DE4420223C1 - Verfahren zur Kombination der intrazellulären Polyhydroxyalkanoat-Synthese in Mikroorganismen mit einer extrazellulären Polysaccharid-Synthese - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein gentechnologisches Verfahren, das es ermöglicht, Mikroorganismen, die intrazellulär Polyhydroxyalkanoate synthetisieren, dahingehend zu verändern, daß sie extrazelluläre Enzyme exprimieren, die die Synthese verschiedenartiger Polysaccharide unter Spaltung von im Kulturmedium vorhandenen Di-, Oligo-, oder Polysacchariden katalysieren. Bei diesen Enzymen handelt es sich im speziellen um Hexosyltransferasen.

Beschreibung

Im Rahmen biotechnologischer Produktionsprozesse werden heutzutage in großem Umfang Mikroorganismen für die Synthese der verschiedensten Substanzen eingesetzt. Von Bedeutung ist unter anderem die Synthese komplexer Biopolymere, wie z. B. Polyhydroxybutyrat (PHB) oder Polyhydroxyalkanoate (PHA). Für diese besteht ein besonderes kommerzielles Interesse, da sie thermoplastische Eigenschaften besitzen, die mit denen synthetisch hergestellter Kunststoffe, wie z. B. Polypropylen, vergleichbar sind.

Die Biopolymere PHA und PHB könnten herkömmliche, industriell hergestellte Polymere zum Teil ersetzen. Sie sind insbesondere für die Verpackungsindustrie potentiell interessant geworden, da sie im Vergleich zu herkömmlichen Kunststoffen verschiedene Vorteile aufweisen wie z. B. 100%ige biologische Abbaubarkeit, hohe Umweltverträglichkeit und die Möglichkeit der Verwendung natürlich nachwachsender Rohstoffe als Ausgangsmaterial für ihre Produktion. Sie können so zu einer Verringerung des nur schwer wiederverwertbaren Kunststoffmülls beitragen.

Die breite Kommerzialisierung dieser Biopolymere scheitert bisher jedoch an den zu hohen Produktionskosten. Diese sind unter anderem bedingt durch die hohe Komplexität der Produktionstechnologie, hohe Kosten für die Produktionsanlagen, kostenintensive Aufarbeitung der Produkte und die hohen Preise für die Rohmaterialien.

Die Produktion synthetischer Kunststoffe auf petrochemischer Basis, wie z. B. Polypropylen, ist dagegen kostengünstiger, so daß die erzeugten Produkte in der Regel sehr billig sind und in großen Quantitäten hergestellt werden.

Es besteht daher ein dringender Bedarf, Möglichkeiten zur ökonomischeren Produktionsweise von PHB und PHA zu entwickeln, die eine breitere Kommerzialisierung dieser Biopolymere erlauben würden.

PHB ist ein Polyester der D(-)-3-Hydroxybuttersäure. Der Begriff Polyhydroxyalkanoat (PHA) umfaßt im folgenden die Polymere der 3- Hydroxybuttersäure, Polymere verwandter Hydroxyalkanoate wie z. B. 3- Hydroxyvalerat, 3-Hydroxyhexanoat, 3-Hydroxydekanoat und darüberhinaus Copolymere und Mischungen dieser Hydroxyalkanoate.

PHB und PHA wurden bisher nur in Prokaryonten gefunden und werden von einer Vielzahl von Bakterienspezies als intrazelluläre Kohlenstoff- und Energiespeichersubstanz benutzt. Sie werden in den Zellen in Granula gespeichert und können bis zu 90% des Zelltrockengewichts ausmachen.

Ein Copolymer aus PHB und Polyhydroxyvalerat wird bereits industriell von Imperial Chemical Industries PLC hergestellt und unter dem Namen BIOPOL vertrieben. Für die Produktion wird hierbei der Mikroorganismus Alcaligenes eutrophus verwendet (Byrom, 1992, FEMS Microbiol. Rew. 103 : 247-250). Dieser wird in einem Glukose-Salz-Medium in einem "fed batch reactor" unter Nährstoffbedingungen kultiviert, die in den ersten 60 h ausschließlich Zellwachstum erlauben und in einer sich daran anschließenden ca. 48 h langen Phase die PHB-Synthese. Diese führt zu einer starken Akkumulation von PHB in den Zellen. Für die Gewinnung des PHBs aus den Zellen, werden diese von dem Kulturmedium getrennt, und das PHB in der Regel mit Hilfe von Lösungsmitteln (Methanol; Chloroform/Methylenchlorid) aus den Zellen extrahiert, anschließend gefällt und vakuumgetrocknet.

Die zu hohen Produktionskosten bei der PHA-Herstellung durch Alcaligenes eutrophus sind zum Teil durch das begrenzte Substratspektrum dieses Mikroorganismus in bezug auf Kohlenhydrate bedingt. Der Wildstamm verwertet als einzigen Zucker Fruktose sowie die Zuckersäure Gluconat (Wilde, 1962, Arch. Mikrobiol. 43 : 109-137; Gottschalk et al., 1964, Arch. Mikrobiol. 48 : 95-108). Vom Wildstamm abgeleitete Mutanten können zusätzlich auf Glukose wachsen (Schlegel and Gottschalk, 1965, Biochem. Z. 341 : 249-259). Diese Stämme werden bevorzugt für die technische Fermentation verwendet, da Glukose kostengünstiger ist als Fruktose. Als günstige Glukosequellen bieten sich u. a. die Disaccharide Saccharose (Glukose-Fruktose), Maltose (Glukose- Glukose) oder auch Oligosaccharide wie z. B. Dextran oder Dextrin an, die teilweise auch als Neben- und Abfallprodukte bei der Verarbeitung landwirtschaftlicher Produkte anfallen.

Nachteil bei der Verwendung dieser kostengünstigen Substrate ist jedoch, daß die für die PHA-Produktion eingesetzten Mikroorganismen, insbesondere, Alcaligenes eutrophus, nicht in der Lage sind, diese Di- bzw. Oligosaccharide aufzunehmen, da keine entsprechenden Transportsysteme für die Aufnahme in die Zelle vorhanden sind. Diese Substrate müssen daher vor der Verwendung hydrolysiert und so in die entsprechenden Hexosemonomere konvertiert werden. Diese Behandlungen sind wiederum zeit- und kostenintensiv.

Aus verschiedenen Mikroorganismen sind Enzyme bekannt, die in der Lage sind, Di-, Oligo- oder Polysaccharide, die aus Hexosemonomeren aufgebaut sind, zu spalten und die bei der Spaltung jeweils ein Hexosemonomer in einer Polymerisierungsreaktion auf eine wachsende Polysaccharidkette übertragen. Insbesondere bekannt sind Enzyme, die die Disaccharide Saccharose bzw. Maltose spalten, wobei jeweils ein Hexosemonomer freigesetzt wird und das verbleibende Hexosemonomer auf eine wachsende Polysaccharidkette übertragen wird. Diese Enzyme zählen zu den Hexosyltransferasen.

Unter dem Begriff Hexosyltransferasen werden im folgenden Enzyme verstanden, die Reaktionen katalysieren, deren Mechanismus sich dadurch auszeichnet, daß eine Hexose direkt von einem Di-, Oligo- oder Polysaccharid auf einen Akzeptor, in der Regel eine wachsende Polysaccharidkette, übertragen wird. Dabei werden für die Katalyse weder aktivierte Glukosederivate, wie sie z. B. bei der Polysaccharidsynthese in Pflanzen und Tieren auftreten, noch Kofaktoren benötigt. Die Energie, die für die Polymerisierung der Hexosereste benötigt wird, wird direkt aus der Spaltung der glykosidischen Bindung im jeweiligen Di-, Oligo- bzw. Polysaccharid gewonnen.

Hexosyltransferasen, die Saccharose als Substrat verwenden, werden danach unterschieden, ob sie den Glukoserest (Glukosyltransferasen) oder den Fruktoserest (Fruktosyltransferasen) aus dem Saccharosemolekül auf eine wachsende Polysaccharidkette übertragen. Als Reaktionsprodukte entstehen im ersten Fall Fruktose und Glukane und im zweiten Fall Glukose und Fruktane.

Glukosyltransferasen, die Saccharose als Substrat verwenden, katalysieren ganz allgemein Reaktionen folgenden Typs:

Saccharose + (Glukan)_n → Fruktose + (Glukan)_n+1

Je nachdem, auf welche Weise die Glukosemoleküle im Glukan miteinander verknüpft sind und ob Verzweigungen auftreten, können verschiedene Glukane als Reaktionsprodukte auftreten.

Bekannt sind extrazelluläre Glukosyltransferasen aus Streptococcen, die die Synthese von Glukanen mit unterschiedlichen Eigenschaften katalysieren. Diese Enzyme werden in drei Gruppen eingeteilt:

• a) Glukosyltransferasen, die wasserlösliche Glukane synthetisieren, die überwiegend α-1,6-verknüpft sind, sogenannte Dextrane, (GTF S-Typ),
• b) Glukosyltransferasen, die wasserunlösliche Glukane synthetisieren, die überwiegend α-1,3-verknüpft sind, sogenannte Mutane, (GTF I-Typ),
• c) Glukosyltransferasen, die eine Kombination aus wasserlöslichen und wasserunlöslichen Glukanen synthetisieren (GTF SI-Typ).

Gene, die für Glukosyltransferasen des Typs S, des Typs I und des Typs SI kodieren, sind bereits aus vier verschiedenen Streptococcen-Spezies isoliert worden (für eine Übersicht: Giffard et al., 1993, J. Gen. Microbiol. 139 : 1511-1522).

Darüberhinaus ist ein Gen beschrieben worden, das für eine Dextransucrase (Sucrose: 1,6-α-D-Glukan 6-α-D-Glukosyltransferase, E.C. 2.4.1.5.) aus Leuconostoc mesenteroides kodiert (WO 89/12386). Hierbei handelt es sich ebenfalls um eine Glukosyltransferase, die Saccharose als Substrat verwendet. Das entstehende Glukan, Dextran, besteht aus überwiegend α- 1,6-verknüpften Glukosemolekülen, wobei die parallelen Ketten untereinander vernetzt sind.

Dextran besitzt breite Anwendungsmöglichkeiten im Nahrungsmittelbereich, im pharmazeutischen Bereich, z. B. als Blutplasmaersatzmittel oder zur Erhöhung der Viskosität von wäßrigen Lösungen, sowie in der chemischen Industrie, z. B. als Grundlage der Dextrangele.

Eine weitere Glukosyltransferase, die Saccharose als Substrat verwendet, ist die Amylosucrase (auch Sucrose:1,4-α-D-Glucan 4-α- Glucosyltransferase, E.C. 2.4.1.4.). Dieses Enzym katalysiert die Reaktion:

Saccharose + (α-1,4-D-Glukan)_n → Fruktose + (α-1,4-D-Glukan)_n+1

Amylosucrase wurde bisher nur in wenigen Bakterienspezies gefunden, darunter hauptsächlich Neisseira Spezies (MacKenzie et al., 1978, Can.J.Microbiol. 24 : 357-362). Aus einer genomischen DNA-Bibliothek von Neisseria polysaccharea wurde in dem Vektor pBluescript SK wurde ein Plasmid isoliert, pNB2 (DSM 9196), das eine Region enthält, die für eine Amylosucrase-Aktivität kodiert.

Die durch Amylosucrase gebildeten α-1,4-Glukane sind von besonderem kommerziellen Interesse, da sie in ihrem chemischen Aufbau dem Amyloseanteil pflanzlicher Stärke entsprechen. Amylose findet verbreitete Anwendung u. a. in der Lebensmittel-, Papier-, Textilindustrie sowie bei der Herstellung von Cyclodextrinen. Stärke selber, die bisher die einzige Quelle für die Gewinnung von α-1,4-Glukanen ist, ist jedoch aus zwei Komponenten aufgebaut. Neben der Amylose als unverzweigte Kette aus α-1,4-verknüpften Glukoseeinheiten, enthält Stärke eine andere Komponente, das Amylopektin. Dies ist ein hochverzweigtes Polymer aus Glukoseeinheiten, bei dem neben den α-1,4-Verbindungen noch Verzweigungen der Glukoseketten über α-1,6-Verbindungen auftreten. Aufgrund der unterschiedlichen Struktur dieser beiden Komponenten und den daraus resultierenden physikalisch-chemischen Eigenschaften finden die beiden Komponenten auch weitgehend unterschiedliche Verwendungsmöglichkeiten. Um sich die Eigenschaften der einzelnen Komponenten direkt zu Nutze machen zu können, ist es erforderlich, diese in reiner Form zu gewinnen. Beide Komponenten können aus Stärke gewonnen werden, was jedoch eine Reihe von Reinigungsschritten erfordert und zeit- und kostenintensiv ist.

Trotz zahlreicher Bemühungen ist die Herstellung reiner Amylose durch Mikroorganismen oder in Pflanzen bisher noch nicht gelungen. Die Produktion reiner Amylose durch biotechnologische Prozesse im Hinblick auf die Bereitstellung eines chemisch einheitlichen Grundstoffes für die verschiedenen industriellen Verwendungszwecke ist daher von besonderem Interesse.

Fruktosyltransferasen, die als Substrat Saccharose verwenden, sind ebenfalls beschrieben. Sie katalysieren Reaktionen folgenden Typs:

Saccharose + (Fruktose)_n → Glukose + (Fruktose)_n+1

Als Produkte treten in dieser Reaktion neben Glukose Polyfruktane auf. Diese enthalten als "Startermolekül" der Polymerisationsreaktion ein Molekül Saccharose, an das Fruktosepolymere addiert sind. Je nach der Verknüpfung der Fruktosemoleküle lassen sich die synthetisierten Polyfruktane in zwei Gruppen einteilen:

• a) (2→1) verknüpfte β-D-Fruktane (Inulin-Typ)
• b) (2→6) verknüpfte β-D-Fruktane (Phlein- oder Lävan-Typ)

Entsprechend den zwei verschiedenen Arten von Polyfruktanen, die als Syntheseprodukt auftreten können, unterscheidet man zwei Typen von Fruktosyltransferasen, die unter den Trivialnamen Lävansucrase (Saccharose: β-D-Fructosyltransferase, E.C. 2.4.1.10.) bzw. Inulosucrase (E.C. 2.4.1.9.) bekannt sind.

Gene für Lävan- bzw. Inulosucrasen sind bisher aus verschiedenen Mikroorganismen isoliert worden. Dazu zählen z. B. Gene aus Bacillus amyloliquefaciens (Tang et al., 1990, Gene 96 : 89-93), Bacillus subtilis (Steinmetz et al., 1985, Mol. Gen. Genetics 200 : 220-228) und Erwinia amylovora (Geier and Geider, 1993, Phys. Mol. Plant Pathology 42 : 387- 404; DE 42 27 061.8 und WO 94/04692). Sie kodieren für Lävansucrasen, die die Synthese von Polyfructanen des Lävan-Typs katalysieren. Ferner ist ein für eine Fruktosyltransferase kodierendes Gen aus Streptococcus mutans (Shiroza et al., 1988, J. Bacteriology 170 : 810-816; Sato and Kuramitsu, 1986, Infect. Immun. 52 : 166-170) beschrieben worden. Dieses Enzym synthetisiert ein Fruktan des Inulin-Typs.

Polyfruktane mit niedrigen Molekulargewichten treten auch in Pflanzen auf. Die von Mikroorganismen gebildeten Polyfruktane weisen durchweg sehr hohe Molekulargewichte auf. Beschrieben sind Molekulargewichte bis 2 000 000 Dalton (Clarke et al., 1991, in: Carbohydrates as Organic Raw Materials, VCH Weinheim, 169-182).

Polyfruktose ist eine preiswerte Fruktosequelle, da sie stabil, nicht­ hygroskopisch und somit gut lagerbar ist. Die Viskositätseigenschaften von Polyfruktose lassen sie auch als Dickungsmittel geeignet erscheinen.

In diesem Zusammenhang ist es auch von Bedeutung, daß Fructose nur sehr unzureichend (i.e. durch Mikroorganismen) verwertet werden kann, und somit Polyfructose als Zusatz für "low-calorie"-Lebensmittel ideal geeignet ist. Desweiteren eignet sie sich zur Verkapselung von Geschmacks-, Farb- oder anderen Zusatzstoffen, da Polyfruktose kein Wasser absorbiert und daher eine Lagerung unter atmosphärischen Bedingungen möglich ist.

Die gebildeten Polyfruktane sind darüberhinaus von Interesse als Ersatz für biologisch nicht abbaubare, chemisch erzeugte Linearpolymere.

Neben Hexosyltransferasen, die Saccharose als Substrat verwenden, sind Hexosyltransferasen bekannt, die Maltose als Substrat verwenden. Beschrieben ist z. B. eine Amylomaltase (auch: α-1,4-Glucan:D-Glukose 4- Glukosyltransferase, E.C. 2.4.1.3) aus Escherichia coli, für die folgender Reaktionsmechanismus vorgeschlagen wird:

Maltose + (1,4-α-Gukan)_n → D-Glukose + (1,4-α-Glukan)_n+1

(Palmer et al., 1976, Eur.J.Biochem. 69 : 105-115; Häselbarth et al., 1971, Biochim. Biophys. Acta 227 : 2996-3012). Das Gen für dieses cytoplasmatische Enzym, das an dem Maltosemetabolismus von E. coli beteiligt ist, wurde ebenfalls bereits beschrieben (Pugsley and Dubreuil, 1988, Mol. Microbiol. 2 : 473 ä479). Die synthetisierten α-1,4- Glukane, die unter geeigneten Bedingungen Kettenlängen ähnlich der Amylose erreichen können, finden entsprechende Anwendungen wie bereits oben für die durch Amylosucrase synthetisierten Glukane beschrieben.

Hexosyltransferasen werden bisher nur in geringem Umfang im Rahmen biotechnologischer Prozesse für die Herstellung von Polysacchariden verwendet.

Beschrieben wird die Verwendung von Dextransucrase (E.C. 2.4.1.5.) aus Leuconostoc mesenteroides (Stamm B-512) oder Leuconostoc dextranicum zur Herstellung von Isomalto-Oligosacchariden bzw. einer Gluco- Oligosaccharid-Mischung (EP 164655 und EP 164656). Ferner wird die Oligosaccharid-Synthese mit Hilfe der Verwendung von Dextransucrase­ produzierenden Bakterien, im speziellen Streptococcus bovis, beschrieben (J01 148195).

Weiterhin beschreibt die EP 117823 die Expression eines Lävansucrase- Gens aus Bacillus subtilis in E.coli mit dem Ziel, das Enzym zur Synthese von Fruktanen Saccharose-haltigen Lösungen zuzusetzen.

Um eine Kostensenkung der PHA-Produktionskosten durch eine Erweiterung des Substratspektrums von Alcaligenes eutrophus zu erreichen, wurde bisher zum einen versucht, durch Mutagenese Stämme zu erzeugen, die andere, kostengünstigere Substrate als der Wildtyp verwenden können, und zum anderen wurde versucht, in den Mikroorganismus Alcaligenes eutrophus heterologe Gene einzuführen, die den Transport alternativer Substrate, wie z. B. Saccharose, in die Zellen erlauben. Beide Ansätze erweisen sich aber als nicht gangbar. Bei der Mutagenese ist es notwendig, eine sehr große Anzahl von Klonen zu screenen, um einen geeigneten Klon zu erhalten. Bei der Einführung von heterologen Genen, die für Transportsysteme von alternativen Substraten kodieren, besteht häufig die Schwierigkeit, daß an derartigen Transportsystemen mehrere Gene beteiligt sind. Es ist daher notwendig, alle essentiellen Gene zu übertragen und sie mit Promotoren zu versehen, die in dem vorgesehen Wirt erkannt werden. Dabei tritt häufig die Schwierigkeit auf, daß die koordinierte Expression dieser Gene im neuen Wirt nicht korrekt verläuft und daher eine effektive Expression des Transportsystems nicht stattfindet. Um Transportsysteme für alternative Substrate auf einen anderen Mikroorganismus zu übertragen, ist es daher in der Regel erforderlich, die genaue Regulation der Gene zu kennen.

Die Aufgabe, eine ökonomischere PHA-Produktion zu ermöglichen, wird nun erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß ein gentechnologisches Verfahren bereitgestellt wird, mit dessen Hilfe Mikroorganismen, die in der Lage sind, intrazellulär PHA zu synthetisieren, insbesondere der Mikroorganismus Alcaligenes eutrophus, dahingehend verändert werden können, daß die Zellen extrazelluläre Hexosyltransferasen exprimieren.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Verfahren zur gentechnischen Veränderung eines Mikroorganismus, der in der Lage ist, intrazellulär PHB oder PHA zu synthetisieren, dadurch gekennzeichnet, daß in diesen Mikroorganismus heterologe DNA-Sequenzen eingebracht werden, die für ein Polypeptid kodieren, das Hexosyltransferaseaktivität aufweist, und daß diese DNA-Sequenzen mit Steuerelementen für die Transkription verknüpft sind, die die Expression in den Zellen sicherstellen, und diese DNA-Sequenzen eine Signalsequenz enthalten, die die Sekretion des synthetisierten Polypeptids gewährleistet.

Insbesondere betrifft die Erfindung ein derartiges Verfahren, dadurch gekennzeichnet, daß es folgende Schritte umfaßt:

• a) Konstruktion einer geeigneten Vektor-DNA, die die Expression eines extrazellulären Polypeptids, das Hexosyltransferase-Aktivität aufweist, erlaubt,
• b) Transformation eines geeigneten Mikroorganismus mit dem in Schritt a) konstruierten Vektor und
• c) Kultivierung des transformierten Mikroorganismus unter Bedingungen, die die Expression des Polypeptids erlauben.

Besonders bevorzugt ist ein Verfahren, bei dem es sich bei dem transformierten Mikroorganismus um den Mikroorganismus Alcaligenes eutrophus handelt oder um den Mikroorganismus Escherichia coli, der durch Einführung der Gene, die für die intrazelluläre PHA-Synthese verantwortlich sind, in der Lage, ist PHA zu produzieren.

Einen weiteren Gegenstand der Erfindung bilden die aus dem erfindungsgemäßen Verfahren resultierenden Mikroorganismen.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht zum einen, Mikroorganismen, die für die PHA-Produktion durch Fermentationsprozesse eingesetzt werden, unter Verwendung kostengünstiger Substrate zu kultivieren. Die ins Medium sekretierten Hexosyltransferasen führen zur Spaltung geeigneter, im Kulturmedium vorhandener Di-, Oligo- oder Polysaccharide. Durch diese Spaltung werden Hexosen freigesetzt, die von den Mikroorganismen aufgenommen und zum Zellwachstum bzw. zur Synthese intrazelluläre Produkte verwendet werden können.

Bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens stellen die Verfahren dar, bei denen in den entsprechenden Wirtsorganismus Hexosyltransferasen übertragen werden, die als Substrate Disaccharide, insbesondere Saccharose oder Maltose, verwenden. Bei der Verwendung von Saccharose als Substrat im Kulturmedium und Expression einer sekretierten Glukosyltransferase, wird im Medium Fruktose freigesetzt, die von den Mikroorganismen aufgenommen werden kann. Wie in Linko et al. (1993, Appl. Microbiol. Biotech. 39 : 11-15) beschrieben, stellt Fruktose ein besonders geeignetes Substrat für die intrazelluläre PHA-Synthese dar und führt im Vergleich zu anderen Kohlenstoffquellen zu einem besonders hohen Anteil an PHA am Trockengewicht der Zellen. Das erfindungsgemäße Verfahren stellt somit auch eine Möglichkeit zur Verfügung, das vorteilhafte, aber verhältnismäßig teure Substrat Fruktose aus dem wesentlich preiswerteren Substrat Saccharose zu erzeugen und eine Kostensenkung zu erreichen.

Die sekretierten Hexosyltransferasen ermöglichen darüberhinaus die extrazelluläre Synthese verschiedener Polysaccharide, wie oben ausführlich beschrieben wurde. Diese Polysaccharide besitzen größtenteils erhebliche kommerzielle Bedeutung. Sie können direkt aus dem Kulturmedium isoliert werden. Die intrazellulär gebildeten Polyhydroxyalkanoate können nach Abtrennen der Zellen von dem Kulturmedium aus den Zellen isoliert werden. Die gleichzeitige extrazelluläre Synthese dieser Polysaccharide in Verbindung mit der intrazellulären PHA-Synthese kann daher eine weitere Kostensenkung der Produktionskosten bedeuten und auf diese Weise zur Steigerung der Rentabilität des gesamten PHA-Produktionsprozesses beitragen.

Ein unter Verfahrensschritt a) angeführter Vektor, der die Expression eines extrazellulären Polypeptides, das Hexosyltransferase-Aktivität aufweist, erlaubt, enthält in der Regel folgende DNA-Sequenzen:

• i) ein oder mehrere Selektionsmarker-Gen(e)
• ii) DNA-Sequenzen, die die Replikation der Vektor-DNA in den gewählten Wirten sicherstellen,
• iii) eine Promotorsequenz, die die Expression des gewählten Hexosyltransferase-Gens in dem gewählten Wirtsorganismus gewährleistet,
• iv) eine DNA-Sequenz, die für ein Polypeptid mit Hexosyltransferase-Aktivität kodiert und in sense-Orientierung mit dem Promotor verknüpft ist,
• v) eine DNA-Sequenz am 3′-Ende des inserierten Gens, die als Terminationssignal für die Transkription dient,
• vi) gegebenenfalls eine Signalsequenz zwischen Promotor und kodierender Region, die die Sekretion des exprimierten Polypeptids sicherstellt.

Das Vorhandensein der einzelnen Sequenzen ist nicht immer unbedingt erforderlich und hängt von dem zur Expression verwendeten System ab. So ist die unter Punkt v) genannte DNA-Sequenz und der unter Punkt i) genannte Selektionsmarker nicht in jedem Fall erforderlich. Des weiteren müssen die DNA-Sequenzen, die die Expression eines Polypeptides mit Hexosyltransferase-Aktivität erlauben, nicht in jedem Fall auf einem Vektor lokalisiert sein, sondern können auch über homologe oder nicht­ homologe Rekombination in das Chromosom integriert sein, in einer oder mehreren Kopien an einem oder mehreren Loci. In diesem Fall muß auch die unter Punkt ii) genannte DNA-Sequenz nicht unbedingt vorhanden sein. Möglich ist des weiteren, daß nicht nur ein, sondern mehrere Gene, die für Hexosyltransferasen verschiedenen Typs kodieren, in einem Organismus zur Expression gebracht werden.

Die Konstruktion derartiger Vektoren und die Manipulation der verwendeten DNA-Sequenzen kann nach den dem Fachmann bekannten gängigen Techniken erfolgen. Geläufige Techniken sind z. B. ausführlich beschrieben in Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York; Methods in Enzymology, 1979, 1983, 1983, 1986 und 1987, Academic Press, New York, Vols. 68, 100, 101, 118 und 152-155; und DNA-Cloning, 1985 und 1987, Vols I, II, III, Glover, Hrsg., IRL Press, Oxford.

Als Promotorsequenz kann, sofern sie in dem gewählten Organismus aktiv ist, die natürlicherweise die Transkription des gewählten Hexosyltransferase-Gens steuernde DNA-Sequenz verwendet werden.

Diese Sequenz kann aber auch gegen andere Promotor-Sequenzen ausgetauscht werden. Es können sowohl Promotoren verwendet werden, die eine konstitutive Expression des Gens bewirken, als auch induzierbare Promotoren, die eine gezielte Regulation der Expression des nachgeschalteten Gens erlauben. Bakterielle und virale Promotorsequenzen mit diesen Eigenschaften sind in der Literatur ausführlich beschrieben. Promotoren, die eine besonders starke Expression des nachgeschalteten Gens erlauben, sind z. B. der T7- Promotor (Studier et al., 1990, in Methods in Enzymology 185 : 60-89), lacuv5, trp, trp-lacUV5 (DeBoer et al, in Rodriguez, R.L. and Chamberlin, M.J., (Eds.), Promotors, Structure and Function; Praeger, New York, 1982, pp.462-481; DeBoer et al, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 : 21-25), lp₁, rac (Boros et al., 1986, Gen 42 : 97-100) oder ompF. Bekannt sind unter anderem Promotoren, die durch Saccharose induzierbar sind, z. B. aus Bacillus amyloliquefaciens.

Die unter Punkt iv) angeführte DNA-Sequenz weist vorzugsweise eine Sequenz auf, die für eine Fruktosyltransferase, insbesondere eine Lävansucrase oder eine Inulosucrase, oder eine Glukosyltransferase, insbesondere Glukosyltransferasen des Typs GTS I, GTS S oder GTS SI aus Streptococcen, eine Amylosucrase, eine Amylomaltase oder eine Dextransucrase kodiert.

Möglich ist aber auch die Verwendung von DNA-Sequenzen, die für Dextranmaltase oder Dextrandextrinase kodieren.

Besitzt das gewählte Gen, das für eine Hexosyltransferase-Aktivität kodiert, in seinem 5′-Bereich keine DNA-Sequenz, die für eine die Sekretion der Hexosyltransferase sicherstellende Signalpeptid-Sequenz kodiert, so kann zwischen Promotor und kodierender DNA-Sequenz eine DNA-Sequenz inseriert werden, die für eine derartige Signalpeptid- Sequenz kodiert. Die verwendete Sequenz muß jeweils im selben Leserahmen wie die das Enzym kodierende DNA-Sequenz sein. Derartige Signalpeptid-Sequenzen sind z. B. bekannt von dem Gen, das für die Lävansucrase aus Bakterien der Gattung Bacillus kodiert (Borchert and Nagarajan, 1991, J. Bacteriol. 173 : 276-282).

Die Konstruktion eines unter Verfahrensschritt a) angeführten Vektors kann zum einen auf die Weise erfolgen, daß eine Expressionskassette, die aus folgenden Elementen aufgebaut ist

• (i) Steuerelementen für die Initiation der Transkription (Promotor)
• (ii) einer DNA-Sequenz, die für eine Hexosyltransferase-Aktivität kodiert und in sense-Orientierung mit dem Promotor verknüpft ist, sowie
• (iii) einer DNA-Sequenz am 3′-Ende des inserierten Gens, die als Terminationssignal für die Transkription dient

und die die Expression einer translatierbaren mRNA ermöglicht, in einem für den gewählten Wirt geeigneten Vektor konstruiert wird.

Zum anderen kann die Expressionskassette in einem gängigen Klonierungsvektor konstruiert, anschließend aus dem Klonierungsvektor unter Verwendung geeigneter Restriktionsenzyme isoliert und in einen für die Transformation des gewählten Wirts geeigneten Vektor inseriert werden.

Desweiteren kann ein Expressions-Vektor hergestellt werden, indem eine DNA-Sequenz, die für eine Hexosyltransferase-Aktivität kodiert, in einen Vektor inseriert wird, der bereits Steuerelemente für die Initiation der Transkription und eine DNA-Sequenz, die als Terminationssignal für die Transkription dient, enthält. In diesem Fall liegt zwischen den Steuerelementen für die Initiation der Transkription und dem Terminationssignal eine unikale Restriktionsschnittstelle oder ein Polylinker, in die die zu exprimierende DNA-Sequenz inseriert werden kann.

Im Fall der Verwendung von Alcaligenes eutrophus zur Expression einer extrazellulären Hexosyltransferase stehen Vektoren zur Verfügung, mit denen eine Vielzahl gram-negativer Bakterien transformiert werden kann, sogenannte "broad host range"-Vektoren. Diese enthalten DNA- Sequenzen, die sowohl eine Replikation der Plasmid-DNA in Bakterien wie E.coli als auch in Alcaligenes eutrophus sicherstellen. Zu diesen Vektoren zählen beispielsweise die Plasmide pLAFR3 und pLAFR6 (Staskawicz et al., 1987, J. Bacteriol. 169 : 5789-5794; Bonas et al., 1989, Mol. Gen. Genet. 218 : 127-136).

Die Einbringung von "broad host range"-Vektoren in Alcaligenes eutrophus erfolgt durch Konjugation mit einem E.coli-Stamm, der das entsprechende Plasmid enthält, und einem Helferstamm mit Hilfe des triparentalen Matings (Figurski and Helinski, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 : 1648-1652; Ditta et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 : 7347- 7351).

Die Kultivierung des transformierten Mikroorganismus erfolgt in Medien, die den Bedürfnissen des jeweils verwendeten Wirts entsprechen müssen, insbesondere unter Berücksichtigung von pH-Wert, Temperatur, Belüftung, etc.

Enthält das verwendete Kulturmedium Saccharose oder Maltose, so kommt es im Medium zur Synthese von Polysacchariden des entsprechenden Typs bei gleichzeitiger Freisetzung von Hexosen. Die Hexosen können von dem kultivierten Mikroorganismus aufgenommen werden. Die synthetisierten Polysaccharide können nach Abschluß des Fermentationsprozesses aus dem Kulturmedium isoliert werden. Das intrazellulär synthetisierte PHB wird nach Gewinnung der Zellen aus diesen nach den aus der Literatur bekannten Methoden isoliert.

Zur Vorbereitung der in den Verfahrensschritten angeführten DNA- Sequenzen stehen eine große Anzahl von Klonierungsvektoren zur Verfügung, die ein Replikationssignal für E.coli und ein Markergen zur Selektion transformierter Bakterienzellen enthalten. Beispiele für derartige Vektoren sind pBlueskript-Plasmide, pBR322, pUC-Serien, M13mp-Serien, pACYC184 usw. Die gewünschte Sequenz kann an einer passenden Restriktionsschnittstelle in den Vektor eingeführt werden. Das erhaltene Plasmid wird für die Transformation von E.coli-Zellen verwendet. Die Transformation kann in der Regel nach Standardmethoden durchgeführt werden, wie beschrieben in Maniatis et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1982, New York: Cold Spring Harbour Laboratory Press). Transformierte E.coli-Zellen werden in einem geeigneten Medium gezüchtet, anschließend geerntet und lysiert. Das Plasmid wird wiedergewonnen. Als Analysemethode zur Charakterisierung der gewonnen Plasmid-DNA werden im allgemeinen Restriktionsanalysen, Gelelektrophoresen, Sequenzierungsreaktionen und weitere biochemisch-molekularbiologische Methoden eingesetzt. Nach jeder Manipulation kann die Plasmid DNA mit Restriktionsendonukleasen gespalten werden und die isolierten DNA-Fragmente mit anderen DNA- Sequenzen verknüpft werden. Jede Plasmid-DNA-Sequenz kann in den gleichen oder anderen Plasmiden kloniert werden.

Verwendete Abkürzungen

GTF Glukosyltransferase
PHB Polyhydroxybutyrat

Claims (14)

1. Verfahren zur genetischen Veränderung eines Mikroorganismus, der in der Lage ist, intrazellulär PHB oder PHA zu synthetisieren, dadurch gekennzeichnet, daß in diesen Mikroorganismus heterologe DNA- Sequenzen eingebracht werden, die für ein oder mehrere Polypeptide kodieren, die Hexosyltransferaseaktivität aufweisen, und diese DNA- Sequenzen mit Steuerelementen für die Transkription verknüpft sind, die die Expression in den Zellen sicherstellen, und diese DNA-Sequenzen eine Signalsequenz enthalten, die die Sekretion des synthetisierten Polypeptids gewährleistet.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es folgende Schritte umfaßt:

• a) Konstruktion einer geeigneten Vektor-DNA, die die Expression eines extrazellulären Polypeptids, das Hexosyltransferase-Aktivität aufweist, erlaubt, wobei diese Vektor-DNA in der Regel folgende Sequenzen enthält:
  • i) ein oder mehrere Selektionsmarker-Gen(e)
  • ii) für den Fall der Nicht-Integration in die chromosomale DNA,DNA-Sequenzen, die die Replikation der Vektor-DNA in den gewählten Wirten sicherstellen,
  • iii) eine Promotorsequenz, die die Expression des gewählten Hexosyltransferase-Gens in dem gewählten Wirtsorganismus gewährleistet,
  • iv) eine DNA-Sequenz, die für ein Polypeptid mit Hexosyltransferase-Aktivität kodiert und in sense-Orientierung mit dem Promotor verknüpft ist,
  • v) in den meisten Fällen eine DNA-Sequenz am 3′-Ende des inserierten Gens, die als Terminationssignal für die Transkription dient,
  • vi) gegebenenfalls eine Signalsequenz zwischen Promotor und kodierender Region, die die Sekretion des exprimierten Polypeptides sicherstellt.
• b) Transformation eines geeigneten Mikroorganismus mit dem in Schritt a) konstruierten Vektor und
• c) Kultivierung des transformierten Mikroorganismus unter Bedingungen, die die Expression des Polypeptids erlauben.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die für ein Polypeptid mit Hexosyltransferase- Aktivität kodierende DNA-Sequenz für eine Glukosyltransferase kodiert.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die für ein Polypeptid mit Hexosyltransferase- Aktivität kodierende DNA-Sequenz für eine Fruktosyltransferase kodiert.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die für ein Polypeptid mit Hexosyltransferase- Aktivität kodierende DNA-Sequenz für eine Lävansucrase (E.C. 2.4.1.10.) kodiert.

6. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die für ein Polypeptid mit Hexosyltransferase- Aktivität kodierende DNA-Sequenz für eine Inulosucrase (E.C. 2.4.1.9.) kodiert.

7. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die für ein Polypeptid mit Hexosyltransferase- Aktivität kodierende DNA-Sequenz für eine Amylosucrase (E.C. 2.4.1.4.) kodiert.

8. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die für ein Polypeptid mit Hexosyltransferase- Aktivität kodierende DNA-Sequenz für eine Amylomaltase (E.C. 2.4.1.3.) kodiert.

9. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die für ein Polypeptid mit Hexosyltransferase- Aktivität kodierende DNA-Sequenz für eine Dextransucrase (E.C. 2.4.1.5.) kodiert.

10. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die für ein Polypeptid mit Hexosyltransferase- Aktivität kodierende DNA-Sequenz für eine Glukosyltransferase des Typs S, I oder SI aus einer Streptococcus-Spezies kodiert.

11. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die für ein Polypeptid mit Hexosyltransferase- Aktivität kodierende DNA-Sequenz für eine Dextrandextrinase kodiert.

12. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der für die Transformation verwendete Mikroorganismus Alcaligenes eutrophus ist.

13. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der für die Transformation verwendete Mikroorganismus Escherichia coli ist.

14. Mikroorganismen erhältlich aus einem Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 13.