KR100247947B1 - Pha 생합성 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드 및 이 플라스미드에 의해 형질전환된 대장균 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 알칼리제네스 sp. SH-69 유래의 PHA 생합성 유전자인phaC, phaA및phaB유전자를 포함하는 재조합 플라스미드 pPHA0319 및 이 플라스미드에 의해 형질전환된 대장균 (E. coli(pPHA0319): KCTC 8866P)를 제공한다. 이렇게 형질전환된 대장균을 이용하는 경우 PHA의 대량생산이 가능하다.

Description

ＰＨＡ 생합성 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드 및 이 플라스미드에 의해 형질전환된 대장균
본 발명은 알칼리제네스 sp. SH-69 (Alcaligenessp. SH-69) 유래의 폴리하이드록시알카노에이트 (PHA) 생합성 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드 및 이 플라스미드에 의해 형질전환된 대장균에 관한 것이다.
많은 종류의 복잡한 바이오폴리머 (biopolymer)를 생산하는 방법으로서 미생물에 의한 합성방법이 이용되어 왔다. 미생물은 일반적으로 과량의 탄소원 및 에너지원이 존재하는 경우 영양적으로 불균형상태에서는 세포내에 에너지 저장물질을 축적한다. 본 발명은 특히 PHA의 축적에 관한 것이다.
PHA 중에서도 폴리하이드록시부티레이트 (polyhydroxybutyrate)는 상업적으로 매우 유용한 바이오폴리머로 알려져 있으며, 많은 종류의 박테리아에 의해 생산되어 세포내에 축적된다. 폴리-베타-하이드록시부티레이트 (PHB)는 D(-)-3-하이드록시부티레이트의 에스테르 폴리머인데, 1925년에 바실러스 메가테리움 (Bacillus megaterium)에서 가장 먼저 발견되었다. PHB는 항생제의 유기합성을 위한 비대칭탄소원, 생분해성/열가소성 물질, 약물전달용 매트릭스 및 뼈 대체용 매트릭스로서 다양하게 이용될 수 있다. PHB는 생체내에서 하이드록시부티레이트로 분해되며, 이것은 또한 혈액 성분 중의 하나이기도 하다.
PHB를 포함하여 다양한 종류의 PHA가 알칼리제네스 유트로푸스 및 슈도모나스 올레오보란스 (Pseudomonas oleovorans) 등의 박테리아에 의해 생산되는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 5-클로로펜타논산의 존재하에서 성장하게 되면 알칼리제네스 유트로푸스는 3-하이드록시부티레이트, 3-하이드록시발레이트 및 5-하이드록시발레이트를 PHA 폴리머로 합성한다. 알칼리제네스 유트로푸스는 포도당과 프로피오네이트를 포함하는 배지에서 배양될 때 폴리(3HB-co-3HV)의 헤테로폴리머를 생산하는데, 이때 3HV의 함량은 약 30% 정도이다. 슈도모나스 올레오보란스는 옥탄 존재하에 배양될 때 폴리-베타-하이드록시옥타노에이트의 호모폴리머를 생산한다.
한편, 알칼리제네스 sp. SH-69는 하수 슬러지로부터 분리된, 그람 음성의 PHA 합성 박테리아인데, 탄소원으로서 당알콜 (sugar alcohol)과 자당 (sucrose)을 이용하고 질소원으로서 요소를 이용하며 프로피오네이트와 같은 보조기질 없이도 배양액에 폴리(3HB-co-3HV)를 축적할 수 있다는 특징을 가지고 있다는 점에서 알칼리제네스 유트로푸스와 구별된다 (Kim, G.J. et al, Biotechnol. Lett.14, pp.27-32, 1992). 알칼리제네스 sp. SH-69는 또한 10mM 정도의 트레오닌, 이소루신 또는 발린이 배지에 첨가되어 있는 경우에 3HV 함량이 높은 (약 11-14몰%) 폴리(3HB-co-3HV)를 합성하는 것으로 알려져 있다. 반면, 야생형의 알칼리제네스 유트로푸스는 3HV의 전구체로서 트레오닌을 이용하지 않으며, 10mM 정도의 이소루신이나 발린이 첨가되는 경우에만 3HV 함량이 2몰% 미만인 폴리(3HB-co-3HV)를 합성한다. 단일의 탄소원으로부터 폴리(3HB-co-3HV)를 합성할 수 있는 로도코커스 루버 (Rhodococcus ruber)의 경우에는, 발린이나 이소루신을 첨가해도 코폴리에스테르의 3HV 함량이 증가되지 않았다. 그러므로, 알칼리제네스 sp. SH-69는 아미노산으로부터 폴리(3HB-co-3HV)를 합성하는 효율적인 대사경로를 가지고 있는 것으로 판단되며, 이는 아미노산의 이용을 가능하게 하는 효소 또는 아미노산의 대사를 통해 프로피오닐-CoA를 합성하는 효소의 활성에 의한 것으로 보인다.
PHA를 합성하는데 있어서, 아세틸-CoA를 PHA로 전환시키는 과정에 관여하는 효소에는 3종류가 있는 것으로 알려져 있는데, 베타-케토티올라아제 (β-ketothiolase), 아세토아세틸-CoA 환원효소 (acetoacetyl-CoA reductase) 및 PHA 합성효소 (PHA synthase)가 바로 그것들이다.
본 발명자들은 알칼리제네스 sp. SH-69에 있어 폴리(3HB-co-3HV)를 합성하는 대사경로에 관심을 가지고 폴리(3HB-co-3HV) 합성공정에 이용될 수 있는 새로운 균주를 개발하기 위해 연구를 계속하면서 PHA/PHB를 생산하는데 관여하는 효소를 암호화하고 있는 유전자를 분리하여 염기서열을 분석하고 이 유전자 산물인 PHA/PHB를 대장균에서 발현시킬 수 있는 플라스미드를 제조함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 알칼리제네스 sp. SH-69 유래의 PHA 합성 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드를 제공하는 것이다.
본 발명이 이루고자 하는 또 다른 기술적 과제는 PHA 합성 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드에 의해 형질전환됨으로써 PHA의 효율적인 생산을 가능하게 하는 대장균을 제공하는 것이다.
도 1은 알칼리제네스 sp. SH-69의 PHA 생합성 유전자를 포함하는 염색체 영역의 지도를 나타낸다.
도 2는 각각 플라스미드 pPHA11, pPHA13 및 pPHA1024에 대한 개략적인 지도이다.
도 3은 본 발명의 재조합 플라스미드인 pPHA0319에 대한 개략적인 지도이다.
상기 목적을 달성하기 위해 본 발명에서는 알칼리제네스 sp. SH-69 유래의 PHA 생합성 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드 pPHA0319를 제공한다.
상기 PHA 생합성 유전자는phaC, phaA및phaB유전자이며, 이들 유전자는phaB, phaC,phaA순서로 배열되어 있다.
상기phaC, phaA유전자는 하나의 오페론으로 되어 있으며, 염기 서열이 하기 서열 1로 되어 있다.
상기phaB유전자의 염기 서열은 하기 서열 2로 되어 있다:
상기, 서열 1 및 2에서,phaC, phaA및phaB의 개시영역은 각각 phaC〉〉, phaA〉〉 및 phaB〉〉로 표시되어 있으며, 리보좀 결합위치는 S/D로, 프로모터 영역은 -10과 -35로 표시되어 있으며, 별표는 종결코돈을 나타낸다.
본 발명에서는 또한 상기 플라스미드 pPHA0319에 의해 형질전환된 대장균 (E. coli(pPHA0319): KCTC 8866P)이 제공된다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다.
PHA 생합성 유전자의 클로닝 및 씨퀀싱
알칼리제네스 sp. SH-69 (충남대학교, 이영하교수로부터 입수함)는 박토-펩톤 10 g/ℓ, 이스트 엑스트렉트 5 g/ℓ, NaCl 10 g/ℓ를 포함하는 루리아-베르타니 (Luria Bertani) 배지를 사용하여 37oC에서 배양하였다. 알칼리제네스 sp. SH-69로부터의 전체 염색체 DNA 추출은 다음과 같은 방법으로 이루어졌다. 배양된 알칼리제네스 sp. SH-69를 원심분리하여 수획한 후 라이소자임 (10 mg/ml)을 포함하는 TE 완충용액 (pH 8.0)에 현탁시켜 37oC에서 1시간 동안 반응시켰다. 10% SDS, 페놀 및 5M NaCl을 첨가한 후 20분간 상온에서 부드럽게 흔들어준 다음 원심분리 (1500rpm, 10분, 4oC)하여 상등액을 분리하였다. 이 상등액에 같은 부피의 클로로포름을 넣고 상온에서 부드럽게 흔들어준 후 원심분리 (1500rpm, 10분, 4oC) 하였다. 위의 과정을 두 차례 반복한 후, 분리된 상층액에 이소프로판올을 첨가하여 전체 염색체 DNA를 얻고 65oC의 TE 완충용액에 현탁시켜 보관하였다. 전체 염색체 DNA에 존재하는 PHA 생합성 유전자들의 개략적인 위치는 도 1에 도시되어 있는 바와 같다. 도 1에서, "E"는EcoRI, S는SmaI, P는PstI 제한효소 작용위치를 나타낸다. 상기 알칼리제네스 균주의 염색체 DNA로부터 약 5-kbp 크기의EcoRI 단편을 분리하여 pUC19 (NEB, USA)에 클로닝시켜 pPHA11을 제조하였다 (도 2 참조). 도 2에서, "E", "S" 및 "P"는 각각 도 1과 관련하여 정의한 바와 같다. PHA11은 도 2에 도시되어 있는 바와 같이phaC와phaA유전자를 포함하고 있으며, 알칼리제네스 유트로푸스의phaA및phaB유전자를 포함하고 있는 플라스미드 pPHA21을 가지고 있는 대장균에 대해, PHA를 축적할 수 있는 능력을 부여하는 것으로 나타났다.
도 1의 알칼리제네스 sp. SH-69의 생합성 유전자 중 상기 5-kbp DNA 단편의 뉴클레오티드에 대한 씨퀀싱은 ExoⅢ를 처리하여 크기가 작아진 써브클론 및 합성된 올리고뉴클레오티드를 이용하여 두 가닥에서 모두 이루어졌으며, 그 결과 5-kbp DNA 단편에는 두 개의 오픈리딩프레임 (open reading frame)으로서 ORF1 (phaC)과 ORF2 (phaA), 및 박테리오파아지 λ 및E.coliIS5 요소 (IS5 element)에 대해 상당한 유사성을 보이는 서열이 포함되어 있었다.
1698bp의 ORF1은 556개의 아미노산으로 이루어진 62.5kDa 단백질을 코딩하며, ORF2 (1176bp) 유전자 산물의 예상 분자량은 392개의 아미노산으로 이루어진 40.2 kDa인 것으로 계산되었다 (서열 1 참조).
데이터베이스 (GenBank의 데이터베이스)를 이용하여 조사한 결과, ORF1과 ORF2는 그 아미노산 서열 (상기 서열 1의 phaC〉〉 및 pha A〉〉의 염기서열부분에 대응하는 아미노산 서열)이 다른 박테리아의 PHA 합성효소 및 베타-케토티올라아제의 아미노산 서열들과 상당한 유사성을 나타내었다. 보다 구체적으로 설명하면, ORF1은, 알칼리제네스 유트로푸스, 줄레아 라미제라 (Zooloea ramigera), 메틸로박테리움 엑스토르켄스 (Methylobacterium extorquens), 로도코커스 스패로이데스 (Rhodococcus sphaeroides), 파라코커스 디니트리피칸스 (Paracoccus denitrificans), 아시네토박터 (Acinetobactersp.), 로도코커스 루버, 슈도모나스 올레오보란스, 슈도모나스 에어루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 라이조비움 에틀리 (Rhizobium etli)에 대해 각각 60%, 55%, 42%, 42%, 40%, 39%, 39%, 39%, 38%, 37%의 동일성을 나타내었다. 또한, ORF2는 베타-케오티올라아제의 아미노산 서열면에서, 알칼리제네스 유트로푸스와 72%, 티오시스티스 비올라시애 (Thiocystis violaceae)와 66%, 크로마티움 비노섬 (Chromatium vinosum)과 65%, 아시네토박터와 63%, 파라코커스 디니트리피칸스와 62%, 라이조비움 멜리로티 (Rhizobium meliloti)와 60%, 줄레아 라미제라와 60% 정도의 상당히 높은 유사성을 나타내었다.
번역개시위치로서 가장 가능성이 높은 부분은, 다른 PHA 합성 유전자와의 서열비교를 통해, 리보좀 결합위치 다음에 자리잡고 있는 ORF1 (phaC)의 ATG 개시코돈인 것으로 밝혀졌다. 또한,E.coliσ70의존적 프로모터 콘센서스 서열과 유사한 서열인, -35 영역에 대한 5'-TTGACA-3', -10 영역에 대한 5'-AACAAT-3'가 번역 개시코돈으로부터 약 60bp 상방에 존재하는 것으로 밝혀졌다 (서열 1 참조).
ORF2 (phaA)의 개시코돈은 ORF1의 종료코돈으로부터 70bp 하방에 위치하고 있다. 리보좀 결합위치가 70-bp 영역에 존재하기는 하지만, 프로모터와 같은 작용을 하는 서열은 아무것도 발견되지 않았는데, 이는 ORF1과 ORF2가 하나의 오페론으로 조직되어 있다는 것을 의미한다.
클로닝된 5-kbp DNA 단편에 존재하지 않는, 알칼리제네스 sp. SH-69의phaB유전자를 클로닝하기 위해, 여러 가지 제한효소를 이용하여 알칼리제네스 sp. SH-69의 염색체 DNA를 완전히 분해하고, 알칼리제네스 유트로푸스의phaC,phaA및phaB유전자를 가지고 있는 플라스미드 pSYL101 (한국과학기술원, 이상엽 교수로부터 입수함)로부터의phaB유전자 단편을 프로우브로 이용하여 써던 하이브리드화 (Southern hybridization)를 실시하였다. 아가로즈 겔로부터, 하이브리드화가 된 것을 강하게 나타내는 위치에 해당하는 약 3-kbpEcoRI 단편을 추출, 정제하여EcoRI에 의해 분해된 pUC19에 삽입시킨 다음, 연결된 DNA를E. coliDH5α (Gibco BRL, USA)에 형질전환시켰다. 형질전환체로부터 플라스미드 DNA를 분리하여, 알칼리제네스 유트로푸스의phaB유전자 단편을 프로우브로 이용하여 써던 하이브리드화를 실시하여, 하이브리드화가 이루어진 것을 강하게 나타내는 플라스미드 pPHA13 (도 2 참조)을 분리하고, 분리된 플라스미드로부터 DNA 삽입체 (약 3-kbp)에 대해 제한효소 지도를 이용하여 분석하였다. 써던 하이브리드화를 실시한 결과, 1.2-kbp의SmaI-PstI 단편이 알칼리제네스 유트로푸스의phaB유전자와 상동성을 나타내는 서열을 포함하고 있다는 것을 알아내었다. 1.2-kbp 단편을 씨퀀싱한 결과, 245개의 아미노산으로 이루어진, 분자량 26.2kDa의 ORF3가 나타났다.
ORF3의 아미노산 서열에 대해 데이터베이스 (GenBank)를 이용하여 조사한 결과 ORF3의 아미노산 서열이 다른 아세토아세틸-CoA 환원효소의 아미노산 서열과 상당히 유사하다는 것을 알아내었다: 즉, 알칼리제네스 유트로푸스와는 68%, 아시네토박터와는 50%, 크로마티움 비노섬과는 49%, 파라코커스 디니트리피칸스와는 49%, 라이조비움 멜리로티와는 49%, 줄레아 라미제라와는 53%의 동일성을 나타내었다. 이러한 결과는, ORF3가 알칼리제네스 sp. SH-69의phaB유전자일 가능성이 높다는 것을 의미하는 것이다. E.coli σ70의존적 프로모터 콘센서스 서열과 유사한 서열인, -35 영역에 대한 5'-TTGACA-3', -10 영역에 대한 5'-AACAAT-3'가 리보좀 결합위치 다음에 위치하는 ATG 개시코돈으로부터 약 35bp 상방에 존재하는 것으로 나타났다 (서열 2 참조).
알칼리제네스 sp. SH-69의 염색체상에서의 ORF1, ORF2 및 ORF3의 상대적인 위치 및 조직기구는, 염색체 DNA를 여러 가지 제한효소를 이용하여 분해한 다음 5-kbp 단편으로부터의 1.1-kbpSamI-EcoRI 단편과 3-kbp 단편으로부터의 1.2-kbpSmaI-PstI 단편을 프로우브로 이용하여 써던 블롯팅함으로써 알아내었다. 그 결과, 3-kbpEcoRI 단편은 5-kbpEcoRI 단편 옆에 위치하는 것으로 나타났다 (도 1).
ORF들의 조직기구를 보다 상세히 알아보기 위해, 알칼리제네스 sp. SH-69의 염색체 DNA 및 5-kbp 단편의 IS5 상동체 하방에 존재하는 서열과 3-kbp 단편의phaB유전자 상방에 존재하는 서열에 해당하는 프라이머로서,
프라이머1: 5'-GAACCGCTACCGGTTTACCAG-3',
프라이머2: 5'-CGAACAGATAGCCCTGCTGGT-3')를 이용하여 폴리머라제 체인 반응 (polymerase chain reaction: PCR)을 실시하였다. PCR 생성물 (486bp)에 대한 서열을 조사한 결과, 5-kbpEcoRI 단편이 3-kbpEcoRI 단편 옆에 존재하며, ORF들은 ORF1(phaC) - ORF2(phaA) - ORF3(phaB)의 순서로 조직되어 있는 것으로 나타났다.
E. coli 에서의 PHA 생합성 유전자의 발현
ORF1, ORF2, ORF3가 PHA 합성효소 (phaC), 베타-케토티올라아제 (phaA) 및 아세토아세틸 CoA 환원효소 (phaB)를 각각 코딩하며, 또한 알칼리제네스 sp. SH-69의 PHA 합성을 담당하는 지에 대해 알아보기 위하여 상기 세 종류의 ORF를 pBluescript Ⅱ KS+ (Stratagene, USA)에 재조합시켜E. coliDH5α (Gibco BRL, USA)에서 발현시켰다. pPHA11로부터의 3.7-kbpEcoRI-SmaI 단편과 pPHA13으로부터의 3.0-kbpEcoRI 단편을 pBluescript Ⅱ KS+에 써브클로닝하여 두 개의 플라스미드 pPHA1024 (도 2 참조)와 pPHA0319 (도 3 참조: 도 3에서 "E", "S", "P"는 각각 도 1과 관련하여 정의한 바와 같다)를 제조하였는데, 이들은 3.0-kbpEcoRI 단편, 즉 ORF3 (phaB)의 방향성에서만 차이를 나타내고 있다. pPHA0319에 의해 형질전환된 대장균 (E. coli(pPHA0319))은 1998년 1월 15일자로 대전광역시 소재의 생명공학연구소내 유전자은행에 기탁번호 KCTC 8866P로 기탁되었다. 또한,phaC,phaA,phaB유전자의 뉴클레오티드 서열도 각각 GenBank에 수탁번호 UC78047, AF002013, AF002014로 기탁되어 있다.
pPHA11, pPHA13, pPHA0319 또는 pPHA1024를 가지고 있는 대장균을 2% 포도당이 포함된 루리아-베르타니 한천배지에서 배양시킴으로써, 재조합 세포가 PHA를 합성할 수 있는 지에 대해 알아보았다. pPHA11 또는 pPHA13을 가지고 있는 균주들은 투명한 콜로니를 형성하였지만, pPHA0319 또는 pPHA1024를 가지고 있는 균주들은 불투명한 콜로니를 형성하였다. 즉, PHA는phaA, phaB, phaC유전자를 모두 포함하는 pPHA0319 또는 pPHA1024 플라스미드를 가지고 있는 균주에서만 생산되었다. 상기 대장균에서의 PHA 함량과 그 조성을 알아보기 위하여 LB와 2% 포도당을 포함하는 액체배지에서 배양한 다음 건조균체 10-20mg을 3%(v/v) 황산을 포함하는 2ml의 메탄올과 2ml의 클로로포름의 혼합액속액을 첨가한 후, 유리 캡튜브에 넣어 100oC에서 4시간 가열반응시키고 상온에서 층분리가 일어날 때까지 방치하였다가 상층액을 제외한 유기용매층 2μl를 취해 기체크로마토그라피를 이용하여 측정하였다. 이때 정량을 위해, 3HB와 3HV 모노머의 함량이 알려져 있는 PHA 표준품을 이용하였다. pPHA1024 또는 pPHA0319를 가지고 있는 재조합 균주들은 PHA를 건조세포중량의 약 50% 정도까지 생산하였으나, pPHA11 또는 pPHA13을 가지고 있는 균주들은 PHA를 생산하지 않았다. 이러한 결과들은, ORF1,2,3이 각각phaC,phaA,phaB를 코딩한다는 것과, 대장균이 알칼리제네스 sp. SH-69의 PHA 생합성 유전자들에 의해 형질전환되는 경우 PHA를 합성할 수 있다는 것을 의미한다.
이상, 단일의 탄소원으로부터 PHA를 합성할 수 있는 알칼리제네스 sp. SH-69로부터phaC,phaA,phaB유전자를 클로닝하여 그 특성을 알아보았다. 뉴클레오티드 씨퀀싱 결과,phaC,phaA유전자가 하나의 오페론으로 되어 있으며,phaB유전자는phaA유전자로부터 약 2-kbp 하방에 위치한다는 것을 알았다. 또한, 본 발명의 재조합 플라스미드 pPHA0319는 대장균에게 PHA 합성능력을 부여할 수 있다. 따라서, 이렇게 형질전환된 대장균에 의해 PHA가 대량 생산될 수 있다. 더 나아가, 본 발명은 미생물을 이용한 폴리머 제조방법이 활성화되어 기존의 화학합성방법을 대신함에 따라 환경문제를 해결하는 한편, 기능적 폴리머의 제조에도 이용될 수 있다.

Claims (4)

  1. 알칼리제네스 sp. SH-69 유래의 PHA 생합성 유전자인phaC, phaA및phaB를 포함하는 재조합 플라스미드 pPHA0319.
  2. 제 1항에 있어서, 상기phaC, phaA유전자는 하나의 오페론으로 되어 있으며, 염기 서열이 하기 서열 1로 되어 있는 것을 특징으로 하는 플라스미드 pPHA0319:
    〈서열 1〉
    여기에서,phaC및phaA의 개시영역은 각각 phaC〉〉, phaA〉〉로 표시되어 있으며, 리보좀 결합위치는 S/D로, 프로모터 영역은 -10과 -35로 표시되어 있으며, 별표는 종결코돈을 나타낸다.
  3. 제 1항에 있어서, 상기phaB유전자는 염기 서열이 하기 서열 2로 되어 있는 것을 특징으로 하는 플라스미드 pPHA0319:
    〈서열 2〉
    여기에서,phaB의 개시영역은 phaB〉〉로 표시되어 있으며, 리보좀 결합위치는 S/D로, 프로모터 영역은 -10과 -35로 표시되어 있으며, 별표는 종결코돈을 나타낸다.
  4. 제 1항의 플라스미드 pPHA0319에 의해 형질전환된 대장균 (E. coli(pPHA0319): KCTC 8866P).
KR1019980005397A 1998-02-20 1998-02-20 Pha 생합성 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드 및 이 플라스미드에 의해 형질전환된 대장균 KR100247947B1 (ko)

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