KR20070097884A

KR20070097884A - 바실러스 시리우스 유래 β―케토티올라제를 코딩하는ＢＣ５３４４ 유전자를 이용한 ＰＨＡ의 제조방법

Info

Publication number: KR20070097884A
Application number: KR1020060028729A
Authority: KR
Inventors: 박시재; 김태완
Original assignee: 주식회사 엘지화학
Priority date: 2006-03-30
Filing date: 2006-03-30
Publication date: 2007-10-05

Abstract

본 발명은 바실러스 시리우스(Bacillus cereus) 유래 β-케토티올라제(β-ketothiolase)를 코딩하는 BC5344 유전자를 이용한 PHA의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는, PHA 합성 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환되거나 PHA 합성 유전자가 염색체 상에 삽입되어 있고, 동시에 β-케토티올라제를 코딩하는 유전자(BC5344)를 함유하는 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 배양한 다음, 상기 배양된 미생물로부터 짧은 사슬 길이(short-chain-length)의 PHA를 회수하는 것을 특징으로 하는 PHA의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, PHA 합성 경로에서 중간체를 생성하는 바실러스 시리우스(Bacillus cereus) 유래의 BC5344 유전자를 phaB 및 phaC 유전자 또는 이들과 같은 기능을 수행하는 다른 박테리아 유래의 유전자들과 함께 도입한 미생물을 이용하여 생분해성 고분자인 PHA 및 P(3HB-co-3HV) 공중합체를 수득할 수 있다.

폴리히드록시알카노에이트(PHA), β-케토티올라제(β-ketothiolase), P(3HB-co-3HV) 공중합체

Description

바실러스 시리우스 유래 β―케토티올라제를 코딩하는 ＢＣ５３４４ 유전자를 이용한 ＰＨＡ의 제조방법{Method for Preparing PHA Using BC5344 Encoding β-ketothiolase Derived from Bacillus cereus}

도 1은 Bacillus cereus 로부터 분리된 BC5344 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드 p10499BC5344의 유전자 지도를 나타낸 것이다.

도 2는 Ralstonia eutropha H16으로부터 분리된 PHA 합성 유전자 phaC 유전자와 phaB 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드 pMCSTacReCB의 유전자 지도를 나타낸 것이다.

발명의 분야

본 발명은 바실러스 시리우스(Bacillus cereus) 유래 β-케토티올라제(β-ketothiolase)를 코딩하는 BC5344 유전자를 이용한 PHA의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는, PHA 합성 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환되거나 PHA 합성 유전자가 염색체 상에 삽입되어 있고, 동시에 서열번호 3의 염기 서열을 가지는 β-ketothiolase를 코딩하는 BC5344 유전자를 함유하는 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 배양한 다음, 상기 배양된 미생물로부터 짧은 사슬 길이(short-chain-length)의 PHA를 회수하는 것을 특징으로 하는 PHA의 제조방법에 관한 것이다.

발명의 배경

PHA(polyhydroxyalkanoate)는 과도한 탄소원이 존재하면서 인, 질소, 마그네슘, 산소 등의 다른 영양분이 부족할 때, 미생물이 에너지나 탄소원 저장물질로 그 내부에 축적하는 폴리에스터(polyester)이다. PHA는 기존의 석유로부터 유래된 합성고분자와 비슷한 물성을 가지면서 완전한 생분해성을 보이기 때문에 기존의 합성 플라스틱을 대체할 물질로 인식되고 있다. 기존에 알려진 PHA는 대표적으로 짧은 탄소수를 가진 SCL-PHA(short-chain-length PHA)와 긴 탄소수를 가진 MCL-PHA(medium-chain-length PHA)로 나눌 수 있다. 짧은 탄소수를 가진 PHA의 대표적인 물질로는 폴리하이드록시부티레이트(P(3HB))가 있으며, 이를 합성하는 유전자는 랄스토니아 유트로파 (Ralstonia eutropha)와 알칼리게네스 라투스 (Alcaligenes latus)로부터 클로닝되어 있어, 이를 함유하고 있는 재조합 대장균이 포도당으로부터 P(3HB)를 합성할 수 있다고 보고된 바 있다. 이와 같이, PHA를 축적할 수 있는 많은 미생물이 지금까지 발견되었고, PHA의 합성에 관련된 유전자가 클로닝되어 그 특징이 연구되어 왔다.

상기 P(3HB)는 PHA의 대표적인 멤버 중의 하나로 그 생합성 경로는 이미 많 이 연구되어 왔다. acetyl-CoA로부터 acetoacetyl-CoA와 3-hydroxybutyryl-CoA (3HB-CoA)이 순차적으로 생성되고,　3-HB-CoA가 PHA synthase에 의해 중합되어 P(3HB)가 합성된다. 이 경로에서 acetoacetyl-CoA를 합성하는데 관여하는 효소가 β-ketothiolase (PhaA)이고, acetoacetyl-CoA를 3HB-CoA로 환원하는 효소가 NADPH acetoacetyl-CoA reductase (PhaB)이다. 이 두 가지 효소는 PHA synthase와 함께 P(3HB)합성에 매우 중요한 역할을 하고 있다. 또한, P(3HB)의 효율적인 합성을 위해서는 각각의 중간체를 만드는 효소들의 활성이 매우 중요하기 때문에 다양한 미생물로부터 이들 효소들이 클로닝 되어왔다.

PHA 합성에 관한 종래 기술로써, 미국공개특허 제6835820호는 poly(3-hydroxyalkanoate) 생합성에 관한 것으로, Bacillus megateriumis에서 유래한 것을 이용한 polyhydroxyalkanoate(PHA)의 생합성에 관하여 개시하고 있다.

또한, 대한민국등록특허 제0321631호 역시 poly(3-hydroxyalkanoate) 생합성에 관한 것이나, 알칼리게네스 레이터스 (Alcaligenes latus)에서 유래한 것을 이용한 PHA의 생합성에 관하여 개시하고 있고, 대한민국 등록특허 제447535호는 P(3HB-co-3HA)를 생산하는 재조합 박테리아 시스템에 관한 것으로, 지방산 분해대사 경로 중 일부가 제거되고 PHA 합성관련 유전자들을 발현하는 발현벡터, 상기 발현벡터에 의하여 형질전환된 형질전환체 및 이를 이용하여 3HB를 높은 비율로 함유하는 P(3HB-co-3HA)를 생산하는 방법이 개시되어 있다. 또한, 상기 발현벡터는 PHA 합성유전자(phaC), β-케토티올라제(β-ketothiolase) 합성유전자(phaA) 및 NADPH 의존적 아세토아세틸-CoA 환원효소(NADPH dependent acetoacetyl-CoA reductase) 합성유전자(phaB)를 포함한다.

또한, 대한민국 등록특허 제0447531호는 MCL-PHA를 생산하는 재조합 박테리아 시스템에 관한 것으로, 지방산 분해대사경로 중 일부가 제거되고 PHA 합성관련 유전자들을 발현하는 발현벡터, 상기 발현벡터에 의하여 형질전환된 형질전환체 및 이를 이용하여 MCL-PHA를 생산하는 방법에 관하여 개시되어 있다. 또한, 본 발명의 MCL-PHA를 생산할 수 있는 재조합 발현벡터는 PHA 합성유전자(phaC)와, fadF 유전자 및/또는 fadD유전자를 포함하고 있다.

그 외에도 PHA 제조방법에 관한 2건의 국내 등록특허(대한민국등록특허 제0447532호 및 대한민국공개특허 제2005-0114098호)가 존재하나, Bacillus cereus에서 유래한 β-ketothiolase를 코딩하는 유전자 BC5344에 관하여 개시된 바는 없었다.

이와 같이, 생분해성 고분자 물질인 poly(3-hydroxyalkanoates)를 제조하는 방법에 대한 종래 기술은 다수 존재하고, 그 중 하나인 poly(3-hydroxybutyrate)의 생합성 경로에 관한 연구 또한 많이 진행되었지만, poly(3-hydroxybutyrate)의 효율적인 합성을 위해서는 중간체를 만드는 효소의 활성이 매우 중요함에도 불구하고, 다양한 미생물로부터 각각의 중간체를 만드는 효소들에 대한 연구가 그 동안 미흡하였다.

이에 본 발명자들은 효율적으로 acetoacetyl-CoA를 합성하는 β-케토티올라제를 찾고 이를 이용한 P(3HB) 생산방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, Bacillus cereus 유래 β-케토티올라제를 코딩하는 유전자(BC5344)를 이용하여 poly(3- hydroxyalkanoates)를 제조할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 PHA 합성 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환되고, 동시에 β-케토티올라제를 코딩하는 Bacillus cereus 유래 유전자(BC5344)를 함유하는 재조합 벡터로 형질전환된 미생물, 상기 미생물을 이용한 PHA 및 P(3HB-co-3HV) 공중합체의 제조방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 PHA 합성 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환되거나 PHA 합성 유전자가 염색체 상에 삽입되어 있고, 동시에 서열번호 3의 염기서열을 가지는 β-케토티올라제(β-ketothiolase)를 코딩하는 Bacillus cereus 유래 유전자(BC5344)를 함유하는 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 PHA 합성 유전자는 탄소수 3~5의 짧은 사슬 길이의 poly(3-hydroxyalkanoates)를 합성할 수 있는 phaC 및 phaB 유전자인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 phaC 유전자 및 phaB 유전자는 Ralstonia eutropha 유래인 것을 특징으로 하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 본 발명에 있어서, 벡터(vector)는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다.　벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다.　적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.　플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명에서 "플라스미드 (plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다.　그러나, 본 발명은 당업계에 알려진 또는 알려지게 되는 바와 동등한 기능을 갖는 벡터의 다른 형태도 포함한다.　　

"발현 조절 서열(expression control sequence)"이라는 표현은 특정한 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필수적인 DNA 서열을 의미한다.　그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.　예를 들면, 원핵생물에 적합한 조절 서열은 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 부위를 포함한다.　진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 시그날 및 인핸서가 이에 포함된다.　플라스미드에서 유전자의 발현 양에 가장 영향을 미치는 인자는 프로모터이다.　고 발현용의 프로모터로서 SRα 프로모터와 사이토메가로바이러스 (cytomegalovirus) 유래 프로모터 등이 바람직하게 사용된다.

본 발명의 DNA 서열을 발현시키기 위하여, 매우 다양한 발현 조절 서열 중 어느 것이라도 벡터에 사용될 수 있다.　유용한 발현 조절서열의 예로는, SV40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T3 및 T7 프로모터들, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코드 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜분해 효소에 대한 프로모터, 상기 포스파타제의 프로모터들, 예를 들어 Pho5, 효모 알파-교배 시스템의 프로모터 및 원핵세포 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 구성과 유도의 기타 다른 서열 및 이들의 여러 조합이 포함된다.　

핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결 (operably linked)"된다.　이것은 적절한 분자 (예를 들면, 전사 활성화 단백질)는 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다.　예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다.　일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는것을 의미한다.　그러나, 인핸서(enhancer)는 접촉할 필요가 없다.　이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다.　그러한 부위가 존 재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 (oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.

본 발명에서, "발현 벡터"는 통상 이종의 DNA의 단편이 삽입된 재조합 캐리어 (recombinant carrier)로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다.　여기서, 이종 DNA는 숙주 세포에서 천연적으로 발견되지 않는 DNA인 이형 DNA를 의미한다.　발현 벡터는 일단 숙주 세포내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며 벡터의 수 개의 카피 및 그의 삽입된 (이종) DNA가 생성될 수 있다.

당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질감염 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가, 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다.　바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함되게 된다.　발현 숙주가 진핵세포인 경우에는, 발현 벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.

본 발명에 있어서, 재조합 벡터로는 플라스미드 벡터, 박테리오파지 벡터, 코스미드 벡터 및 YAC(Yeast Artificial Chromosome) 벡터를 포함한 다양한 벡터들이 도입될 수 있다.　본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는게 바람직하다.　상기 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생 제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다.　적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.

본 발명에 따른 재조합 벡터는 적절한 숙주세포로 통상의 방법으로 형질전환할 수 있다. 숙주세포로는 박테리아, 효모 및 곰팡이 등이 가능하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 선호되는 숙주세포는 원핵세포로, 대장균이 바람직하다.　적합한 원핵 숙주세포의 예로, E. coli균주 DH5a, E. coli균주 JM101, E. coli K12균주 294, E. coli균주 W3110, E. coli균주 X1776, E. coli XL-1Blue(Stratagene) 및 E. coli B 등을 포함한다.　그러나 FMB101, NM522, NM538 및 NM539와 같은 E. coli균주 및 다른 원핵생물의 종(speices) 및 속(genera)등이 또한 사용될 수 있다.　상기한 E. coli에 덧붙여, 아그로박테리움 A4와 같은 아그로박테리움 속 균주, 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실리(bacilli), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium) 또는 세라티아 마르게센스(Serratia marcescens)와 같은 다른 장내세균 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 속 균주가 숙주세포로서 이용될 수 있으며, 상기 예시에 제한되는 것은 아니다.　　

또한, 원핵세포의 형질전환은 Sambrook et al., supra의 1.82 섹션에 기술된 칼슘 클로라이드 방법을 사용해서 용이하게 달성될 수 있다.　선택적으로, 전기천공법(electroporation)(Neumann et al ., EMBO J., 1: 841(1982))이 또한 이러한 세포 들을 형질전환하는데 사용될 수 있다.　

본 발명은 또한, 상기 형질전환된 미생물을 배양한 다음, 상기 배양된 미생물의 짧은 사슬 길이(short-chain-length) PHA를 회수하는 것을 특징으로 하는 짧은 사슬 길이(short-chain-length) PHA의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 짧은 사슬 길이의 탄소수는 3~5이고, 상기 짧은 사슬 길이의 PHA는 poly(3-hydroxybutyrate)인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 형질전환된 미생물을 홀수개의 탄소수를 갖는 유기산 또는 지방산을 함유하는 배지에 배양한 다음, 상기 배양된 미생물로부터 poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate)[P(3HB-co-3HV)] 공중합체를 회수하는 것을 특징으로 하는 P(3HB-co-3HV) 공중합체의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 홀수개의 탄소수를 갖는 유기산은 프로피온산(propionic acid)이고, 지방산은 발레르산(valeric acid)인 것을 특징으로 할 수 있다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.

β-케토티올라제를 코딩하는 유전자 BC5344를 클로닝하기위해, Bacillus cereus ATCC 14579　게놈시퀀스 (NC_004722)에 기초하여 합성된 올리고뉴클레오티드 프라이머(서열번호 1 및 2)를 사용하여, PCR으로 BC5344 유전자를 증폭시켰다. 이에 따른, BC5344 유전자의 염기서열과 이로부터 유추되는 아미노산 서열은 각각 서열번호 3 및 4와 같다. 또한, BC5344 유전자는 Ralstonia eutropha의 phaA 유전자 와 높은 유사성을 보이기 때문에 phaA로 명명하였다.

한편, 대한민국등록특허 제10-0447531호 "MCL-PHA를 생산하는 재조합 박테리아 시스템"에 개시된 방법과 동일한 방법으로 제작한 p10499A 발현 벡터에 상기 증폭된 phaA 유전자를 EcoRI/XbaI로 절단해 삽입함으로써, 도 1에 나타난 바와 같이 p10499BC5344을 제조하였다. 또한, P(3HB) 합성경로를 구성하는 PhaC와 PhaB는 Ralstonia eutropha H16으로부터 PCR을 통해 얻었고, pTac99A 발현벡터에 phaC는 EcoRI/XbaI에 phaB는 XbaI/HindIII로 삽입해 인공적인 phaCB operon을 제작하여 발현하게 하였다 (pTac99ReCB).

pTac99ReCB를 SspI으로 절단해 tac promoter와 phaCB operon과 transcription terminator가 있는 유전자절편을 EcoRV로 절단한 pBBR1MCS 벡터에 삽입하여, 도 2에 나타난 바와 같이, pMCSTacReCB를 제작한 후, 이를 이용하여 형질전환된 미생물을 제작하였다. 또한, 상기 형질전환된 미생물을 각각 배양하여, 수득된 P(3HB) 및 P(3HB-co-3HV) 공중합체의 함량을 측정하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.

실시예 1: BC5344 유전자의 클로닝 및 이를 함유한 p10499BC5344 의 제작

β-케토티올라제를 코딩하는 유전자 BC5344를 클로닝하기위해, Bacillus cereus ATCC 14579　게놈시퀀스 (NC_004722)에 기초하여 합성된 올리고뉴클레오티드 프라이머(서열번호 1 및 2)를 사용하여, PCR으로 BC5344 유전자를 증폭시켰다.

본 발명자들은 Bacillus cereus ATCC 14579로부터 β-ketothiolase를 코딩하는 유전자(BC5344)를 클로닝하고자, Bacillus cereus ATCC 14579　게놈시퀀스 (NC_004722)에 기초하여 합성된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여, PCR로 BC5344 유전자를 증폭시켰다.

서열번호 1 (f-EcoRI) : ggaattcatgagtaaaacagttatttta

서열번호 2 (b-XbaI) : gctctagattagtgaacttcaatcatcac

이에 따른, BC5344 유전자의 염기서열과 이로부터 유추되는 아미노산 서열은 각각 서열번호 3 및 4와 같다.

BC5344 유전자는 Ralstonia eutropha의 phaA 유전자와 높은 유사성을 보이기 때문에 이하 phaA라 하였다. 한편, p10499A는 대한민국등록특허 제10-0447531호 "MCL-PHA를 생산하는 재조합 박테리아 시스템"에 개시된 방법과 동일한 방법에 의해 제작한 것으로, 플라스미드 pTrc99A에 EcoRV/EcoRⅠ 효소를 처리하여 절단한 다음, 동일한 효소로 절단한 gntT104 프로모터 유전자 절편을 T4 DNA 리가아제를 이용하여 연결하여 p10499A 벡터를 제조하였다.

본 발명의 발현 벡터를 만들기 위해, 상기 증폭된 phaA 유전자를 상기한 방법으로 제작된 p10499A (Park et al. FEMS Microbiol . Lett 214: 217, 2002) 발현 벡터에 EcoRI/XbaI로 절단해 삽입함으로써, 도 1에 나타난 바와 같이 p10499BC5344을 제조하였다. 또한, p10499BC5344는 BC5344 유전자가 별도의 유전제없이 즉, constitutive하게 발현이 되도록 제작되었다.

실시예 2: 재조합 벡터 pMCSTacReCB 의 제작

P(3HB) 합성경로를 구성하는 PhaC와 PhaB는 Ralstonia eutropha H16으로부터 PCR을 통해 얻었고, pTac99A 발현벡터에 phaC는 EcoRI/XbaI에 phaB는 XbaI/HindIII로 삽입해 인공적인 phaCB operon을 제작하여 발현하게 하였다 (pTac99ReCB).

Ralstonia eutropha phaC와 phaB를 얻을 때 사용한 프라이머 (서열번호 5~8)는 다음과 같다.

서열번호 5 (ReCf-EcoRI) : 5‘-ggaattc atggcgaccggcaaaggcgcggcagc

서열번호 6 (ReCb-XbaI) : 5‘-gctctagattatgccttggctttgacgtatcgcccagg

서열번호 7 (ReB1222f-XbaI): 5‘-gctctagaggaaggggttttccggggccgcgcgcg

서열번호 8 (ReBb-HindIII): 5‘-cccaagcttttagcccatatgcaggccgccgttgagcg

pTac99ReCB를 SspI으로 절단해 tac promoter와 phaCB operon과 transcription terminator가 있는 유전자절편을 EcoRV로 절단한 pBBR1MCS 벡터에 삽입하여, 도 2에 나타난 바와 같이, pMCSTacReCB를 제작하였다.

실시예 3: 본 발명에 따른 재조합 대장균의 제작 및 이를 이용한 P(3 HB )의 제조

실시예 1 및 2에서 제작된 p10499BC5344 및 pMCSTacReCB를 대장균 XL1-Blue에 도입하여 형질전환된 재조합 대장균을 수득하였다.

상기 수득된 재조합 대장균을 20g/L의 포도당, 100mg/L의 ampicillin 및 34mg/L의 chloramphenicol 등이 포함된 LB 배지에서 배양하였다. 세포농도가 600nm 파장에서 흡광도 값이 약 0.6이 되었을 때, 1 mM의 IPTG를 첨가하여 P(3HB) 생합성관련 효소들인 Ralstonia eutropha 유래의 phbB 및 phbC 유전자들의 발현을 유도하였다. IPTG 첨가 후 약 96시간이 경과하였을 때, 배양을 종료하고, 원심분리하여 배양액으로부터 균체를 회수하였다. 회수된 균체를 80^oC의 건조기에서 48시간 건조한 후 가스크로마토그래피 분석을 수행하여 세포내 합성된 P(3HB) 함량을 측정하였다. 분석에 사용된 표준물질은 P(3HB-co-3HV) 공중합체로서, 이 중 3HV의 함량은 무게비로 약 12% 이었다.

분석 결과, 대장균 내에 합성된 P(3HB)의 함량은 건조세포중량 대비 약 60%로, 본 발명에 따른 재조합 대장균을 통하여 P(3HB)를 제조할 수 있었다.

실시예 4: P(3 HB - co -3 HV ) 공중합체의 제조

실시예 3에서 수득된 재조합 대장균을 20g/L의 포도당, 20mM의 NaOH로 중화된 프로피온산, 100mg/L의 ampicillin, 및 34mg/L의 chloramphenicol 등이 포함된 LB 배지에서 배양하였다. 프로피온산의 경우 NaOH로 중화시킨 후 사용하였다. 세포 농도가 600nm 파장에서의 흡광도 값으로 약 0.6이 되었을 때, 1mM의 IPTG를 첨가해 주어 PHB 생합성관련 효소들인 Ralstonia eutropha 유래의 phbB 및 phbC 유전자들의 발현을 유도하였다. IPTG 첨가 후 약 96 시간이 경과 되었을 때 배양을 종료하였고, 원심분리하여 배양액으로부터 균체를 회수하였다. 회수된 균체를 80^oC의 건조기에서 48시간 건조한 후 가스크로마토그래피 분석을 수행하여 세포내 합성된 P(3HB-co-3HV) 공중합체 함량을 측정하였다. 분석에 사용된 표준물질은 P(3HB-co-3HV) 공중합체로서, 이 중 3HV의 함량은 무게비로 12% 이었다.

분석 결과, 대장균 내에 합성된 P(3HB-co-3HV) 공중합체의 함량은 건조세포중량 대비 약 17.3%이었고, 공중합체 중의 3HV 함량은 약 0.37 mol%로, 본 발명에 따른 재조합 대장균을 통하여 P(3HB-co-3HV) 공중합체를 제조할 수 있었다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따르면, 미생물을 이용하여 PHA 합성 경로에서 중간체를 생성하는 Bacillus cereus 유래의 BC5344 유전자를 phaB 및 phaC 유전자 또는 이들과 같은 기능을 수행하는 다른 박테리아 유래의 유전자들과 함께 도입해 줌으로써 생분해성 고분자인 PHA 및 P(3HB-co-3HV) 공중합체를 수득할 수 있다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통 상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> LG Chem,LTD. <120> Method for Preparing PHA Using BC5344 Encoding beta-ketothiolase Derived from Bacillus cereus <130> P06-B040 <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 ggaattcatg agtaaaacag ttatttta 28 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gctctagatt agtgaacttc aatcatcac 29 <210> 3 <211> 1182 <212> DNA <213> Bacillus cereus <400> 3 atgagtaaaa cagttatttt aagtgctgca agaacaccag ttggaaaatt tggaggatct 60 ttaaaggatg taaaagcgac ggaacttgga ggaattgcaa ttaaagcagc acttgaaaga 120 gcaaatgttg cggctagtga tgttgaagaa gttatatttg gaacggttat tcaaggtggg 180 cagggacaaa ttccatcgcg ccaagctgcg agggctgctg gaatcccttg ggaagtgcag 240 acggaaacag tgaataaagt ttgtgcatca gggcttcgtg cggttacgtt agcggatcag 300 attattcgta ctggcgatca atcactgatt gtagctggcg gtatggagtc gatgagtaac 360 agtccttaca ttttacgtgg agcaagatgg ggatacagaa tgggcaacaa cgaagttatt 420 gatttaaacg ttgctgacgg tttaacatgc gcattttcag gtacacacat gggcgtttat 480 ggcggagaag ttgcaaagga agatggaatt tctcgcgaag cgcaagatga atgggcatat 540 cgtagccatc agcgtgcggt ttcagcgcat aaagaagggc gttttgaaga ggaaatcgtg 600 ccagtaacga ttccgcaaag aaaaggcgat cctattgtcg ttgcaaagga tgaggcgcca 660 cgtgaagata caacgattga aaagttagca aagttaaaac ctgtatttga taagacagcg 720 acggtgacag ctggtaatgc gccgggacta aacgatggtg gtgccgcact tgtattaatg 780 agcgaagaca gagcgaagca agaaggaaga aagccattag cgacaatttt ggcgcataca 840 gcaattgcag tggaatctaa agatttccca agaactccag gttatgcaat taacgcattg 900 cttgaaaaaa caggaaagac aattgaagac attgatttat tcgagattaa tgaagccttt 960 gcagcggtag caattgcaag tacagaaatc gcaggaattg atccggaaaa attgaatgta 1020 aatggcggcg cggtagcgat gggacatcca attggagcaa gcggagcgcg cattatcgtt 1080 acactaatcc atgcacttaa gcagcgcggc ggtggaattg gaattgcttc gatttgtagc 1140 ggtggcggtc aaggggacgc agtgatgatt gaagttcact aa 1182 <210> 4 <211> 393 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 4 Met Ser Lys Thr Val Ile Leu Ser Ala Ala Arg Thr Pro Val Gly Lys 1 5 10 15 Phe Gly Gly Ser Leu Lys Asp Val Lys Ala Thr Glu Leu Gly Gly Ile 20 25 30 Ala Ile Lys Ala Ala Leu Glu Arg Ala Asn Val Ala Ala Ser Asp Val 35 40 45 Glu Glu Val Ile Phe Gly Thr Val Ile Gln Gly Gly Gln Gly Gln Ile 50 55 60 Pro Ser Arg Gln Ala Ala Arg Ala Ala Gly Ile Pro Trp Glu Val Gln 65 70 75 80 Thr Glu Thr Val Asn Lys Val Cys Ala Ser Gly Leu Arg Ala Val Thr 85 90 95 Leu Ala Asp Gln Ile Ile Arg Thr Gly Asp Gln Ser Leu Ile Val Ala 100 105 110 Gly Gly Met Glu Ser Met Ser Asn Ser Pro Tyr Ile Leu Arg Gly Ala 115 120 125 Arg Trp Gly Tyr Arg Met Gly Asn Asn Glu Val Ile Asp Leu Asn Val 130 135 140 Ala Asp Gly Leu Thr Cys Ala Phe Ser Gly Thr His Met Gly Val Tyr 145 150 155 160 Gly Gly Glu Val Ala Lys Glu Asp Gly Ile Ser Arg Glu Ala Gln Asp 165 170 175 Glu Trp Ala Tyr Arg Ser His Gln Arg Ala Val Ser Ala His Lys Glu 180 185 190 Gly Arg Phe Glu Glu Glu Ile Val Pro Val Thr Ile Pro Gln Arg Lys 195 200 205 Gly Asp Pro Ile Val Val Ala Lys Asp Glu Ala Pro Arg Glu Asp Thr 210 215 220 Thr Ile Glu Lys Leu Ala Lys Leu Lys Pro Val Phe Asp Lys Thr Ala 225 230 235 240 Thr Val Thr Ala Gly Asn Ala Pro Gly Leu Asn Asp Gly Gly Ala Ala 245 250 255 Leu Val Leu Met Ser Glu Asp Arg Ala Lys Gln Glu Gly Arg Lys Pro 260 265 270 Leu Ala Thr Ile Leu Ala His Thr Ala Ile Ala Val Glu Ser Lys Asp 275 280 285 Phe Pro Arg Thr Pro Gly Tyr Ala Ile Asn Ala Leu Leu Glu Lys Thr 290 295 300 Gly Lys Thr Ile Glu Asp Ile Asp Leu Phe Glu Ile Asn Glu Ala Phe 305 310 315 320 Ala Ala Val Ala Ile Ala Ser Thr Glu Ile Ala Gly Ile Asp Pro Glu 325 330 335 Lys Leu Asn Val Asn Gly Gly Ala Val Ala Met Gly His Pro Ile Gly 340 345 350 Ala Ser Gly Ala Arg Ile Ile Val Thr Leu Ile His Ala Leu Lys Gln 355 360 365 Arg Gly Gly Gly Ile Gly Ile Ala Ser Ile Cys Ser Gly Gly Gly Gln 370 375 380 Gly Asp Ala Val Met Ile Glu Val His 385 390 <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ggaattcatg gcgaccggca aaggcgcggc agc 33 <210> 6 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gctctagatt atgccttggc tttgacgtat cgcccagg 38 <210> 7 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gctctagagg aaggggtttt ccggggccgc gcgcg 35 <210> 8 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 cccaagcttt tagcccatat gcaggccgcc gttgagcg 38

Claims

PHA 합성 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환되거나 PHA 합성 유전자가 염색체 상에 삽입되어 있고, 동시에 서열번호 3의 염기 서열을 가지는 β-케토티올라제(β-ketothiolase)를 코딩하는 바실러스 시리우스(Bacillus cereus) 유래 유전자(BC5344)를 함유하는 재조합 벡터로 형질전환된 미생물.
제1항에 있어서, 상기 형질전환된 미생물은 대장균인 것을 특징으로 하는 형질전환된 미생물.
제1항에 있어서, 상기 PHA 합성 유전자는 탄소수 3~5의 짧은 사슬 길이의 poly(3-hydroxyalkanoates)를 합성할 수 있는 phaC 및 phaB 유전자인 것을 특징으로 하는 형질전환된 미생물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 형질전환된 미생물을 배양한 다음, 상기 배양된 미생물로부터 짧은 사슬 길이(short-chain-length) PHA를 회수하는 것을 특징으로 하는 짧은 사슬 길이(short-chain-length) PHA의 제조방법.
제4항에 있어서, 상기 짧은 사슬 길이의 탄소수는 3~5인 것을 특징으로 하는 방법.
제4항에 있어서, 상기 짧은 사슬 길이의 PHA는 poly(3-hydroxybutyrate)인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 형질전환된 미생물을 홀수개의 탄소수를 갖는 유기산 또는 지방산을 함유하는 배지에 배양한 다음, 상기 배양된 미생물로부터 P(3HB-co-3HV) 공중합체를 회수하는 것을 특징으로 하는 P(3HB-co-3HV) 공중합체의 제조방법.
제7항에 있어서, 상기 홀수개의 탄소수를 갖는 유기산은 프로피온산(propionic acid)인 것을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 홀수개의 탄소수를 갖는 지방산은 발레르산(valeric acid)인 것을 특징으로 하는 방법.