DE4417169A1

DE4417169A1 - Rekombinante Herstellung von Polyhydroxyalkanoaten in glucosefreiem Medium

Info

Publication number: DE4417169A1
Application number: DE19944417169
Authority: DE
Inventors: Werner Dr Lubitz; Stefanie Dr Resch
Original assignee: Vogelbusch GmbH
Current assignee: LUBITZ, WERNER, PROF. DR., WIEN, AT
Priority date: 1994-05-17
Filing date: 1994-05-17
Publication date: 1995-11-23

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Polyhydroxyalkanoaten in einem prokaryontischen Wirtsorganis mus, der die für eine Biosynthese von Hydroxyalkanoat-Polymeren verantwortlichen Gene enthält, durch Züchtung des Wirtsorganis mus in einem Kulturmedium unter solchen Bedingungen, die zur Bildung von Polyhydroxyalkanoaten durch den Wirtsorganismus führen.

Polyhydroxybuttersäure (PHB und andere Polyhydroxyalkanoate (PHA) sind natürliche Polyester, die in Reaktion auf Streßbe dingungen von verschiedenen Bakterien gebildet und als intra zelluläre Granulate angereichert werden (Anderson et al., Microbiol. Rev. 54 (1990), 450-472). Dabei werden durch verschiedene Bakterien Hydroxyalkanoat -Homopolymere oder -Copolymere erzeugt, die Monomere mit unterschiedlichen Ketten längen, insbesondere C₃-C₁₂-Hydroxycarbonsäuren enthalten. Die am besten charakterisierten PHA stammen aus Alcaligenes eutrophus und Pseudomonas oleovorans. A. eutrophus erzeugt PHB oder Copolymere von PHB, die Hydroxyalkanoat-Einheiten mit einer Kettenlänge von 3 bis 5 Kohlenstoffatomen enthalten, wobei Poly-3-hydroxybuttersäure und Poly-3-hydroxyvaleriansäure die Hauptkomponenten sind. P. oleovorans erzeugt PHA-Copolyme re, die aus Hydroxyalkanoaten mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen aufgebaut sind.

In A. eutrophus wird PHB oder ein PHB-Copolymer aus Acetyl- Coenzym A durch drei aufeinanderfolgende enzymatische Reaktio nen erzeugt, die durch (i) β-Ketothiolase (phbA), (ii) Aceto acetyl-CoA-Reduktase (phbB) und (iii) PHB-Synthase (phbC) katalysiert werden.

Das diese drei Gene enthaltende phbcAB-Operon von A. eutrophus A16 wurde in E.coli kloniert (Janes et al. (1990), Molecular Characterization of the Poly-β-hydroxybutyrate Biosynthetic Pathway of Alcaligenes eutrophus H16. In: Novel Biodegradable Microbial Polymers (Dawes, E.A., Hrsg.) S. 175-190, Kluwer, Dordrecht). Die Expression dieses Operons in rekombinanten E.coli-Zellen führt bei Verwendung eines glucosehaltigen Kulturmediums zur Bildung von 67 Gew.-% PHB bezüglich des Trockengewichts der Zelle. Bei Subklonierung der Gene auf diesem Operon in zwei verschiedene Plasmide, von denen eines das phbA- und das phbB-Gen unter transkriptioneller Kontrolle der lac-Promotor/Operator-Region enthält und das zweite das phbC-Gen mit seiner natürlichen Promotorsequenz enthält, findet man bei Züchtung eines mit diesen Plasmiden transformierten rekombinanten E.coli in einem glucosehaltigen Kulturmedium, daß sogar mehr als 90 Gew.-% des Trockengewichts der Zelle PHB sind. (Kalousek et al., in Proceedings of the International Symposium on Bacterial Polyhydroxyalkanoates, Schlegel, H.G., Steinbüchel. A, Hrsg., Golke Druck, Göttingen 1993.)

Es besteht ein erhebliches Interesse an der kommerziellen Ver wertung von Polyhydroxyalkanoaten, da diese Polymere thermopla stische Eigenschaften aufweisen, biologisch abbaubar sind und aus erneuerbaren Kohlenstoffquellen erzeugt werden können. So wird beispielsweise eine Glucose-verwendende Mutante von A. eutrophus als Produktionsstamm zur Massenproduktion eines aus β-Hydroxybuttersäure und β-Hydroxyvaleriansäure bestehenden Copolyesters verwendet (PHB-co-HV). Dieser Copolyester ist unter dem Warenzeichen Biopol seit 1982 kommerziell erhältlich.

Obwohl PHB und andere Polyhydroxyalkanoate ein großes Potential als Quelle von erneuerbaren und biologisch abbaubaren thermo plastischen und elastomeren Substanzen besitzen, ist ihr Preis viel höher als der von aus Erdöl stammenden Kunststoffen, wie etwa Polyethylen. Der wichtigste Faktor, der die Anwendung von biologisch erzeugten PHA-Kunststoffen begrenzt, sind gegen wärtig die Produktionskosten. Folglich besteht ein starkes Bedürfnis, diese Produktionskosten zu verringern.

Hierzu wurden neue Bakterienstämme entwickelt, die anstelle der sehr teuren Glucose, die am häufigsten als Medienzusatz zur PHA-Erzeugung verwendet wird, andere Kohlehydrate wie Lactose, Galactose und Saccharose enthalten (Steinbüchel (1991), Polyhydroxyalkanoic Acids. In: Biomaterials (D. Byrom, Hrsg.), pp. 123-213, MacMillan, Basingtoke). Page (FEMS Microbiol. 103 (1992), 149-157) beschreibt einen Azotobacter vinelandii Mutan tenstamm, der ein PHB-co-HV-Copolymer bei Kultivierung auf ver schiedenen nicht-raffinierten Zuckerquellen einschließlich Rübenmolasse, Rohrmolasse und Maissirup erzeugt. Weiterhin wurde vor kurzem gezeigt, daß PHB in genetisch manipulierten Pflanzen erzeugt wird, die die Gene von A. eutrophus exprimie ren (Poirier et al., FEMS Microbiol. Rev. 103 (1992), 137-146).

Der Nachteil aller aus dem Stand der Technik bekannten Ver fahren zur Herstellung von Polyhydroxyalkanoaten besteht jedoch darin, daß PHA in Kulturmedien, die keine Glucose oder andere Kohlehydrate als Kohlenstoffquelle enthalten, bisher nur in geringer Ausbeute erzeugt werden konnten. Die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe bestand somit darin, ein Verfahren zur Herstellung von Polyhydroxyalkanoaten bereitzu stellen, bei dem man ein kostengünstiges Kulturmedium verwenden kann und gleichzeitig das Polymer in hoher Ausbeute erhält.

Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung von Polyhydroxyalkanoaten in einem prokaryontischen Wirts organismus, der die für eine Biosynthese von Hydroxyalkanoat- Polymeren erforderlichen Gene enthält, durch Kultivierung des Wirtsorganismus in einem Medium unter solchen Bedingungen, die zur Bildung von Polyhydroxyalkanoaten durch den Wirtsorganismus führen, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen Wirtsorganismus, der mindestens eine Kopie eines Polyhy droxyalkanoat -Synthasegens unter gesteigerter Expressionskon trolle enthält, und ein im wesentlichen glucosefreies Kulturme dium verwendet.

Unter dem Begriff "gesteigerte Expressionskontrolle" im Sinne der vorliegenden Erfindung ist eine Erhöhung der Expression des Polyhydroxyalkanoat-Synthasegens gegenüber dem nativen Gen in einem glucosefreien Kulturmedium zu verstehen. Diese gestei gerte Expressionskontrolle kann vorzugsweise dadurch erfolgen, daß man

(a) eine heterologe Transkriptionsregulationssequenz,
(b) eine heterologe Translationsregulationssequenz oder
(c) eine Kombination aus (a) und (b) verwendet.

Besonders bevorzugt ist es, einen Mikroorganismus zu verwenden, der das Polyhydroxyalkanoat-Synthasegen in gesteigerter Kopien zahl, z. B. auf einem extrachromosomalen Multicopy-Plasmid, und unter Kontrolle einer heterologen Transkriptions- oder/und Translationsregulationssequenz enthält.

Die vorliegende Erfindung beruht auf der überraschenden Erkenntnis, daß bei Verwendung eines Mikroorganismus, der das Polyhydroxybuttersäure-Synthasegen aus Alcaligenes eutrophus unter gesteigerter Expressionskontrolle enthält, die z. B. erreicht wird, indem die nativell Transkriptionsregulations sequenz durch eine heterologe Transkriptionsregulationssequenz, z. B. den E.coli lac-Promotor/Qperator, ersetzt wird, eine hohe Synthese von Hydroxybuttersäurepolymeren auch bei Verwendung eines im wesentlichen von Glucose und anderen Kohlehydraten freien Kulturmediums möglich ist. Im Gegensatz dazu zeigt eine E. coli-Zelle, die das Polyhydroxybuttersäure-Synthasegen unter Kontrolle der "nativen" Transkriptionsregulationssequenz enthält, unter gleichen Bedingungen eine ganz erheblich geringere Bildung von Polyhydroxybuttersäure.

Durch die vorliegende Erfindung ist es möglich, Polyhydroxyal kanoate in prokaryontischen Organismen unter Verwendung eines im wesentlichen glucosefeien Mediums zu erzeugen, wodurch die Herstellungskosten des Polymers signifikant, d. h. um einen Faktor von bis zu 3, verringert werden können.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist zur Herstellung von "Hydroxyalkanoat-Polymeren" bzw. "Polyhydroxyalkanoaten" geeignet, d. h. von Polyhydroxyfettsäure-Polymeren oder -Copolymeren, in denen die Hydroxycarbonsäure -Monomereinheiten eine Kettenlänge von vorzugsweise 3 bis 12 Kohlenstoffatomen aufweisen. Besonders bevorzugt sind Polyhydroxybuttersäure und Polyhydroxybuttersäure-Copolymere, insbesondere Polyhydroxybut tersäure-Polyhydroxyvaleriansäure-Copolymere.

Der im erfindungsgemäßen Verfahren zur Bildung der Polyhydroxy alkanoate verwendete prokaryontische Wirtsorganismus kann ein an sich beliebiger Wirtsorganismus sein, vorausgesetzt, daß er zur Bildung von Polyhydroxyalkanoaten unter den jeweiligen Kultivierungsbedingungen in der Lage ist. Vorzugsweise ist der Wirtsorganismus ein gram-negativer prokaryontischer Wirts organismus. Besonders bevorzugt verwendet man E.coli als Wirtsorganismus, da die Kultivierung von E.coli leicht und ohne größere Schwierigkeiten auch in wenig komplexen Medien erfolgen kann. Es kann jedoch auch bevorzugt sein, als Wirtsorganismus diejenige Bakterienart zu verwenden, aus der das im erfindungs gemäßen Verfahren eingesetzte Polyhydroxyalkanoat-Synthasegen ursprünglich stammt, z. B. Alcaligenes eutrophus.

Der Wirtsorganismus muß beim erfindungsgemäßen Verfahren minde stens eine Kopie des Polyhydroxyalkanoat-Synthasegens unter ge steigerter Expressionskontrolle enthalten. In einer Ausfüh rungsform der Erfindung wird hierzu ein Polyhydroxyalkanoat- Synthasegen unter Kontrolle einer heterologen Transkriptions regulationssequenz verwendet. Unter einer Transkriptions regulationssequenz im Sinne der vorliegenden Erfindung ist eine DNA-Sequenz zu verstehen, die einen Promotor, d. h. einen für die Bindung der RNA-Polymerase verantwortlichen Bereich, sowie gegebenenfalls einen Operator, d. h. einen für die Bindung eines Repressors verantwortlichen Bereich und einen Enhancer, d. h. einen für die Bindung eines Induktors verantwortlichen Bereich, umfaßt. Unter einer "heterologen" Transkriptionsregulations sequenz ist zu verstehen, daß die "native" Transkriptions regulationssequenz soweit verändert wurde, daß eine effiziente Transkription des Gens auch ohne Vorhandensein von Glucose oder anderen Kohlehydraten im Medium stattfindet. Dies kann z. B. durch partielle oder vollständige Deletion der nativen Promo tor/Operator-Sequenzen des phbC-Gens und durch Insertion eines heterologen Promotors, d. h. eines Promotors, der von einem fremden Gen stammt, erfolgen.

Zweckmäßigerweise verwendet man einen heterologen Promotor, der im jeweiligen Wirtsorganismus für eine effiziente Transkription sorgen kann. Beispiele für derartige Promotoren sind dem Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie geläufig. Bevorzugte Beispiele sind Transkriptionsregulationssequenzen aus E.coli oder E.coli-Phagen (z. B. Bacteriophage λ) oder davon abgeleitete Transkriptionsregulationssequenzen, z. B. syn thetische oder modifizierte Sequenzen. Besonders bevorzugt sind induzierbare Transkriptionsregulationssequenzen, z. B. die E.coli lac- oder trp-Transkriptionsregulationssequenz oder die λ-P_L-Transkriptionsregulationssequenz oder davon abgeleitete Sequenzen (z. B. die synthetische tac-Transkriptionsregula tionssequenz).

Um zu erreichen, daß die native Transkriptionsregulations sequenz des Polyhydroxyalkanoat-Synthasegens nicht mehr funktionell ist, d. h. nicht mehr wie die native Sequenz bei Abwesenheit von Glucose oder anderen Kohlehydraten reprimierbar ist, werden die entsprechenden DNA-Abschnitte aus dem Trans kriptionsregulationsbereich des phbC-Gens partiell oder vollständig deletiert oder soweit verändert, daß sie nicht länger funktionell sind. Vorzugsweise werden mindestens 100 Basenpaare, besonders bevorzugt mindestens 200 Basenpaare und noch mehr bevorzugt mindestens 300 Basenpaare stromaufwärts des Transkriptionsstarts deletiert. Am meisten bevorzugt wird der gesamte 5′-seitige Bereich des Transkriptionsstarts deletiert.

Beim phbC-Gen aus Alcaligenes eutrophus wurde z. B. der Trans kriptionsstart 307 bp stromaufwärts des phbC-ATG-Startkodons identifiziert. Dementsprechend befindet sich die Transkrip tionsregulationssequenz dieses Gens im Bereich stromaufwärts des ATG-Startkodons. Für eine gesteigerte Expressionskontrolle kann dieser Bereich teilweise oder vollständig deletiert werden.

Entsprechende Veränderungen zum Erreichen einer gesteigerten Expressionskontrolle können analog auch bei anderen PHA- Synthasegenen im Bereich stromaufwärts des Transkriptionsstarts durchgeführt werden. Am meisten bevorzugt wird dieser Bereich vollständig deletiert und durch eine geeignete heterologe Sequenz ersetzt.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfah rens wird ein Polyhydroxyalkanoat-Synthasegen verwendet, das zur gesteigerten Expressionskontrolle eine heterologe Trans lationsregulationssequenz, d. h. eine Shine-Dalgarno-Sequenz enthält. Vorzugsweise wird eine solche Shine-Dalgarno-Sequenz verwendet, die zu einer wirksamen Bindung der ribosomalen RNA des jeweiligen Wirtsorganismus und somit zu einer effizienten Translationsinititation in der Lage ist. Vorzugsweise enthält die Translationsregulationssequenz hierzu eine mindestens 5, besonders bevorzugt mindestens 6 Nucleotide lange Basenfolge, die zur Anti-Shine-Dalgarno-Sequenz am 3′-Ende der 16 S rRNA des jeweiligen Wirtsorganismus komplementär ist. Besonders bevorzugt umfaßt die Translationsregulationssequenz die zum 3′- Ende der 16S rRNA von E.coli komplementäre Basenfolge 5′- AAGGAG-3′, wobei das 3′-Ende dieser Basenfolge einen Abstand von 6 bis 10 Nucleotiden, insbesondere 8 Nucleotiden, vom ATG- Startkodon des Polyhydroxyalkanoat-Synthasegens aufweist.

Zusätzlich kann die Translationsregulationssequenz strom aufwärts der zur Anti-Shine-Dalgarno-Sequenz komplementären Basenfolge, vorzugsweise unmittelbar stromaufwärts eine weitere Basenfolge 5′-TTAACTTTA-3′ umfassen. Als besonders geeignet für das erfindungsgemäße Verfahren hat sich die in Fig. 1 gezeigte Translationsregulationssequenz von Gen 10 des Bakteriophagen T7 erwiesen. Weiterhin geeignet sind auch andere ribosomale Bindungsstellen, wie sie z. B. in Winnacker, Gene und Klone, Eine Einführung in die Gentechnologie (1985), VCH-Verlags gesellschaft mbH, Weinheim, Bundesrepublik Deutschland, S 217 ff. angegeben sind.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die gesteigerte Expressionskontrolle dadurch er reicht, daß sich das Polyhydroxyalkanoat-Synthasegen unter Kon trolle einer heterologen Transkriptionsregulationssequenz und einer heterologen Translationsregulationssequenz wie oben defi niert befindet.

Das im vorliegenden Verfahren verwendete Polyhydroxyalkanoat- Synthasegen kann aus einem beliebigen Organismus stammen, der ein solches Synthasegen enthält. Wesentlich für das erfindungs gemäße Verfahren ist, daß sich das Gen unter Kontrolle einer heterologen Transkriptionsregulationssequenz befindet, d. h. daß die Regulation der Genexpression durch die native Transkrip tionsregulationssequenz nicht mehr funktionell aktiv ist.

Beispielsweise kann das Polyhydroxyalkanoat-Synthasegen aus Mi kroorganismen der Gattungen Bacillus, Alcaligenes, Zoogloea, Pseudomonas, Chromatium und Thiocystis stammen. Die Isolierung und Charakterisierung von Polyhydroxyalkanoat-Biosynthesegenen aus diesen Organismen wurde bereits beschrieben: Für Alcalige nes eutrophus (siehe z. B. Slater et al., J. Bacteriol. 170 (1988), 4431-4436, Schubert et al., J. Bacteriol. 170 (1988), 5837-5847, Peoples und Sinkey, J. Biol. Chem. 264 (1989), 15293-15297, Janes et al., Molecular Characterization of the Poly-β-Hydroxybutyrate Biosynthetic Pathway of Alcaligenes eutrophus H16. In Novel Biodegradable Microbial Polymers (Dawes, E.A., Hrsg.), S. 175-190, Kluwer, Dordrecht, Schubert et al., J. Bacteriol. 173 (1991), 168-175); für Zoogloea ramigera (Peoples et al., J. Biol. Chem. 262 (1987), 97-102, Peoples und Sinskey, Mol. Microbiol. 3 (1989), 349-357); für Pseudomonas olevorans (Husiman et al., J. Biol. Chem. 266 (1991), 2191-2198) und für Chromatium vinosum und Thiocystis violacea (Liebergesell und Steinbüchel, Eur. J. Biochem. 209 (1992), 135-150; Liebergesell et al., FEMS Microbiol. Lett. 99 (1992), 227-232). Auf den Inhalt dieser Arbeiten wird hiermit ausdrücklich Bezug genommen. Besonders bevorzugt stammt das Polyhydroxyalkanoat-Synthasegen aus Alcaligenes eutrophus. Selbstverständlich umfaßt die vorliegende Erfindung auch die Verwendung von Polyhydroxyalkanoat-Synthasegenen, die durch rekombinante DNA-Techniken modifiziert worden sind.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird ein Wirtsorganismus ver wendet, der die für eine Biosynthese von Hydroxyalkanoat- Polymeren erforderlichen Gene enthält, wobei das PHA-Syn thasegen unter gesteigerter Expressionskontrolle steht. Die Herstellung solcher Organismen erfolgt typischerweise durch rekombinante DNA-Methoden, insbesondere durch Transformation eines Ausgangsorganismus mit einer rekombinanten DNA, die das PHA-Synthasegen unter Kontrolle einer heterologen Transkriptions- oder/und Translationsregulationssequenz enthält. Diese rekombinante DNA befindet sich vorzugsweise auf einem rekom binanten Vektor, der weiterhin einen für den jeweiligen zu verwendenden Wirtsorganismus geeigneten Replikationsursprung sowie gegebenenfalls einen Selektionsmarker enthält. Die Transformation von prokaryontischen Organismen durch geeignete Vektoren gehört zum Allgemeinwissen eines Fachmanns auf dem Gebiet der Molekularbiologie und braucht hier nicht näher erläutert zu werden.

Der zur Transformation des Ausgangsorganismus verwendete rekom binante Vektor kann beispielsweise ein Plasmidvektor, d. h. ein zirkulärer extrachromosomaler Vektor, oder ein Bakteriophagen vektor (z. B. ein Lambda-Vektor) oder ein filamentöser Bakterio phagenvektor (M13, f1 und fd) oder ein Cosmidvektor sein (siehe z. B. Sambrook et al., Molecular Cloning. A baboratory Manual, 2nd Ed. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Kap. 1, 2, 3 und 4). Vorzugsweise wird als rekombinanter Vektor ein Plasmidvektor, insbesondere ein Multi Copy-Plasmidvektor verwendet.

Der beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Wirtsorganismus enthält die für eine Biosynthese von Hydroxyalkanoat-Polymeren erforderliche Gene. Neben dem Polyhydroxyalkanoat-Synthasegen handelt sich dabei üblicherweise um ein β-Ketothiolasegen oder/und ein Acetoacetyl-CoA-Reduktasegen. Bei Verwendung eines Wirtsorganismus, der eines oder beide dieser oben genannten Gene nicht enthält, ist es zweckmäßig, das betreffende Gen bzw. die betreffenden Gene in den Wirtsorganismus einzuführen, um den Substratpool für die Polyhydroxyalkanoat-Synthase zu erhöhen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält der Wirtsorganismus auch das β- Ketothiolasegen oder/und das Acetoacetyl-CoA-Reduktasegen unter gesteigerter Expressionskontrolle.

Um eine gesteigerte Expressionskontrolle zu erreichen, können das β-Ketothiolasegen oder/und das Acetoacetyl-CoA-Reduktasegen beim erfindungsgemäßen Verfahren - wie z. B. im nativen PHB- Operon von Alcaligenes eutrophus - unter Kontrolle einer einzigen Transkriptionsregulationssequenz stehen, vorausge setzt, daß es sich um eine heterologe Transkriptionsregula tionssequenz handelt, die gleich oder verschieden zu einer heterologen Transkriptionsregulationssequenz für das PHA- Synthasegen sein kann. Hierzu können z. B. das PHA-Synthasegen, das β-Ketothiolasegen und das Acetoacetyl-CoA-Reduktasegen im Wirtsorganismus auf einem einzigen extrachromosomalen Plasmid unter Kontrolle gleicher oder verschiedener Transkriptions regulationssequenzen angeordnet sein. Andererseits kann der Wirtsorganismus auch zwei verschiedene kompatible Plasmide mit unterschiedlichen Replikationsursprüngen enthalten, wobei das erste Plasmid das PHA-Synthasegen unter Kontrolle einer ersten heterologen Transkriptionsregulationssequenz und das andere Plasmid das β-Ketothiolasegen und das Acetoacetyl-CoA-Reduk tasegen unter Kontrolle einer zweiten heterologen Transkrip tionsregulationssequenz enthält, wobei die erste und die zweite Transkriptionsregulationssequenz gleich oder verschieden sein können.

Andererseits führt auch die Verwendung einer heterologen Trans lationssequenz alleine schon zu einer gesteigerten Expressions kontrolle.

Ein weiteres wesentliches Merkmal des erfindungsgemäßen Verfah rens besteht darin, daß man ein im wesentlichen glucosefreies Kulturmedium verwendet. Unter einem im wesentlichen glucose freien Kulturmedium ist ein Medium zu verstehen, das weniger als 0,01 Gew.-% Glucose, vorzugsweise weniger als 0,001 Gew.-% Glucose, besonders bevorzugt weniger als 0,0001 Gew.-% Glucose und am meisten bevorzugt überhaupt keine (als solche zugesetz te) Glucose enthält. Weiterhin ist es bevorzugt, daß das Kulturmedium im wesentlichen auch keine anderen Kohlehydrate, z. B. Fructose, Lactose, Maltose, Saccharose und ähnliche Zucker in gereinigter oder roher Form enthält. Auf diese Weise erzielt man eine erhebliche Kostenverringerung bei der Fermentation des Wirtsorganismus, ohne gleichzeitig eine drastische Einbuße der PHB-Ausbeute in Kauf nehmen zu müssen.

Beispiele für geeignete Kulturmedien sind solche, die zur Züch tung des jeweiligen Wirtsorganismus geeignet sind. Solche Medien enthalten eine Stickstoff- und eine Kohlenstoffquelle, wobei die Kohlenstoffquelle keine Glucose und vorzugsweise auch kein anderer Zucker ist. Beispiele für geeignete Kohlenstoff quellen sind Fleischextrakte, Bakterienextrakte, Hefenextrakte, Casaminosäuren oder im wesentlichen zuckerfreie industrielle Abwässer, die Aminosäuren oder/und Bestandteile von Mikroorga nismen wie etwa Hefen und Bakterien enthalten. In einer Ausführungsform der Erfindung verwendet man "Vollmedien", die als Kohlenstoffquellen enzymatisch verdaute Fleisch-, Bakterien- und/oder Hefeextrakte enthalten. Spezifische Beispiele hierfür sind das bB-Medium, das NZCYM-Medium, NZYM-Medium, das NZM- Medium, das Terrific-Broth-Medium, das SOB-Medium oder das YT- Medium, deren Zusammensetzung in Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd. Edition (1989), Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Appendix H) beschrieben ist.

Bei Verwendung derartiger Medien ohne Glucosezusatz wurde erfindungsgemäß eine Ausbeute von bis zu 70 Gew.-% PHB bezüg lich des Trockengewichts der Zelle gefunden, während ein Mikroorganismus, der das Polyhydroxyalkanoat-Synthasegen ohne gesteigerte Expressionskontrolle enthält, unter vergleichbaren Bedingungen maximal 10 Gew.-% PHB bildet.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann man auch ein Mineralmedium (z. B. ein M9-Medium, vgl. Sambrook et al., supra) verwenden, dem eine Kohlenstoff quelle, wie etwa Casaminosäuren oder eine andere der oben genannten C-Quellen in einem Anteil von 0,01 bis 1 Gew.-%, besonders bevorzugt 0,02 bis 0,5 Gew.-% und am meisten bevor zugt 0,05 bis 0,2 Gew.-% zugesetzt wird. Bei Verwendung eines Mineralmediums ist es weiterhin bevorzugt, daß der pH-Wert-Be reich von 6,5 bis 7,5 eingestellt wird. Bei Verwendung eines Mineralmediums oder eines mit Mineralmedium (vorzugsweise im Verhältnis von 2 : 1 bis 9 : 1) verdünnten Vollmediums erhält man eine PHB-Ausbeute von bis zu 40 Gew.-% auf Basis des Gesamtzel lentrockengewichts. Diese Ausbeute ist zwar etwas geringer als die bei Verwendung eines Vollmediums. Aufgrund des geringeren Preises eines Mineralmediums oder eines verdünnten Vollmediums kann jedoch deren Verwendung in vielen Fällen bevorzugt sein.

Weitere Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens sind, daß die Kultivierung des Wirtsorganismus durch die gesteigerte Expres sionskontrolle des Polyhydroxyalkanoat-Synthasegens und der anderen Gene des PHB-Operons überraschenderweise nicht beein trächtigt wird und daß durch das erfindungsgemäße Verfahren bereits während einer frühen Phase (ca. 2 bis 7 h) der Kulti vierung des Wirtsorganismus eine höhere Produktbildung als bei einem Wirtsorganismus ohne gesteigerte Expressionskontrolle in einem glucosehaltigen Kulturmedium zu erkennen ist.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine re kombinante DNA, die ein Polyhydroxyalkanoat-Synthasegen unter gesteigerter Expressionskontrolle, vorzugsweise unter Kontrolle

(a) einer heterologen Transkriptionsregulationssequenz,
(b) einer heterologen Translationsregulationssequenz oder
(c) einer Kombination von (a) und (b) enthält.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein rekombinanter Vektor, der mindestens eine Kopie einer erfin dungsgemäßen rekombinanten DNA enthält. Vorzugsweise ist der erfindungsgemäße Vektor ein extrachromosomaler zirkulärer Plasmidvektor, der neben der erfindungsgemäßen rekombinanten DNA einen mit dem jeweiligen Wirtsorganismus geeigneten Replikationsursprung sowie gegebenenfalls einen Selektions marker (z. B. ein Antibiotikumresistenzgen) enthält. Der erfindungsgemäße Vektor ist ein prokaryontischer Vektor, d. h. ein zur Expression des PHA-Synthasegens in einem prokaryonti schen Wirtsorganismus geeigneter Vektor.

Die Erfindung betrifft auch eine prokaryontische Zelle, die mit einer erfindungsgemäßen rekombinanaten DNA oder mit einem erfindungsgemäßen rekombinanten Vektor transformiert ist. Die erfindungsgemäße prokaryontische Zelle ist vorzugsweise eine gram-negative prokaryontische Zelle und ist besonders bevorzugt eine E.coli-Zelle. Vorzugsweise enthält die erfindungsgemäße prokaryontische Zelle weiterhin ein β-Ketothiolasegen oder/und ein Acetoacetyl-CoA-Reduktasegen unter gesteigerter Expres sionskontrolle.

Die erfindungsgemäße rekombinante DNA kann zur Synthese von Polyhydroxyalkanoaten in prokaryontischen Wirtsorganismen verwendet werden. Ein hierfür geeigneter Wirtsorganismus enthält vorzugsweise darüber hinaus ein β-Ketothiolasegen und ein Acetoacetyl-CoA-Reduktasegen.

Die Plasmide pSYN (E.coli BMH 71-18) und pUMS (E.coli DH5 alpha) wurden am 12.05.1994 bei der DSM - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen mbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig unter den Nummern DSM 9202 (pSYN) und DSM 9201 (pUMS) hinterlegt.

Weiterhin wird die vorliegende Erfindung unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele, Figuren und Sequenzprotokolle erläu tert.

Es zeigen:

Fig. 1a eine schematische Darstellung des Plasmids p4A, welches das komplette phbCAB-Operon unter Kontrolle der nativen Transkriptionsregulationssequenz enthält,

Fig. 1b eine schematische Darstellung des Plasmids pUMS, wel ches die Gene phbA und phbB unter Kontrolle des lac- Promotor/Operators enthält,

Fig. 1c eine schematische Darstellung des Plasmids pDSP, wel ches das phbC-Gen unter Kontrolle der nativen Trans kriptionsregulationssequenz enthält,

Fig. 1d eine schematische Darstellung des Plasmids pSYN, wel ches das phbC-Gen unter Kontrolle des lac-Promo tor/Operators und der Shine-Dalgarno-Sequenz von Gen 10 des Bakteriophagen T7 enthält,

Fig. 2a eine schematische Darstellung des positiven Selek tionsvektors pGS23, der die ribosomale Bindungsstelle des Bacteriophagen T7 Gen 10 enthält,

Fig. 2b eine schematische Darstellung der Plasmide puc19-THIO und pG5-THIO, die das phbA-Gen unter Kontrolle des lac-Promotor/Operators und der nativen bzw. der T7 Gen 10 SD-Sequenz enthalten.
SEQ ID NO. 1: das synthetische Oligonukleotid (1),
SEQ ID NO. 2: das synthetische Oligonukleotid (2),
SEQ ID NO. 3: das synthetische Oligonukleotid (3),
SEQ ID NO. 4: das synthetische Oligonukleotid (4),
SEQ ID NO. 5: das synthetische Oligonukleotid (5),
SEQ ID NO. 6: das synthetische Oligonukleotid (6) und
SEQ ID NO. 7: das synthetische Oligonukleotid (7).

Beispiele Beispiel 1 Konstruktion von Plasmiden 1.1 Konstruktion des Plasmids pUMS

Als Ausgangsmaterial diente das Plasmid p4A, das alle drei Gene des PHB-Operons aus Alcaligenes eutrophus unter Kontrolle ihrer nativen Transkriptionsregulationssequenz in der in Fig. 1a ge zeigten schematischen Anordnung enthält. Dieses Plasmid wurde bereits von Janes et al. (1990), Molecular Characterization of the Poly-β-hydroxybutyrate Biosynthetic Pathway of Alcaligenes eutrophus H16. In: Novel Biodegradable Microbial Polymers (Dawes, E.A., Hrsg.) S. 175-190, Kluwer, Dordrecht, beschrie ben.

Zur Konstruktion von pUMS wurden die phbA- und phbB-Gene aus dem Plasmid p4A in das Plasmid pUM1 kloniert, das ein Derivat von pACYC184 (Chang und Cohen, J. Bacteriol. 134 (1978), 1141- 1156) ist, in dem das 0,5 kb PvuII-Fragment mit dem Kanamycin- Resistenzgen durch das 0,8 kb PvuII-Fragment aus pUc19 (Yanisch-Perron et al., Gene 33 (1985), 103-119) ersetzt wurde, auf dem sich die lac-Promotor-Operator-Sequenz befindet. Ein 2,3 kb PstI-Fragment des Plasmids p4A wurde nach partieller Spaltung des Plasmids isoliert und in die PstI-Restriktions stelle des Plasmids pUM1 insertiert. Die Ligationsmischung wurde dann zur Transformation von E.coli CQ21 (Raab et al., J. Mol. Biol. 199 (1988), 5-105) durch Elektroporation nach der von Zabarovsky und Winberg (Nucleic Acids Res. 18 (1990), 5912) beschriebenen Prozedur transformiert. Transformanten wurden auf Platten mit 150 µg/ml Ampicillin selektioniert. Plasmid-DNA mit Insertionen der erwarteten Größe wurden mit PstI gespalten, wodurch drei Fragmente entstanden, die den ursprünglichen Klonierungsvektor pUMI und die 480 bp und 1,8 kb PstI-Fragmente aus dem Plasmid p4A darstellen. Die Orientierung des klonierten phbA-, phbB-Fragments in dem resultierenden Plasmid pUMS wurde durch Restriktionsspaltung mit KpnI bestimmt. Das erhaltene Restriktionsmuster zeigte, daß das Plasmid das insertierte DNA- Fragment in einer Orientierung enthält, die eine transkriptio nelle Kontrolle beider Gensequenzen durch das lac-Promo tor/Operator-System erlaubt (vgl. Fig. 1b).

1.2 Konstruktion des Plasmids pDSP

Durch eine partielle PstI-Spaltung des Plasmids p4A wurde ein das phbC-Gen, das Ampicillin-Resistenzgen und den Replikations ursprung enthaltendes 5,5 kb DNA-Fragment isoliert und reli giert. Nach Elektroporation des Ligationsgemisches in E.coli CQ21 wurde ein Plasmid erhalten, das ein 2,3 kb Deletionsklon des Plasmids p4A ist. Dieses Plasmid wurde als pDSP bezeichnet und ist schematisch in Fig. 1c dargestellt.

1.3 Konstruktion des Plasmids pGS-SYN

Unter Verwendung des Plasmids pDSP und der synthetischen Oligonucleotide (1) 5′-GAACAATCAACATATGGCGACCGG-3′ und (2) 5′-AATCCCGGGTAGGATCCCTTGGCTTTGACGTATCG- 3, wurde eine NdeI- Restriktionsstelle einschließlich des Startkodons von phbC und eine BamHI-Stelle stromabwärts des phbC-Gens von Plasmid pDSP unter Verwendung der PCR-Technik eingeführt. Das PCR-Produkt wurde anschließend mit NdeI- und BamHI gespalten und das 1767 bp NdeI-BamHI-Fragment wurde in die NdeI- und BamHI-Restrik tionsstellen des Plasmids pGS23 insertiert, das ein positiver Selektionsvektor auf Basis der Lambda-Lysiskassette mit dem S105 amber-Allel zusammen mit den R- und Rz-Funktionen ist (siehe Beispiel 4.2). Für eine positive Selektion des Inserts, das das phbc-Gen in pGS23 enthält, wurde die Ligationsmischung durch Elektroporation in den E.coli-Supressorstamm MS59 (Messing et al., Nucleic Acids Res. 9 (1981), 309-321) trans formiert, der vollständig die S105-Funktion wieder herstellt.

Auf diese Weise konnte eine positive Selektion auf das inser tierte Fragment des phbC-Gens in pGS23 mit einem Wirkungsgrad von 100% durchgeführt werden.

1.4 Konstruktion des Plasmids pSYN

Unter Verwendung des Plasmids pGS-SYN wurde ein Stopkodon TGA an Kodon 590 im phbC-Gen mittels einer ortsspezifischen Mutagenese unter Verwendung des mutagenen Oligonucleotids (3) 5′-CGGTACCCGGTCATGCCTTGGC-3′ gemäß Deng und Nickoloff (Anal. Biochem. 200 (1992), 81) eingeführt.

Auf dem Plasmid pSYN befindet sich das phbC-Gen unter Kontrolle des lac-Promotors und enthält - anstelle der nativen Transla tionskontrollsequenz (vgl. Fig. 1c) - die Translationskontroll sequenz von Gen 10 des Bakteriophagen T7 (vgl. Fig. 1d).

Beispiel 2 Bestimmung von Polyhydroxybuttersäure

Zur Bestimmung des PHB-Gehalts von rekombinanten E.coli-Zellen wurde PHB aus Proben von gefriergetrockneten Zellen durch Methanolyse nach der Technik von Braunegg et al. (Appl. Microbiol. Biotechnol. 6 (1978), 29-37) in das 3-Hydroxybutter säure-methyl-esterderivat überführt. Dieser Ester wurde gaschromatographisch mit einem Shimadzu C-4A-Gaschromatographen analysiert, der mit einer Permaphase PEG 25 Mx-Kapillarsäule (25 m × 0,32 mm, Perkin Elmer) und einem Flammenionisations detektor ausgestattet war. Ein 2 µl Aliquot der organischen Phase wurde unter Verwendung von Helium als Trägergas analy siert. Die Temperaturen des Injektors und des Detektors waren 180°C bzw. 220°C. Zur wirksamen Abtrennung des Esters wurde ein Temperaturprogramm verwendet (70°C für 1 Min., Temperatur anstieg von 8°C pro Min., 200°C für 5 Min.). Unter diesen Bedingungen waren die Retentionszeiten für 3 verschiedene 3- Hydroxyalkanoatsäuremethylester-Standards wie folgt: C4 : 4,33 und C5 : 5,83.

Beispiel 3 Expression von PHB in verschiedenen rekombinanten E.coli- Stämmen

Es wurde ein Vergleich folgender rekombinanter E.coli-Stämme durchgeführt: (i) E.coli/Plasmid p4A, wo das phbCAB-Operon unter nativer Expressionskontrolle ist, (ii) E.coli/Plasmide pDSP und pUMS, wo die Expression der phbAB-Gene unter Kontrolle des lac-Promotors und die Expression des phbC-Gens unter nativer Expressionskontrolle ist und (iii) E.coli/Plasmide pSYN und pUMS, wo die Expression des phbC-Gens unter Kontrolle des lac-Promotors und der ribosomalen Bindungsstelle des T7-Gens 10 stattfindet.

Der Vergleich wurde in bB-Medium und bB-Medium + 1% Glucose durchgeführt. Der die Plasmide enthaltende E.coli-Stamm war der laci-Stamm MC4100 (Silhary et al. (1984), Experiments with Genefusions. Cold Spring Harbor baboratory, New York, S. XI- XII).

Die Ergebnisse dieser Versuche sind in Tabelle 1 dargestellt. Proben zur Bestimmung der gaschromatographischen PHB-Erzeugung wurden zu den angegebenen Zeiten entnommen.

Tabelle 1

Überraschenderweise wurde gefunden, daß bei Verwendung eines unter Kontrolle einer heterologen Transkriptions- und Transla tionsregulationssequenz stehenden phbC-Gens auch in einem glucosefreien Medium eine starke PHB-Synthese gefunden wurde.

Weiterhin wurde ein Versuch zur PHB-Synthese in rekombinantem E.coli unter Verwendung synthetischer Medien durchgeführt.

Die Ergebnisse dieses Versuchs sind in Tabelle 2 dargestellt.

Tabelle 2

Die angegebenen Medien enthalten pro Liter die folgenden Kompo nenten:

Die Ergebnisse in den Tabellen 1 und 2 zeigen, daß ein Wirts organismus, der das phbC-Gen unter gesteigerter Expressionskon trolle enthält, auch in einem Medium ohne Zusatz von Glucose signifikante Mengen an PHB erzeugt.

Beispiel 4

Erhöhung der β-Ketothiolase- und Acetoacetyl-CoA-Reduktase- Aktivität durch Steigerung der Expressionskontrolle.

4.1 Vergleich der α-Ketothiolase- und Acetoacetyl-CoA-Reduk tase-Aktivität bei nativen und heterologen Transkriptions regulationssequenzen

Es wurde die β-Ketothiolase- und Acetoacetyl-CoA-Reduktaseakti vität folgender rekombinanter E.coli-Stämme durchgeführt:

(i) E.coli/Plasmid p4A und
(ii) E.coli/Plasmide pDSP und pUMS.

Der Vergleich wurde in LB-Medium und LB-Medium + 1% Glucose durchgeführt. Der die Plasmide enthaltende E.coli-Stamm war der laci-Stamm MC4100 (vgl. Beispiel 3).

Die Ergebnisse dieser Versuche sind in Tabelle 3 dargestellt. Die Aktivitäten von β-Ketothiolase und Acetoacetyl-CoA-Reduk tase aus dem Plasmid p4A sind in jeder Säule als 100% angege ben. Die Aktivitäten von β-Ketothiolase und Acetoacetyl-CoA- Reduktase in der löslichen Proteinfraktion wurden nach dem Verfahren von Senior und Dawes (Biochem. J. 125 (1971), 55-68) bestimmt. Eine Enzymeinheit U ist als Umsatz von 1 µmol Substrat pro Minute definiert.

Die Ergebnisse in der Tabelle 3 zeigen, daß ein Wirtsorganis mus, der das phbA- und das phbB-Gen unter gesteigerter Ex pressionskontrolle enthält, auch in einem Medium ohne Zusatz von Glucose eine deutliche Erhöhung der von den jeweiligen Genen codierten Enzymaktivität zeigt.

4.2 Erhöhung der β-Ketothiolase-Aktivität durch Verwendung einer heterologen Translationsregulationssequenz

Konstruktion des positiven Selektionsvektors pGS23
Aus dem Plasmid pLS157 (Bläsi et al., EMBO J. 8 (1989), 3501- 3510) wurde die Lambda-Lysiskassette, die die Gene S, R und Rz enthält, auf einem 1456 bp EcoRI-BamHI-Fragment isoliert und in einem mit EcoRI und BamHI linearisierten M13mp18 Vektor inser tiert. Dann wurde an Codon 56 des S-Wildtypgens mittels einer Stellen-spezifischen Mutagenese unter Verwendung des syntheti schen Oligonucleotids (4) 5′-CACGAATGAACTAGGCGATAATGG-3′ nach der Methode von Kunkel et al. (Methods Enzymol. 154 (1987), 367-382) eine amber-Mutation eingeführt. Anschließend wurde eine NdeI-Restriktionsstelle innerhalb des Met-Codons 3 des S- Gens durch Stellen-spezifische Mutagenese unter Verwendung des Oligonucleotids (5) 5′-TTTCTGGCATATGCATGTCTTACCC-3′ herge stellt. Das resultierende S105 amber-Allel wurde als Nde-BamHI- Fragment in das Plasmid pET-3C (Rosenberg et al., Gene 56 (1987), 125-135) kloniert, so daß das Startcodon des 5105 amber-Allels an die Shine-Dalgarno-Sequenz des Bacteriophagen T7 Gen 10 angrenzt. Das mit der T7 Gens 10 Shine-Dalgarno- Sequenz versehene S105 amber-Allel wurde zusammen mit den R- und Rz-Genen auf einem XbaI-BamHI-Fragment reisoliert und in die XbaI- und BamHI-Stellen des Plasmids pUC19 kloniert. Im erhaltenen puc19-Derivat wurde die NdeI-Restriktionsstelle durch partielle Spaltung mit NdeI und anschliessende kurze Behandlung mit der Nuclease BaI31 eliminiert. Der resultierende positive Selektionsvektor pGS23 enthält eine singuläre NdeI-Re striktionsstelle, die sich am Met-Codon 1 des S105 am-Allels befindet (vgl. Fig. 2a).

Konstruktion des Plasmids pUC19-THIO

Das Plasmid pTZ18-PHB (Slater et al., J. Bacteriol. 170 (1988), 4431-4436), das die PHB-Gene aus Alcaligenes eutrophus H16 ent hält, wurde mit PstI und NruI gespalten. Das resultierende 1902 bp Fragment mit dem phbA-Gen wurde in puc19 insertiert, das zuvor partiell mit PvuII und vollständig mit PstI gespalten worden war. Im resultierenden Plasmid pUc19-THIO (Fig. 2b) erfolgt die Transkription des phbA-Gens durch den lac-Promotor, während die Translation durch die nativen phbA-Translations initiationssignale erfolgt.

Konstruktion des Plasmids pGS-THIO

Unter Verwendung des Plasmids puc19-THIO und der synthetischen Oligonucleotide (6) 5′-GGACTACACATATGACTG-3′ und (7) 5′-AATGGATCCTTATTTGCGCTCGAC-3′ als Primer wurde ein PCR-Produkt erzeugt, das anschließend mit NdeI und BamHI gespalten wurde. Das resultierende 1185 bp lange NdeI-BamHI-Fragment wurde in die entsprechenden Restriktionsstellen des positiven Selek tionsvektors pGS23 insertiert. Die Ligationsmischung wurde in den E.coli-Supressorstamm MS59 (Messing et al. (1981) supra) transformiert. Alle Plasmide, die aus Kolonien auf LB-Ampicil lin-Platten erhalten wurden, hatten die Lambda-Lysis-Kassette verloren und enthielten die phbA-Insertion. In pGS-THIO ist die ribosomale Bindungssequenz des phbA-Gens durch die des Phagen T7 Gen 10 ersetzt (vgl. Fig. 2b).

β-Ketothiolase-Aktivitätstest

Die E.coli-Stämme MC4100/pUC-THIO und MC4100/pGS-THIO wurden über Nacht in LB-Ampicillin-Medium kultiviert, abzentrifugiert, durch Sonifizierung aufgeschlossen und in 20 mM Phosphatpuffer, pH 7,2, 5 mM MgCl₂, 1 mM EDTA, 1 mM Dithiotreitol und 1 M Glycerin resuspendiert. Die spezifische Aktivität der β- Ketothiolase unter Verwendung der spektrophotometrischen Methode von Davis et al. (J. Biol. Chem. 262 (1987), 82-89) wurde in drei unabhängigen Messungen bestimmt. Dabei wurden in E.coli MC4100/pUc19-THIO 33 ± 5 und in E.coli MC4100/pGS-THIO 63 ± 7 β-Ketothiolase-Einheiten pro mg Protein gefunden. Dieses Ergebnis zeigt, daß die Steigerung der Expressionskon trolle des phbA-Gens durch Verwendung einer Kombination von heterologer Transkriptionsregulationssequenz (lac-Promotor/Ope rator) und heterologer Translationsregulationssequenz (T7 Gen 10 SD-Sequenz) weiter verbessert werden kann.

Sequenzprotokoll

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Polyhydroxyalkanoaten in einem prokaryontischen Wirtsorganismus, der die für eine Biosynthese von Hydroxyalkanoat-Polymeren erforderlichen Gene enthält, durch Kultivierung des Wirtsorganismus in einem Medium unter solchen Bedingungen, die zur Bildung von Polyhydroxyalkanoaten durch den Wirtsorganismus führen, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Wirtsorganismus, der mindestens eine Kopie eines Polyhydroxyalkanoat-Synthasegens unter gesteigerter Expressionskontrolle enthält, und ein im wesentlichen glucosefreies Kulturmedium verwendet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen gram-negativen prokaryontischen Wirts organismus verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man E.coli als Wirtsorganismus verwendet.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Polyhydroxyalkanoat-Synthasegen aus einem Mikroor ganismus stammt, der aus den Gattungen Bacillus, Alcali genes, Zoogloea, Pseudomonas, Chromatium und Thiocystis ausgewählt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Polyhydroxyalkanoat-Synthasegen aus Alcaligenes eutrophus stammt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man zur gesteigerten Expressionskontrolle des Poly hydroxyalkanoat-Synthasegens

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Polyhydroxyalkanoat-Synthasegen unter Kon trolle einer heterologen Transkriptionsregulationssequenz verwendet.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die heterologe Transkriptionsregulationssequenz, unter deren Kontrolle sich das Polyhydroxyalkanoat-Synthasegen befindet, einen E.coli- oder E.coli-Phagenpromotor oder einen davon abgeleiteten Promotor umfaßt.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die heterologe Transkriptionsregulationssequenz einen E.coli lac-Promotor oder einen davon abgeleiteten Promotor umfaßt.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Polyhydroxyalkanoat-Synthasegen unter Kon trolle einer heterologen Translationsregulationssequenz verwendet.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die heterologe Translationsregulationssequenz eine mindestens 6 Nucleotide lange Basenfolge umfaßt, die zur Anti-Shine-Dalgarno-Sequenz am 3′-Ende der 16S rRNA des jeweiligen Wirtsorganismus komplementär ist.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Translationsregulationssequenz die Basenfolge 5,- AAGGAG-3′ umfaßt, wobei das 3′-Ende dieser Basenfolge einen Abstand von 6-10 Nucleotiden vom ATG-Startcodon des Polyhydroxyalkanoat-Synthasegens aufweist.

13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Translationsregulationssequenz stromaufwärts der zur Anti-Shine-Dalgarno-Sequenz komplementären Basenfolge eine weitere Basenfolge 5′-TTAACTTTA-3′ umfaßt.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß man die Translationsregulationssequenz von Gen 10 des Bacteriophagen T7 verwendet.

15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Wirtsorganismus verwendet, der das Poly hydroxyalkanoat-Synthasegen auf einem extrachromosomalen Plasmid enthält.

16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Wirtsorganismus verwendet, der weiterhin ein β-Ketothiolasegen oder/und ein Acetoacetyl-CoA-Reduktase gen enthält.

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Wirtsorganismus verwendet, der das β- Ketothiolasegen oder/und das Acetoacetyl-CoA-Reduktasegen unter gesteigerter Expressionskontrolle enthält.

18. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Kulturmedium verwendet, das im wesentlichen frei von Kohlehydraten ist.

19. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Kulturmedium verwendet, das als Kohlenstoff quelle enzymatisch verdaute Bakterien-, Fleisch- oder/und Hefeextrakte, Casaminosäuren oder Gemische davon enthält.

20. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Kulturmedium verwendet, das als Kohlenstoff quelle im wesentlichen zuckerfreie industrielle Abwässer mit Aminosäuren oder/und Bestandteilen von Mikroorganismen enthält.

21. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Mineralmedium mit einem Gehalt einer Kohlen stoffquelle von 0,05 bis 0,5 Gew.-% verwendet.

22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert des Mediums im Bereich von 6,5 bis 7,5 ist.

23. Rekombinante DNA, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Polyhydroxyalkanoat-Synthasegen unter gestei gerter Expressionskontrolle umfaßt.

24. Rekombinante DNA nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß das Polyhydroxyalkanoat-Synthesegen unter Kontrolle

(a) einer heterologen Transkriptionsregulationssequenz,
(b) einer heterologen Translationsregulationssequenz oder
(c) einer Kombination aus (a) und (b) ist.

25. Rekombinanter Vektor, dadurch gekennzeichnet, daß er mindestens eine Kopie einer rekombinanten DNA nach Anspruch 23 oder 24 enthält.

26. Prokaryontische Zelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit einer rekombinanten DNA nach Anspruch 23 oder 24 oder mit einem rekombinanten Vektor nach Anspruch 25 transformiert ist.

27. Prokaryontische Zelle nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß sie weiterhin ein β-Ketothiolasegen oder/und ein Acetoacetyl-CoA-Reduktasegen unter gesteigerter Expres sionskontrolle enthält.

28. Verwendung einer rekombinanten DNA nach Anspruch 23 oder 24 zur Synthese von Polyhydroxyalkanoaten in prokaryonti schen Wirtsorganismen.