다.
(1) 중합 단위로서 3-하이드록시부티레이트 단위를 적어도 포함하는 폴리에스테르의 생산능을 갖는 미생물을, 탄소원 및 질소원을 포함하는 배양액 중에 있어서 배양하는 것을 포함하는, 폴리에스테르의 제조방법으로서,
제조되는 폴리에스테르가, 폴리스티렌 환산 겔침투 크로마토그래피 측정에 의한 중량평균 분자량이 100만 이상이며, 중합 단위로서 3-하이드록시부티레이트 단위를 적어도 포함하는 폴리에스테르이며,
상기 배양액의 pH가 4 이상 7.5 이하이며,
배양이 하기의 조건(a) 및 (b)를 만족시키는, 상기 방법.
(a) 배양액의 침투압이 배양기간 중 200mOsmol 이상 900mOsm 이하로 유지되어 있다:
(b) 배양액의 질소원자 농도가 배양기간 중 0.30g/L 이상으로 유지되어 있다:
(2) 상기 미생물이, 커프리아비더스(Cupriavidus)속, 알칼리게네스(Alcaligenes)속, 랄스토니아(Ralstonia)속, 델프티아(Delftia)속, 코마모나스(Comamonas)속, 히드로게노파가(Hydrogenophaga)속,　버크홀데리아(Burkholderia)속, 에세리키아(Escherichia)속, 아조토박터(Azotobacter)속, 메틸로박테리움(Methylobacterium)속, 파라코코스(Paracoccos)속, 아시네토박터(Acinetobacter)속, 에로모나스(Aeromonas)속, 알로크로마티움(Allochromatium)속, 아조라이조비움(Azorhizobium)속, 바실러스(Bacillus)속, 카울로박터(Caulobacter)속, 크로모박테륨(Chromobacterium)속, 엑토티오로도스피라(Ectothiorhodospira)속, 클렙시엘라(Klebsiella)속, 노카르디아(Nocardia)속, 로도박터(Rhodobacter)속, 로도코커스(Rhodococcus)속, 로도스피릴룸(Rhodospirillum)속, 리케치아(Rickettsia)속, 시노르히조비움(Sinorhizobium)속, 스핑고모나스(Sphingomonas)속, 시네코시스티스(Synechocystis)속, 티오코커스(Thiococcus)속, 티오시스티스(Thiocystis)속, 비브리오(Vibrio)속, 및 와우터시아(Wautersia)속으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 미생물인, (1)에 기재된 방법.
(3) 상기 미생물이, 커프리아비더스 네케이터(Cupriavidus necator)인, (1) 또는 (2)에 기재된 방법.
(4) 배양온도가, 15℃~45℃인, (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(5) 배양이, 유가(流加)배양 또는 연속배양인, (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(6) 상기 탄소원이, ε-카프로락톤, δ-발레로락톤, δ-카프로락톤 혹은 이들의 감화물, 또는 이들의 염 중 적어도 1종을 포함하는, (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(7) 중합 단위로서 3-하이드록시부티레이트 단위를 적어도 포함하는 폴리에스테르의 생산능을 갖는 미생물을, 탄소원 및 질소원을 포함하는 배양액 중에 있어서 배양하는 것을 포함하는, 폴리에스테르의 제조방법으로서,
제조되는 폴리에스테르가, 폴리스티렌 환산 겔침투 크로마토그래피 측정에 의한 중량평균 분자량이 100만 이상이며, 중합 단위로서 3-하이드록시부티레이트 단위를 적어도 포함하는 폴리에스테르이며,
상기 배양액의 pH가 4 이상 7.5 이하이며,
배양이, 회분배양이며,
배양이 하기의 조건(a) 및 (b)를 만족시키는, 상기 방법.
(a) 배양개시 시에 있어서의 배양액의 침투압이 200mOsmol 이상 900mOsm 이하이다:
(b) 배양개시 시에 있어서의 배양액의 질소원자 농도가 0.30g/L 이상이다.
본 발명에 따르면, 중합 단위로서 3-하이드록시부티레이트 단위를 적어도 포함하고, 분자량이 100만 이상이며, 또한 분자량 분포가 좁은(즉, Mw/Mn이 작은) 폴리에스테르를 제조할 수 있다.
도 1은, 실시예 1에서 제조한 PHA의 분자량 분포를 나타낸다.
도 2는, 비교예 7에서 제조한 PHA의 분자량 분포를 나타낸다.
도 3은, 실시예 4에서 제조한 PHA의 분자량 분포를 나타낸다.
도 4는, 실시예 2에서 제조한 PHA의 1H-NMR을 나타낸다.
도 5는, 실시예 2에서 제조한 PHA의 13C-NMR을 나타낸다.
도 6은, 실시예 6에서 제조한 P(3HB)의 1H-NMR을 나타낸다.
도 7은, 도 6의 확대도를 나타낸다.
도 8은, 비교예 17에서 얻어진 배양 3일째의 배양액으로부터 추출정제한 PEG화 P(3HB)의 1H-NMR을 나타낸다.
도 9는, 도 8의 확대도를 나타낸다.
도 10은, 비교예 17의 5일째의 배양액으로부터 추출정제한 PEG화 P(3HB)의 1H-NMR확대도를 나타낸다.
이하, 본 발명의 실시의 형태에 대하여 설명한다.
[폴리에스테르의 제조방법]
본 발명에 있어서 제조되는 폴리에스테르는, 폴리스티렌 환산 겔침투 크로마토그래피 측정에 의한 중량평균 분자량이 100만 이상이며, 중합 단위로서 3-하이드록시부티레이트 단위를 적어도 포함하는 폴리에스테르이다.
본 발명의 특징 중 하나는, 상기와 같이, 제조되는 폴리에스테르의 폴리스티렌 환산 겔침투 크로마토그래피 측정에 의한 중량평균 분자량(Mw)이 100만 이상이라는 고분자량인 것에 있다. 폴리스티렌 환산 겔침투 크로마토그래피 측정에 의한 중량평균 분자량은 바람직하게는 125만 이상이며, 보다 바람직하게는 138만 이상이며, 보다 더욱 바람직하게는 180만 이상이며, 특히 바람직하게는 190만 이상이다. 폴리스티렌 환산 겔침투 크로마토그래피 측정에 의한 중량평균 분자량은, 200만 이상, 210만 이상, 220만 이상, 230만 이상, 240만 이상, 250만 이상, 260만 이상, 270만 이상, 280만 이상, 290만 이상, 300만 이상, 310만 이상, 320만 이상, 330만 이상, 340만 이상, 350만 이상, 360만 이상, 370만 이상, 380만 이상, 390만 이상, 또는 400만 이상이어도 된다. 폴리스티렌 환산 겔침투 크로마토그래피 측정에 의한 중량평균 분자량의 상한은 특별히 한정되지 않으나, 일반적으로는, 2000만 이하이며, 1000만 이하, 800만 이하, 700만 이하, 600만 이하, 또는 500만 이하여도 된다.
폴리에스테르는, 바람직하게는, 폴리스티렌 환산 겔침투 크로마토그래피 측정에 의한 수평균 분자량(Mn)이 30만 이상이다. 폴리스티렌 환산 겔침투 크로마토그래피 측정에 의한 수평균 분자량은, 35만 이상, 40만 이상, 45만 이상, 50만 이상, 55만 이상, 60만 이상, 65만 이상, 70만 이상, 75만 이상, 80만 이상, 85만 이상, 90만 이상, 95만 이상, 100만 이상, 110만 이상, 120만 이상, 또는 130만 이상이어도 된다. 폴리스티렌 환산 겔침투 크로마토그래피 측정에 의한 수평균 분자량의 상한은 특별히 한정되지 않으나, 일반적으로는, 1000만 이하이며, 500만 이하, 400만 이하, 300만 이하, 또는 200만 이하여도 된다.
Mn에 대한 Mw의 비율(Mw/Mn)은 특별히 한정되지 않으나, 예를 들어 1.0~10.0, 1.0~6.0, 1.0~4.0이며, 더욱 작은 편이 바람직하고, 바람직하게는 1.0~3.3이며, 보다 바람직하게는 1.0~3.0이며, 더욱 바람직하게는 1.0~2.9이며, 1.0~2.5여도 된다.
본 발명에 있어서는, PHA분해효소를 갖는 PHA 생산 야생주여도, 배양후반에 있어서 현저한 분자량 저하를 일으키지 않고 고분자량체 또한 분자량 분포가 좁은 PHA를 제조할 수 있다.
폴리스티렌 환산 겔침투 크로마토그래피 측정에 의한 중량평균 분자량의 측정은, 후기하는 실시예에 기재된 방법으로 마찬가지로 행할 수 있다.
본 발명에 있어서 제조되는 폴리에스테르는, 중합 단위로서 3-하이드록시부티레이트 단위를 적어도 포함한다. 즉, 폴리에스테르는, 중합 단위로서 3-하이드록시부티레이트 단위만을 포함하는 것이어도 되고, 중합 단위로서 3-하이드록시부티레이트 단위와, 기타 중합 단위를 포함하는 것이어도 된다. 3-하이드록시부티레이트 단위 이외의 기타 중합 단위로는, 예를 들어, 4-하이드록시부티레이트 단위를 들 수 있고, 추가로 락테이트(LA), 글리콜레이트(GA), 3-하이드록시프로피오네이트(3HP), 3-하이드록시발레레이트(3HV), 5-하이드록시발레레이트(5HV), 5-하이드록시헥사노에이트(5HH), 6-하이드록시헥사노에이트(6HH), 또는 3-하이드록시헥사노에이트(3HH), 혹은 탄소수 7 이상의 하이드록시알카노에이트 등에서 유래하는 중합 단위여도 된다.
3-하이드록시부티레이트 단위 이외와 4-하이드록시부티레이트 단위를 포함하는 폴리에스테르로는, 중합 단위로서 3-하이드록시부티레이트 단위 및 4-하이드록시부티레이트 단위만을 포함하는 폴리에스테르여도 되고(즉, 중합 단위는, 3-하이드록시부티레이트 단위와 4-하이드록시부티레이트 단위만으로 이루어진다), 혹은, 중합 단위로서 3-하이드록시부티레이트 단위 및 4-하이드록시부티레이트 단위를 포함하고, 추가로 상기 이외의 다른 중합 단위를 포함하고 있어도 된다. 상기한 다른 중합 단위로는, 락테이트(LA), 글리콜레이트(GA), 3-하이드록시프로피오네이트(3HP), 3-하이드록시발레레이트(3HV), 5-하이드록시발레레이트(5HV), 5-하이드록시헥사노에이트(5HH), 6-하이드록시헥사노에이트(6HH), 또는 3-하이드록시헥사노에이트(3HH), 혹은 탄소수 7 이상의 하이드록시알카노에이트 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 3-하이드록시부티레이트 단위와 4-하이드록시부티레이트 단위는 각각 다음 식으로 표시된다.
3-하이드록시부티레이트 단위: -OCH(CH3)CH2C(=O)-
4-하이드록시부티레이트 단위: -OCH2CH2CH2C(=O)-
폴리에스테르가, 3-하이드록시부티레이트 단위와 4-하이드록시부티레이트 단위를 포함하는 폴리에스테르인 경우, 전체 모노머 단위에 대한 4-하이드록시부티레이트 단위의 비율은 특별히 한정되지 않으나, 바람직하게는 3몰%~40몰%이며, 보다 바람직하게는 10몰%~40몰%이며, 더욱 바람직하게는 14몰%~40몰%이다. 전체 모노머 단위에 대한 4-하이드록시부티레이트 단위의 비율은, 15몰% 이상, 16몰% 이상, 17몰% 이상, 18몰% 이상, 19몰% 이상, 또는 20몰% 이상이어도 된다. 20.2몰% 이상, 20.6몰% 이상, 21몰% 이상, 22몰% 이상, 23몰% 이상, 24몰% 이상, 25몰% 이상, 26몰% 이상, 27몰% 이상, 또는 28몰% 이상이어도 된다. 전체 모노머 단위에 대한 4-하이드록시부티레이트 단위의 비율은, 35몰% 이하, 34몰% 이하, 33몰% 이하, 32몰% 이하, 31몰% 이하, 30몰% 이하, 29몰% 이하, 28몰% 이하, 27몰% 이하, 27몰% 이하, 26몰% 이하, 또는 25몰% 이하여도 된다.
전체 모노머 단위에 대한 4-하이드록시부티레이트 단위의 비율은, 후기하는 실시예에 기재된 방법에 준하여 측정할 수 있다.
폴리에스테르는, 랜덤폴리머, 블록폴리머, 교호폴리머, 또는 그래프트폴리머 중 어느 것이어도 되나, 바람직하게는 랜덤폴리머이다.
P(3HB) 생산능을 갖는 미생물로는, 커프리아비더스(Cupriavidus)속, 알칼리게네스(Alcaligenes)속, 랄스토니아(Ralstonia)속, 델프티아(Delftia)속, 코마모나스(Comamonas)속, 히드로게노파가(Hydrogenophaga)속,　버크홀데리아(Burkholderia)속, 에세리키아(Escherichia)속, 아조토박터(Azotobacter)속, 메틸로박테리움(Methylobacterium)속, 파라코코스(Paracoccos)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속, 아시네토박터(Acinetobacter)속, 에로모나스(Aeromonas)속, 알로크로마티움(Allochromatium)속, 아조라이조비움(Azorhizobium)속, 바실러스(Bacillus)속, 카울로박터(Caulobacter)속, 크로모박테륨(Chromobacterium)속, 엑토티오로도스피라(Ectothiorhodospira)속, 클렙시엘라(Klebsiella)속, 노카르디아(Nocardia)속, 로도박터(Rhodobacter)속, 로도코커스(Rhodococcus)속, 로도스피릴룸(Rhodospirillum)속, 리케치아(Rickettsia)속, 시노르히조비움(Sinorhizobium)속, 스핑고모나스(Sphingomonas)속, 시네코시스티스(Synechocystis)속, 티오코커스(Thiococcus)속, 티오시스티스(Thiocystis)속, 비브리오(Vibrio)속, 와우터시아(Wautersia)속에 속하는 미생물을 사용할 수 있다. 상기 중에서도, 커프리아비더스(Cupriavidus)속은 바람직하고, 커프리아비더스 네케이터(Cupriavidus necator)가 보다 바람직하다. 일례로는, 커프리아비더스 네케이터(Cupriavidus necator) H16주(ATCC17699)를 사용할 수 있다.
한편, 커프리아비더스 네케이터(Cupriavidus necator) H16주 야생주에서는 3HB, 3HV, 4HB, 5HV 등은 충분히 PHA에 취입가능하나, 기질특이성이 상이한 PHA 중합효소유전자를 도입한 유전자변형균을 이용하면 다른 하이드록시산도 PHA에 중합가능하다. 따라서, 커프리아비더스 네케이터(Cupriavidus necator) H16주야생주뿐만 아니라, 상기한 바와 같이, 다른 커프리아비더스(Cupriavidus)속, 알칼리게네스(Alcaligenes)속, 랄스토니아(Ralstonia)속, 델프티아(Delftia)속, 코마모나스(Comamonas)속, 히드로게노파가(Hydrogenophaga)속,　버크홀데리아(Burkholderia)속, 에세리키아(Escherichia)속, 아조토박터(Azotobacter)속, 메틸로박테리움(Methylobacterium)속, 파라코코스(Paracoccos)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속, 아시네토박터(Acinetobacter)속, 에로모나스(Aeromonas)속, 알로크로마티움(Allochromatium)속, 아조라이조비움(Azorhizobium)속, 바실러스(Bacillus)속, 카울로박터(Caulobacter)속, 크로모박테륨(Chromobacterium)속, 엑토티오로도스피라(Ectothiorhodospira)속, 클렙시엘라(Klebsiella)속, 노카르디아(Nocardia)속, 로도박터(Rhodobacter)속, 로도코커스(Rhodococcus)속, 로도스피릴룸(Rhodospirillum)속, 리케치아(Rickettsia)속, 시노르히조비움(Sinorhizobium)속, 스핑고모나스(Sphingomonas)속, 시네코시스티스(Synechocystis)속, 티오코커스(Thiococcus)속, 티오시스티스(Thiocystis)속, 비브리오(Vibrio)속, 와우터시아(Wautersia)속 등 PHA를 중합하는 능력을 갖는 유전자변형 미생물을 사용하는 것도 가능하다.
본 발명에 있어서는, P(3HB)의 생산능을 갖는 미생물을, 탄소원 및 질소원을 포함하는 배양액 중에 있어서 배양한다.
배양액의 pH는 4 이상 7.5 이하이다. pH는 7.0 미만, 6.5 이하, 6.4 이하, 6.3 이하, 6.1 이하여도 되고, 4.5 이상, 5.0 이상, 5.1 이상, 5.2 이상, 5.3 이상, 5.4 이상, 5.5 이상이어도 된다.
배양온도는, 일반적으로는 15℃~45℃이며, 바람직하게는 20℃~40℃이며, 보다 바람직하게는 25℃~38℃이다.
배양방식은, 회분배양, 유가배양 또는 연속배양 중 어느 것이어도 된다.
본 발명에 있어서는, 배양조건은, 하기의 조건(a) 및 (b)를 만족시킨다.
(a) 배양액의 침투압이 배양기간 중 200mOsmol 이상 900mOsm 이하로 유지되어 있다:
(b) 배양액의 질소원자 농도가 배양기간 중 0.30g/L 이상으로 유지되어 있다:
조건(a) 및 (b)를 만족시키는 배양조건을 채용함으로써, 고분자량이며, 또한 분자량 분포가 좁은(즉, Mw/Mn이 작은) 폴리에스테르를 제조할 수 있는 것이 판명되었다.
「(a)배양액의 침투압이 배양기간 중 200mOsmol 이상 900mOsm 이하로 유지되어 있다」고 하는 기재, 그리고 「(b)배양액의 질소원자 농도가 배양기간 중 0.30g/L 이상으로 유지되어 있다」고 하는 기재에 있어서의 「유지되어 있다」는 것은, 배양기간 중의 대부분(예를 들어, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상)의 기간에 있어서, 배양액의 침투압 및 배양액의 질소원자 농도가 상기한 조건을 만족시키고 있으면 되고, 반드시 모든 배양기간(즉, 배양기간의 100%의 시간)에 걸쳐서 항상 배양액의 침투압 및 배양액의 질소원자 농도가 상기한 조건을 만족시키고 있는 것을 필요로 하는 것은 아니다. 예를 들어, 배양기간 중의 단시간(예를 들어, 6시간 이내, 5시간 이내, 4시간 이내, 3시간 이내, 2시간 이내, 1시간 이내, 30분 이내, 20분 이내, 10분 이내, 또는 5분 이내 등)이면, 배양액의 침투압, 및/또는 배양액의 질소원자 농도는, 상기한 조건의 범위 외가 되는 상황이 존재하고 있어도 되는 것으로 한다. 또한, 배양액의 침투압, 및/또는 배양액의 질소원자 농도는, 상기한 조건의 범위 외가 되는 상황은, 본 발명의 효과를 손상시키지 않는 한, 1회의 배양공정의 사이에, 복수회 존재하고 있어도 된다.
배양기간 중의 배양액의 침투압은, 바람직하게는 200mOsmol 이상 900mOsm 이하이며, 보다 바람직하게는 200mOsmol 이상 800mOsm 이하이며, 더욱 바람직하게는 200mOsmol 이상 700mOsm 이하이며, 더욱 한층 바람직하게는 200mOsmol 이상 600mOsm 이하이며, 특히 바람직하게는 200mOsmol 이상 500mOsm 이하이다. 침투압의 하한은, 200mOsmol 이상이면 되고, 210mOsmol 이상, 220mOsmol 이상, 230mOsmol 이상, 240mOsmol 이상, 250mOsmol 이상, 또는 300mOsmol 이상이어도 된다. 침투압의 상한은, 900mOsm 이하이면 되고, 800mOsm 이하, 700mOsm 이하, 600mOsm 이하, 500mOsm 이하, 또는 400mOsm 이하여도 된다.
배양기간 중의 배양액의 질소원자 농도는 0.30g/L 이상이며, 바람직하게는 0.40g/L 이상, 0.42g/L 이상, 0.50g/L 이상, 0.55g/L 이상, 0.63g/L 이상, 또는 0.78g/L 이상이어도 된다. 질소원자 농도의 상한은 특별히 한정되지 않으나, 일반적으로는, 15.6g/L 이하, 또는 7.8g/L 이하이다.
배양기간 중의 배양액의 NH4 +농도로는, 바람직하게는 0.39g/L 이상이며, 0.40g/L 이상, 0.51g/L 이상, 0.54g/L 이상, 0.64g/L 이상, 0.70g/L 이상, 0.81g/L 이상, 또는 1.00g/L 이상이어도 된다. NH4 +농도의 상한은 특별히 한정되지 않으나, 일반적으로는, 20.0g/L 이하, 또는 10.0g/L 이하이다.
본 명세서 중에 있어서 후기하는 바와 같이, 본 발명에 있어서는, 침투압에 관한 상기 조건(a)과 질소원자 농도에 관한 상기 조건(b)을 동시에 만족시킴으로써, 증식연동적으로 PHA를 축적시킬 수 있고, 이에 따라 고분자량의 PHA를 축적할 수 있는 것이 판명되었다. 침투압과 질소원자 농도를 제어함으로써, 고분자량의 PHA를 축적할 수 있는 것은 본 발명에 의해 비로소 발견된 지견이다.
침투압의 측정방법은, 특별히 한정되지 않으나, 후기하는 실시예에 기재된 빙점강하법에 의해 측정할 수 있다.
배양액의 질소원자 농도의 측정방법도 특별히 한정되지 않으나, 후기하는 실시예에 기재된 암모늄이온정량법에 의해 정량하고, 암모늄이온농도로부터, 하기 식에 의해 질소원자 농도로 환산하면 된다.
암모늄이온농도(g/L)×14/18=질소원자 농도(g/L)
배지성분은, 사용하는 미생물이 자화(資化)할 수 있는 물질이면 특별히 제한은 없고, PHA중합의 연쇄이동에 기여하는 물질 이외의 물질인 것은 바람직하다.
탄소원으로는, 예를 들어, 메탄올, 에탄올, 부탄올, 아세트산 또는 부티르산 등의 유기탄소원, 이산화탄소 등의 무기탄소원, 효모엑기스, 당밀, 펩톤 및 육엑기스 등의 천연물, 아라비노오스, 글루코오스, 만노오스, 프룩토오스 및 갈락토오스 등의 당류, 또는 솔비톨, 만니톨 및 이노시톨 등을 사용할 수 있다. 한편, 메탄올, 에탄올 또는 부탄올 등의 단쇄알코올류는 연쇄이동제가 될 가능성이 있으므로, 탄소원으로는, 메탄올, 에탄올 및 부탄올 이외의 것이 바람직하다.
질소원으로는, 예를 들어, 암모니아, 암모늄염(염화암모늄, 황산암모늄, 인산암모늄), 질산염 등의 무기질소 화합물 및/또는, 예를 들어, 요소, 콘·스티프·리쿼, 카제인, 펩톤, 효모엑기스, 육엑기스 등의 유기질소함유물을 사용할 수 있다.
회분배양에 있어서는, 탄소원이 고갈되기에 앞서 질소원이 고갈되어 증식비연동적인 PHA생산으로 이행하지 않으면 되고, 예를 들어 플라스크 배양조건에서는 황산암모늄을 2g/L 이상으로 첨가하는 것이 바람직하다. 또한 유가배양이나 연속배양에 있어서는, 질소원자 농도로 0.30g/L 이상(또는 0.42g/L 이상, 또는 0.55g/L 이상), 침투압 200mOsm 이상을 유지하는 것이 바람직하다.
또한 회분배양에 있어서는, 탄소원 외에, 황산암모늄이나 염화나트륨 등의 염의 첨가에 의해 배양 전의 침투압은 증가하나, 배양개시 시의 침투압이 200mOsm 이상이면 되고, 배양종료시에 탄소원이나 다른 미네랄성분의 소비에 의해 침투압이 200mOsm 미만으로 저하되어도 된다.
무기성분으로는, 예를 들어, 칼슘염, 마그네슘염, 칼륨염, 나트륨염, 인산염, 망간염, 아연염, 철염, 구리염, 몰리브덴염, 코발트염, 니켈염, 크롬염, 붕소 화합물 및 요오드 화합물 등으로부터 각각 선택되고, 보다 구체적으로는, 인산제일칼륨, 인산제이칼륨, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 염화나트륨 등을 들 수 있다.
그 외의 유기영양원으로는, 예를 들어 글리신, 알라닌, 세린, 트레오닌, 프롤린 등의 아미노산; 비타민 B1, 비타민 B12, 비타민 C 등의 비타민 등을 들 수 있다.
본 발명의 바람직한 태양에 따르면, 탄소원은, ε-카프로락톤, δ-발레로락톤, δ-카프로락톤 혹은 이들의 감화물, 또는 이들의 염 중 적어도 1종을 포함한다. 탄소원으로는 추가로, 당, 유지, 지방산, 아미노산 및 펩티드 중 적어도 1종을 포함하고 있어도 된다.
본 발명에 있어서는, 바람직하게는, 침투압을 유지하기 위해, NaCl 등의 무기염; (NH4)2SO4 등의 질소함유 무기염; 당류 또는 단쇄지방산 등의 탄소원; ε-카프로락톤 등의 자화성 유기용매탄소원; DMSO 등의 유기용매 등, 물에 가용이며, 침투압의 증가에 기여하고, 후술하는 연쇄이동제가 되기 어려운 성분을 사용하는 것이 바람직하다.
ε-카프로락톤을 배양에 첨가하면, ε-카프로락톤은 개환되고, 6-하이드록시헥사노에이트(6HH)가 되고, CoA가 부가되어 6HH-CoA가 되고, β산화계에서 아세틸CoA가 빠지고 4HB-CoA가 남아, PHA에 취입되면 4HB유닛이 된다. PHA중합효소의 기질특이성으로부터 6HH-CoA는 PHA에는 취입되기 어려워, P(3HB-co-4HB)가 축적된다.
4HB-CoA도 β산화를 받으면, 아세틸CoA도 생성된다.
신장 중인 PHA중합효소의 효소-S-PHA복합체에 하이드록시기를 갖는 화합물이 들어가고, 효소와 PHA폴리머쇄간의 티오에스테르를 절단하고, PHA폴리머쇄는 효소로부터 연쇄이동제로 이동하고 PHA중합이 정지되는 반응은, 라디칼중합에 따라 연쇄이동반응이라고 한다. 4HB나 디올류는 하이드록시기를 갖는 화합물이며, γ-부티로락톤도 개환하여 4HB가 되므로, 이들 하이드록시기를 갖는 화합물은 PHA중합시의 연쇄이동제로서 작용하고, PHA의 중합을 정지시킬 가능성이 있다. 특히 디올류는 말단의 2개의 하이드록시기 중 어느 쪽이어도 연쇄이동에 관여하는 것이 가능하므로, 특히 PHA중합의 정지를 일으키기 쉽고, 고분자량체 PHA가 얻어지기 어렵다고 생각된다.
ε-카프로락톤이 개환하면 6HH가 생성되고, 결국 하이드록시기를 갖는 화합물이 된다. 4HB-CoA는 PHA중합효소의 기질이 용이하게 될 수 있으나 6HH-CoA는 기질이 되기 어려운 것과 마찬가지로, 6HH가 4HB보다 필시 연쇄이동제로서 작용하기 어려우므로, ε-카프로락톤을 사용한 경우에 보다 고분자량체 PHA가 얻어지는 것으로 생각된다. 동일한 이유에 의해, δ-발레로락톤이나 δ-카프로락톤을 이용한 경우에도 PHA의 조성이나 조성비는 상이하나 고분자량체 PHA가 얻어지는 것으로 생각된다.
미생물에 의한 물질생산에는, 증식연동적 생산과 증식비연동적 생산이 있다.
증식연동적인 PHA생산에서는, PHA 이외의 균체성분이 증식되고 있음과 동시에 PHA도 축적된다. 증식연동적 PHA생산에서는, 아세틸CoA는 PHA합성과 균체증식의 양방에서 쟁탈(取り合い)이 되어, 아세틸CoA는 잉여가 되기 어렵다. 증식연동적 PHA생산 동안에는, PHA의 분해에 의한 유리(遊離)의 하이드록시산의 발생도 억제되고, 연쇄이동반응도 일어나기 어렵다고 추측되고, 분자량이 상대적으로 높아지는 것으로 추측된다.
증식비연동적인 PHA생산에서는, 균체성분의 증식이 정지된 후에, PHA의 축적이 일어나고, PHA함량이 증가해간다. 균체증식이 정지되어 있으므로, 과잉의 아세틸CoA는 PHA생산에 사용된다. 증식비연동적인 PHA생산 동안에는, 일단 PHA의 형태로 취입된 성분을 재차 분화하여 유리하이드록시산을 균체 내외로 배출하고 있는 듯 하다. 배양의 후반에 있어서 질소원이 고갈된 경우, 증식연동적 생산으로부터 증식비연동적 생산으로 이행하고, 연쇄이동반응도 빈번하게 일어나, 합성과 분해가 동시에 일어나기 쉬운 상태(분자량이 저하되기 쉬운 상태)가 되는 것으로 추측된다.
본 발명에 있어서는, 증식연동적으로 PHA를 축적시킨 경우에, 영양제한상태로 증식비연동적으로 PHA를 축적시키는 경우보다 우위에서 고분자량의 PHA를 축적하는 것이 발견되었다. 즉, 본 발명의 폴리에스테르의 제조에 있어서는, 균체의 증식과 PHA의 축적을 나눈 영양제한에 의한 증식비연동적인 PHA생산이 아니라, 균체의 증식과 PHA의 축적이 동시에 일어나는 증식연동적인 PHA생산인 것이 바람직하다.
한편, 본 발명에서는, 커프리아비더스 네케이터(Cupriavidus necator)를 질소원이 충분히 있으며 침투압을 일정 이상 확보하여 배양하는 경우, 증식연동적인 PHA생산이 보이는 것을 발견하였다. 지금까지 커프리아비더스 네케이터(Cupriavidus necator) H16주(ATCC17699)의 P(3HB)나 P(3HB-co-4HB)의 생산에 있어서, 연쇄이동제(예를 들어 폴리에틸렌글리콜(PEG))를 배지에 첨가한 경우, PHA의 분자량이 저하되는 것은 알려져 있었다. 질소제한 등에 의한 증식비연동적인 PHA생산에 있어서, 4HB를 탄소원으로 한 P(3HB-co-4HB)생산에의 PHA카르복시말단에의 PEG의 결합이 관찰되었다(Macromolecules(1996), 29(1), 10-17). 그러나, 프룩토오스를 탄소원으로 한 P(3HB)생산에의 P(3HB)와 PEG의 결합을 나타내는 데이터는 얻어지지 않고, PEG와 PHA중합효소가 상호작용하고, PEG가 아니라 물에 의한 연쇄이동에 의해 PHA의 중합정지빈도를 증가시켰기 때문에 P(3HB)의 분자량이 저하되었을지도 모른다는 주장이 있었다(Macromolecules(1996), 29(24), 7753-7758).
본 발명에 있어서, 커프리아비더스 네케이터(Cupriavidus necator) H16주로 PEG존재하에 증식연동적 P(3HB)생산시킨 경우, P(3HB)와 PEG의 직접 결합이 NMR해석으로 판명되었다(본 명세서의 비교예 17, 표 26, 도 8~도 10). 증식비연동적인 P(3HB)생산에서는 PEG에 의한 연쇄이동이 일어나고 있어도, 균체 내의 PHA분해효소 등의 영향에 의해 말단의 P(3HB)와 PEG 간의 에스테르결합이 재빨리 절단되고, 결과로서 PEG분자가 P(3HB)말단에 결합하지 않는 상태만이 관찰되고 있었다고 추찰되나, 연쇄이동제를 첨가하지 않으면 고분자량체가 얻어지는 증식연동적인 P(3HB)생산조건에서는 필시 PHA의 분해가 억제되고, 연쇄이동제인 PEG첨가에 의해 분자량 저하가 관찰됨과 동시에, P(3HB)와 PEG의 결합이 분해되지 않고 남아 있으므로 1H-NMR로 직접 관찰가능한 것으로 생각된다.
본 발명의 방법에 있어서의 배양시간은 특별히 한정되지 않으나, 일반적으로는 24시간 이상이며, 48시간 이상, 72시간 이상, 96시간 이상, 또는 120시간 이상이다. 배양시간의 상한은 특별히 한정되지 않으나, 일반적으로는, 240시간 이하이며, 216시간 이하, 또는 192시간 이하여도 된다.
본 발명의 방법에 따라서 배양함으로써 얻어진 배양액으로부터, 여과 및 원심분리 등의 통상의 고액분리수단에 의해 균체를 분리회수하고, 이 균체를 세정, 건조하여 건조균체를 얻을 수 있다. 이 건조균체로부터, 상법에 따라, 예를 들어, 클로로포름과 같은 유기용제로, 생성된 폴리에스테르를 추출하고, 이 추출액에, 예를 들어, 헥산과 같은 빈용매를 첨가함으로써 폴리에스테르를 침전시키고, 회수할 수 있다.
이하의 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하나, 본 발명은 이하의 실시예에 의해 특별히 한정되는 것은 아니다.
실시예
[커프리아비더스 네케이터(Cupriavidus necator) H16주에 의한 공중합 폴리에스테르의 제조]
<실시예 1>
커프리아비더스 네케이터(Cupriavidus necator) H16주(ATCC17699)를 사용하여 PHA를 제조하였다.
KH2PO4 2.72g/L, Na2HPO4 4.26g/L, NaHCO3 0.3g/L, (NH4)2SO4 2g/L, MgSO4·7H2O 0.2g/L, 효모엑기스 0.2g/L, 미네랄용액 3.5mL로 이루어지는 멸균된 배지1에, 프룩토오스를 14.24g/L로 첨가한 배지에서 시험관 진탕배양을 30℃ 24시간 행하여, 전전(前前) 배양액을 얻었다.
미네랄용액: FeC6H5O7·xH2O 6g/L, ZnSO4·7H2O 2g/L, CuSO4·5H2O 0.1g/L, MnCl2·4H2O 1g/L, KI 0.1g/L, (NH4)6Mo7O24·4H2O 0.1g/L, CoCl2·6H2O 0.1g/L, H3BO3 0.2g/L, NaCl 5g/L, CaCl2·2H2O 4g/L를 물에 용해시킨 것.
상기 배지1에 프룩토오스를 14.24g/L로 첨가한 배지, 혹은 프룩토오스 8.86g/L와 ε-카프로락톤 5.38g/L로 첨가한 배지 100mL가 들어간 500mL 용적의 삼각플라스크에 상기의 전전 배양액 1mL를 식균하고, 30℃, 150rpm으로 48시간 내지 96시간 배양하고, 배양주모(전 배양액)로 하였다.
상기 배지1의 (NH4)2SO4를 12.5g/L로 변경한 배지를 3L용(容) 자 퍼멘터(ジャ―ファ―メンタ―)에 2L 준비, 멸균하고, 배양주모 100mL를 식균하고, 42질량% 프룩토오스용액에 NaCl을 12.4g/L로 용해시킨 당용액과 ε-카프로락톤을 멸균필터(PTFE 0.2μm 포어)를 개재하여 무균적으로 유가개시하였다. 탄소원의 유가속도나 유가비율은 임의로 설정할 수 있으나, 탄소원을 균체가 다 소비되지 않고 배양조 내에 과잉으로 잔존하여 균체증식이 정지되는 것을 피하기 위해, 당용액의 유가속도는 1~2g/h 정도(0.5~1g/h·L), ε-카프로락톤의 유가속도는 0.2~0.5g/h(0.1~0.25g/h·L) 정도로 저유속으로 배양개시하고, 균체의 증식에 맞추어 단계적 혹은 연속적으로 유가속도를 증가시켰다. 통기량은 0.2~0.3L/min, 교반속도는 500~700rpm, 배양온도는 36℃, 배양pH 하한은 6.0으로 제어하고, 12.5% 암모니아수를 pH조정용 알칼리에 사용하였다. 4HB 전구체 탄소원(실시예 1에서는 ε-카프로락톤):프룩토오스의 중량 비율은 약 0.5로 하였다. 배양개시 후 140.2시간으로 배양종료하였다.
배양 중, 혹은 배양 후, 균체와 배양상청을 원심분리에 의해 회수하고, 균체는 -20℃에서 동결 후, 동결건조에 제공하였다.
동결건조균체 중은 PHA 조성 분석, PHA 분자량 해석에 이용하였다.
PHA 조성 분석은, 메틸에스테르화 후에 가스크로마토그래피로 PHA를 구성하는 모노머유닛에서 유래하는 메틸에스테르체 등을 분석함으로써 행하였다.
PHA의 분자량 해석은 동결건조균체로부터 클로로포름 추출한 PHA를 겔 퍼미에이션 크로마토그래피법으로 행하였다. 실시예 1의 PHA의 분자량 분포를 도 1에 나타낸다.
배양상청은 침투압 측정과 암모니아 농도 측정에 제공하였다.
<실시예 2>
자 배양에서의 배지에 NaCl을 2.5g/L로 첨가하고, (NH4)2SO4를 10g/L로 변경한 배지를 사용하고, 유가탄소원으로서 42질량% 프룩토오스 용액과 ε-카프로락톤을 사용하고, 배양시간을 140.2시간으로 한 것 이외는 실시예 1과 마찬가지로 행하였다.
<실시예 3>
자 배양에 있어서의 탄소원으로서 42질량% 프룩토오스용액과 ε-카프로락톤을 사용하고, 배양시간을 100시간으로 한 것 이외는 실시예 1과 마찬가지로 행하였다.
<비교예 1>
자 배양에서의 배지에서 (NH4)2SO4를 7.5g/L로 변경한 배지를 사용하고, 배양시간을 122.5시간으로 한 것 이외는 실시예 3과 마찬가지로 행하였다.
<비교예 2>
자 배양에서의 배지에서 (NH4)2SO4를 4g/L로 변경한 배지를 사용하고, 배양시간을 125.5시간으로 한 것 이외는 실시예 3과 마찬가지로 행하였다.
<비교예 3>
자 배양에서의 pH조정용 알칼리로서 4N NaOH를 사용하고, 배양시간을 173.3시간으로 한 것 이외는 실시예 3과 마찬가지로 행하였다.
<비교예 4>
자 배양에서의 배지에서 (NH4)2SO4를 10g/L로 변경하고, 배양시간을 140.5시간으로 한 것 이외는 비교예 3과 마찬가지로 행하였다.
<비교예 5>
자 배양에서의 배지에서 (NH4)2SO4를 7.5g/L로 변경하고, 배양시간을 165.5시간으로 한 것 이외는 비교예 3과 마찬가지로 행하였다.
<비교예 6>
자 배양에서의 pH 하한 제어를 pH 6.5로 변경하고, 배양시간을 122시간으로 한 것 이외는 비교예 5와 마찬가지로 행하였다.
<비교예 7>
자 배양에서의 pH 하한 제어를 pH 7로 변경하고, 배양시간을 137.7시간으로 한 것 이외는 비교예 5와 마찬가지로 행하였다. 비교예 7의 PHA의 분자량 분포를 도 2에 나타낸다.
<비교예 8>
자 배양에서의 pH 하한 제어를 pH 7.5로 변경하고, 배양시간을 149시간으로 한 것 이외는 비교예 5와 마찬가지로 행하였다.
<참고예 1>
플라스크 전 배양과 자 배양에 있어서의 탄소원으로서 42질량% 프룩토오스 용액과 γ-부티로락톤을 사용하고, 배양시간을 105시간으로 한 것 이외는 실시예 3과 마찬가지로 행하였다.
<참고예 2>
4HB 전구체(참고예 2에서는 γ-부티로락톤):프룩토오스의 중량 비율은 약 0.6으로 한 것 이외는 참고예 1과 마찬가지로 행하였다.
<비교예 11>
자 배양에서의 배지에서 (NH4)2SO4를 7.5g/L로 변경한 배지를 사용하고, pH조정용 알칼리로서 2N NaOH를 사용하고, 배양시간을 165시간으로 한 것 이외는 참고예 1과 마찬가지로 행하였다.
<비교예 12>
플라스크 전 배양과 자 배양에 있어서의 탄소원으로서 42질량% 프룩토오스 용액과 1,4-부탄디올을 사용하고, 4HB 전구체(비교예 12에서는 1,4-부탄디올):프룩토오스의 중량 비율은 약 0.7로 하고, 배양시간을 208.5시간으로 한 것 이외는 실시예 3과 마찬가지로 행하였다.
<비교예 13>
4HB 전구체(비교예 13에서는 1,4-부탄디올):프룩토오스의 중량 비율은 약 0.5로 한 것 이외는 비교예 12와 마찬가지로 행하였다.
<비교예 14>
자 배양에서의 배지에서 (NH4)2SO4를 7.5g/L로 변경한 배지를 사용하고, pH조정용 알칼리로서 2N NaOH를 사용하고, 배양시간을 189.5시간으로 한 것 이외는 비교예 13과 마찬가지로 행하였다.
<실시예 4>
플라스크 전 배양과 자 배양에 있어서의 탄소원으로서 42질량% 프룩토오스 용액을 사용하고, 배양시간을 185.2시간으로 한 것 이외는 실시예 1과 마찬가지로 행하였다. 실시예 4의 PHA의 분자량 분포를 도 3에 나타낸다.
<실시예 5>
플라스크 전 배양과 자 배양에 있어서의 탄소원으로서 42질량% 프룩토오스 용액을 사용하고, 배양시간을 185.9시간으로 한 것 이외는 실시예 2와 마찬가지로 행하였다.
<실시예 6>
플라스크 전 배양과 자 배양에 있어서의 탄소원으로서 42질량% 프룩토오스 용액을 사용하고, 배양시간을 150시간으로 한 것 이외는 실시예 3과 마찬가지로 행하였다.
균체로부터 PHA를 추출정제하는 방법은 이하와 같이 행하였다. 스크류캡 부착 유리제 삼각플라스크에서, 동결건조균체 4~10g 정도를 400mL의 클로로포름에 현탁하고, 30℃에서 24~48시간 추출하였다. 얻어진 점조의 용액을 여지로 여과하여, 균체잔사를 제거하였다. 얻어진 청징액을 이배포레이터로 100~200mL 정도로 농축하여, 5배량의 빈용매인 헥산으로 PHA를 석출시켰다. 얻어진 백색침전물을 에탄올로 세정 후, 진공건조시켜, 정제PHA를 얻었다.
<비교예 15>
플라스크 전 배양과 자 배양에 있어서의 탄소원으로서 42질량% 프룩토오스 용액을 사용하고, 배양시간을 84시간으로 한 것 이외는 비교예 2와 마찬가지로 행하였다.
<비교예 16>
플라스크 전 배양과 자 배양에 있어서의 탄소원으로서 42질량% 프룩토오스 용액을 사용하고, 자 배양에서의 배지에서 (NH4)2SO4를 4g/L로 변경한 배지를 사용하고, 배양시간을 92.6시간으로 한 것 이외는 비교예 5와 마찬가지로 행하였다.
<비교예 17(PEG200 첨가의 배양: PEG화 P(3HB)의 제조>
플라스크 전 배양과 자 배양에 있어서의 탄소원으로서 42질량% 프룩토오스 용액을 사용하고, 자 배양에서의 배지에 NaCl을 2.5g/L, PEG200을 20ml/L로 첨가하고, 배양시간을 130.9시간으로 한 것 이외는 실시예 1과 마찬가지로 행하였다. 배양 3일째의 배양액과 5일째의 배양액을 회수하고, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, -20℃에서 동결 후, 동결건조에 제공하였다.
[분석방법의 설명]
<PHA 분자량 측정(겔 퍼미에이션 크로마토그래피(GPC)법)>
PHA 분자량의 측정은 이하와 같이 겔 퍼미에이션 크로마토그래피법에 의해 행하였다.
동결건조균체에서 유래하는 PHA가 약 0.5mg/ml가 되도록 클로로포름을 첨가하고, 60℃에서 4시간 추출용해시킨 후, 실온으로 되돌리고, 구멍직경 0.2μm의 PTFE 필터로 여과하여 불용물을 제거하고, 측정샘플로 하였다. GPC조건은 이하와 같다.
장치: 시마즈제작소제 HPLC Prominence시스템
칼럼: 쇼와덴코제 Shodex K-806L(2개 직렬)
칼럼온도: 40℃
이동상: 클로로포름(1ml/min)
검출기: RI(40℃)
스탠다드: Shodex 폴리스티렌 분자량 스탠다드(687만~1270)
주입량: 60μl
분석시간: 30분
<PHA 조성 분석(GC법)>
균체에 포함되는 PHA의 조성 분석은 이하와 같이 행하였다. 얻어진 건조균체 약 10mg을 스크류캡 부착 시험관에 재서 넣고, 클로로포름 2mL와 내부표준이 들어간 메탄올황산 혼액(내부표준:안식향산 0.5g/L, 황산 3.7질량%) 2mL를 혼합하고, 121℃, 90분 가열처리를 하여 실온까지 냉각하여, PHA를 메틸에스테르화하였다. 반응 종료 후 순수를 1ml 첨가하고, 격하게 교반한 후, 원심분리를 행하여 유기용매층을 얻었다. 이 유기용매층을 황산나트륨으로 탈수 후 가스크로마토그래피로 분석함으로써, PHA 성분 함량을 산출하였다. GC조건은 이하와 같다.
가스크로마토그래피 분석조건
장치: 시마즈 GC-2025
캐필러리칼럼: DB-1(0.25mm(id)×60m, Film두께 1μm)
캐리어가스: He(3.23ml/min)
칼럼온도: 125℃ 6.5min-rate25℃/min-260℃
메이크업유량: 30mL/min
H2유량: 40ml/min
Air유량: 400ml/min
인젝션: 250℃
검출기: FID(260℃)
스플릿: 1:20
주입량: 1μL
분석시간: 21.5분
<암모늄이온 정량방법(CE법)>
배양상청 중의 NH4 + 농도 정량은 이하와 같이 행하였다. 배양액을 원심분리하여 얻어진 배양상청을 그대로, 혹은 적절히 희석하고, 애질런트테크놀로지사제 캐필러리 전기영동장치 7100형으로, 와코순약공업사제 양이온 혼합 표준액III(NH4 + 농도 25mg/L)을 표품으로 하여 NH4 농도를 산출하였다.
<침투압 측정방법(빙점강하법)>
배양상청의 침투압은 이하와 같이 빙점강하법을 이용한 방법으로 측정하였다. 침투압 측정장치(어드밴스인스트루먼츠사제. 어드밴스 침투압계 3250)를 사용하여 배양상청의 침투압값(mOsm/kg H2O, 간략히 mOsm이라고 기재한다)을 측정하였다. 캘리브레이션은 100mOsm, 1500mOsm 표준액으로 행하는, 로우레인지모드(0~2000mOsm용)로 행하였다.
[폴리머의 분석]
<1H-NMR 및 13C-NMR>
실시예 6에서 얻어진 정제 PHA(P(3HB))의 화학구조를 핵자기공명분광장치(일본분광 ECA500)를 사용하여 해석하였다. 정제한 PHA를 1.5질량% 농도로 CDCl3에 용해하여, 측정샘플로 하였다. 1H-NMR스펙트럼은 500MHz로 실온에서 계측하였다. 13C-NMR스펙트럼은 125MHz로 실온에서 계측하였다.
실시예 2에서 제조한 PHA의 1H-NMR을 도 4에 나타내고, 13C-NMR을 도 5에 나타낸다.
실시예 6의 P(3HB)만의 1H-NMR을 도 6에 나타내고, 도 6의 확대도를 도 7에 나타낸다.
비교예 17에서 얻어진 배양 3일째의 배양액으로부터 추출정제한 PHA의 1H-NMR을 도 8 및 도 9에 나타낸다. 도 9는 도 8의 확대도이다. 동(同) 배양 5일째의 배양액으로부터 추출정제한 PHA의 1H-NMR확대도를 도 10에 나타낸다. PEG200 존재하에서의 커프리아비더스 네케이터(Cupriavidus necator) H16(ATCC17699) 야생주의 증식연동적인 P(3HB)생산에서 얻어진 P(3HB)의 1H-NMR 해석에 의해, P(3HB)와 PEG의 직접 결합을 나타내는 결과가 얻어졌다.
<실시예 7~20(플라스크 배양)>
커프리아비더스 네케이터(Cupriavidus necator) H16주(ATCC17699)를 사용하여 플라스크배양으로 PHA를 제조하였다.
상기 배지1에 프룩토오스 8.86g/L와 ε-카프로락톤 5.38g/L로 첨가한 배지(실시예 7~19, 단 황산암모늄과 염화나트륨농도는 표에 기재된 양), 또는 프룩토오스 8.86g/L와 ε-카프로락톤 6.46g/L로 첨가한 배지(실시예 20, 단 황산암모늄농도는 표에 기재된 양), 각각 100mL가 들어간 500mL 용적의 삼각플라스크에 상기 전 배양배지 1mL를 식균하고, 30℃, 150rpm으로 표에 기재된 시간으로 배양하였다. 배양개시 전의 pH는 6.8~7.5 정도이며, 배양 종료시에는 5.7~6.2 정도로 약산성이 되어 있었다. 배양 중의 pH는 5.7~7.5 정도였다. 배양 종료 후, 원심분리로 균체를 회수하고, 동결건조하여, 건조균체중량을 측정하였다. 또한, GC법에 의한 PHA의 함량과 조성 분석의 결과나 침투압 측정결과를 합하여 하기 표 27에 나타낸다.
실시예 7~20의 플라스크 배양(회분배양)에 있어서는, 배양개시 시에 있어서는, 배양액의 침투압이 200mOsmol 이상 900mOsm 이하이며, 또한 배양액의 질소원자 농도가 0.30g/L 이상이라는 조건을 만족시키고 있다. 배양액의 침투압이 200mOsmol 이상 900mOsm 이하이며, 또한 배양액의 질소원자 농도가 0.30g/L 이상이라는 조건을 만족시키는 배양기간에 있어서는, 중량평균 분자량이 100만 이상이며, 중합 단위로서 3-하이드록시부티레이트 단위를 적어도 포함하는 폴리에스테르가 제조되어 있다. 또한, 실시예 7~20의 플라스크 배양(회분배양)에 있어서는, 배양개시 시의 침투압이 200mOsm 이상인 한편, 배양종료시에는 탄소원이나 다른 미네랄성분의 소비에 의해 침투압이 200mOsm 미만으로 저하되어 있는 경우도 상정되나, 그 경우에 있어서도 중량평균 분자량이 100만 이상이며, 중합 단위로서 3-하이드록시부티레이트 단위를 적어도 포함하는 폴리에스테르가 제조된다.
[결과]
상기한 실시예 1~6, 비교예 1~8 및 11~16, 참고예 1 및 2의 분석결과를 이하에 나타낸다.
Frc: 프룩토오스
ECL: ε-카프로락톤
GBL: γ-부티로락톤
BD: 1,4-부탄디올
E/F: ε-카프로락톤/프룩토오스 비
G/F: γ-부티로락톤/프룩토오스 비
B/F: 1,4-부탄디올/프룩토오스 비
[표 1]
Figure pct00001
[표 2]
Figure pct00002
[표 3]
Figure pct00003
실시예 1~6, 비교예 1~8 및 11~17, 참고예 1 및 2의 배양시간 마다의 분석결과를 이하에 나타낸다.
DCW: Dry Cell Weight
RB: Residual Biomass
E/F: ε-카프로락톤/프룩토오스 비
G/F: γ-부티로락톤/프룩토오스 비
B/F: 1,4-부탄디올/프룩토오스 비
[표 4]
Figure pct00004
[표 5]
Figure pct00005
[표 6]
Figure pct00006
[표 7]
Figure pct00007
[표 8]
Figure pct00008
[표 9]
Figure pct00009
[표 10]
Figure pct00010
[표 11]
Figure pct00011
[표 12]
Figure pct00012
[표 13]
Figure pct00013
[표 14]
Figure pct00014
[표 15]
Figure pct00015
[표 16]
Figure pct00016
[표 17]
Figure pct00017
[표 18]
Figure pct00018
[표 19]
Figure pct00019
[표 20]
Figure pct00020
[표 21]
Figure pct00021
[표 22]
Figure pct00022
[표 23]
Figure pct00023
[표 24]
Figure pct00024
[표 25]
Figure pct00025
[표 26]
Figure pct00026
[표 27]
Figure pct00027
<실시예 21>
상기 배지1에 δ-발레로락톤을 5.53g/L와 프룩토오스를 8.86g/L를 첨가한 배지에서 30℃, 4일간, 150pm으로 플라스크 배양한 경우, Mw 1008만, Mn 325만, Mw/Mn 3.1의 PHA가 얻어졌다.
<실시예 22>
상기 배지1에 δ-카프로락톤을 5.25g/L와 프룩토오스 8.86g/L를 첨가한 배지에서 30℃, 4일간, 150pm으로 플라스크 배양한 경우, Mw 630만, Mn 200만, Mw/Mn 3.1의 PHA가 얻어졌다.

Claims (7)

  1. 중합 단위로서 3-하이드록시부티레이트 단위를 적어도 포함하는 폴리에스테르의 생산능을 갖는 미생물을, 탄소원 및 질소원을 포함하는 배양액 중에 있어서 배양하는 것을 포함하는, 폴리에스테르의 제조방법으로서,
    제조되는 폴리에스테르가, 폴리스티렌 환산 겔침투 크로마토그래피 측정에 의한 중량평균 분자량이 100만 이상이며, 중합 단위로서 3-하이드록시부티레이트 단위를 적어도 포함하는 폴리에스테르이며,
    상기 배양액의 pH가 4 이상 7.5 이하이며,
    배양이 하기의 조건(a) 및 (b)를 만족시키는, 상기 방법.
    (a) 배양액의 침투압이 배양기간 중 200mOsmol 이상 900mOsm 이하로 유지되어 있다:
    (b) 배양액의 질소원자 농도가 배양기간 중 0.30g/L 이상으로 유지되어 있다:
  2. 제1항에 있어서,
    상기 미생물이, 커프리아비더스(Cupriavidus)속, 알칼리게네스(Alcaligenes)속, 랄스토니아(Ralstonia)속, 델프티아(Delftia)속, 코마모나스(Comamonas)속, 히드로게노파가(Hydrogenophaga)속,　버크홀데리아(Burkholderia)속, 에세리키아(Escherichia)속, 아조토박터(Azotobacter)속, 메틸로박테리움(Methylobacterium)속, 파라코코스(Paracoccos)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속, 아시네토박터(Acinetobacter)속, 에로모나스(Aeromonas)속, 알로크로마티움(Allochromatium)속, 아조라이조비움(Azorhizobium)속, 바실러스(Bacillus)속, 카울로박터(Caulobacter)속, 크로모박테륨(Chromobacterium)속, 엑토티오로도스피라(Ectothiorhodospira)속, 클렙시엘라(Klebsiella)속, 노카르디아(Nocardia)속, 로도박터(Rhodobacter)속, 로도코커스(Rhodococcus)속, 로도스피릴룸(Rhodospirillum)속, 리케치아(Rickettsia)속, 시노르히조비움(Sinorhizobium)속, 스핑고모나스(Sphingomonas)속, 시네코시스티스(Synechocystis)속, 티오코커스(Thiococcus)속, 티오시스티스(Thiocystis)속, 비브리오(Vibrio)속, 및 와우터시아(Wautersia)속으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 미생물인, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 미생물이, 커프리아비더스 네케이터(Cupriavidus necator)인, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    배양온도가, 15℃~45℃인, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    배양이, 유가배양 또는 연속배양인, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 탄소원이, ε-카프로락톤, δ-발레로락톤, δ-카프로락톤 혹은 이들의 감화물, 또는 이들의 염 중 적어도 1종을 포함하는, 방법.
  7. 중합 단위로서 3-하이드록시부티레이트 단위를 적어도 포함하는 폴리에스테르의 생산능을 갖는 미생물을, 탄소원 및 질소원을 포함하는 배양액 중에 있어서 배양하는 것을 포함하는, 폴리에스테르의 제조방법으로서,
    제조되는 폴리에스테르가, 폴리스티렌 환산 겔침투 크로마토그래피 측정에 의한 중량평균 분자량이 100만 이상이며, 중합 단위로서 3-하이드록시부티레이트 단위를 적어도 포함하는 폴리에스테르이며,
    상기 배양액의 pH가 4 이상 7.5 이하이며,
    배양이, 회분배양이며,
    배양이 하기의 조건(a) 및 (b)를 만족시키는, 상기 방법.
    (a) 배양개시 시에 있어서의 배양액의 침투압이 200mOsmol 이상 900mOsm 이하이다:
    (b) 배양개시 시에 있어서의 배양액의 질소원자 농도가 0.30g/L 이상이다.
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