DE69233223T2

DE69233223T2 - Herstellung von polyalkanoat

Info

Publication number: DE69233223T2
Application number: DE69233223T
Authority: DE
Inventors: Matthias Liebergesell; Alexander Steinbüchel
Original assignee: Metabolix Inc
Current assignee: Yield10 Bioscience Inc
Priority date: 1991-07-16
Filing date: 1992-07-15
Publication date: 2004-08-26
Anticipated expiration: 2012-07-16
Also published as: EP0594678A1; ATE251218T1; US20040088751A1; CA2113432A1; AU671595B2; CA2113432C; DE69233223D1; EP0594678B1; JPH07501926A; US6515205B1; GB9115245D0; WO1993002194A1; AU2312792A

Description

Diese Erfindung betrifft die Erzeugung von Polyhydroxyalkanoat durch das Kultivieren von Mikroorganismen, die dieses erzeugen.
Poly-3-hydroxybutyrat ist ein linearer Polyester von D(-)-3-Hydroxybutyrat. Es wurde zuerst 1925 in Bacillus megaterium entdeckt. Polyhydroxybutyrat akkumuliert in intrazellulären Granula vieler verschiedener Bakterien. Die Granula sind offenbar membrangebunden und können mit dem Farbstoff Sudan-Schwarz angefärbt werden. Das Polymer wird unter den Bedingungen eines Nährstoffmangels erzeugt und dient als Kohlenstoff- und Energiereserve. Das Molekulargewicht von Polyhydroxybutyrat variiert von ungefähr 50 000 bis zu über 1 000 000 in Abhängigkeit vom jeweiligen Mikroorganismus, den Wachstumsbedingungen und dem Verfahren, das für die Extraktion des Polyhydroxybutyrats eingesetzt wird. Polyhydroxybutyrat ist eine ideale Kohlenstoffreserve, da es in der Zelle in einem hoch reduzierten Zustand vorliegt (es ist praktisch unlöslich), und es bewirkt einen vernachlässigbaren osmotischen Druck.
Polyhydroxybutyrat und verwandte Polyhydroxyalkanoate, wie Poly-3-hydroxyvalerat und Poly-3-hydroxyoctanoat, sind biologisch abbaubare, thermoplastische Materialien von beträchtlicher kommerzieller Bedeutung.
Der Begriff „Polyhydroxyalkanoat", wie er hier im Folgenden verwendet wird, schließt Copolymere von Polyhydroxybutyrat mit anderen Polyhydroxyalkanoaten, wie Poly-3-hydroxyvalerat, ein.
Polyhydroxyalkanoat ist biologisch abbaubar und wird schnell von Mikroorganismen im Boden zersetzt. Es ist thermoplastisch (es schmilzt bei 180°C) und kann leicht mittels Verfahren, die für andere thermoplastische Materialien, wie Polyethylen hoher Dichte, das bei ungefähr der gleichen Temperatur (190°C) schmilzt, gut eingeführt sind, in unterschiedliche Formen gebracht werden. Das Material ist ideal für die Erzeugung biologisch abbaubarer Verpackungen, die sich auf Mülldeponien und Rieselfeldern zersetzen. Das Polymer ist biokompatibel und biologisch abbaubar, und es wird vom Sägetierköper, einschließlich dem des Menschen, gut vertragen, und sein Abbauprodukt, das 3-Hydroxybutyrat, ist bei Säugetieren ein normaler Metabolit. Allerdings baut sich Polyhydroxyalkanoat im Körper nur langsam ab, und sein Einsatz in der Medizin ist auf diejenigen Anwendungen beschränkt, bei denen ein Abbau über längere Zeiträume erforderlich ist.
Polyhydroxyalkanoat, das von dem Mikroorganismus Alcaligenes eutrophus erzeugt wird, wird in Form eines Copolymers mit Polyhydroxybutyrat und Polyhydroxyvalerat von Imperial Chemical Industries PLC produziert und unter dem Handelsnamen BIOPOL verkauft. Es wird normalerweise in Form von Pellets für eine thermische Weiterverarbeitung bereit gestellt. Allerdings ist die Herstellung von Polyhydroxyalkanoat mittels bestehender Verfahren teurer als diejenige von beispielsweise Polyethylen. Es ist deshalb wünschenswert, dass neue, ökonomischere Herstellungsverfahren für Polyhydroxyalkanoat bereit gestellt werden.
WO-A-9100917 beschreibt ein Verfahren zur Synthese von Polyhydroxyalkanoat. Es beschreibt auch die Isolierung von Genen, die für die drei Enzyme β-Ketothiolase, Acetyl-CoA-Reduktase und PHB-Polymerase codieren, aus Zoogloea ramigera, Alcaligenes eutrophus, Nocardia salmonicida und Pseudomonas oleovorans. Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Materialien und eines Verfahrens für die effiziente Erzeugung von Polyhydroxyalkanoat über die Bereitstellung weiterer Gene für seine Synthese.
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Genfragmente bereit gestellt, die durch eine Isolierung aus dem Bakterium Chromatium vinosum erhalten werden können und für die PHA-Polymerase und die β-Ketothiolase, wie es in der 3 definiert ist, sowie die Acetoacetyl-CoA-Reduktase, wie es in der 5 definiert ist, codieren.
Vorzugsweise handelt es sich bei Chromatium vinosum um den als D bezeichneten Stamm, der öffentlich bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen unter der Zugangsnummer 180 erhältlich ist.
Die Erfindung stellt auch ein EcoRI-Fragment von 16,5 kb der DNA von Chromatium vinosum bereit, das als PP10 bezeichnet wird und hier im Folgenden in der 1 oder der 2 gezeigt ist, und das mit einem SmaI/EcoRI-Fragment von 5,2 kb hybridisiert werden kann, das als SE52 bezeichnet wird und aus Alcaligenes eutrophus isoliert wurde, und von dem bekannt ist, dass es alle drei der genannten Gene enthält, die für die Expression von PHAs verantwortlich sind.
Die Erfindung stellt ferner ein Fragment des genannten PP10-Fragments bereit, das als SE45 bezeichnet wird und für die Gene der PHA-Synthase und der β-Ketothiolase codiert, sowie einen Bereich, der als SB24 bezeichnet wird, der für das Gen der Acetoacetyl-CoA-Reduktase codiert.
Die Erfindung stellt auch ein rekombinantes Genom eines Mikroorganismus bereit, vorzugsweise eines Bakteriums oder einer Pflanze, das eines oder mehrere der genannten Fragmente enthält, die als PP10, SE45 und Bereich SB24 bezeichnet werden.
Schließlich stellt die Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung von PHAs bereit, das das Kultivieren eines Bakteriums umfasst, bei dem es sich nicht um Chromatium vinosum handelt, und das in seinem Genom stabil durch Transformation inkorporiert ein Gen oder mehrere Gene enthält, das bzw. die aus den Genen ausgewählt ist bzw. sind, die für die PHA-Synthase und die β-Ketothiolase, wie es in der 3 definiert ist, und die Acetoacetyl-CoA-Reduktase, wie es in der 5 definiert ist, von Chromatium vinosum codieren.
Die Biosynthese von Polyhydroxyalkanoat aus dem Substrat Acetyl-CoA umfasst drei enzymkatalysierte Schritte.
Die drei beteiligten Enzyme sind die β-Ketothiolase, die Acetoacetyl-CoA-Reduktase und die Polyhydroxybutyrat-Synthase, deren Gene aus Chromatium vinosum kloniert wurden. Man weiß, dass die drei Gene die Erzeugung von Polyhydroxyalkanoaten ermöglichen, und die beteiligten Reaktionen sind im Folgenden dargestellt:
Die Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die folgenden begleitenden Zeichnungen beschrieben:
1 ist die physikalische Karte des EcoRI-Fragments von 16,5 kb der DNA von Chromatium vinosum, das als PP10 bezeichnet wird. Die Positionen der Restriktionsstellen und die Positionen und Namen der Unterfragmente sind angegeben. Die Gene der PHA-Synthase und der β-Ketothiolase liegen im Fragment SE45 und das Gen der Acetoacetyl-CoA-Reduktase liegt im Bereich SB24.
2 ist die Karte von PP10, die die Positionen der Gene der β-Ketothiolase und der Acetoacetyl-CoA-Reduktase sowie der offenen Leserahmen ORF2 und ORF3 der PHA-Synthase zeigt.
3 ist die vollständige Nucleotidsequenz des Fragments SE45. Die Startstellen und die Terminationsstellen der Transkription für das Gen der β-Ketothiolase und für ORF3 und ORF3 sind angegeben. Die Positionen der „-10"- und „-35"-Sequenzen sind ebenfalls gezeigt, wie auch die Positionen der vermutlichen Ribosomen-Bindungsstellen („s/d"). Das Start- und das Stop-Codon (*) für die Translation sind ebenfalls markiert, und es werden die Aminosäuresequenzen der β-Ketothiolase und von ORF2 und ORF3 angegeben.
4 zeigt die gegenseitige Ausrichtung der Aminosäuresequenzen des ORF3 von Chromatium vinosum, der PHA-Polymerase von Alcaligenes eutrophus und der PHA-Polymerasen 1 und 2 von Pseudomonas oleovorans.
5 zeigt die vollständige Nucleotidsequenz der für die Gene der PHA-Synthese codierenden DNA von Chromatium vinosum. Es sind die Positionen der Gene der PHA-Polymerase (phbC), der Acetoacetyl-CoA-Reduktase (phbB) und der Ketothiolase (phbA) gezeigt, und ebenso die Positionen von ORF2, ORF4, ORF5 und ORF7.
6 zeigt die gegenseitige Ausrichtung der Aminosäuresequenzen der Ketothiolasen, die durch C. vinosum (C. v.), A. eutrophus (A. e.), Zoogloea ramigera (Z. r.), Escherichia coli (E. c.), Saccharomyces uvarum (S. u.) und Rattus norvegicus (R. n.) codiert werden.
7 zeigt die gegenseitige Ausrichtung der Aminosäuresequenzen der Acetoacetyl-CoA-Reduktasen, die durch C. vinosum (C. v.), A. eutrophus (A. e.) und Z. ramigera (Z. r.) codiert werden.
8 ist eine Tabelle (Tabelle 1), die die heterologe Expression von DNA-Fragmenten von C. vinosum in Escherichia coli zeigt. Es sind die Aktivitäten der Enzyme der PHA-Biosynthese, die von den verschiedenen Fragmenten exprimiert werden, gezeigt. Es sind auch die PHA-Mengen, die in den mit den Fragmenten transformierten E. coli akkumulieren, angegeben.
BEISPIEL
Der Organismus C. vinosum war eine Gabe von Dr. J. Imhoff von der Universität Bonn, Deutschland.
1. Isolierung von DNA-Fragmenten von C. vinosum die für die Gene der PHA-Synthese codieren
Ein SmaI/EcoRI-Fragment von 5,2 kb (SE52), das für alle drei Gene der PHA-Biosynthese codiert, wurde früher aus Alcaligenes eutrophus isoliert [Schubert et al., J. Bacteriol. 170 (1988)]. Dieses Fragment wurde für das Aufspüren der Gene der PHA-Biosynthese von C. vinosum verwendet. Mit EcoRI restriktionsverdaute genomische DNA von C. vinosum wurde auf eine Nylonmembran geblottet und mit biotinylierter SE52-DNA hybridisiert. Es zeigte sich ein Signal, das ein DNA-Fragment von 16,5 kb repräsentierte.
Es wurde eine λL47-Genbank aus genomischer DNA von C. vinosum hergestellt, und Platten mit ungefähr 800 Plaques wurden auf Nylonmembranen geblottet und mit biotinylierter SE52-DNA hybridisiert. Es wurde ein positiver rekombinanter Phage isoliert, der ein EcoRI- Fragment von 16,5 kb enthielt, das PP10 genannt wurde (1). Mit PP10 und einem EcoRI/PstI-Unterfragment (EP94) von PP10 von 9,4 kb konnte der Phänotyp des Wildtyps in PHA-negativen Mutanten von A. eutrophus wiederhergestellt werden.
Expressionsstudien an E. coli (siehe unten) zeigten, dass ein SmaI/EcoRI-Unterfragment (SB45) von EP94 von 4,5 kb für die PHA-Synthase und die β-Ketothiolase codiert. Die Nucleotidsequenz dieses Fragments wurde mittels des Dideoxy-Kettenabbruchverfahrens von Sanger et al. mit alkalisch denaturierter doppelsträngiger Plasmid-DNA bestimmt. Es wurde der T7-Polymerase-Sequenzierungskit von Pharmacia, Uppsala, Schweden, mit 7-Desazaguanosin-5'-triphosphat anstelle von dGTP verwendet. Der größte Teil der Sequenz wurde mit einem Set unidirektional überlappender Klone mit Deletionen, die über einen Verdau mit Exonuclease III erzeugt worden waren, bestimmt. Für Sequenzierungsbereiche, die nicht von den Deletionsplasmiden abgedeckt wurden, wurden synthetische Oligonucleotide verwendet.
Es war nicht möglich, das SmaI/PstI-Fragment PS49 von 4,9 kb in einen Multicopy-Vektor zu klonieren. Deshalb wurde das Fragment EP94 (1) mit der Exonuclease BaI31 behandelt, in Bluescript SK ligiert und in E.-coli-X1-1-Blue transferiert. Es wurde ein Klon isoliert, der das Bluescript SK mit einem Fragment von 5,5 kb (B55) enthielt und Aktivität der β-Ketothiolase und der NADH-abhängigen Reduktase exprimierte. 3146 Basenpaare von B55 waren Teil des SE45-Fragments. Der andere Teil (ungefähr 2350 Basenpaare, SB24) ist mittels der Primer-Hopping-Strategie sequenziert worden. Die Sequenz und die Position des Reduktase-Gens auf SB24 sind bekannt. Die Ergebnisse dieser Studien, einschließlich der Organisation der Gene der PHA-Biosynthese in C. vinosum und die Orte der Gene der Ketothiolase, der Reduktase und der PHA-Synthase sind in der 2 gezeigt. Die Bestimmung der vollständigen Sequenz von SB24 ist derzeit in Arbeit.
2. Sequenzanalyse der Gene der PHB-Synthese von C vinosum
Die Nucleotidsequenz von SE45 ist in der 3 gezeigt. Die Fragmentgröße von SE45 liegt bei 4506 bp.
2.1 PHB-Synthase
Die Sequenz des Fragments, das dem Gen der PHB-Synthase entspricht, wird als ORF3 bezeichnet. Die Bestimmung der Synthase-Aktivität von Deletionsplasmiden, die SE45 enthielten (siehe unten), ergab Hinweise darauf, dass die Expression von ORF2 für die Expression von Synthase-Aktivität ebenfalls erforderlich ist.
ORF2 und ORF3 werden als ein Operon transkribiert. Die Bestimmung der Startstelle der Transkription von ORF2 wurde über eine Kartierung mit S1-Nuclease durchgeführt. Diese Stelle liegt bei by 3059 vom 3'-Ende von SE45. Eine vermutliche „-10"-Stelle, mit der Sequenz 5'-ACAGAT-3', kommt bei by 3073–3078 vor, und eine „-35"-Stelle kommt bei by 3092–3099 vor. Eine vermutliche Ribosomen-Bindungsstelle kommt bei by 3040–3045 vor. Das Startcodon für die Translation beginnt bei by 3030. Das Stopcodon für die Translation kommt bei by 1958 vor.
Die vermutliche Ribosomen-Bindungsstelle von ORF3 kommt bei by 1907–1911 vor. Das ATG für den Start der Translation von ORF3 kommt bei by 1899 vor, und das Codon für den Stop der Translation bei by 833. Vermutliche Terminationsstellen der Transkription kommen in Haarnadelstrukturen bei by 773–786 und 796–823 vor.
ORF2 codiert für ein Polypeptid von 358 Aminosäuren mit einem MG von 40525 Dalton. ORF3 codiert für ein Polypeptid von 356 Aminosäuren mit einem MG von 39739 Dalton. Die Größe des Gens ORF3 ist ungefähr 30% kleiner als diejenige der Gene der PHA-Polymerase von A. eutrophus und P. oleovorans. Die gegenseitigen Ausrichtungen der Primärstrukturen der PHA-Polymerase von C. vinosum, der PHA-Polymerase von A. eutrophus und der PHA-Polymerasen 1 und 2 von P. oleovorans sind in der 4 gezeigt. Somit ist die ORF3-Polymerase von C. vinosum kürzer als die anderen Polymeraseenzyme, ihr fehlen die ersten 172 Aminosäuren vom NH₂-Terminus der PHA-Polymerase von A. eutrophus und die ersten 148 Aminosäuren der Pseudomonas-Polymerasen. Die Aminosäuresequenz des ORF3 zeigte insgesamt eine Homologie von 25% zur Polymerase von A. eutrophus, wobei bestimmte diskrete Bereiche konservierte Sequenzen hatten.
Die Aminosäuresequenz des ORF2 zeigte keine signifikante Homologie zu anderen Enzymen in der NBRF-Genbank.
2.2 β-Ketothiolase
Die Gene der β-Ketothiolase und der Acetoacetyl-CoA-Reduktase werden entgegengesetzt zur Richtung von ORF2 und ORF3 transkribiert (2). Eine „-10"-Stelle im identifizierten Ketothiolase-Promotor kommt bei by 3105–3111 vor, und eine „-35"-Stelle bei by 3082–3086. Eine vermutliche Ribosomen-Bindungsstelle kommt bei by 3167–3171 vor. Das Startsignal für die Translation kommt bei by 3161 vor. Das Stopsignal für die Translation kommt bei by 4361 vor.
Die gegenseitige Ausrichtung der Primärstrukturen der β-Ketothiolasen von Chromatium vinosum und aus anderen Quellen ist in der 5 gezeigt. Es ist eine beträchtliche Homologie zwischen den Aminosäuresequenzen der Ketothiolasen von C. vinosum und anderen bakteriellen und nicht-bakteriellen Quellen offensichtlich.
2.3 Acetoacetyl-CoA-Reduktase
Die gegenseitige Ausrichtung der Primärstrukturen der Acetoacetyl-CoA-Reduktasen von C. vinosum, A. eutrophus und Z. ramigera ist in der 6 gezeigt. Alle drei Reduktasen haben eine ähnliche Kettenlänge, und es ist eine beträchtliche Homologie zwischen den Sequenzen der Reduktasen dieser Bakterien offensichtlich.
Die Gene der PHA-Synthese von Chromatium vinosum unterscheiden sich demnach von den Genen der PHA-Synthese von A. eutrophus und P. oleovorans in den folgenden Punkten:

i) Während bei A. eutrophus die Gene der PHB-Polymerase, der Acetoacetyl-CoA-Reduktase und der β-Ketothiolase alle als ein Operon transkribiert werden, werden bei C. vinosum die Gene der Ketothiolase und der Reduktase getrennt von der Polymerase transkribiert, und sie werden in entgegengesetzter Richtung zu den ORF3- und ORF2-Genen der Polymerase transkribiert.
ii) Im Gegensatz zu A. eutrophus, bei dem nur ein Genprodukt für die Aktivität der Polymerase benötigt wird, werden bei C. vinosum zwei Genprodukte, die von ORF2 und ORF3 repräsentiert werden, für die Expression von Polymeraseaktivität benötigt.
iii) Bei C. vinosum ist die ORF3-Polymerase um 172 Aminosäuren, und zwar am Aminoterminus, kürzer als die Polymerase von A. eutrophus und um 148 Aminosäuren kürzer als die Polymerasen 1 und 2 von P. oleovorans. Der ORF3 von C. vinosum zeigt lediglich 25% Homologie mit der Primärsequenz der Polymerase von A. eutrophus.
iv) Bei A. eutrophus ist das an der PHB-Synthese beteiligte Acetoacetyl-CoA-Reduktase-Enzym spezifisch für NADPH, während das Enzym von C. vinosum eine ausgeprägte Bevorzugung von NADH zeigt.

Zwischen den Strukturgenen für die Ketothiolase und die Acetoacetyl-CoA-Reduktase von Chromatium vinosum liegen zwei offene Leserahmen (ORF4 und ORF5), und stromabwärts vom Reduktase-Gen wurde ein ORF7 identifiziert (5). Es wurden keine weiteren ORFs in dem für PHA codierenden Bereich von A. eutrophus identifiziert.
3. Expression der Gene der PHB-Synthese von C. vinosum in anderen Bakterien
Mit den Fragmenten PP10 und EP94 konnte die Fähigkeit PHB-negativer Mutanten von A. eutrophus zur Synthese von PHB wiederhergestellt werden. Rekombinante Stämme der PHB-negativen Mutante A.-eutrophus-PHB-4, die mit diesen Fragmenten transformiert wurden, waren zur Synthese von Polymeren fähig, die 3-Hydroxybutyrat und 3-Hydroxyisovalerat in signifikanten Anteilen enthielten, wenn sie mit den geeigneten Substraten versorgt wurden.
Studien zur Expression von DNA-Fragmenten von C. vinosum in E. coli werden in der Tabelle 1 präsentiert. So exprimierten E.-coli-Zellen nach der Transformation mit Plasmiden, die die Fragmente PP10 und EP94 enthielten, PHB-Polymerase-, Acetoacetyl-CoA-Reduktase- und β-Ketothiolase-Aktivität. Sie synthetisierten auch PHB bis zu 10 bis 12% des Trockengewichtes. E.-coli-Zellen, die mit Plasmiden, die das Fragment SE45 enthielten, transformiert waren, exprimierten die PHB-Polymerase und die β-Ketothiolase, aber nicht die Acetoacetyl-CoA-Reduktase, und sie waren nicht zur Synthese von PHB fähig.
4. Polymer-Biochemie
Die spezifische optische Drehung von Methyl-3-hydroxybuttersäure, die durch Methanolyse von PHB aus C. vinosum (aus Acetat akkumuliert), aus A. eutrophus-PHB-4-pHP1014::PP10 (aus Fructose akkumuliert) und aus E.-coli-S17-1-pSUP202::PP10 (aus Glucose akkumuliert) frei gesetzt wurde, war in allen Fällen negativ. Die ermittelten Werte der spezifischen optischen Drehung waren denjenigen ähnlich, die für PHB, das aus A. eutrophus (aus Fructose akkumuliert) isoliert worden war, ermittelt wurden.

Claims

Genfragmente, die durch Isolierung aus dem Bakterium Chromatium vinosum erhalten werden können, wobei die genannten Genfragmente für die Polyhydroxyalkanoat-Synthase (PHA-Synthase) und die β-Ketothiolase, wie es in der 3 definiert ist, und die Acetoacetyl-CoA-Reduktase, wie es in der 5 definiert ist, codieren.
Genfragmente nach Anspruch 1, wobei das Chromatium vinosum der als D bezeichnete Stamm ist, der öffentlich bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen unter der Zugangsnummer 180 erhältlich ist.
EcoRI-Fragment von 16,5 kb der DNA von Chromatium vinosum, das als PP10 bezeichnet wird, wie es in der 1 oder der 2 gezeigt ist, und das mit einem SmaI/EcoRI-Fragment von 5,2 kb hybridisiert werden kann, das als SE52 bezeichnet wird und aus Alcaligenes eutrophus isoliert wurde und von dem bekannt ist, dass es die Gene enthält, die für die PHA-Synthase, die Acetoacetyl-CoA-Reduktase und die β-Ketothiolase codieren.
Fragment des PP10-Fragments nach Anspruch 3, das als SE45 bezeichnet wird, das für die Gene der PHA-Synthase und der β-Ketothiolase codiert.
Fragment des PP10-Fragments nach Anspruch 3, das als SB24 bezeichnet wird, das für das Gen der Acetoacetyl-CoA-Reduktase codiert.
Rekombinantes Genom, das eines oder mehrere der Fragmente enthält, die als PP10, SE45 und Bereich SB24 gemäß den Ansprüchen 3, 4 bzw. 5 bezeichnet werden.
Bakterium, das in sein Genom inkorporiert eines oder mehrere der Fragmente enthält, die als PP10, SE45 und Bereich SB24 gemäß den Ansprüchen 3, 4 bzw. 5 bezeichnet werden.
Pflanze, die in ihrem Genom stabil durch Transformation inkorporiert eines oder mehrere der Fragmente enthält, die als PP10, SE45 und Bereich SB24 gemäß den Ansprüchen 3, 4 bzw. 5 bezeichnet werden.
Verfahren zur Erzeugung von Polyhydroxyalkanoaten, das das Kultivieren eines Bakteriums umfasst, bei dem es sich nicht um Chromatium vinosum handelt, und das in seinem Genom stabil durch Transformation inkorporiert ein Gen oder mehrere Gene enthält, das bzw. die aus den Genen ausgewählt ist bzw. sind, die für die PHA-Synthase und die β-Ketothiolase, wie es in der 3 definiert ist, und die Acetoacetyl-CoA-Reduktase, wie es in der 5 definiert ist, von Chromatium vinosum codieren.
Gen, das für die β-Ketothiolase codiert, das die in der 3 gezeigte Nucleotidsequenz aufweist.
Gen, das für die Polyhydroxyalkanoat-Synthase codiert (phbC), das die in der 5 gezeigte Nucleotidsequenz aufweist.
Gen, das für die Acetoacetyl-CoA-Reduktase codiert (phbB), das die in der 5 gezeigte Nucleotidsequenz aufweist.