CZ304183B6 - Zpusob produkce polyhydroxyalkanoátu (PHA) na olejovém substrátu - Google Patents
Zpusob produkce polyhydroxyalkanoátu (PHA) na olejovém substrátu Download PDFInfo
- Publication number
- CZ304183B6 CZ304183B6 CZ20120571A CZ2012571A CZ304183B6 CZ 304183 B6 CZ304183 B6 CZ 304183B6 CZ 20120571 A CZ20120571 A CZ 20120571A CZ 2012571 A CZ2012571 A CZ 2012571A CZ 304183 B6 CZ304183 B6 CZ 304183B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- pha
- oil
- production
- lipolytic enzymes
- culture medium
- Prior art date
Links
- 229920000903 polyhydroxyalkanoate Polymers 0.000 title claims abstract description 130
- 239000005014 poly(hydroxyalkanoate) Substances 0.000 title claims abstract description 123
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 70
- 239000000758 substrate Substances 0.000 title claims abstract description 52
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 86
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 86
- 230000002366 lipolytic effect Effects 0.000 claims abstract description 63
- 239000003921 oil Substances 0.000 claims abstract description 60
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 claims abstract description 60
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 31
- 241000481518 Ralstonia eutropha H16 Species 0.000 claims abstract description 20
- 239000002699 waste material Substances 0.000 claims abstract description 19
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 16
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 16
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims abstract description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 14
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- 239000008157 edible vegetable oil Substances 0.000 claims abstract description 10
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims abstract description 7
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 claims abstract description 7
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 claims abstract description 7
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims abstract description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 3
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims abstract 3
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 37
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 22
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 18
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 14
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 claims description 12
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 6
- 238000005273 aeration Methods 0.000 claims description 4
- JXKPEJDQGNYQSM-UHFFFAOYSA-M sodium propionate Chemical compound [Na+].CCC([O-])=O JXKPEJDQGNYQSM-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- 235000010334 sodium propionate Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000004324 sodium propionate Substances 0.000 claims description 4
- 229960003212 sodium propionate Drugs 0.000 claims description 4
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 claims description 2
- JOOXCMJARBKPKM-UHFFFAOYSA-N 4-oxopentanoic acid Chemical compound CC(=O)CCC(O)=O JOOXCMJARBKPKM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 229940040102 levulinic acid Drugs 0.000 claims 1
- 229940124305 n-propanol Drugs 0.000 claims 1
- 238000005086 pumping Methods 0.000 claims 1
- 239000013587 production medium Substances 0.000 abstract description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 abstract description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 abstract description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 abstract description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 76
- 229920000331 Polyhydroxybutyrate Polymers 0.000 description 43
- 239000005015 poly(hydroxybutyrate) Substances 0.000 description 43
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 32
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 31
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 30
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 29
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 29
- REKYPYSUBKSCAT-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxypentanoic acid Chemical compound CCC(O)CC(O)=O REKYPYSUBKSCAT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 25
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 22
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 22
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 21
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 21
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 21
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 17
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 17
- 239000000047 product Substances 0.000 description 16
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 description 14
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 12
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 11
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 11
- 241001528539 Cupriavidus necator Species 0.000 description 10
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 10
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N dimethylselenoniopropionate Natural products CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 10
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 10
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 10
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 10
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 9
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 8
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- 208000037534 Progressive hemifacial atrophy Diseases 0.000 description 7
- 235000019626 lipase activity Nutrition 0.000 description 7
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 7
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 7
- 238000012017 passive hemagglutination assay Methods 0.000 description 7
- 108010010718 poly(3-hydroxyalkanoic acid) synthase Proteins 0.000 description 7
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 7
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 6
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 6
- SJZRECIVHVDYJC-UHFFFAOYSA-M 4-hydroxybutyrate Chemical compound OCCCC([O-])=O SJZRECIVHVDYJC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- -1 carbon hydroxy acids Chemical class 0.000 description 5
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 5
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 5
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 5
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 5
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 5
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 5
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 5
- 235000019260 propionic acid Nutrition 0.000 description 5
- IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N quinbolone Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H]([C@]4(C=CC(=O)C=C4CC3)C)CC[C@@]21C)C1=CCCC1 IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 5
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 5
- IUPHTVOTTBREAV-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxybutanoic acid;3-hydroxypentanoic acid Chemical compound CC(O)CC(O)=O.CCC(O)CC(O)=O IUPHTVOTTBREAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920013642 Biopol™ Polymers 0.000 description 4
- 101710158368 Extracellular lipase Proteins 0.000 description 4
- 240000005384 Rhizopus oryzae Species 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 101710128940 Triacylglycerol lipase Proteins 0.000 description 4
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 4
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 4
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 4
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 4
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 4
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 4
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 4
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 4
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 4
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 4
- WHBMMWSBFZVSSR-UHFFFAOYSA-M 3-hydroxybutyrate Chemical compound CC(O)CC([O-])=O WHBMMWSBFZVSSR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 3
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 3
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 3
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 3
- WHBMMWSBFZVSSR-UHFFFAOYSA-N R3HBA Natural products CC(O)CC(O)=O WHBMMWSBFZVSSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 229920000704 biodegradable plastic Polymers 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 3
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 3
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 3
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 238000002411 thermogravimetry Methods 0.000 description 3
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000004102 tricarboxylic acid cycle Effects 0.000 description 3
- HPMGFDVTYHWBAG-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxyhexanoic acid Chemical compound CCCC(O)CC(O)=O HPMGFDVTYHWBAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YEJRWHAVMIAJKC-UHFFFAOYSA-N 4-Butyrolactone Chemical compound O=C1CCCO1 YEJRWHAVMIAJKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004672 Acetyl-CoA C-acyltransferase Human genes 0.000 description 2
- 108010003902 Acetyl-CoA C-acyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N CoASH Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 240000002129 Malva sylvestris Species 0.000 description 2
- 235000006770 Malva sylvestris Nutrition 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 2
- 235000013752 Rhizopus oryzae Nutrition 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- OJFDKHTZOUZBOS-CITAKDKDSA-N acetoacetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 OJFDKHTZOUZBOS-CITAKDKDSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 238000001286 analytical centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 2
- WERYXYBDKMZEQL-UHFFFAOYSA-N butane-1,4-diol Chemical compound OCCCCO WERYXYBDKMZEQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N coenzime A Natural products OC1C(OP(O)(O)=O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000000113 differential scanning calorimetry Methods 0.000 description 2
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 230000009477 glass transition Effects 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical compound C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- CWEFIMQKSZFZNY-UHFFFAOYSA-N pentyl 2-[4-[[4-[4-[[4-[[4-(pentoxycarbonylamino)phenyl]methyl]phenyl]carbamoyloxy]butoxycarbonylamino]phenyl]methyl]phenyl]acetate Chemical compound C1=CC(CC(=O)OCCCCC)=CC=C1CC(C=C1)=CC=C1NC(=O)OCCCCOC(=O)NC(C=C1)=CC=C1CC1=CC=C(NC(=O)OCCCCC)C=C1 CWEFIMQKSZFZNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 2
- 230000005501 phase interface Effects 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 2
- QHHKKMYHDBRONY-WZZMXTMRSA-N (R)-3-hydroxybutanoyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C[C@H](O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 QHHKKMYHDBRONY-WZZMXTMRSA-N 0.000 description 1
- WSLDOOZREJYCGB-UHFFFAOYSA-N 1,2-Dichloroethane Chemical group ClCCCl WSLDOOZREJYCGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010030844 2-methylcitrate synthase Proteins 0.000 description 1
- IPLKGJHGWCVSOG-UHFFFAOYSA-N 4-chlorobutanoic acid Chemical compound OC(=O)CCCCl IPLKGJHGWCVSOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SJZRECIVHVDYJC-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxybutyric acid Chemical compound OCCCC(O)=O SJZRECIVHVDYJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940006015 4-hydroxybutyric acid Drugs 0.000 description 1
- 241000607534 Aeromonas Species 0.000 description 1
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 1
- 240000006439 Aspergillus oryzae Species 0.000 description 1
- 235000002247 Aspergillus oryzae Nutrition 0.000 description 1
- 241000193033 Azohydromonas lata Species 0.000 description 1
- 241000194107 Bacillus megaterium Species 0.000 description 1
- 244000257790 Brassica carinata Species 0.000 description 1
- 235000005156 Brassica carinata Nutrition 0.000 description 1
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 1
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 1
- DKPFZGUDAPQIHT-UHFFFAOYSA-N Butyl acetate Natural products CCCCOC(C)=O DKPFZGUDAPQIHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 1
- 235000012766 Cannabis sativa ssp. sativa var. sativa Nutrition 0.000 description 1
- 235000012765 Cannabis sativa ssp. sativa var. spontanea Nutrition 0.000 description 1
- 102000004308 Carboxylic Ester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000863 Carboxylic Ester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 241000700190 Caviidae Species 0.000 description 1
- 108010071536 Citrate (Si)-synthase Proteins 0.000 description 1
- 102000006732 Citrate synthase Human genes 0.000 description 1
- 241001528480 Cupriavidus Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102100031375 Endothelial lipase Human genes 0.000 description 1
- 238000012366 Fed-batch cultivation Methods 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 description 1
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000012011 Isocitrate Dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010075869 Isocitrate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 241000589308 Methylobacterium extorquens Species 0.000 description 1
- 241000235395 Mucor Species 0.000 description 1
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M Propionate Chemical compound CCC([O-])=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000204735 Pseudomonas nitroreducens Species 0.000 description 1
- 241000589774 Pseudomonas sp. Species 0.000 description 1
- 241000232299 Ralstonia Species 0.000 description 1
- 241000235403 Rhizomucor miehei Species 0.000 description 1
- 241000235527 Rhizopus Species 0.000 description 1
- 241000303962 Rhizopus delemar Species 0.000 description 1
- 241000952054 Rhizopus sp. Species 0.000 description 1
- 244000157378 Rubus niveus Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005708 Sodium hypochlorite Substances 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000297179 Syringa vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000004338 Syringa vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 241000223258 Thermomyces lanuginosus Species 0.000 description 1
- XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N 0.000 description 1
- 108091000039 acetoacetyl-CoA reductase Proteins 0.000 description 1
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003905 agrochemical Substances 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 150000001491 aromatic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 1
- 230000001651 autotrophic effect Effects 0.000 description 1
- OGBUMNBNEWYMNJ-UHFFFAOYSA-N batilol Chemical class CCCCCCCCCCCCCCCCCCOCC(O)CO OGBUMNBNEWYMNJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 description 1
- 239000000560 biocompatible material Substances 0.000 description 1
- 239000003225 biodiesel Substances 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 229930188620 butyrolactone Natural products 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 235000009120 camo Nutrition 0.000 description 1
- 125000002837 carbocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 235000005607 chanvre indien Nutrition 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 235000019879 cocoa butter substitute Nutrition 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003974 emollient agent Substances 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- OCLXJTCGWSSVOE-UHFFFAOYSA-N ethanol etoh Chemical compound CCO.CCO OCLXJTCGWSSVOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 235000013410 fast food Nutrition 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000000769 gas chromatography-flame ionisation detection Methods 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000008570 general process Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 239000011487 hemp Substances 0.000 description 1
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-M hexadecanoate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N hexanoic acid Chemical compound CCCCCC(O)=O FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 150000001261 hydroxy acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000003262 industrial enzyme Substances 0.000 description 1
- 239000003317 industrial substance Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005297 material degradation process Methods 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000001450 methanotrophic effect Effects 0.000 description 1
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 235000021243 milk fat Nutrition 0.000 description 1
- 239000007003 mineral medium Substances 0.000 description 1
- 239000002121 nanofiber Substances 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 239000012454 non-polar solvent Substances 0.000 description 1
- 229940127073 nucleoside analogue Drugs 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 235000014593 oils and fats Nutrition 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 229940094443 oxytocics prostaglandins Drugs 0.000 description 1
- UQGPCEVQKLOLLM-UHFFFAOYSA-N pentaneperoxoic acid Chemical compound CCCCC(=O)OO UQGPCEVQKLOLLM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 1
- 108010081808 poly(3-hydroxyalkanoic acid) depolymerase Proteins 0.000 description 1
- 108010078304 poly-beta-hydroxybutyrate polymerase Proteins 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 150000008442 polyphenolic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- QAQREVBBADEHPA-IEXPHMLFSA-N propionyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CC)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 QAQREVBBADEHPA-IEXPHMLFSA-N 0.000 description 1
- RUOJZAUFBMNUDX-UHFFFAOYSA-N propylene carbonate Chemical compound CC1COC(=O)O1 RUOJZAUFBMNUDX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- WIOQNWTZBOQTEU-ZMHDXICWSA-N s-[2-[3-[[(2r)-4-[[[(2r,3s,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-4-hydroxy-3-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-hydroxyphosphoryl]oxy-2-hydroxy-3,3-dimethylbutanoyl]amino]propanoylamino]ethyl] 3-oxopentanethioate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CC(=O)CC)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 WIOQNWTZBOQTEU-ZMHDXICWSA-N 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000002453 shampoo Substances 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000000000 soil microbiome Species 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 230000037351 starvation Effects 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 239000004753 textile Substances 0.000 description 1
- 229920001169 thermoplastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004416 thermosoftening plastic Substances 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005809 transesterification reaction Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 125000003203 triacylglycerol group Chemical group 0.000 description 1
- DCXXMTOCNZCJGO-UHFFFAOYSA-N tristearoylglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC)COC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC DCXXMTOCNZCJGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 238000009369 viticulture Methods 0.000 description 1
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/62—Carboxylic acid esters
- C12P7/625—Polyesters of hydroxy carboxylic acids
Landscapes
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Zpusob produkce polyhydroxyalkanoátu (PHA), pri kterém se na olejovém substrátu obsahujícím rostlinný olej a/nebo jedlý olej a/nebo odpadní jedlý olej, s výhodou fritovací olej, kultivuje kmen bakterií Cupriavidus necator H16, který pretvárí olej na PHA pri soucasné produkci vlastních extracelulárních lipolytických enzymu, které se z kultivacního média alespon cástecne izolují v prubehu fermentacního procesu pred ukoncením produkce a izolace PHA. Lipolytické enzymy izolované z C. necator v prubehu kultivace se pouzijí k úprave olejového substrátu tak, ze se pridají k produkcnímu médiu pred zahájením kultivace, prípadne téz v prubehu kultivace spolecne s príkrmovou dávkou oleje. Pri izolaci PHA vyprodukovaných zpusobem podle vynálezu se po ukoncení fermentace obsah produkcního reaktoru zahreje na teplotu 80 .degree.C po dobu alespon 30 minut, následne se zchladí na teplotu 60 .degree.C a pridají se lytická cinidla obsahující smes detergentu, napríklad SDS, a proteolytického enzymu, címz se získá surový homogenát, prípadne lyzát.
Description
Oblast techniky
Vynález se týká způsobu produkce polyhydroxyalkanoátů (PHA), u něhož se na olejovém substrátu obsahujícím rostlinný olej a/nebo jedlý olej a/nebo odpadní jedlý olej, s výhodou fritovací olej, kultivuje kmen bakterií Cupriavidus necator H16, který přetváří olej na PHA při současné produkci extracelulárních lipolytických enzymů, které se z kultivačního média alespoň částečně izolují v průběhu fermentačního procesu před ukončením produkce a izolace PHA.
Dosavadní stav techniky
Jednou z nejefektivnějších možností výroby biomateriálu je využití přirozených procesů probíhajících v mikroorganismech. Některé bakterie vytváří z látek v prostředí, které jim slouží jako potrava, zásobní polymer PHA. Tento polymer si bakterie ukládají na horší časy a v době hladovění jej pak mohou využít jako vnitřní potravu.
Polyhydroxyalkanoáty (PHA) jsou skupina opticky aktivních polyesterů syntetizovaných některými bakteriálními kmeny jako zásobní forma energie. Monomerem PHA jsou (R)-3-hydroxykyseliny. Všechny monomerní jednotky jsou v R konfiguraci díky stereospecifitě enzymu, který je za syntézu PHA zodpovědný - PHA syntáze. Pouze v několika málo případech bylo zjištěno malé množství S monomeru v polyesteru. Molekulová hmotnost PHA se pohybuje v rozmezí od 200 000 do 3 000 000 Da v závislosti na mikroorganismu a kultivačních podmínkách. PHA se v buňce nachází cytoplazmě ve formě granulí o rozměrech 0,2 až 0,5 pm [1],
PHA mohou představovat až 90 % hmotnosti buňky. Na rozdíl od ostatních biopolymerů, jako jsou například polysacharidy, bílkoviny nebo DNA, jsou PHA termoplasty. Díky svým mechanickým a technologickým vlastnostem jsou PHA velmi zajímavé z hlediska svého použití a mohou představovat alternativu k plastům připravovaným synteticky z ropy [2].
V závislosti na počtu atomů v monomerní jednotce se PHA dělí na PHA s krátkým řetězcem (short-chain-lenght - SCL) o délce 3 až 5 atomů uhlíku a na PHA se středně dlouhým řetězcem (medium-chain-lenght - MCL) o délce 6 až 14 atomů uhlíku v monomeru. Struktura PHA je znázorněna na obr. 1, přičemž pro PHA s krátkým řetězcem je R = CH3- C5Hh a pro PHA se středním řetězcem je R = C6H13-Ci4H29.
Už v roce 1926 izoloval Lemoigne polyhydroxybutyrát (PHB) z bakterie Bacillus megaterium. Na konci 50-tých let minulého století byla prokázána přítomnost PHB jako zásobní formy energie a uhlíku u řady Gram-negativních bakterií. V roce 1974 byly kromě PHB izolovány také kopolymery obsahující 3-hydroxyvalerát a 3-hydroxyhexanoát. Od té doby byla identifikována řada mikroorganismů schopných syntézy PHA včetně průmyslových kmenů. Jsou to jak Grampozitivní, tak Gram-negativní bakterie (autotrofní, heterotrofní, fototrofní; aerobní i anaerobní viz patent WO 2009156950 A2), ale také některé kmeny archaebakterií. Mikroorganismy syntetizují PHA jako zásobní formu energie a uhlíku při dostatku uhlíkatého zdroje a limitaci ostatními živinami. Po vyčerpání uhlíkatého zdroje jsou pak PHA utilizátory jako zdroj energie a uhlíku. PHA představují ideální zásobní formu jak uhlíku, tak energie, což je dáno jejich nízkou rozpustností a vysokou molekulární hmotností. Díky těmto vlastnostem se výrazně nepodílí na osmotickém tlaku v buňce [1],
V roce 1976 britská společnost Imperiál Chemical Industrie (ICI) rozpoznala potenciál PHI3 nahradit syntetické polymery připravované většinou z ropy. Přestože bakteriální produkce PHB byla drahá, předpokládalo se, že prudký růst cen ropy umožní rentabilní bakteriální výrobu PHB. Protože k očekávanému růstu cen ropy nedošlo, nachází PHB uplatnění především jako bio- 1 CZ 304183 B6 degradabilní a biokompatibilní materiál. Kvůli vysoké ceně však PHB a P(HB-co-HV) (kopolymer hydroxybutyrátu a hydroxyvalerátu), které se objevují pod obchodní značkou Biopol, nacházejí spíše sporadické uplatnění na trhu. V roce 1990 německá firma Wella použila obaly z Biopolu pro nový šampón. V roce 1996 odkoupila americká firma Monsanto Biopol od firmy ZENECA BioProducsts, dceřinné společnosti ICL I v současné době jsou prezentovány patenty k produkci PHA pomocí transgenních rostlin, což by mělo snížit náklady na výrobu (př. US 2003/0017576 Al, US 2004/0101865 Al).
Biochemická stránka biosyntézy PHB je velmi dobře prostudována. U většiny bakterií, např. Alcaligenes eutrophus (též Ralstonia eutropha', nyní Cupriavidus necator) je PHB syntetizován reakcí, která se skládá ze tří kroků. Nejprve dvě molekuly acetyl-CoA reagují za vzniku acetoacetyl-CoA, tato reakce je katalyzována 3-ketothiolázou. Acetoacetyl-CoA je stereo selektivně redukován na (R)-3-hydroxybutyryl-CoA reakcí katalyzovanou NADPH-dependentní acetoacetyl-CoA reduktázou. Nakonec je PHB syntetizován polymerizací (R)-3-hydroxybutyryICoA, kteráje realizována enzymem PHB syntázou [1],
Schéma biosyntézy PHB je znázorněno na Obr. 2
K biosyntéze PHB dochází při dostatku uhlíkatého zdroje a při limitaci například dusíkem, železem, fosforem, sírou, draslíkem anebo kyslíkem. Syntéza PHB je regulována na enzymové úrovni. Z hlediska regulace syntézy PHB je zásadní intracelulární koncentrace acetyl-CoA a volného HSCoA. Při podmínkách vyrovnaného růstu je acetyl-CoA oxidován v Krebsově cyklu. Během této oxidace je produkováno NADH, které je dále využíváno pro biosyntetické účely. Při zastavení růstu kultury koncentrace NADH roste a dochází ke snížení aktivity citrátsyntázy a isocitrátdehydrogenázy. Acetyl-CoA pak nemůže být oxidován v Krebsově cyklu a vstupuje do biosyntetické dráhy PHB. 3-ketothioláza je inhibována volným HSCoA, který je produkován během oxidace acetyl-CoA v Krebsově cyklu během normálního růstu kultury [4],
Některé kmeny bakterií produkují různé typy kopolymerů PHA. Kopolymer PHB a PHV může být syntetizován například kmenem Alcaligenes eutrophus nebo jinými typy mikroorganismů, a to při růstu na substrátu obsahujícím glukózu a propionovou kyselinu, případně přímo prekurzor 3-hydroxyvalerát. Pokud je použita propionová kyselina, je syntéza podobná syntéze PHB jen s tím rozdílem, že acetyl-CoA kondenzuje s propionyl-CoA za vzniku 3-ketovaleryl-CoA, což vede k inkorporaci 3-hydroxyvalerátu do struktury polymeru. Pokud je uhlíkatým zdrojem kyselina s lichým počtem atomů uhlíku, pochází 3-hydroxyvalerát přímo z β-oxidace mastných kyselin. U Alcaligenes eutrophus také nízká hladina rozpuštěného kyslíku v médiu zvyšuje inkorporaci 3-hydroxyvalerátu do struktury polymeru [1]. Schéma struktury PHB a P(HB-co-HV) je znázorněno na obr. 3.
Některé mikroorganismy jsou schopny syntetizovat P(HB-co-HV) při růstu v médiu, které neobsahuje prekurzory 3-hydroxyvalerátu, např. i některé mutanty Alcaligenes eutrophus. Kopolymer 3-hydroxybutyrátu a 4-hydroxybutyrátu může být syntetizován u Alcaligenes eutrophus z kyseliny 4-hydroxybutyrové, 1,4-butandiolu, butyrolaktonu a 4-chlorbutyrátu [1].
PHA jsou uloženy v buňkách ve formě granulí. Počet a velikost granulí závisí na kultivačních podmínkách a také se liší v rámci různých bakteriálních kultur. Hustota PHB granulí se pohybuje okolo 1,18 až 1,24 g.cm-3. hustota granulí MCL PHA je pak přibližně 1,05 g.cm'3. Granule se skládají z polyesterů, proteinů a lipidů. Polyestery jsou obsaženy uvnitř objemu granulí, povrch je tvořen fosfolipidovou vrstvou, do které jsou zabudovány proteiny plnící různé funkce. PHA obecně mají hydrofobní charakter, proto i fosfolipidy a proteiny vytvářejí rozhraní mezi PHA a okolním prostředí [1].
Jedním z proteinů PHA granulí je PHA syntáza. Pravděpodobně existují tři typy PHA syntáz, které se liší substrátovou specifitou a primární strukturou. Společným rysem je aktivní místo obsahující cystein. První typ PHA syntázy katalyzuje syntézu SCL PHA (short-chain-lengt) z 3-2CZ 304183 B6 uhlíkatých hydroxykyselin. Druhý typ inkorporuje delší hydroxykyseliny (6 až 14 uhlíků) do struktury PHA (MCL PHA). Třetí typ se od prvních dvou odlišuje svou strukturou. Zatímco předcházející PHA syntázy jsou tvořeny jednou podjednotkou o velikosti 60 až 70 kDa, třetí typ PHA syntázy je tvořeny dvěma podjednotkami: C-podjednotkou (~ 40 kDa) a E-podjednotkou (~ 40 kDa). Pro syntézu PHA tímto typem enzymu jsou nutné obě podjednotky. Substrátová specifita není tak striktní jako u předcházejících PHA syntáz, ale spíše je preferovaná syntéza SCL PHA [5].
Schéma struktury granule PHA je znázorněno na obr. 4.
Dalším proteinem, kterýje možno nalézt v granuli PHA, je intracelulámí PHA depolymeráza. Ta je zodpovědná za využívání PHA jako zdroje energie a uhlíku v případě limitace C zdrojem z prostředí. Dosavadní studie naznačují, že proces degradace PHA intracelulárními depolymerázami je přibližně 1 Okřát pomalejší než jejich syntéza. Regulace intracelulárních depolymeráz však ještě není zcela vysvětlena. Ve struktuře PHA granulí se nacházejí také nekatalytické proteiny, které se nazývají phasiny. Předpokládá se, že se podílí na stabilizaci hydrofobních PHA ve vodním prostředí buněčné cytoplasmy [6].
Homopolymer PHB je polyester se všemi asymetrickými uhlíkatými atomy v R konfiguraci. Vykazuje poměrně vysokou krystaličnost (asi 50 až 80 %), což ho činí tuhým a křehkým. Teplota skelného přechodu je 5 až 9 °C, teplota tání 173 až 180 °C. PHB se rozkládá při 200 °C, což je blízko teplotě tání. V chloroformovém roztoku vytváří pravotočivou šroubovici. Mechanickými vlastnostmi PHB (např. Youngův modul pružnosti (3,5 GPa), pružnost v tahu (40MPa)) připomíná polypropylen. Průtažnost je však jen okolo 3 %, což je výrazně méně, než je tomu u polypropylenu [1].
Některé vlastnosti derivátů PHA jsou uvedeny následující tabulce 1.
Tabulka 1
| Para meter | PHB | P(3HB-HV) | P(3HB-4HO) | P(3HO-3HH) | Polyprophylene |
| Tm (°C) | 179 | 145 | 150 | 61 | 176 |
| Tg (°C) | -4 | -1 | -7 | -36 | -10 |
| Crystallinity (%) | 70 | 56 | 45 | 30 | 60 |
| Rupture extension (%) | 5 | 50 | 444 | 300 | 400 |
| Young Module (GPa) | 3.5 | 2.9 | -- | - | 1.7 |
Pokud je do struktury polymeru zabudován 3-hydroxyvalerát, mechanické vlastnosti se výrazně zlepší. Youngův modul pružnosti klesne pod 0,7 GPa a pružnost v tahu klesne na 30 MPa. Průtažnost materiálu roste s rostoucím podílem 3-hydroxyvalerátu. Teplota tání kopolymeru klesá na přibližně 130 °C, mírně však klesne i teplota rozkladu. Díky těmto vlastnostem může být kopolymer taven bez toho, aby došlo kjeho rozkladu. Jak již bylo zmíněno, poly-(HB-co-HV) s obsahem 3-hydroxyvalerátu od 0 do 30 % je komerčně dostupný pod názvem Biopol [1],
Kopolymer 3-hydroxybutyrátu a 4-hydroxybutyrátu nevytváří krystalické struktury. Teplota skelného přechodu klesá od 5 do -50 °C, teplota tání také klesá od 180 do 54 °C s rostoucím
-3 CZ 304183 B6 obsahem 4-hydroxybutyrátu (0 až 100 %) v polymeru. Pro 94% 4-hydroxybutyrát je Youngův modul pružnosti přibližně 55 MPa, pružnost v tahu 39 MPa a průtažnost 500 % [1],
Přestože existuje řada bakteriálních kmenů schopná produkce PHA, k průmyslovému využití je možno aplikovat jen několik málo z nich. Použitelnost bakteriálního kmene ovlivňuje řada faktorů. Především je to stabilita a bezpečnost, růstové a akumulační schopnosti, dosažitelné množství biomasy a množství PHA. Dále to jsou míra extrahovatelnosti PHA, molekulová hmotnost PHA, množství použitelných substrátů a finanční náročnost jednotlivých komponent média [1],
Firma ZENECA Bioproducts využívala k produkci PHB a P(HB-co-HV) mutantní kmeny Alcaligenes eutrophus. Proces byl veden jako dvoufázový fed-batch systém. V prvním kroku byla kultivována biomasa v minerálním médiu obsahujícím glukózu jako zdroj uhlíku a energie a přesně stanovené množství fosfátu. Po nárůstu kultury došlo k vyčerpání fosfátu a v druhém kroku pak docházelo k limitaci fosforem, což vedlo k akumulaci PHA. V druhém kroku byla kultuře dodávána glukóza tak dlouho, dokud nedošlo k biosyntéze požadovaného množství PHA. Každá fáze probíhala přibližně 48 hodin a konečná koncentrace suché hmotnosti biomasy byla přibližně 48 hodin a konečná koncentrace suché hmotnosti biomasy byla přibližně 100 g/1. Kopolymer P(HB-co-HV) byl syntetizován přídavkem směsi glukózy a propionové kyseliny ve druhé fázi kultivace. Obsah 3-hydroxyvaIerátu v polymeru byl kontrolován poměrem glukózy a propionové kyseliny [7],
Jiný proces byl vyvinut rakouskou firmou Biotechnologische Forschungsgesellschaft. Ta k produkci homopolymeru PHB použila kmen Alcaligenes latus DSM 1124, který byl schopen produkce PHB v množství až 80% buněčné sušiny. Proces byl veden jako jednokrokový fed-batch a jako zdroj uhlíku byla použita sacharóza [8].
Produkční náklady lze snížit, pokud by byl jako substrát využíván např. methanol, který je jedním z nejlevnějších uhlíkatých zdrojů. Kmen Methylobacterium extorquens produkoval PHB při diskontinuální fed-batch kultivaci na methanolu. Optimální koncentrace methanolu byla 1,7 g/1. Byla dosažena koncentrace biomasy 9 až 10 g/1 a množství PHB dosahovala 30 až 33 % biomasy. Ani požití levného uhlíkatého zdroje ovšem nesníží provozní náklady, protože malé množství produkovaného PHB prodražuje a znesnadňuje následný separační proces.
Velký potenciál v sobě skrývá geneticky modifikovaná bakterie Escherichia coli. To je schopna produkce PHA v extrémně velkých intracelulárních množstvích (až 80 až 90 % sušiny), pomocí metod genového inženýrství je možno připravit také kmeny produkující kopolymer P(HB-coHV), případně jiné kopolymery. Syntéza PHA pomocí rekombinantní E. coli není spojena s limitací, ale závisí na množství dostupného acetyl-CoA. Výhodou je také rychlý růst, schopnost utilizovat ekonomicky nenáročné zdroje uhlíku, vysoká hustota buněk narostlé kultury a snadná purifikace produktu (př. patenty KR20030070790 (A) - 2003-09-02, KR20030070789 (A) 2003-09-02, KR20070097883 (A) - 2007-10-05, KR20070097884 (A) - 2007-10-05, US 2003/0004299 A1 atd.).
Hlavní slabinou PHA v souboji se syntetickými polymery připravovanými z nafty jsou prozatím vysoké produkční náklady. Díky tomu je bakteriálně produkovaný PHA asi 5 až lOkrát dražší než například polypropylen nebo polyethylen. Naším cílem je najít efektivní způsob řízení produkce PHA v bakteriích tak, aby bakterie produkovaly co nejvíce polymeru. Výslednou cenu polymeru ovlivňuje zejména cena vstupních surovin pro kultivaci a náročné oddělení polymeru z buněk. Naše strategie počítá se snížením ceny vstupů využitím vhodných odpadních surovin jako krmivá pro bakterie, a to na bázi odpadních olejů. Dále počítáme s optimalizací purifikačního procesu a s využitím doprovodného produktu fermentace - extracelulární lipázy k předzpracování substrátu v médiu, případně jako samostatný doprovodný produkt s řadou průmyslových aplikací.
Lipolytické enzymy řadíme mezi esterové hydrolázy, katalyzující ve dvoufázovém systému voda — lipid, rozklad mono-, di— a triacylglycerolů na vyšší mastné kyseliny, alkohol a glycerol kom-4CZ 304183 B6 plexním mechanizmem závislým na mnoha faktorech. Lipolytické enzymy jsou definovány jako karboxylesterázy, které hydrolyzují acylglyceroly. Lipolytické enzymy, které hydrolyzují acylglyceroly s uhlíkatým řetězcem mastných kyselin kratším než .0 °C, jsou považovány za esterázy nebo karboxylázy (EC 3.1.1.1). Enzymy, které hydrolyzují acylglyceroly obsahující řetězce mastných kyselin s počtem uhlíků >10, jsou označovány jako lipázy nebo také jako triacylglycerolacylhydrolázy (EC 3.1.1.3). Esterázy jsou aktivní ve vodných roztocích, zatímco „pravé“ lipázy jsou aktivnější spíše na rozhraní voda-lipid než ve vodní fázi [20].
Lipolytické enzymy jsou děleny do tří skupin:
• První skupina je nespecifická. Lipolytické enzymy této skupiny uvolňují mastné kyseliny ze všech tří pozic acylglycerolu a kompletně hydrolyzují triacylglyceroly na mastné kyseliny a glycerol.
• Druhá skupina lipolytických enzymů je 1,3-specifická. Uvolňuje mastné kyseliny z vnějších pozic triacylglycerolu a dává vznik 1,2-diacylglycerolům, 2,3-diacylglycerolům a 2-monoacylglycerolům za uvolnění mastných kyselin. Dlouhá inkubace triacylglycerolu s 1,3-specifickými lipázami vede většinou k úplné hydrolýze triacylglycerolů na mastné kyseliny a glycerol.
• Třetí skupina zahrnuje lipolytické enzymy, které preferují jen určité mastné kyseliny.
Většina lipáz patří mezi extracelulární enzymy, které jsou uvolňovány do prostředí během pozdní exponenciální a časné stacionární růstové fáze. Produkce lipáz je ovlivněna řadou různých faktorů, jako je teplota, pH, zdroj dusíku, uhlíku a lipidů, stres, a koncentrace rozpuštěného kyslíku a. anorganických solí. Optimumlipázové aktivity je většinou kolem pH 6 až 9. Lipázy ιΑ. niger a Rhizopus sp. jsou však aktivní i v kyselém prostředí při pH 4. Naopak alkalická lipáza aktivní při pH 11 byla izolována od P. nitroreducens. Také teplotní optimum a tepelná stabilita se různí. U mezofilních MO je maximální aktivita lipáz při teplotě 30 až 35 °C. U termofilních MO je to většinou 60 °C. U psychrofilních mikroorganizmů jsou lipázy produkovány již při nízkých teplotách okolo 5 °C. Většina mikroorganizmů může také produkovat více než jeden typ extracelulárních lipáz s různou specifikou [21].
Mechanizmus lipázové aktivity je znázorněn na obr. 5.
Lipolytické enzymy řadíme mezi tzv. serinové hydrolázy. Trojrozměrná 3D struktura těchto enzymů vykazuje charakteristické α/β-ohyby - α-helixy a β—listy. Katalytická triáda je složena ze tří aminokyselinových zbytků, a to šeřinu, asparaginu a histidinu; u některých lipáz se vyskytuje glutamin namísto asparaginu. Lipolytická reakce probíhá pouze na rozhraní fází lipid - voda, koncentrace substrátu na rozhraní fází tedy přímo ovlivňuje rychlost reakce. V jedné fázi mohou tak existovat molekuly substrátu v rozdílném stavu bez přímého vlivu na reakční rychlost [22],
Aktivita esteráz je funkcí koncentrace substrátu a řídí se kinetikou Michaelis-Mentenové, maximální reakční rychlost je dosažena při koncentraci substrátu, kteráje mnohonásobně menší než je saturační koncentrace. Naopak lipázy nevykazují žádnou aktivitu, dokud je substrát (lipid) ve stavu jednotlivých molekul ve vodě. Když koncentrace substrátu převýší bod rozpustnosti, začíná se formovat emulze, a reakční rychlost výrazně narůstá. Aktivita lipáz pak přímo závisí na přítomnosti rozhraní fází. Objasněním prostorové struktury lipáz se potvrdilo, že aktivní centrum enzymu je chráněno polypeptidovým řetězcem znemožňujícím napojení samotné molekuly lipidu na enzym a následnou tvorbu aktivního komplexu. Pokud však lipáza přichází do přímého styku s lipidovou fází, začínají konformační změny, které posunou chránící polypeptidový řetězec a umožní přístup lipidu do aktivního centra enzymu. V důsledku hydrofobní interakce s lipidovou fází se zvyšuje síla vazby enzym-substrát. Tato skutečnost vysvětluje fenomén aktivace lipáz v přítomnosti fázového rozhraní. Pokud enzym působící na triacylglyceroly nevykazuje tento typ aktivace, měl by být považován za esterázu. Kinetika lipolytické reakce se na rozdíl od esteráz neřídí rovnicí Michaelis-Mentenové, předpokládá se dvoukrokový mechanismus zahrnující fyzikální adsorpci lipázy na povrch lipidové fáze probíhající souběžně s aktivací enzymu a posunem
-5 CZ 304183 B6 ochranné polypeptidové pokličky a následné vytvoření komplexu enzym-substrát, který je poté hydrolyzován na produkt a regenerovaný enzym [20 - 22],
Mechanismus hydrolýzy esterové vazby je v podstatě stejný jak pro lipázu, tak i esterázu, je složen ze čtyř kroků, jak vyplývá z obr. 6, na němž je znázorněno schéma mikrobiální degradace lipidů. Porovnáním aminokyselinových sekvencí a 3D struktury lipáz a esteráz bylo navrženo, aby jejich rozlišení bylo provedeno na základě pH; aktivní místo lipázy disponuje negativním potenciálem v rozmezí pH spojeným s maximem lipázové aktivity (typicky při pH 8,0), zatímco aktivní místo esterázy vykazuje podobné chování při hodnotách pH 6,0, což souvisí s obvyklým nižším pH optimem aktivity.
Většina známých mikroorganizmů je schopna produkovat lipázy, ale jen některé druhy jsou průmyslově využívané. Důvodem je nedostatečná produkce enzymů, nežádoucí fyzikálně chemické vlastnosti lipáz, omezené možnosti izolace z kultivačního média, atd. Komerčně nejvyužívanější plísně jsou rody Aspergillus, Penicillium, Mucor a Rhizopus. Hlavními producenty komerčních lipáz jsou Aspergillus niger, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Rhizopus arrhizus, R. delemar, R. japonicus, R. niveus a R. oryzae [20].
Lipolytické enzymy přitahují v dnešní době značnou pozornost kvůli svému biotechnologickému potenciálu. Představují nej významnější skupinu biokatalyzátorů pro biotechnologické aplikace, které se úspěšně využívají při syntézách biopolymerů, bionafty, při produkci agrochemikálií a aromatických sloučenin. Poptávka po průmyslových enzymech, především mikrobiálního původu, je tak stále větší. Enzymy nachází využití v potravinářském a farmaceutickém průmyslu, textilním a kosmetickém průmyslu a při výrobě detergentů. Lipázy se používají v pivovarnictví a vinařství, při výrobě sýrů a potravinových doplňků. Jsou významné i ve farmacii při transesterifikacích a hydrolýzách hrají primární roli v produkci speciálních lipidů. Mají význam při modifikacích monoglyceridů ajejich následném využití jako emulgátorů. Některé průmyslové významné chemikálie vyráběné chemickými procesy z tuků a olejů mohou být produkované i lipázami s mnohem větší a lepší specifikou. Lipázy se také využívají při výrobě náhražky kakaového másla a výrobě esterů pro použití v kosmetickém průmyslu. V mlékárenském průmyslu jsou používány pro hydrolýzu mléčného tuku. Aktuální aplikace jsou zvýšení chuti sýrů, zrychlení zrání sýrů, výrobu sýrů, přísada do jiných výrobků. Využití v pracích prášcích má lipáza z Aspergillus oryzae. Lipázy se používají při úpravě olejů a tuků, jako kosmetická změkčovadla, dále jako průmyslové katalyzátory při přípravě některých prostaglandinů, steroidů, karbocyklických analogů nukleosidů a farmaceuticky významných polyfenolických sloučenin [21],
Rovněž využití PHA se nabízí v řadě oblastí. Předpokládá se, že jeho hlavní využití bude v oblasti obalového průmyslu, zejména k produkci kojeneckých a dětských lahví, plastů pro dětské a ekologické výrobky (např. hračky), obalů pro kosmetický průmysl, tzv. inteligentních potravinářských obalů. Zajímavá je aplikace pro výrobu nádob (př. kelímky) pro jednorázové použití, např. pro řetězce rychlého občerstvení, které mohou zase poskytovat odpadní olej jako substrát pro produkci bioplastu.
Polymer PHA lze však využít i kjiným aplikacím: lze zněj připravit nanovlákna a nanočástice pro cílený transport léčiv, dají se z něj vyrobit biokompatibilní implantáty použitelné v lékařství jako vlákna, cévní náhrady apod.
Je třeba konstatovat, že produkce bioplastů je v současné době poměrně nízká, protože jejich cena je prozatím vyšší než u syntetických plastů, což značně omezuje poptávku. V nejbližších letech však lze očekávat podstatně přísnější regulace pro použití ekologických plastů a tím rozvoj výroby bioplastů.
V současné době je produkce PHA z olejových substrátů pomocí bakterií známá, ale ve srovnání s klasickou výrobou plastů z ropy je příliš nákladná, takže se obtížně prosazuje.
-6CZ 304183 B6
Cílem vynálezu je navrhnout způsob produkce PHA z olejového substrátu, který by byl ekonomický a produkoval velké množství PHA.
Podstata vynálezu
Cíle vynálezu je dosaženo způsobem produkce polyhydroxyalkanoátů (PHA) na olejovém substrátu obsahujícím rostlinný olej a/nebo jedlý olej a/nebo odpadní jedlý olej, s výhodou fritovací olej, na němž se kultivuje kmen bakterií Cupriavidus necator H16, který přetváří olej na PHA při současné produkci extracelulárních lipolytických enzymů, které se z kultivačního média alespoň částečně izolují v průběhu fermentačního procesu před ukončením produkce a izolace PHA, přičemž podstata vynálezu spočívá v tom, že před zahájením kultivace se do olejového substrátu přidají extracelulámí lipolytické enzymy vyprodukované Cupriavidus necator H16, čímž se urychlí růst bakteriální kultury.
Souběžná produkce PHA a extracelulárních lipolytických enzymů, při níž se před zahájením kultivace do olejového substrátu přidají extracelulámí lipolytické enzymy vyprodukované Cupriavidus necator H16, představuje novinku v produkci PHA, přičemž extracelulámí lipolytické enzymy jsou indukovány přítomností olejového substrátu a bakterie Cupriavidus necator H16 produkují účinnou molekulární formu schopnou efektivně zpřístupnit olejový substrát kutilizaci. Přitom je výhodné, že enzymy jsou extracelulámí produkt a PHA je intracelulámí produkt, což usnadňuje separaci obou produktů.
Vzhledem ktomu, že maximální produkce extracelulárních lipolytických enzymů předchází maximální produkci PHA o několik hodin, byl navržen nový technologický postup pro izolaci extracelulárních lipolytických enzymů v průběhu produkce PHA pomocí sterilní nebo nesterilní ultrafiltrace.
Optimální prostředí pro kultivaci se vytváří udržováním pH kultivačního média na hodnotě 7 nebo hodnotě blízké, přídavkem NaOH nebo H2SO4 a řízeným vzdušněním se koncentrace rozpuštěného kyslíku v průběhu fermentace udržuje v rozmezí hodnot 20 až 30 %.
Vzdušněním se reguluje růst kultury, produkce PHA a obsah 3- hydroxyvalerátu v kopolymerů.
Pro podporu růstu bakterií na olejovém substrátu se po izolaci extracelulárních lipolytických enzymů tyto enzymy přidávají alespoň částečně zpět do kultivačního média společně s doplňkovou dávkou oleje/olejového substrátu.
Přehled obrázků na výkresech
Na přiložených výkresech znázorňuje obr. 1 strukturu PHA, obr. 2 schéma biosyntézy PHB, obr. 3 schéma struktury PHB a P(HB-co-HV), obr. 4 schéma struktury PHA granule, obr. 5 mechanizmus lipázové aktivity, obr. 6 schéma mikrobiální degradace lipidů, obr. 7 srovnání indukce aktivity extracelulámí lipázy na různých typech uhlíkatého substrátu, obr. 8 výtěžek metabolitů v průběhu typického fermentačního procesu, obr. 9 charakterizaci průběhu centrifugace polymerního produktu metodou analytické centrifugace (4000 rpm, 2 hodiny, 5 °C), obr. 10 vliv přídavku lipázy na průběh kultivace Cupriavidus necator H16 při použití oleje jako zdroje uhlíku, obr. 11 Příklad GC-FID chromatogramu PHA, obr. 12 příklad GPC chromatogramu PHA, obr. 13 TGA analýza PHB, obr. 14 DSC analýza PHB, obr. 15 pH optimum extracelulámí lipázy, obr. 16 vliv iontové síly na aktivitu lipázy a obr. 17 záznam separace - barvení stříbrem.
-7CZ 304183 B6
Příklady provedení vynálezu
Produkční kmen
K souběžné produkci extracelulárních lipolytických enzymů a PHA byl používán kmen bakterie Cupriavidus necator H16; Czech Collection of Microorganisms (CCM 3726). Jedná se o sbírkový kmen povolený k produkci PHA určených pro styk s potravinami, u kmene nebyla provedena žádná genetická modifikace.
Kultivace bakterií na odpadním oleji
Odpadní substráty jsou využívány k produkci PHA v řadě patentů. Jeden z nejobecnějších postupů zpracování zřejmě většiny typů odpadů je uveden v patentu US 2009/0317879 Al, kde však jsou odpady vesměs zpracovány methanotrofními bakteriemi na nižší karboxylové kyseliny (propionová, octová) a na methan, čímž se odpad zpřístupní produkčnímu kmeni. V jiném patentu (US 2010/0190221 Al) jsou využívány dokonce substráty, které mohou být toxické pro mikroorganismy nebo životní prostředí. Pomocí enzymu methanmonooxygenázy jsou převáděny organické sloučeniny na utilizovatelné substráty.
Rovněž vlastní produkce PHA na odpadních olejích nejrůznějšího druhuje součástí řady různých patentů. Autoři využívali např. skládkový odpad obsahující olej (CN 101255277 (A) - 2008-0903), dále jedlý odpadní olej k produkci PHA pomocí vodíkových bakterií (JP 2004254668 (A) 2004-09-16), různé typy rostlinných olejů - uvedeno obecně (WO 2009/156950 A2 -jmenovitě slunečnicový, řepkový, konopný a další bez bližšího upřesnění; neuvádějí odpadní fritovací olej). Dalším možným substrátem je olej zBrassica carinata utilizovaný bakteriemi rodu Pseudomonas (WO 2010/0441180A1). Dále existuje několik publikací zabývajících se produkcí PHA z olejů a příbuzných substrátů [9-19], V žádném z dostupných zdrojů se nevyskytuje možnost využití odpadního fritovacího oleje předem hydrolyzovaného enzymem indukovaným v průběhu kultivace samotným produkčním kmenem.
Souběžná produkce dvou průmyslově významných metabolitů (PHA a extracelulárních lipolytických enzymů), z nichž jeden (extracelulámí lipolytický enzym) je indukován výhradním typem substrátu o konkrétním chemickém složení (rostlinný olej), přičemž tento substrát je s výhodou navíc odpadní a specifický (fritovací olej, který nemá další využití), je odbouratelný druhým z produktů (lipolytickými enzymy) a současně poskytuje nejvyšší výtěžky druhého z metabolitů (na oleji byly dosaženy u produkčního kmene absolutně nejvyšší výtěžky PHA - až 96 % biomasy) nebyla dosud v případě produkce PHA popsána v literatuře odborné ani patentové.
V některých patentech se vyskytuje popis produkce doprovodných produktů (př. WO 02/070659 A2), většinou se však jedná o alespoň částečně anaerobní proces zpracování substrátu (výjimečně olej, který však musí být utilizován aerobně) a jedná se většinou o malé molekuly - produkty typicky kvasných procesů (kyselina octová, propionová apod.), které mohou být dále nějakým způsobem využity. Jeden publikovaný patent popisuje simultánní produkci intracelulárních PHA a extracelulárních polysacharidů, avšak za využití geneticky modifikovaných kmenů (WO 95/33 838).
Aktivity extracelulárních lipolytických enzymů na různých typech uhlíkatého substrátu jsou uvedeny v Tabulce 2
-8CZ 304183 B6
| Relativní aktivita [%] | U/ml | U/mg | |
| Olej | 100.0 ± 1.1 | 34.37±0.37 | 72.23±0.77 |
| Fruktóza | 5.3±1.4 | 1.83±0.49 | 0.21 ±0.06 |
| NB | 38.7±7.1 | 13.29±2.46 | 0.26±0.05 |
| Glycerol | 38.1 ±4.1 | 13.11 ±1.40 | 10.15±1.09 |
| Propionát | 23.9±5.4 | 8.23±1.85 | 25.68±5.77 |
| Palmitát | 54.3+3.5 | 18.67±1.20 | 37.92±2.44 |
a srovnání indukce aktivity extracelulámích lipolytických enzymů na různých typech uhlíkatého substrátu je znázorněna na obr. 7.
Složení médií: inokulační; produkční; přídavek prekurzoru
Dosud nejběžnějším druhem PHA akumulovaným v bakteriích produkčních kmenů je homopolymer PHB. Vzhledem k nízké krystalinitě a flexibilitě byly postupně vyvíjeny procesy k produkci kopolymerů P(3HB-co-3HHx), kde byl produkován zejména kopolymer s kyselinou 3hydroxyvalerovou, obvykle s využitím transgenního kmene Ralstonia eulropha nebo transgenních kmenů s geny z některého druhu Pseudomonas sp. (japonské patenty Kokai 57-150393, 59220192). Nedávno byly přihlášeny patenty na produkci p(3HB-co-3-HHx) obsahující kyselinu 3-hydroxyhexanovou (patenty Kokai 5-93049, 7-93049) pomocí půdní bakterie Aeromonas cavie. Zavedením 3-HH bylo dosaženo vysoké flexibility polymeru. Rovněž byly přihlášeny práce zaměřené na produkci kopolymeru s 3-hydroxyalkanovými kyselinami se zavedenou methylovou skupinou, nejčastěji s využitím rekombinantních kmenů (př. US 2011/0081692 Al). Také byl prezentován patent na produkci PHA u vybraných druhů rodu Pseudomonas s řízeným složením kopolymeru regulovaným pomocí složení média (C-zdroj - mastné kyseliny) a přídavků vhodných prekurzorů (US 2011/0166318 Al), případně patent na přípravu blokových kopolymerů pomocí řízení enzymových aktivit a složení média (WO 0006762 Al).
Vzhledem k širokému použití a rovněž souladu složení kopolymeru 3-HB-HV s evropskou legislativou pro použití v potravinářství (tj. na potenciální aplikace) jsme se zaměřili na produkci kopolymeru 3-HB-HV s obsahem HV od 4 do 10 %.
Složení médií
Médium pro úchovu a inokulum I
Beef extrakt 10 g
Pepton 10 g
NaCl 5 g
Destilovaná voda 1000 ml
Médium pro další inokulační kroky a produkční médium:
Olej (odpadní, rostlinný) (NH4)2SO4
Na2PO4
KH2PO4
Micro element solution* Destilovaná voda
FeCI3
CaCal3
CuSO4
CoCI2
NiCl2
CrCl2
Destilovaná voda g
3g
11,1 g
1,02 g ml
1000 ml*Micro element solution
9.7 g
7.8 g
0,156 g
0,119 g
0,118g
0,062 g
1000 ml
-9CZ 304183 B6
Kultivace bakterií, produkce biomasy a její řízení
Bylo připraveno inokulum I o celkovém objemu 2000 ml (obvykle v Erlenmeyerových baňkách), pak zaočkovací inokulum II ve fermentoru o objemu 25 1 a po 23 h kultivace bylo inokulem zaočkováno 200 1 kultivačního média v produkčním tanku.
Kultivace v produkčním médiu probíhala po dobu 32 až 38 hodin. V 8. až 12. hodině bylo přidáno 10 g/1 prekurzoru (propionát sodný), 3 g/1 (NH4)2SO4 a 20 g/1 oleje (příkrm). V čase 8 až 21,5 h bylo obvykle dosaženo maximální aktivity extracelulárních lipolytických enzymů, část média (10 až 50%) byla tedy odčerpána, biomasa byla odseparována pomocí ultrafdtrace a následně (i) sterilně vrácena zpět do procesu nebo (ii) přidána do reaktoru nesterilně před izolací PHA. Permeát obsahující extracelulámí lipolytické enzymy byl dále zakoncentrován na ultrafiltraci (vylučovací limit molekulové hmotnosti, tzv. „cut-ofP‘ 10 kDa). V čase 20 až 25 h byla přidána další dávka oleje (20 g/1).
Výtěžky metabolitů v průběhu typického fermentačního procesu jsou znázorněny na Obr. 8 a popsány v Tabulce 3:
| Čas | Biomasa[g/I] | PHA [g/1] | PHA % | 3HV [%] | Lipáza[U/ml] |
| 8 | 6.23 ± 0.04 | 4.08 ± 0.04 | 65.45 ± 0.72 | 0.00 ± 17.20 | 17.20 ±2.70 |
| 14.5 | 11.52 ±0.09 | 8.89 ± 0.25 | 77.15 ±2.17 | 0.51 ± 18.68 | 18.68 ±0.91 |
| 21.5 | 16.14 ±0.49 | 10.85 ± 0.41 | 67.23 ± 2.54 | 1.32 ± 16.40 | 16.40 ± 1.27 |
| 24.5 | 37.65 ± 0.74 | 31.23 ± 0.20 | 82.95 ± 0.53 | 2.43 ± 5.22 | 5.22 ± 0.72 |
| 29.5 | 43.79 ±0.18 | 36.19 ± 1.89 | 82.65 ±4.31 | 4.01 ± 7.04 | 7.04 ± 1.82 |
| 32 | 53.90 ± 0.70 | 49.94 ± | 92.66 ±3.21 | 6.37 ± 9.27 | 9.27 ± 1.38 |
1.73
Výtěžnostní koeficient YPHa/s = θ·7 (do kalkulace byl zahrnut olej i prekurzor).
V průběhu kultivace bylo pH kultivačního média udržováno na hodnotě 7 přídavkem 1M NaOH nebo 0,5M H2SO4, vzdušnění bylo regulováno tak, aby hodnota koncentrace rozpuštěného kyslíku („dissolved oxygen“, DO) byla v průběhu fermentace 20 až 30 %.
Jednokroková ekologická izolace polymeru z buněk přímo v průmyslovém reaktoru bezprostředně po ukončení kultivace
Buňky se od média obvykle nejprve oddělují centrifugaci nebo filtrací. Poté musí být narušeny, aby došlo k uvolnění polymeru. Nejčastěji používanou metodou je extrakce polymeru pomocí vhodného rozpouštědla (chloroform, methylen chlorid propylen karbonát, dichlorethylen). Tento proces je však na spotřebu rozpouštědla velmi náročný, a to jej prodražuje. Jiná metoda využívá chlornanu sodného, ten ovšem způsobuje částečnou degradaci PHB a snižuje jeho molekulovou hmotnost. Byla publikována řada patentů využívajících snad všechny typy dostupných organických rozpouštědel - i těch, v nichž se PHA prokazatelně nerozpouští. Postupy izolace polymeru PHA pomocí organických rozpouštědel lze najít v řadě publikací i v patentech, př. RU 2199 587 C2, US 2002/0081646 A1 a další.
Byly ale rovněž popsány procesy (obvykle obecně), které mohou být použity při komerční produkci PHB a P(HB-co-HV) jako alternativa k extrakci rozpouštědly. Jednou z možností je lyofi- 10CZ 304183 B6 lizace (mrazové sušení; WO 2006103699 Al, WO 2010/082810 Al), dále byly popsány postupy používající směsi enzymů a detergentů bez bližšího upřesnění složení lytické směsi (př. WO2010116681 (Al) - 2010-10-14).
V předložené přihlášce nejsou buňky předem oddělovány, polymer je izolován přímo ve fermentačním reaktoru bezprostředně po ukončení kultivace (obvykle 32 až 38 hodin). Buňky v kultivačním médiu jsou nejprve vystaveny zahřátí, kdy se kultivační médium ohřeje na teplotu 80 °C (30 min) a po následném ochlazení na 60 °C je přidána směs obsahující proteolytícký enzym (tj. enzym hydrolyzující bílkoviny, např. alkalázu) a detergent (př. dodecylsulfát sodný) s optimalizovanou koncentrací (0,04 g SDS/1 g CDW; Alcojet - neutrální průmyslový detergent). Většina buněčných komponent je působením těchto dvou činidel hydrolyzována, zatímco polymer zůstane nedotčen. Poté se polymer oddělí frakční membránovou ultrafiltrací, promyje vodou a vysuší lyofilizací.
Centrifugace jakožto běžně používaná technika k oddělení buněk od média, případně polymeru od zbytku buněk se ukázala být obtížně použitelnou. Zejména centrifugace produktu je docela obtížná, protože zbytkový olej unáší relativně velkou část (cca 1/4 až 1/3) centrifugovaného vzorku k hladině, což představuje značnou ztrátu, jak vyplývá z Obr. 9, na němž je znázorněna charakterizace průběhu centrifugace polymerního produktu metodou analytické centrifugace (4000 rpm, 2 hodiny, 5 °C).
Proto byla v předložené přihlášce optimalizována frakční membránová ultrafiltrace za použití filtračních kazet s „cut-off“ vylučovacím limitem 200 až 400 kDa.
Finální produkt může být ještě promyt za účelem zvýšení čistoty. V následující tabulce (Tabulka 5) je uveden přehled možných purifikačních podmínek a jejich vliv na čistotu produktu PHA.
| Tabulka 5 | |
| H2O 25 °C | PHA % 92.39 ±6.15 |
| H2O 40 °C | 93.79 ±9.78 |
| H2O 60 °C | 101,64±0.86 |
| H2O 80 °C | 102.44±5.91 |
| OJMNaOH | 100.55±1.92 |
| 0,lM HCI | 91.73±1.42 |
| 3% H2O2 | 58.36±1.42 |
| 1% EtOH | 91.34±1.43 |
| kontrola | 91.72±2.49 |
Produkce, izolace a využití extracelulámích lipolytických enzymů
Pokud se bakterie kultivuje na oleji (a to výhradně na oleji), kterým může být rostlinný olej a/nebo jedlý olej a/nebo odpadní jedlý olej, s výhodou fritovací olej, produkuje extracelulámí lipolytické enzymy, které jí pomáhají olej rozkládat a využít. Extracelulámí lipolytické enzymy jsou průmyslově významné enzymy a v průběhu této kultivace jsou produkovány ve velkém, tedy průmyslově zajímavém množství. Proto navrhujeme celkové technologické řešení zahrnující společnou produkci PHA (intracelulární polymer; výtěžek 93 až 96 %) a lipázy (extracelulámí enzym; aktivita ca 100 U/ml). Při společné produkci je potřeba předřadit finální lýze buněk a izolaci PHA krok zahrnující izolaci extracelulámích lipolytických enzymů z kultivačního média.
Navrhli jsme efektivní technologické řešení izolace extracelulámích lipolytických enzymů v průběhu fermentačního procesu metodou frakcionované membránové filtrace. Maximální produkce extracelulámích lipolytických enzymů předchází maximální produkci PHA o několik hodin, v průběhu produkce PHA se tedy odčerpá, buď sterilně všechno kultivační médium, nebo nesterilně část kultivačního média i s buňkami (záleží na vybavení biotechnologické linky). A následně jsou techniky možné dva způsoby izolace extracelulárních lipolytických enzymů;
a) sterilní ultrafiltrace kultivačního média od buněk ve vhodném čase (obvykle po 24. h kultivace), doplnění nového kultivačního média se substrátem a prekurzorem k rostoucím buňkám. Prekurzor se přidává do kultivačního média společně s doplňkovou dávkou oleje (příkrm) a s extracelulárními lipolytickými enzymy.
b) nesterilní odčerpání části kultury (př. 1/3 buněk v kultivačním médiu), izolace buněk a následná purifikace extracelulárním lipolytických enzymů ultrafiltraci; poté návrat buněk s cca 70% obsahem polymeru zpět do reaktoru těsně před finální izolací PHA.
Extracelulámí lipolytické enzymy je dále možné využít v následující kultivaci jako faktor navyšující produkci biomasy a tím zrychlující celý proces. Pokud jsou do média obsahujícího olej přidány extracelulámí lipolytické enzymy izolované dle postupu popsaného výše v množství 0,5 až 3 U na ml kultivačního média (tj. cca 2%) a následně je médium inokulováno kulturou Cupriavidus necator, roste bakteriální kultura o cca 20 až 30 % více. Extracelulámí lipolytické enzymy produkované C. necator se pro tento účel jeví vhodnější než např. komerčně dodávaná lipáza produkovaná mikroorganismem Rhizopus oryzae. Vliv přídavku extracelulárních lipolytických enzymů na průběh kultivace Cupriavidus necator H16 při použití oleje jako zdroje uhlíku je znázorněn na Obr. 10.
Charakterizace polymeru PHA
Stanovení obsahu a struktury produkovaného PHA
Koncentrace a složení PHA se nejčastěji stanovuje metodou plynové chromatografie (GC) s detekcí F1D (plamenově ionizační detektor). Před vlastní analýzou je polymer podroben kyselé hydrolýze a následné methylaci za vzniku těkavých methylesterů 3-hydroxykyselin. Tyto estery jsou následně separovány a detekovány pomocí GC. Na Obr. 11 je uveden typický chromatogram polymeru složeného z 3-hydroxybutyrátu a 3-hydroxyvalerátu. Integrací píků a posléze metodou kalibrační křivky (Tab. 6) lze odečíst obsah každé ze složek a vyjádřit jejich poměr, tedy zastoupení 3-HV v kopolymeru PHB-HV.
Tabulka 6 Vztah mezi plochou píku a koncentrací 3HB (3HV)
| 3HB (mg-ml'1) | 3HB plocha (-) | 3HV (mg-ml'1) | 3HV plocha (-) |
| 2,0592 | 16133,8 | 0,2808 | 3076,1 |
| 4,1272 | 31629,3 | 0,5628 | 6159,2 |
| 6,1952 | 44894,3 | 0,8448 | 8801,3 |
| 8,2632 | 65493,6 | 1,1268 | 12837,5 |
| 10,296 | 77344,3 | 1,4040 | 15265,1 |
Stanovení molekulové hmotnosti produkovaného PHA
Molekulová hmotnost PHA je velmi důležitým parametrem zejména z hlediska aplikačního využití. Důležitá je její hodnota jak při zpracování PHA např. na bioplazmy, nanovlákna nebo částice, ale i při řadě farmaceutických aplikací, zejména v souvislosti s biodegradabilitou použitých materiálů. Proto je důležité charakterizovat produkovaný mikrobiální polymer co nejdetailněji, případně objektivizovat podmínky pro produkci polymeru o definované molekulové hmotnosti.
- 12CZ 304183 B6
Molekulová hmotnost produkovaného PHA polymeru byla stanovována metodou gelové permeační chromatografie (GPC). Příklad GPC chromatografu PHA je znázorněn na obr. 12. V průběhu řady testovacích experimentů bylo zjištěno, že pouhou modifikací kultivačních podmínek (např. nutriční stres) a volbou kultivačního média lze ovlivnit molekulovou hmotnost výsledného polymeru. Někteří autoři k tomuto účelu používali enzymové preparáty, chemické látky nebo radiaci (viz př. US 2006/0183205 Al).
V našem případě bylo dosaženo produkce polymeru s molekulovou hmotností v rozmezí 1,85 až 2,41 E+05, přičemž na sacharidovém substrátu bylo dosažené více než dvojnásobné hodnoty.
o
Molekulová hmotnost vybraných vzorků PHA je uvedena v tabulce 7
| Mn | Mw | D | |
| Biomer PHB (komerčně dostupný materiál) | 1.75-10 5 | 5.15-10 5 | 2.94 |
| Sigma P(HB-co-HV); 5 % HV (komerčně dostupný | 1.84-10 | 5.51-10 | 2.99 |
| materiál) | 5 | 5 | |
| Sigma P(HB-co-HV); 12 % HV (komerčně | 1.36-10 | 2.95-10 | 2.17 |
| dostupný materiál) | 5 | 5 | |
| PHB, kultivace C. necator H16, substrát fruktóza | 6.94-10 5 | 1.81-10 6 | 2.61 |
| PHB, kultivace C. necator H16, substrát olej | 3.84-10 5 | 1.15-10 6 | 3.00 |
| P(HB-co-HV), 6 % HV; kultivace C. necator H16, | 2.41-10 | 6.60-10 | 2.74 |
| substrát olej, prekurzor propionát sodný | 5 | 5 |
Tepelná stabilita
Tepelné vlastnosti PHA závisí na zastoupení jednotlivých monomerů (viz. tab. 1). Jednotlivé parametry jako teplota degradace materiálu, teplota tání atd. se rutinně stanovují pomocí TGA (termogravimetrická analýza), která je znázorněná na obr. 13, a DSC (diferenciální skenovací kalorimetrie), která je znázorněna na obr. 14.
Teplota tání a bodu degradace vybraných vzorků PHA je uvedena v Tabulce 8
| Teplota degradace [*€] | Teplota tání [Ό] | |
| Biomer PHB (komerčně dostupný materiál) | 264 | 168.52 |
| Sigma P(HB-co-HV); 5 % HV (komerčně dostupný | ||
| materiál) | 264 | 144,87 |
| Sigma P(HB-co-HV); 12 % HV (komerčně | ||
| dostupný materiál) | 278 | 146,36 |
| PHB, kultivace C. necator H16, substrát fruktóza | 281 | 172.36 |
| PHB, kultivace C. necator H16, substrát olej | 281 | 171.05 |
| P(HB-co-HV), 6 % HV; kultivace C. necator H16, | ||
| substrát olej, prekurzor propionát sodný | 256 | 166,40 |
Rozpustnost PHA
PHA není rozpustné v jednoznačně polárních nebo jednoznačně nepolárních rozpouštědlech. Schopnost polymer zčásti rozpustit nebo vytvořit gel mají rozpouštědla ze střední oblasti eluo30 tropní řady. Rozpustnost PHA ve vybraných organických rozpouštědlech ukazuje Tabulka 9:
| Rozpustnost Barva kapaliny | Hexan HX nr. slabě nažl. | Dichlormetha n DCM mr. slabě nažl. | Xylen XYL mr. + gel slabě nažl. | Toluen TOL gel slabě nažl. |
| Rozpustnost Barva kapaliny | Dioxan DOX mr. slabě nažl. | Chloroform CHL gel slabě nažl. | Dimethylsulfoxi d DMSO gel slabě nažl. | Butylacetát BuAc mr. + gel slabě nažl. |
| Rozpustnost Barva kapaliny | Ethylacetát EthAc nr. slabě nažl. | Aceton ACE nr. slabě nažl. | 2-propylalkohol 2PrOH nr. slabě nažl. | Ethanol EtOH nr. slabě nažl. |
| R - dobře rozpustný; | r - rozpustný; mr | - málo rozpustný; | nr- |
nerozpustný; gel- tvoří gel
Charakterizace extracelulárních lipolytických enzymů
K základním molekulárním charakteristikám patří pH optimum, jehož hodnoty jsou shrnuty v obr. 15 a uvedeny v Tabulce 10, která uvádí změny aktivity extracelulárních lipolytických enzymů při různém pH hodnocené v % ve srovnání s nejvyšší hodnotou 100 %.
| PH | Aktivita (%) |
| 3,0 | 7,42 ± 2,22 |
| 4,0 | 6,52 ±1,96 |
| 4,8 | 9,59 ±0,31 |
| 5,8 | 18,8 0± 1,13 |
| 6,6 | 27,49 ±1,48 |
| 7,0 | 37,21 ±2,36 |
| 7,4 | 76,60± 9,89 |
| 8,0 | 79,28 ± 5,69 |
| 8,3 | 54,6 ± 1,78 |
| 9,0 | 10,1 ±2,66 |
| 9,4 | 16,88 ±2,49 |
| 9,8 | 68,54 ±3,49 |
| 10,6 | 100 ± 17,47 |
| 11,0 | 60,23 ±8,70 |
| 11,5 | 2,05 ± 0,96 |
| 12,0 | 6,14 ±5,04 |
| 13,0 | 11,13 ± 6,93 |
Průběh pH optima vykazuje dvě maxima, což odpovídá dvěma molekulárním formám extracelulárních lipolytických enzymů. U mikroorganismů je podobný typ sekrece lipolytických enzymů obvyklý; vzhledem k hodnotě pH optima lze předpokládat, že obě formy štěpí acylglyceroly a jde zřejmě o enzymy s odlišnou preferencí esterové vazby v triacylglycerolech.
Vliv iontové síly (NaCl, 0 až 5 mol/1) na aktivitu extracelulárních lipolytických enzymů je uveden na Obr. 16. Z průběhu závislosti je patrné, že aktivita extracelulárních lipolytických enzymů klesá s rostoucí iontovou silou, což je významné z hlediska složení kultivačního média.
- 14CZ 304183 B6
Parciální purifikace extracelulárních lipolytických enzymů
Kultivační médium obsahuje po separaci buněk kromě extracelulárních lipolytických enzymů i řadu jiných proteinů a dalších látek. Navíc jsou všechny tyto látky včetně cílového enzymu značně zředěny. Za účelem zahuštění a bližší charakterizace extracelulárních proteinů byly provedeny některé následující experimenty zaměřené na ověření levné a efektivní izolace a současné purifikace enzymu.
Srážení acetonem vedlo ke značným ztrátám aktivity, výtěžek představoval cca 1 %. Při srážení síranem amonným v rozmezí koncentrací 60 až 80 % bylo nasycení úspěšnější, avšak následná dialýza vedla k prakticky kompletní ztrátě aktivity, výtěžky se pohybovaly kolem 3 %. Další metodou použitou na purifikací extracelulárních lipolytických enzymů byla frakcionovaná ultrafiltrace. V první fázi byly odstraněny buňky (na filtru s cut-off 1 mil. kDa) a dále byly izolovány extracelulámí lipolytické enzymy na ultrafiltru s „cut-off‘ vylučovacím limitem 10 kDa. Došlo k 8-násobnému zkoncentrování a výtěžku cca 91 U/ml kultury, viz Tabulka 11. Ultrafiltrace byla tedy navržena jako optimální součást technologie.
Tabulka 11
| Aktivita (U-ml'1) | Koncentrace proteinů (mg-ml·1) | Aktivita (U-mg'1) | objem (ml) | výtěžek (-) | |
| Supernatant | 29,92 ± 3,24 | 0,30± 0,01 | 99,74 ± 10,83 | 400 | 1,00 |
| Ultrafiltration | 90,68+ 1,47 | 0,44 + 0,01 | 206,11 ±3,36 | 50 | 0,38 |
Molekulová hmotnost extracelulárních proteinů a čistota preparátů extracelulárních lipolytických enzymů stanovená pomocí PAGE/SDS
Za účelem charakterizace proteinového složení a tedy i čistoty zahuštěného preparátu extracelulárních lipolytických enzymů byla využita metoda polyakrylamidové gelové elektroforézy (PAGE) v přítomnosti dodecylsulfátu sodného (SDS), kde se proteiny separují na základě pohyblivosti ve stejnosměrném elektrickém poli. Pohyblivost je dána poměrem hmotnosti a náboje částice. Poněvadž všechny proteiny mají za těchto podmínek stejný náboj i tvar, separace probíhá v podstatě na základě rozdílů molekulové hmotnosti. Záznam separace (barvení stříbrem) je na obr. 17. Legenda k obr. 17 je v následující Tabulce 12
| linie | Vzorek - purifikačni krok |
| 1 | Standard |
| 2 | Dialýza |
| 3 | Dialýza |
| 4 | Ultrafiltrace |
| 5 | Aceton- precipitace |
| 6 | (NH4)2SO4 precipitace 60% |
| 7 | (NH4)2SO4 precipitace 70% |
| 8 | (NH4)2SO4 precipitace 80% |
- 15 CZ 304183 B6 a Tabulce 113, která popisuje proteinové frakce elektroforézy
| Zóna | relativní molekulová hmotnost (Da-103) |
| Proteinová frakce 1 | 15,95 |
| Proteinová frakce 2 | 18,80 |
| Proteinová frakce 3 | 24,34 |
| Proteinová frakce 4 | 47,54 |
| Proteinová frakce 5 | 64,52 |
Extracelulámí frakce C. necator H16 obsahuje 5 hlavních proteinových frakcí o molekulové hmotnosti 15,95 kDa; 18,00 kDa; 24,34 kDa a 47,54 kDa a 64,52 kDa. Z nich první čtyři byly viditelné i po dialýze. Po aplikaci ultrafiltrace (membránový filtr s 10 kDa „cut-off‘ vylučovacím limitem) byly majoritními frakcemi proteiny s MR 18,80 kDa a 24,34 kDa, frakce 15,95 kDa byla viditelná pouze slabě. Současně bylo metodou PAGE/SDS potvrzeno, že preparát extracelulárních lipolytických enzymů získaný frakcionovanou ultrafiltrací je sice poměrně málo koncentrovaný, ale obsahuje minimum příměsí a lze jej použít k přímé aplikaci - buď jako přídavek do kultivačního média k průmyslové produkci PHA, k předzpracování olejového substrátu, nebo k jiným průmyslovým aplikacím.
Reference
1. Flickinger, Michael C.; Drew, Stephen W. Encyclopedia of Bioprocess Technology - Fermentation, Biocatalysis and Bioseparation, Volumes 15. John Wiley&Sons, 1999. 2024-2133 s. ISBN 1-59124-457-9.
2. Sudech K., Abe H., Doi Y, Synthesis, structure and properties of polyhydroxyalkanoates: biological polyesters, Progres in Polymeric Science, 2000, vol. 25. 1503-1555 p. ISSN 00796700.
3. Steinbuchel A, Valentin Η. E. Diversity of bacterial polyhydroxyalkanoic acids: minireview, FEMS Mikrobiology Letters, 1995, vol. 125. 219-228 p. ISSN 0378-1097.
4. Kessler B., Wilholt B. Factors involved in theregularoty network of Polyhydroxyalkanoate metabolism: review, Journal of Biotechnology, 2001, vol. 86, 97- 104p., ISSN 0168-1656.
5. Rehm, B.H.A.: Polyester synthases: natural catalystsforplastics. TheBiochemical Journal 2003, vol. 376, 15 -33 p., ISSN 0264-6021.
6. Rehm Β. H. A. Genetics and biochemistry of polyhydroxyalkanoates granule self-assembly: The key role of polyester synthese, Biotechnology Letters, 2006, vol. 28, 207—213 p. ISSN 1573-6776
7. Byrom D. Novel Biodegradable Microbial Polymers. Springer, 1990.113-117 p. ISBN 9780792309499.
8. Hrabak O. Industrial production of poly-P-hydroxybutyrate, FEMS Mikrobiology Reviews, 1992, vol. 103, 251-255 p. ISSN 0168-6445.
9. Taniguchi I., Kagotani K., Kimura Y. Microbial production of poly(hydroxyalkanoates)s from waste edible oils. Green Chemistry, 2003, vol. 545-548 p., ISSN 1463-9270.
10. Chán P.-L., Yu V., Wai L., Yu H.-F. Production of medium-chain-length polyhydroxy alkanoates by Pseudomonas aeruginosa with fatty acids and alternativě carbon sources. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2006, vol. 129, 933-941 p. ISSN 0273-2289.
l.Bhubalan K., Lee W.-H., Loo C.-Y., Yamamoto T., Tsuge T., Doi Y., Sudesh K. Controlled biosynthesis and characterization of poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate-co-3- 16CZ 304183 B6 hydroxyhexanoate) from mixtures of palm kemel oil and 3HV-precursors. Polymer Degradation and Stability, 2008, vol 93, 17—23 p. ISSN 0141-3910.
12. Kimura H., Takahashi T., Hiraka H., Iwana M., Takeishi M. Effective biosynthesis of poly(3hydroxybutyrate) from plant oils by Chromobacterium sp. Polymer Journal, 1999, vol. 31, 210-212 p. ISSN 0032-3896.
13. Fukui T., Doi Y. Efficient production of polyhydroxyalkanoates from plant oils by Alcaligenes eutrophus and its recombinant strain. Applied Microbiology and Biotechnology, 1998, vol. 49, 333-336 p. ISSN 1432-0614.
14. Kek Y-Κ., Chang C.-W., Amirul A.-A., Sudesh K. Heterologous expression of Cupriavidus sp. USMAA2-4 PHA synthase gene in PHB1 mutant for the production of poly(3-hydroxybutyrate) and its copolymers. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2010, online first, DOI 10.1007/sl 1274-010-0335-5.
15. Alias Z., Tan I. K. P. Isolation of palmoil- utilizin, polyhydroxyalkanoate (PHA)-producting bacteria by an enrichement technique. Bioresource Technology, 2005, vol. 96, 1229-1234 p. ISSN 0960-8524.
ló.Marsudi S., Unno H., Hoři K. Palm oil utilization for the simultaneous production of polyhydroxyalkanoates and rhamnolipids by Pseudomonas aeruginosa, Applied Microbiology and Biotechnology, 2008, vol. 78, 955-961 p. ISSN 1432-0614.
17.Akiyama M., Taima YDoi Y. Production of poly(3-hydroxyalkanoates) by bacterium of the genus Alcaligenes utilizin long-chain fatty acids. Applied Microbiology and Biotechnology, 1992, vol. 37, 698-701 p. ISSN 1432-0614.
18.0bruca S., Marova I., Snajdar O., Mravcova L., Svoboda Z. Productionofpoly(3hydroxybutyrate-co-3-hydroxyalerate) by Cupriavidus necator from waste rapeseed oil using propanol as a precursor of 3-hydroxyvalerate, Biotechnology, Letters, 2010, vol. 32, 1925— 1932 p. ISSN 0141-5492
19. Verlinden R. A. J., Hill DJ, Kenward MA, Williams CG, Piotrowska-Seget Z., Radecka IK Production o fpolyhydroxyalkanoates from waste frying oil by Cupriavidus necator. AMB· Express, 2011, vol. 1, DOE10.1186/2191-0855-1-11
20. Hasan F., Shah AA, Hameed A: Industrial applications of microbial lipases. Enzyme and Microbial Technology 2006, vol. 39, 35-251 p.
21. Joseph, B., Ramteke P. W., Thomas, G., Shrivastava, N.: Standard Rewiew Cold-active microbial Lipases: a versatile tool forindustrial applications. Biotechnology and Molecular Biology Rewiew, June 2007, vol. 2, pp. 39—48. ISSN 1538/2273.
22. Bornscheuer U.T.: Microbial carboxylesterases: classification, properties and application in biocatalysis; FEMS Microbiology Reviews 26 (2002) 73-81.
Claims (9)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob produkce polyhydroxyalkanoátů, PHA, u něhož se na olejovém substrátu obsahujícím rostlinný olej a/nebo jedlý olej a/nebo odpadní jedlý olej, s výhodou fritovací olej, kultivuje kmen bakterií Cupriavidus necator H16, který přetváří olej na PHA při současné produkci extracelulámích lipolytických enzymů, které se z kultivačního média alespoň částečně izolují v průběhu fermentačního procesu před ukončením produkce a izolace PHA, vyznačující se tím , že před zahájením kultivace se do olejového substrátu přidají extracelulámí lipolytické enzymy vyprodukované Cupriavidus necator H16, čímž se urychlí růst bakteriální kultury.- 17 CZ 304183 B6
- 2. Způsob produkce PHA podle nároku 1, vyznačující se tím, že extracelulární lipolytické enzymy se z kultivačního média izolují sterilní ultrafiltrací kultivačního média, při níž se oddělí buňky bakterií Cupriavidus necator H16 a vrátí se zpět do produkčního zařízení.
- 3. Způsob produkce PHA podle nároku 1, vyznačující se tím, že extracelulární lipolytické enzymy se z kultivačního média izolují nesterilním odčerpáním části fermentovaného kultivačního média, načež se z odčerpané části fermentovaného kultivačního média oddělí buňky bakterií, které se před izolací PHA vrátí do fermentovaného kultivačního média, a ze zbytku se izolují extracelulární lipolytické enzymy.
- 4. Způsob produkce PHA podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že po izolaci extracelulárních lipolytických enzymů se tyto do kultivačního média alespoň částečně vrací společně s doplňkovou dávkou olejového substrátu pro podporu růstu bakterií Cupriavidus necator H16.
- 5. Způsob produkce PHA podle libovolného z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že během kultivace se pH kultivačního média udržuje na hodnotě 7 přídavkem NaOH nebo H2SO4 a koncentrace rozpuštěného kyslíku se řízeným vzdušněním v průběhu fermentace udržuje v rozmezí hodnot 20 až 30 %.
- 6. Způsob produkce PHA podle libovolného z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že olejový substrát obsahuje přídavek látky ze skupiny propionát sodný, n-propanol, levulinová kyselina.
- 7. Způsob produkce PHA podle libovolného z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že po ukončení fermentace se obsah produkčního reaktoru zahřeje na teplotu 80 °C po dobu alespoň 30 minut, následně se zchladí na teplotu 60 °C a přidají se lytická činidla obsahující směs detergentu, například SDS, a proteolytického enzymu, čímž se získá surový homogenát, případně lyzát.
- 8. Způsob produkce PHA podle nároku 7, vyznačující se tím, že surový homogenát/lyzát se čistí frakcionovanou membránovou filtrací a promytím vodou o teplotě 20 až 60 °C, přičemž konečná výtěžnost PHA je až 96 % z původní biomasy buněk.
- 9. Způsob produkce PHA podle nároku 2 nebo 3, vyznačující se tím, že extracelulární lipolytické enzymy se zahustí ultrafiltrací, čímž se dosáhne jejich čistoty v intervalu 100 až 200 U/mg.
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20120571A CZ304183B6 (cs) | 2012-08-27 | 2012-08-27 | Zpusob produkce polyhydroxyalkanoátu (PHA) na olejovém substrátu |
| CN201380056284.XA CN104755623A (zh) | 2012-08-27 | 2013-08-23 | 自油底物制备聚羟基脂肪酸酯(pha)的方法 |
| PCT/CZ2013/000100 WO2014032633A1 (en) | 2012-08-27 | 2013-08-23 | Method of producing polyhydroxyalkanoates (pha) from oil substrate |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20120571A CZ304183B6 (cs) | 2012-08-27 | 2012-08-27 | Zpusob produkce polyhydroxyalkanoátu (PHA) na olejovém substrátu |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2012571A3 CZ2012571A3 (cs) | 2013-12-11 |
| CZ304183B6 true CZ304183B6 (cs) | 2013-12-11 |
Family
ID=49304630
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20120571A CZ304183B6 (cs) | 2012-08-27 | 2012-08-27 | Zpusob produkce polyhydroxyalkanoátu (PHA) na olejovém substrátu |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104755623A (cs) |
| CZ (1) | CZ304183B6 (cs) |
| WO (1) | WO2014032633A1 (cs) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2017076374A1 (en) | 2015-11-06 | 2017-05-11 | Vysoké Učení Technické V Brně | Polymer-made fibre preparation method |
| EP3560479A1 (en) | 2018-04-24 | 2019-10-30 | NAFIGATE Corporation, a.s. | A uv filter based on polyhydroxybutyrate and a method of its preparation |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3224367B1 (en) | 2014-11-25 | 2020-07-22 | Bioextrax AB | Process for extraction of bioplastic and production of monomers from the bioplastic |
| CN104830919A (zh) * | 2015-04-24 | 2015-08-12 | 任连海 | 利用高效菌将餐厨废油合成pha的工艺方法 |
| CN105481215B (zh) * | 2015-10-15 | 2018-05-18 | 北京理工大学 | 一种利用微生物回收含油危险废物中原油的方法 |
| CN106190907B (zh) * | 2016-07-19 | 2019-10-25 | 中南大学 | 一种利用木质素降解菌合成生物塑料前体聚羟基脂肪酸酯的方法 |
| JP7196848B2 (ja) | 2017-08-29 | 2022-12-27 | 三菱瓦斯化学株式会社 | ポリエステルの製造方法 |
| RU2687135C1 (ru) * | 2018-10-02 | 2019-05-07 | Общество с ограниченной ответственностью "ГИПРОБИОСИНТЕЗ" | Штамм гетеротрофных бактерий Cupriavidus gilardii - ассоциант для получения микробной белковой массы |
| CN119899880A (zh) * | 2019-12-23 | 2025-04-29 | 希欧生物清洁有限公司 | 新型生物塑料 |
| CN115151628A (zh) * | 2020-02-28 | 2022-10-04 | 株式会社钟化 | 长链脂肪酸的制造方法及其利用 |
| JP7596532B2 (ja) | 2022-04-06 | 2024-12-09 | シェンチェン ブルーファ バイオサイエンシズ カンパニー リミテッド | アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種を発現する遺伝子操作された微生物及びＰＨＡ生産量の向上方法 |
| CN115261346B (zh) * | 2022-04-06 | 2023-04-07 | 深圳蓝晶生物科技有限公司 | 表达乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的工程化微生物及提高pha产量的方法 |
| KR20240177806A (ko) * | 2023-06-19 | 2024-12-30 | 씨제이제일제당 (주) | 신규한 아세토아세틸-CoA 리덕타아제 변이체 및 이의 용도 |
| CN117343970B (zh) * | 2023-10-24 | 2025-01-21 | 杭州佳嘉乐生物技术有限公司 | 一种提升植物油脂亲肤感的油脂发酵方法 |
Family Cites Families (27)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3168826D1 (en) | 1980-11-18 | 1985-03-21 | Ici Plc | Polymer blends |
| GB8301344D0 (en) | 1983-01-18 | 1983-02-16 | Ici Plc | Poly(beta-hydroxybutyric acid) |
| DE4420223C1 (de) | 1994-06-06 | 1995-05-04 | Inst Genbiologische Forschung | Verfahren zur Kombination der intrazellulären Polyhydroxyalkanoat-Synthese in Mikroorganismen mit einer extrazellulären Polysaccharid-Synthese |
| RU2199587C2 (ru) | 1995-08-21 | 2003-02-27 | Дзе Проктер Энд Гэмбл Компани | Способ выделения полигидроксиалканоата из биомассы и полигидроксиалканоат, полученный данным способом |
| WO2000006762A1 (en) | 1998-07-30 | 2000-02-10 | Metabolix, Inc. | Production of block copolymers of polyhydroxyalkanoates in biological systems |
| EP1182259A1 (en) | 2000-08-17 | 2002-02-27 | BASF Plant Science GmbH | Pyruvate:NADP+ oxidoreductase and uses thereof |
| JP3768799B2 (ja) | 2000-10-30 | 2006-04-19 | キヤノン株式会社 | 置換脂肪酸エステル化物を原料とするポリヒドロキシアルカノエートの製造方法 |
| JP4024676B2 (ja) | 2000-11-17 | 2007-12-19 | メタボリックス，インコーポレイテッド | 脂肪酸生合成経路からの中間鎖長のポリヒドロキシアルカノエートの産生 |
| US20030004299A1 (en) | 2001-03-02 | 2003-01-02 | Regents Of The University Of Minnesota | Production of polyhydroxyalkanoates |
| KR100447535B1 (ko) | 2002-02-26 | 2004-09-08 | 한국과학기술원 | Ｐ(3ＨＢ-ｃｏ-3ＨＡ)를 생산하는 재조합 박테리아 시스템 |
| KR100447531B1 (ko) | 2002-02-26 | 2004-09-08 | 한국과학기술원 | Ｍｃｌ-ｐｈａ를 생산하는 재조합 박테리아 시스템 |
| WO2004067756A1 (en) | 2003-01-29 | 2004-08-12 | Biomatera Inc. | Method for controlling molecular weight and distribution of biopolymers |
| JP2004254668A (ja) | 2003-02-28 | 2004-09-16 | Tenmates:Kk | Ｐｈａの製造方法 |
| US7579176B2 (en) | 2003-10-15 | 2009-08-25 | Newlight Technologies, Llc | Method for the production of polyhydroxyalkanoic acid |
| WO2006103699A1 (en) | 2005-03-31 | 2006-10-05 | Council Of Scientific & Industrial Research | A process for the extraction of polyhydroxyalkanoates from bacteria |
| KR20070097884A (ko) | 2006-03-30 | 2007-10-05 | 주식회사 엘지화학 | 바실러스 시리우스 유래 β―케토티올라제를 코딩하는ＢＣ５３４４ 유전자를 이용한 ＰＨＡ의 제조방법 |
| KR20070097883A (ko) | 2006-03-30 | 2007-10-05 | 주식회사 엘지화학 | 바실러스 시리우스 유래 β―케토티올라제를 코딩하는ＢＣ４０２３ 유전자를 이용한 ＰＨＡ의 제조방법 |
| CN101255227A (zh) | 2008-04-14 | 2008-09-03 | 邵胜学 | 利用含油污泥合成聚羟基烷酸酯的方法 |
| JP5396639B2 (ja) | 2008-06-05 | 2014-01-22 | 国立大学法人東京工業大学 | ポリヒドロキシアルカン酸共重合体及びその製造法 |
| MX2008008292A (es) | 2008-06-23 | 2009-12-23 | Ct Investig Y Estudios Del Ipn | Metodos para la produccion de polihidroxialcanoatos (pha) de cadena media usando aceite vegetal como fuente de carbono. |
| US8030021B2 (en) | 2008-06-24 | 2011-10-04 | The Board Of Trustees Of The Leland Standford Junior University | Use of selection pressures to enable microbial biosynthesis of polyhydroxyalkanoates from anaerobic degradation products |
| IT1392236B1 (it) | 2008-10-13 | 2012-02-22 | Ballistreri | Produzione di plastica biodegradabile da olio di brassica carinata ad alto contenuto di acido erucico e da acidi grassi a catena molto lunga |
| MY155003A (en) | 2009-01-13 | 2015-08-28 | Plainexus Res Lab Sdn Bhd | A method for producing biodegradable resins |
| JP2012115145A (ja) | 2009-03-30 | 2012-06-21 | Kaneka Corp | ポリヒドロキシアルカノエートの回収方法 |
| US20120165500A1 (en) * | 2009-08-27 | 2012-06-28 | Newlight Technologies, Llc | Process for the production of polyhydroxyalkanoates |
| US8273852B2 (en) | 2009-12-07 | 2012-09-25 | Queen's University At Kingston | Medium chain length polyhydroxyalkanoate polymer and method of making same |
| EP2646563A1 (en) * | 2010-11-29 | 2013-10-09 | Micromidas, Inc. | Pha-producing bacteria |
-
2012
- 2012-08-27 CZ CZ20120571A patent/CZ304183B6/cs unknown
-
2013
- 2013-08-23 CN CN201380056284.XA patent/CN104755623A/zh active Pending
- 2013-08-23 WO PCT/CZ2013/000100 patent/WO2014032633A1/en active Application Filing
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| Kahar P. et al. High yield production of polyhydroxyalkanoates from soybean oil by Ralstonia eutropha and its recombinant strain. Polym. Degrad. Stab., 2004, 83, 79-86. * |
| Lu J et al. Characterization of an extracellular lipase and its chaperone from Ralstonia eutropha H16. Appl. Microbiol. Biotechnol., publikovano online v kvetnu 2012. * |
| Obruca S. et al. Production of poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) by Cupriavidus necator from waste rapeseed oil using propanol as a precursor of 3-hydroxyvalerate. Biotechnol. Lett., 2010, 32, 1925-32. * |
| Verlinden RA et al. Production of polyhydroxyalkanoates from waste frying oil by Cupriavidus necator. AMB Express, 2011, 1:11. * |
| Yasotha K et al. Recovery of medium-chain-length polyhydroxyalkanoates (PHAs) through enzymatic digestion treatments and ultrafiltration. Biochem. Eng. J., 2006, 30, 260-8. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2017076374A1 (en) | 2015-11-06 | 2017-05-11 | Vysoké Učení Technické V Brně | Polymer-made fibre preparation method |
| EP3560479A1 (en) | 2018-04-24 | 2019-10-30 | NAFIGATE Corporation, a.s. | A uv filter based on polyhydroxybutyrate and a method of its preparation |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2014032633A1 (en) | 2014-03-06 |
| CN104755623A (zh) | 2015-07-01 |
| CZ2012571A3 (cs) | 2013-12-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ304183B6 (cs) | Zpusob produkce polyhydroxyalkanoátu (PHA) na olejovém substrátu | |
| Surendran et al. | Can polyhydroxyalkanoates be produced efficiently from waste plant and animal oils? | |
| Van Thuoc et al. | Utilization of waste fish oil and glycerol as carbon sources for polyhydroxyalkanoate production by Salinivibrio sp. M318 | |
| Sindhu et al. | Microbial poly-3-hydroxybutyrate and related copolymers | |
| Madison et al. | Metabolic engineering of poly (3-hydroxyalkanoates): from DNA to plastic | |
| Muhammadi et al. | Bacterial polyhydroxyalkanoates-eco-friendly next generation plastic: production, biocompatibility, biodegradation, physical properties and applications | |
| Madkour et al. | PHA recovery from biomass | |
| US8956835B2 (en) | Methods for producing polyhydroxyalkanoates from biodiesel-glycerol | |
| Thakor et al. | Biosynthesis of medium chain length poly (3-hydroxyalkanoates)(mcl-PHAs) by Comamonas testosteroni during cultivation on vegetable oils | |
| Prieto et al. | Synthesis and degradation of polyhydroxyalkanoates | |
| Sudesh | Polyhydroxyalkanoates from palm oil: biodegradable plastics | |
| Koller et al. | Polyhydroxyalkanoates: basics, production and applications of microbial biopolyesters | |
| Chung et al. | Production of medium-chain-length 3-hydroxyalkanoic acids by β-oxidation and phaC operon deleted Pseudomonas entomophila harboring thioesterase gene | |
| FR2988733A1 (fr) | Microorganisme recombinant | |
| Ingram et al. | Anabolism of poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) by Cupriavidus necator DSM 545 from spent coffee grounds oil | |
| JP6313708B2 (ja) | 高分子量ｐｈａ生産微生物とそれを用いた高分子量ｐｈａの製造方法 | |
| Chen et al. | White biotechnology for biopolymers: hydroxyalkanoates and polyhydroxyalkanoates: production and applications | |
| Singh et al. | Microbially originated polyhydroxyalkanoate (PHA) biopolymers: an insight into the molecular mechanism and biogenesis of PHA granules | |
| Ch’ng et al. | Biosynthesis and lipase-catalysed hydrolysis of 4-hydroxybutyrate-containing polyhydroxyalkanoates from Delftia acidovorans | |
| Yee et al. | Polyhydroxyalkanoate synthesis by recombinant Escherichia coli JM109 expressing PHA biosynthesis genes from Comamonas sp. EB172 | |
| ES2932307T3 (es) | Sistemas para el cocultivo de cepas de ralstonia eutropha | |
| Mothes et al. | Synthesis of poly (3‐hydroxybutyrate‐co‐4‐hydrobutyrate) with a target mole fraction of 4‐Hydroxybutyric acid units by two‐stage continuous cultivation of Delftia acidovorans P4a | |
| Bhattacharyya et al. | Polyhydroxyalkanoates: resources, demands and sustainability | |
| Mumtaz et al. | Fed-batch production of P (3HB-co-3HV) copolymer by Comamonas sp EB 172 using mixed organic acids under dual nutrient limitation | |
| Braunegg et al. | Production of plastics from waste derived from agrofood industry |