DE60123862T2

DE60123862T2 - Polyhydroxyalkanoatsynthase und dafür kodierendes Gen

Info

Publication number: DE60123862T2
Application number: DE60123862T
Authority: DE
Inventors: Tetsuya Ohta-ku Yano; Takeshi Ohta-ku Imamura; Sakae Ohta-ku Suda; Tsutomu Ohta-ku Honma
Original assignee: Canon Inc
Current assignee: Canon Inc
Priority date: 2000-03-30
Filing date: 2001-03-30
Publication date: 2007-04-12
Anticipated expiration: 2021-03-31
Also published as: EP1138770A3; DE60123862D1; JP3848045B2; EP1138770B1; KR20010095185A; ATE342988T1; US20010055795A1; JP2001275671A; EP1138770A2; KR100479943B1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft eine Polyhydroxyalkanoat-Synthase (Polyhydroxyalkanoat wird hier nachstehend als "PHA" bezeichnet), ein diese PHA-Synthase codierendes Gen, einen rekombinanten Vektor, der dieses Gen enthält, eine Transformante, die die PHA-Synthase ausprägen kann, die durch diesen rekombinanten Vektor transformiert worden ist, ein Verfahren zur Herstellung der PHA-Synthase unter Verwendung der Transformante und ein Verfahren zur Herstellung des PHA unter Verwendung dieser Transformante. Insbesondere betrifft die Erfindung eine von Mikroorganismen stammende PHA-Synthase, die ein Polyhydroxyalkanoat produzieren kann, und ein die PHA-Synthase codierendes Gen, das für die Ausprägung der PHA-Synthase durch Transformation verwendet wird.
Einschlägiger Stand der Technik
Es ist von einer Anzahl von Mikroorganismen berichtet worden, die Poly-3-hydroxybuttersäure (PHB) oder ein anderes PHA produzieren und im Inneren speichern ("Biodegradable Plastic Handbook", herausgegeben von Biodegradative Plastic Research Society, NTS Co. Ltd., S. 178–197). Diese Polymere können wie herkömmliche Kunststoffe für die Herstellung einer Vielzahl von Produkten, zum Beispiel durch Verarbeitung aus der Schmelze, verwendet werden. Da sie biologisch abbaubar sind, haben sie den Vorteil, daß sie von Mikroorganismen in der Natur vollständig abgebaut werden können und nicht zu einer Verschmutzung führen, weil sie wie viele herkömmliche Polymerverbindungen in der Natur zurückbleiben. Außerdem haben sie eine hervorragende Biokompatibilität, und somit ist die Verwendung bei Anwendungszwecken, wie ein weiches medizinisches Teil, zu erwarten.
Es ist bekannt, daß die Zusammensetzung und Struktur eines solchen von einem Mikroorganismus produzierten PHA beträchtlich variieren kann, wobei dies von der Art des für die Produktion verwendeten Mikroorganismus, der Zusammensetzung des Kulturmediums und den Züchtungsbedingungen abhängt. Die Forschungen haben sich deshalb hauptsächlich auf die Steuerung einer solchen Zusammensetzung oder Struktur konzentriert, um die physikalischen Eigenschaften eines PHA zu verbessern.
Die japanischen Patentanmeldungen Nr. 6-15604, 7-14352 und 8-19227 beschreiben zum Beispiel, daß Alcaligenes eutropus H16 (ATCC Nr. 17699) und dessen Varianten 3-Hydroxybuttersäure (3HB) und dessen Copolymer mit 3-Hydroxyvaleriansäure (3HV) mit unterschiedlichen Verhältnissen der Zusammensetzung produzieren können, wenn während der Züchtung die Kohlenstoffquelle geändert wird.
Die japanische Patentveröffentlichung Nr. 2642937 offenbart, daß PHA, bei dem eine Monomereinheit 3-Hydroxyalkanoat mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen ist, erzeugt werden kann, wenn Pseudomonas oleovorans (ATCC Nr. 29347) ein nicht-cyclischer aliphatischer Kohlenwasserstoff als Kohlenstoffquelle zugeführt wird.
Die offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 5-74492 offenbart Verfahren, bei denen Methylobacterium sp., Paracoccus sp., Alcaligenes sp. und Pseudomonas sp. mit einem primären Alkohol mit 3 bis 7 Kohlenstoffatomen in Kontakt gebracht werden, wodurch ein Copolymer von 3HB und 3HV erzeugt wird.
Die offengelegten japanischen Patentanmeldungen Nr. 5-93049 und 7-265065 offenbaren, daß Aeromonas caviae unter Verwendung von Oleinsäure oder Olivenöl als Kohlenstoffquelle gezüchtet wird, wodurch ein Zweikomponenten-Copolymer von 3HB und 3-Hydroxyhexansäure (3HHx) erzeugt wird.
Die offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 9-191893 offenbart, daß Comamonas acidovorans IF013852 unter Verwendung von Gluconsäure und 1,4-Butandiol als Kohlenstoffquellen gezüchtet wird, wodurch ein Polyester erzeugt wird, der 3HB und 4-Hydroxybuttersäure als Monomereinheiten aufweist.
J. of Bacteriology 180 (1998), S. 6459–6467 offenbart, daß der Stamm Pseudomonas sp. 61–3, der ein Gemisch des Homopolymers [P(3HB)] und eines statistischen Copolymers [P(3HB-co-3HA)] erzeugt, das aus 3HA-Einheiten mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen besteht, auf molekularem Niveau geklont und analysiert worden ist.
Außerdem wird berichtet, daß bestimmte Mikroorganismen PHA produzieren, die eine Vielzahl von Substituenten, wie einen ungesättigten Kohlenwasserstoffrest, Ester-, Aryl- (aromatisch) und Cyanogruppen, Halogenkohlenwasserstoff und Epoxid, aufweisen. Kürzlich gab es Versuche zur Verbesserung der physikalischen Eigenschaften eines PHA, das unter Anwendung eines solchen Verfahrens von einem Mikroorganismus produziert worden ist, Makromol. Chem., 191, 1957–1965 (1990), Macromolecules, 24, 5256–5260 (1991) und Chirality, 3, 492–494 (1991) beschreiben zum Beispiel die Herstellung eines PHA, das 3-Hydroxy-5-phenylvaleriansäure (3HPV) als Monomereinheit enthält, durch Pseudomonas oleovorans, wobei Änderungen der physikalischen Eigenschaften des Polymers beobachtet wurden, die möglicherweise auf dem Vorhandensein von 3HPV beruhen.
Wie vorstehend beschrieben wurden von Mikroorganismen produzierte PHA mit unterschiedlichen Kombinationen der Zusammensetzung und der Struktur erhalten, wenn Faktoren, wie die Art des verwendeten Mikrooganismus, die Zusammensetzung des Kulturmediums und die Züchtungsbedingungen, geändert wurden. Jeder Mikroorganismus weist eine intrinsische PHA-Synthase mit einer Substratspezifität auf, die sich deutlich voneinander unterscheidet. Folglich war es problematisch, PHA, die unterschiedliche Monomereinheiten aufweisen, die für eine Vielzahl von Anwendungszwecken geeignet sind, unter Verwendung bekannter Mikroorganismen oder PHA-Synthasen in solchen bekannten Mikroorganismen zu produzieren.
Wie vorstehend beschrieben kann inzwischen erwartet werden, daß ein PHA mit einer Vielzahl von Substituenten in seinen Seitenketten ein "funktionelles Polymer" ist, das aufgrund der Eigenschaften der eingeführten Substituenten deutlich vorteilhafte Funktionen und Eigenschaften aufweist. Es ist folglich äußerst nützlich und wichtig, einen Mikroorganismus zu erforschen und zu entwickeln, der ein sehr nützliches Polymer produzieren und speichern kann, das sowohl Funktionalität als auch biologische Abbaubarkeit aufweist. Außerdem können es uns die Identifizierung einer PHA-Synthase, die an der Produktion des sehr nützlichen PHA beteiligt ist, und die Gewinnung eines diese PHA-Synthase codierenden Gens erlauben, einen neuen transformierten Mikroorganismus zu produzieren, der das gewünschte PHA produzieren kann. Das heißt, die Konstruktion eines rekombinanten Vektors, der ein Gen aufweist, das eine PHA-Synthase codiert, und die Bereitstellung eines mit diesem rekombinanten Vektor transformierten Mikroorganismus können es uns ermöglichen, unter Verwendung dieses transformierten Mikroorganismus ein PHA herzustellen oder einen rekombinanten Typ der PHA-Synthase auszuprägen. Wie vorstehend beschrieben kann es wichtig sein, für die Herstellung eines gewünschten PHA einen transformierten Mikroorganismus zu verwenden, um ein sehr nützliches Hilfsmittel für die Verbesserung der Produktivität für das PHA und für eine bessere Ausnutzung des PHA bereitzustellen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Aufgaben dieser Erfindung, die die vorstehend genannten Probleme lösen können, sind die Erforschung eines neuen Mikroorganismus, der im Mikroorganismus ein PHA mit neuer Seitenkettenstruktur produzieren und speichern kann, die Identifizierung eines Enzymproteins, das mit der Fähigkeit zur Erzeugung des neuen PHA in Zusammenhang steht, das heißt einer neuen PHA-Synthase, und die Bestimmung eines Gens, das dessen Aminosäuresequenz codiert. Spezieller ist eine Aufgabe der Erfindung die Bereitstellung einer neuen PHA-Synthase, herrührend von einem Mikroorganismus, der ein PHA mit einer neuen Seitenkettenstruktur produzieren kann, sowie einer DNA, die dessen Aminosäuresequenz codieren kann. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines rekombinanten Vektors mit einer eingeführten DNA, die eine verfügbare PHA-Synthase codiert und für die Transformation eines Mikroorganismus verwendet wird, sowie eines transformierten Mikroorganismus, der unter Verwendung dieses rekombinanten Vektors erzeugt worden ist. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zum Ausprägen und Produzieren einer rekombinanten PHA-Synthase im transformierten Mikroorganismus und eines Verfahrens zur Herstellung eines gewünschten PHA unter Verwendung des transformierten Mikroorganismus.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung einer modifizierten PHA-Synthase, deren Aminosäuresequenz modifiziert ist, sofern die Enzymaktivität bei der Ausprägung der rekombinanten PHA-Synthase im transformierten Mikroorganismus nicht beeinflußt wird, wie sie vorstehend beschrieben ist, und einer DNA, die diese modifizierte Aminosäuresequenz codiert.
Für die Entwicklung eines PHA mit einer neuen Struktur der Seitenkette, die zum Beispiel als Material für Vorrichtungen oder als medizinisches Material nützlich ist, haben die Erfinder, als sie sich der Lösung der vorstehend genannten Probleme zugewandt haben, einen neuen Mikroorganismus erforscht, der das gewünschte PHA produzieren und im Inneren speichern kann. Außerdem haben die Erfinder ausgewählte neue Mikroorganismen intensiv erforscht, die ein neues PHA produzieren, um eine PHA-Synthase zu identifizieren, die an der Produktion des neuen PHA beteiligt ist, und um ein Gen zu erhalten, das diese PHA-Synthase codiert. Außerdem haben die Erfinder Untersuchungen durchgeführt zur Konstruktion eines rekombinanten Vektors mit einem Gen für die erhaltene PHA-Synthase, zur Transformation eines Wirtsmikroorganismus unter Verwendung dieses rekombinanten Vektors, zur Ausprägung einer rekombinanten PHA-Synthase im erhaltenen transformierten Mikroorganismus und zur Bestimmung der Produktion des gewünschten PHA.
Im Verlauf der vorstehend genannten Untersuchung haben die Erfinder 5-(4- Fluorphenyl)valeriansäure (FPVA) der Formel (II) synthetisiert:
und aus dem Boden einen neuen Mikroorganismus abgetrennt, der die vorstehend genannte Verbindung (II) als Ausgangsmaterial (Substrat) in die entsprechende 3-Hydroxy-5-(4-fluorphenyl)valeriansäure (3HFPV) der Formel (III) überführen kann:
und ein neues PHA produzieren und speichern kann, das eine Monomereinheit der Formel (I) aufweist:
die von 3HFPV stammt. Dieser abgetrennte neue Mikroorganismus wird als Stamm YN2 bezeichnet. Die Erfinder haben auch festgestellt, daß zusätzlich zur vorstehend genannten Enzymaktivität für die Überführung von FPVA in 3HFPV der Stamm YN2 auch 4-Cyclohexylbuttersäure (CHxBA) der Formel (IV):
als Ausgangsmaterial (Substrat) verwenden kann, um es in 3-Hydroxy-4-cyclohexylbuttersäure (3HCHxB) der Formel (V):
zu überführen und ein PHA zu produzieren und zu speichern, das eine Monomereinheit der Formel (VI) aufweist:
die vom 3HCHxB stammt.
Die mikrobiologische Eigenschaften des Stamms YN2 sind wie folgt:
Mikrobiologische Eigenschaften des Stamms YN2
(Morphologische Eigenschaften)

Zellform und -größe: Bacillusform 0,8 μm × 1,0 bis 1,2 μm
Polymorphie der Zellen: keine
Motilität: ja
Sporulation: nein
Gramfärbung: negativ
Koloniebildung: kreisförmig, entlang des gesamten Umfangs glatt, wenig konvex, glatte Oberfläche, glänzend, gelblich-weiß

(Physiologische Eigenschaften)

Katalase: positiv
Oxidase: positiv
O/F-Test: oxidierte Form
Reduktion eines Nitrats: negativ
Indolproduktion: negativ
Ansäuerung von Dextrose: negativ
Arginin-Dihydrolase: negativ
Urease: negativ
Esculinhydrolyse: negativ
Gelatinehydrolyse: negativ
β-Galactosidase: negativ
Fluorchromerzeugung auf King B-Agar: positiv
Bildung mit 4% NaCl: negativ
Ansammlung von Poly-β-hydroxybuttersäure: negativ

(Fähigkeit zur Substratassimilation)

Dextrose: positiv
L-Arabinose: negativ
D-Mannose: positiv
D-Manitol: positiv
N-Acetyl-D-glucosamin: positiv
Maltose: negativ
Kaliumgluconat: positiv
n-Caprinsäure: positiv
Adipinsäure: negativ
dl-Äpfelsäure: positiv
Natriumcitrat: positiv
Phenylacetat: positiv

Anhand dieser mikrobiologischen Eigenschaften haben die Erfinder versucht, den Stamm YN2 entsprechend dem Bergey Manual of Systematic Bacteriology, Band 1 (1984) und dem Bergey Manual of Determinative Bacteriology 9. Aufl. (1994) zu kategorisieren, um zu bestimmen, daß dieser Stamm zu Pseudomonas cichorii gehört. Somit wurde er als Pseudomonas cichorii YN2 bezeichnet.
Es gab keine Berichte zu einem Stamm bei Pseudomonas cichorii, der PHA produzieren kann, so wie es der Stamm YN2 zeigt. Die Erfinder haben folglich festgestellt, daß der Stamm YN2 ein neuer Mikroorganismus ist. Der Anmelder hat den Pseudomonas cichorii YN2 beim Patent Microorganism Depository Center in the National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministriy of International Trade and Industry unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-7375 hinterlegt. Der Stamm YN2 wurde auf der Basis des Budapester Vertrags international hinterlegt, und dessen internationale Zugangsnummer lautet "FERM BP-7375".
Den Erfindern gelang das Klonen eines Gens für eine PHA-Synthase aus dem neuen Mikroorganismenstamm YN2, und sie haben das Gen sequenziert. Die Erfinder haben auch die Aminosäuresequenz für die PHA-Synthase bestimmt, die von diesem Gen codiert wird. Auf der Basis der vorstehend genannten Beobachtung gelangten sie zur vorliegenden Erfindung.
Insbesondere ist die erfindungsgemäße PHA-Synthase eine Polyhydroxyalkanoat-Synthase mit der Aminosäuresequenz mit der Sequenzidentifizierungsnummer 1 oder 3. Außerdem kann die erfindungsgemäße PHA-Synthase eine PHA-Synthase sein, die die Aminosäuresequenz der Sequenzidentifizierungsnummer 1 im wesentlichen beibehält und eine modifizierte Aminosäuresequenz aufweist, bei der Aminosäuren deletiert, substituiert oder hinzugefügt sind, sofern dies die Aktivität als Polyhydroxyalkanoat-Synthase nicht beeinträchtigt, oder eine PHA-Synthase sein, die die Aminosäuresequenz der Sequenzidentifizierungsnummer 3 im wesentlichen beibehält und eine modifizierte Aminosäuresequenz aufweist, bei der Aminosäuren deletiert, substituiert oder hinzugefügt sind, sofern dies die Aktivität als Polyhydroxyalkanoat-Synthase nicht beeinträchtigt.
Das erfindungsgemäße PHA-Synthase-Gen ist ein Gen für eine Polyhydroxyalkanoat-Synthase, das eine DNA umfaßt, die die Aminosäuresequenz der Sequenzidentifizierungsnummer 1 oder die Sequenz ihrer modifizierten Aminosäure codiert, oder ein Gen für eine Polyhydroxyalkanoat-Synthase, das eine DNA umfaßt, die die Aminosäuresequenz der Sequenzidentifizierungsnummer 3 oder die Sequenz ihrer modifizierten Aminosäure codiert. Ausführungsformen des erfindungsgemäßen PHA-Synthase-Gens, die von einem Genomgen im Stamm YN2 stammen, schließen ein PHA-Synthase-Gen, das eine DNA-Sequenz der Sequenzidentifizierungsnummer 2 als eine DNA codierende Aminosäuresequenz der Sequenzidentifizierungsnummer 1 einschließt, und ein PHA-Synthase-Gen ein, das eine DNA-Sequenz der Sequenzidentifizierungsnummer 4 als eine DNA aufweist, die die Aminosäuresequenz der Sequenzidentifizierungsnummer 3 codiert.
Die Erfindung stellt auch einen rekombinanten Vektor bereit, der eine Gen-DNA, die die vorstehend genannte Aminosäuresequenz codiert, als Polyhydroxyalkanoat-Synthase-Gen aufweist. Diese Erfindung stellt auch einen transformierten Mikroorganismus bereit, der durch Einführen eines an einen Wirt angepaßten rekombinanten Vektors transformiert worden ist.
Die vorliegende Erfindung gibt auch ein Verfahren zur Herstellung eines Polyhydroxyalkanoats an, das die Schritte des Züchtens des transformierten Mikroorganismus, in den ein rekombinanter Vektor eingeführt worden ist, in einem Kulturmedium, das ein Substrat für eine Polyhydroxyalkanoat-Synthase enthält, und des Auffangens des Polyhydroxyalkanoats aus dem Kulturpräparat umfaßt. Die vorliegende Erfindung gibt auch ein Verfahren zur Herstellung eines Polyhydroxyalkanoats an, das die Schritte des Züchtens des transformierten Mikroorganismus, in den ein rekombinanter Vektor eingeführt worden ist, und des Bewirkens, daß dieser transformierte Mikroorganismus das Polyhydroxyalkanoat produziert, umfaßt.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung eines Polyhydroxyalkanoats kann die Substratspezifität ausnutzen, die für eine Polyhydroxyalkanoat-Synthase charakteristisch ist, die vom Stamm YN2 stammt: zum Beispiel die Herstellung eines Polyhydroxyalkanoats, das eine Monomereinheit der Formel (I) umfaßt, die von 3HFPV stammt, unter Verwendung des vorstehend genannten transformierten Mikroorganismus oder die Herstellung eines Polyhydroxyalkanoats, das eine Monomereinheit der Formel (VI) umfaßt, die von 3HCHxB stammt.
Die PHA-Synthase und das die PHA-Synthase codierende Gen der vorliegenden Erfindung stammen von einem neuen Mikroorganismus, dem Stamm Pseudomonas cichorii YN2, und zeigt eine solche Substratspezifität, daß sie selektiv ein PHA produziert, das eine Monomereinheit mit einer neuen Struktur der Seitenkette aufweist. Ein rekombinanter Vektor, der das PHA-Synthase-Gen aufweist, und ein durch diesen rekombinanten Vektor transformierter Mikroorganismus können ein PHA produzieren, das eine Substratspezifität zeigt, die der von Pseudomonas cichorii YN2 ähnlich ist. Folglich codiert das erfindungsgemäße PHA-Synthase-Gen ein Enzym, das die selektive Herstellung eines PHA ermöglicht, das eine Monomereinheit mit einer neuen Struktur der Seitenkette aufweist, und erlaubt es uns, einen transformierten Mikroorganismus zu schaffen, der für die Herstellung eines PHA mit verschiedenen vorteilhaften physikalischen Eigenschaften nützlich ist, bei dem die Verwendung als funktionelles Polymer erwartet werden kann.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 erläutert eine Basensequenz, die die erste PHA-Synthase codiert, die von Pseudomonas cichorii YN2 (FERM BP-7375) stammt;
2 erläutert eine Basensequenz, die die erste PHA-Synthase codiert, die von Pseudomonas cichorii YN2 (FERM BP-7375) stammt;
3 erläutert eine Basensequenz, die die erste PHA-Synthase codiert, die von Pseudomonas cichorii YN2 (FERM BP-7375) stammt;
4 erläutert eine Basensequenz, die die erste PHA-Synthase codiert, die von Pseudomonas cichorii YN2 (FERM BP-7375) stammt;
5 erläutert eine Basensequenz, die die erste PHA-Synthase codiert, die von Pseudomonas cichorii YN2 (FERM BP-7375) stammt;
6 erläutert eine Basensequenz, die die zweite PHA-Synthase codiert, die von Pseudomonas cichorii YN2 (FERM BP-7375) stammt;
7 erläutert eine Basensequenz, die die zweite PHA-Synthase codiert, die von Pseudomonas cichorii YN2 (FERM BP-7375) stammt;
8 erläutert eine Basensequenz, die die zweite PHA-Synthase codiert, die von Pseudomonas cichorii YN2 (FERM BP-7375) stammt;
9 erläutert eine Basensequenz, die die zweite PHA-Synthase codiert, die von Pseudomonas cichorii YN2 (FERM BP-7375) stammt; und
10 erläutert eine Basensequenz, die die zweite PHA-Synthase codiert, die von Pseudomonas cichorii YN2 (FERM BP-7375) stammt.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die erfindungsgemäße PHA-Synthase ist ein Enzymprotein, das von einem neuen Mikroorganismus stammt, der von den hier genannten Erfindern abgetrennt worden ist, Pseudomonas cichorii YN2 (FERM BP-7375). Insbesondere kann sie 5-(4-Fluorphenyl)valeriansäure (FPVA) in die entsprechende 3-Hydroxy-5-(4-fluorphenyl)valeriansäure (3HFPV) oder 4-Cyclohexylbuttersäure (CHxBA) in die entsprechende 3-Hydroxy-4- cyclohexylbuttersäure (3HCHxB) überführen und hat folglich eine Enzymaktivität, die an der Produktion eines PHA beteiligt ist, das die entsprechende Monomereinheit aufweist.
Die PHA-Synthase und ein das Enzym codierende Gen dieser Erfindung werden ausführlicher beschrieben.
Aus dem Stamm YN2 haben die Erfinder ein Gen geklont, das in eine PHA-Synthase translatiert worden ist, die die vorstehend genannte Substratspezifität aufweist, um das Vorhandensein einer PHA-Synthase zu bestimmen, die zumindest zwei Aminosäuresequenzen umfaßt. Insbesondere umfaßt die erfindungsgemäße PHA-Synthase in einem Chromogen im Stamm YN2 zwei Enzyme, das heißt die PHA-Synthase umfaßt die Aminosäuresequenz der Sequenzidentifizierungsnummer 1, die von einer DNA mit der Sequenz der Sequenzidentifizierungsnummer 2 codiert wird, und eine PHA-Synthase, die die Aminosäuresequenz der Sequenzidentifizierungsnummer 3 umfaßt, die von einer DNA mit der Sequenz der Sequenzidentifizierungsnummer 4 codiert wird. Gen-DNA mit den Sequenzen der Sequenzidentifizierungsnummern 2 und 4 können nach folgenden Verfahren geklont werden.
Da PHA-Synthase ein Enzymprotein ist, das von einem Chromgen im Stamm Pseudomonas cichorii YN2 translatiert worden ist, wird zuerst eine Chromosomen-DNA erhalten, die die gewünschte PHA-Synthase enthält. Eine Chromosomen-DNA kann nach einem bekannten Abtrennungsverfahren von Zellen des Stamms YN2 abgetrennt werden. Der Stamm YN2 wird zum Beispiel im Medium LB oder im Medium M9 gezüchtet, das mit einer geeigneten Kohlenstoffquelle ergänzt ist, aufgebrochen und behandelt, wie es zum Beispiel bei Marmer et al. im Journal of Molecular Biology, Bd. 3, S. 208 (1961) beschrieben ist, wodurch eine Chromosomen-DNA hergestellt wird.
Dann wird aus der so erhaltenen Chromosomen-DNA eine Genbank hergestellt. Die Chromosomen-DNA wird unter Verwendung eines geeigneten Restriktionsenzyms (zum Beispiel Sau3AI) abgebaut, und ein Fragment mit der geeigneten Länge wird mit einem ligationsfähigen Vektor ligiert, der mit einem Restriktionsenzym (zum Beispiel BamHI) abgeschnitten worden ist, wodurch eine Genbank erzeugt wird.
Die geeignete Länge des Fragmentes ändert sich in Abhängigkeit von dem für die Herstellung der Bank verwendeten Vektor, zum Beispiel etwa 4.000 bis 25.000 bps für einen üblichen Plasmidvektor und etwa 15.000 bis 30.000 bps für einen Cosmid- oder Phagenvektor. Eine geeignete Länge des DNA-Fragmentes kann nach einem bekannten Verfahren gewonnen werden, zum Beispiel nach einem Verfahren, das den Dichtegradienten von Saccharose verwendet oder ein Agarosegel benutzt, wie es in Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1982) beschrieben ist.
Da bei einer Genbank E. coli als Wirtsmikroorganismus verwendet wird, ist der Vektor ein Phagenvektor oder ein Plasmidvektor, der im Wirtsmikroorganismus (E. coli) autonom wachsen kann. Zu Beispielen der Phagen- oder Cosmidvektoren, die allgemein verwendet werden, gehören pWE15, M13, λEMBL3, λEMBL4, λFIXII, λDASHII, λZAPII, λgt10, λgt11, Charon4A und Charon21A. Zu Beispielen der häufig verwendeten Plasmidvektoren gehören pBR-, pUC-, pBluescriptII-, pGEM-, pTZ- und pET-Gruppen. Zusätzlich zu E. coli können verschiedene Schuttle-Vektoren verwendet werden, zum Beispiel Vektoren, die zu einer autonomen Replikation in einer Vielzahl von Wirtsmikroorganismen, wie Pseudomonas sp., in der Lage sind. Diese Vektoren können zum Beispiel in Abhängigkeit von der Chromosomen-DNA, die mit ihnen ligiert werden soll, wiederum mit einem geeigneten Restriktionsenzym abgeschnitten werden, wodurch das gewünschte Fragment bereitgestellt wird.
Das Chromosomen-DNA-Fragment kann unter Verwendung von DNA-Ligase mit einem Vektorfragment ligiert werden. Es kann zum Beispiel ein handelsübliches Ligations-Kit (Takara Shuzo Co., Ltd., usw.) verwendet werden. Folglich können zum Beispiel verschiedene Chromosomen-DNA-Fragmente mit einem Plasmidvektor-Fragment ligiert werden, um ein Gemisch rekombinanter Plasmide herzustellen, die verschiedene DNA-Fragmente umfassen (hier nachstehend als "Genbank" bezeichnet).
Zusätzlich zu einem Verfahren, das eine geeignete Länge des Chromosomen-DNA-Fragmentes verwendet, kann die Genbank nach einem Verfahren hergestellt werden, bei dem alle mRNA aus dem Stamm YN2 herausgelöst, gereinigt und für die Herstellung eines cDNA-Fragmentes verwendet werden, wobei reverse Transkriptase benutzt wird, wie es in Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982 beschrieben ist. Nach einer anderen Ausführungsform wird ein vorbereiteter Vektor in einer Genbank verwendet, um E. coli zu transformieren oder zu transduzieren, und dann wird der Wirt E. coli gezüchtet, um die Genbank zu einer großen Menge zu amplifizieren, wie es in Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982 beschrieben ist.
Ein rekombinanter Vektor, der ein Gen-DNA-Fragment umfaßt, kann nach einem bekannten Verfahren in einen Wirtsmikroorganismus eingeführt werden. Wenn zum Beispiel E. coli als Wirtsmikroorganismus verwendet wird, kann ein rekombinanter Plasmidvektor eingeführt werden, wobei das Calciumchloridverfahren (Journal of Molecular Biology, Bd. 53, S. 159 (1970)), das Rubidiumchloridverfahren (Methods in Enzymology, Bd. 68, S. 253 (1979)), die Elektroporation (Current Protocols in Molecular Biology, Bd. 1, S. 1.8.4 (1994)) angewendet werden. Wenn ein Cosmidvektor oder Phagenvektor verwendet wird, kann die Transduktion im Wirt E. coli unter Anwendung der in vitro Verpackung durchgeführt werden (Current Protocols in Molecular Biology, Bd. 1, S. 5.7.1 (1994)). In einer anderen Ausführungsform kann der Konjugationstransfer mit einem Stamm ausgenutzt werden, der einen rekombinanten Vektor beibehält, wodurch ein den Vektor beibehaltender Stamm erzeugt wird.
Aus der Genbank wird dann eine Probe hergestellt, um ein DNA-Fragment zu erhalten, das ein PHA-Synthase-Gen des Stamms YN2 umfaßt.
Für PHA-Synthase-Gene in bekannten Mikroorganismen sind bereits einige Basensequenzen genannt worden; zum Beispiel bei Peoples, O. P. und Sinskey, A. J., J. Biol. Chem., 264, 15293 (1989); Huisman, G. W. et al., J. Biol. Chem., 266, 2191 (1991); Pieper, U. et al., FEMS Microbiol. Lett., 96, 73 (1992); Timm, A. und Steinbuchel, A., Eur. J. Biochem., 209, 15 (1992); Matsusaki, H. et al., J. Bacteriol., 180, 6359 (1998). Diese aufgeführten Sequenzen werden verglichen, um eine Region auszuwählen, bei der die Sequenz in einem höheren Ausmaß konserviert ist, und somit ein Oligonucleotid für einen Primer zu gestalten, der bei der Polymerase-Kettenreaktion (hier nachstehend als "PCR" bezeichnet) verwendet wird. Zu solchen Oligonucleotiden für einen Primer, die ein gemeinsames Merkmal von PHA-Synthase-Genen ausnutzen, gehört eine Sequenz, die bei Timm, A. und Steinbuchel, A., Eur. J. Biochem., 209, 15 (1992) beschrieben ist, sie sind jedoch nicht darauf begrenzt. Ein Oligonucleotid kann zum Beispiel unter Verwendung einer handelsüblichen DNA-Synthesevorrichtung, wie Custom Synthesis Service, Amersham-Pharmacia Biotech., synthetisiert werden, wobei dies von der gestalteten Sequenz abhängt.
Für ein erfindungsgemäßes PHA-Synthase-Gen, das von YN2 stammt, wurden synthetische DNA gestaltet, die die Sequenzen der Sequenzidentifizierungsnummern 5 und 6 aufweisen.
Dann wird das gestaltete Oligonucleotid als Primer der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unterzogen, wobei als Templat eine Chromosomen-DNA im Stamm YN2 verwendet wird, wodurch ein durch die PCR amplifiziertes Fragment erhalten wird. Das durch die PCR amplifizierte Fragment, das vom Primer stammt, umfaßt an beiden Enden eine Sequenz, die in PHA-Synthase-Genen üblich ist. Eine Teilsequenz, die vom PHA-Synthase-Gen selbst im Stamm YN2 stammt, ist als Templat an beiden Enden zwischen den Sequenzen enthalten, die dem Primer komplementär sind.
Das erhaltene, durch PCR amplifizierte Fragment ist folglich dem PHA-Synthase-Gen im Stamm YN2 fast 100% homolog, und es wird erwartet, daß es als Probe bei der Koloniehybridisierung ein höheres S/N-Verhältnis zeigt. Außerdem kann es die Kontrolle der Striktheit bei der Hybridisierung erleichtern.
Das vorstehend genannte, durch PCR amplifizierte Fragment wird mit einem geeigneten Reagens markiert und als Probe verwendet, um die vorstehend genannte Chromosmen-DNA-Bank einer Koloniehybridisierung zu unterziehen, um einen rekombinanten Stamm E. coli auszuwählen, der das PNA-Synthase-Gen beibehält (Current Protocols in Molecular Biology, Bd. 1, S. 6.0.3 (1994)). Das durch PCR amplifizierte Fragment kann zum Beispiel unter Verwendung eines üblichen Nachweissystems markiert werden, wobei ein markiertes Enzym oder ein handelsübliches Kit, wie AlkPhosDirect (Amersham-Pharmacia Biotech) verwendet wird.
Ein rekombinanter Stamm E. coli, der ein Genfragment beibehält, das ein PHA-Synthase-Gen aufweist, kann zusätzlich zum vorstehend beschriebenen Verfahren, das einen Gentyp verwendet, durch ein Verfahren ausgewählt werden, das einen Phenotyp benutzt, wobei die PHA-Synthese direkt ausgewertet wird. Insbesondere wird bei der Expression einer PHA-Synthase aus einem erhalten gebliebenen PHA-Synthase-Gen in einem rekombinanten Stamm E. coli das PHA durch die PHA-Synthase produziert. Die PHA-Synthese kann nachgewiesen werden, um einen rekombinanten Stamm E. coli auszuwählen, in dem die PHA-Synthase ausgeprägt wird. Die PHA-Synthese kann zum Beispiel durch Färben mit Sudanschwarz B (Archives of Biotechnology, Bd. 71, S. 283 (1970)) oder durch Bestimmung der Ansammlung von PHA durch Phasenkontrast-Mikroskopie nachgewiesen werden.
Ein Plasmid wird aus einem rekombinanten E. coli aufgefangen, der nach irgendeinem der vorstehend genannten Verfahren ausgewählt worden ist, wobei ein Alkaliverfahren angewendet wird (Current Protocols in Molecular Biology, Bd. 1, S. 1.6.1 (1994)). Das aufgefangene Plasmid kann verwendet werden, um ein DNA-Fragment, das ein PHA-Synthase-Gen aufweist, oder mehrere DNA-Fragmente bereitzustellen, die teilweise ein PHA-Synthase-Gen enthalten. Das erhaltene DNA-Fragment kann zum Beispiel nach dem Sanger-Sequenzierungsverfahren sequenziert werden (Molecular Cloning, Bd. 2, S. 13.3 (19891). Insbesondere kann dies nach einem Farbstoff-Primer-Verfahren oder einem Farbstoff-Terminator-Verfahren durchgeführt werden, wobei eine automatische Sequenziervorrichtung, wie der DNA Sequencer 377A (Perkin Elmer), verwendet wird. Da die Sequenz des Vektors selbst, in dem das DNA-Fragment aufgenommen worden ist, bekannt ist, kann die Sequenz des darin geklonten DNA-Fragmentes zweifelsfrei analysiert werden.
Nach der Sequenzierung aller erhaltenen DNA-Fragmente, die ein PHA-Synthase-Gen aufweisen, kann eine Hybridisierung durchgeführt werden, wobei ein DNA-Fragment verwendet wird, das nach einem geeigneten Verfahren, wie der chemischen Synthese, der PCR unter Verwendung von Chromosomen-DNA als Templat oder den Abbau des diese Sequenz umfassenden DNA-Fragmentes mit einem Restriktionsenzym, als Probe hergestellt worden ist, wodurch die DNA des erfindungsgemäßen PHA-Synthase-Gens bereitgestellt wird.
Die Erfinder haben nach dem vorstehend genannten Verfahren ein Gen ausgewählt, das in eine PHA-Synthase translatiert worden ist, die die vorstehend genannte Substratspezifität vom Stamm YN2 aufweist, wodurch eine PHA-Synthase gefunden worden ist, die mindestens zwei Aminosäuresequenzen aufweist. Insbesondere haben die Erfinder ein PHA-Synthase-Gen, das aus der Chromosomen-DNA des Stamms YN2 aufgefangen worden ist und die Sequenz der Sequenzidentifizierungsnummer 2 umfaßt, und eine PHA-Synthase, die von diesem Gen codiert wird und die Aminosäure der Sequenzidentifizierungsnummer 1 umfaßt, sowie auch ein PHA-Synthase-Gen, das die Sequenz der Sequenzidentifizierungsnummer 4 umfaßt, und eine PHA-Synthase gefunden, die von diesem Gen codiert wird und die Aminosäure der Sequenzidentifizierungsnummer 3 umfaßt.
Das erfindungsgemäße PNA-Synthase-Gen kann ein degeneriertes Isomer einschließen, das das gleiche Polypeptid codiert, das die gleiche Aminosäuresequenz hat und in einem Degenerierungscodon verschieden ist. Insbesondere schließt es in Abhängigkeit vom Wirt durch die Auswahl und Umwandlung eines häufiger verwendeten degenerierten Codons, das die gleiche Aminosäure codiert, auch ein degeneriertes Isomer ein. Neben der PHA-Synthase, die die Aminosäuresequenz der Sequenzidentifizierungsnummer 1 umfaßt, die dem Stamm YN2 inhärent ist, und der PHA-Synthase, die die Aminosäuresequenz der Sequenzidentifizierungsnummer 3 umfaßt, kann die erfindungsgemäße PHA-Synthase eine Mutation, wie eine Deletion, Substitution oder Addition verschiedener Aminosäuren, aufweisen, sofern deren Aktivität zur Erzeugung von PHA und Substratspezifität nicht beeinträchtigt werden können oder die Aminosäuresequenz erhalten bleiben kann. Eine Mutation, wie Deletion, Substitution oder Addition kann durch ein Verfahren zur Einführung einer ortsspezifischen Mutation eingeführt werden, das auf einem PHA-Synthase-Gen basiert, das dem Stamm YN2 inhärent ist, das die Sequenzidentifizierungsnummer 2 oder 4 aufweist (Current Protocols in Molecular Biology Bd. 1, S. 8.1.1 (1994)).
Ein erfindungsgemäßer rekombinanter Vektor wird bei einer Anwendung benutzt, bei der eine erfindungsgemäße rekombinante PHA-Synthase unter Verwendung von Pseudomonas sp. oder eines Mikroorganismus, wie E. coli, als Wirt ausgeprägt wird. Es ist folglich bevorzugt, daß sich der erfindungsgemäße rekombinante Vektor in einem verwendeten Wirt selbst autonom replizieren kann, der einen Promotor für die Expression, eine DNA eines erfindungsgemäßen PHA-Synthese-Gens und eine Transkriptions-Terminationssequenz umfaßt, die für den Wirt geeignet ist. Außerdem ist es bevorzugt, daß nach der Einführung des rekombinanten Vektors ein Vektor verwendet wird, der verschiedene Markergene umfaßt, die für dessen Auswahl benutzt werden.
Für verschiedene Arten von bakteriellen Wirten, wie Pseudomonas sp. und E. coli, geeignete Expressionsvektoren schließen pLA2917 (ATCC 37355) mit einem RK2-Replikationsursprung, der repliziert und von einem Bereich von Wirten beibehalten werden kann, oder pJRD215 (ATCC 37533) mit einem RSF1010-Replikationsursprung ein. Ohne darauf begrenzt sein zu wollen, kann irgendein Vektor verwendet werden, der einen Replikationsursprung hat, der repliziert und von einem Bereich von Wirten beibehalten werden kann. Es kann irgendein Promotor verwendet werden, der in einem Bakterium als Wirt ausgeprägt werden kann; zum Beispiel Promotoren, die von E. coli, einem Phagen usw. stammen, wie die Promotoren trp, trc, tac, lac, PL, PR, T7 und T3.
Wenn eine Hefe als Wirt verwendet wird, kann der Expressionsvektor der Vektor YEp13, YCp50, pRS oder pYEX sein. Ein Promotor kann zum Beispiel der Promotor GAL oder AOD sein.
Ein erfindungsgemäßer transformierter Mikroorganismus kann erzeugt werden, indem ein erfindungsgemäßer rekombinanter Vektor in einen Wirt eingeführt wird, der für einen Expressionsvektor geeignet ist, der während der Herstellung des rekombinanten Vektors verwendet wurde. Zu Beispielen der Bakterien, die als Wirt verwendet werden können, gehören Escherichia sp., Pseudomonas sp., Ralstonia sp., Alcaligenes sp., Comamonas sp., Burkholderia sp., Agrobacterium sp., Flabobacterium sp., Vibrio sp., Enterobacter sp., Rhizobium sp., Gluconobacter sp., Acinetobacter sp., Moraxella sp., Nitrosomonas sp., Aeromonas sp., Paracoccus sp., Bacillus sp., Clostridium sp., Lactobacillus sp., Corynebacterium sp., Arthrobacter sp., Achromobacter sp., Micrococcus sp., Mycobacterium sp., Streptococcus sp., Streptomyces sp., Actinomyces sp., Norcadia sp. und Methylobacterium sp. Eine rekombinante DNA kann nach einem geeigneten Verfahren, wie dem vorstehend genannten Calciumchloridverfahren und der Elektroporation, in ein Bakterium eingeführt werden.
Neben den vorstehend genannten Bakterien können als Wirt Hefen und Schimmel, wie Saccharomyces sp. und Candida sp., verwendet werden. Eine rekombinante DNA kann zum Beispiel durch Elektroporation (Methods Enzymol., 194, 182–187 (1990)), ein Sphäroplastverfahren (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1929–1933 (1978)) und ein Lithiumacetatverfahren (J. Bacteriol., 153, 163–168 (1983)) in eine Hefe eingeführt werden.
Eine erfindungsgemäße PHA-Synthase kann hergestellt werden, indem eine erfindungsgemäße Transformante, die nach dem vorstehend angegebenen Verfahren hergestellt worden ist, gezüchtet wird und bewirkt wird, daß ein entsprechendes PNA-Synthase-Gen in einem eingeführten Expressionsvektor die Synthase als rekombinantes Protein erzeugt. Die erfindungsgemäße PHA-Synthase wird in der Kultur erzeugt und gespeichert (gezüchtetes Bakterium oder Kulturüberstand) und von der Kultur abgetrennt, um sie für die Herstellung eines rekombinanten Enzymproteins zu verwenden. Für diesen Zweck kann eine erfindungsgemäße Transformante nach einem üblichen Verfahren gezüchtet werden, das für die Züchtung eines Wirts verwendet wird. Die Züchtung kann nach irgendeinem der üblichen Verfahren erfolgen, die für die Züchtung eines Mikroorganismus angewendet werden, wie eine Batch-, Flow-batch-, kontinuierliche Züchtungs- und Reaktorart. Diese Züchtung kann durchgeführt werden, indem zum Beispiel ein Medium verwendet wird, das einen Induktor für die Expression des vorstehend genannten Polyhydroxyalkanoat-Synthase-Gens enthält.
Für eine Transformante, die unter Verwendung eines Bakteriums, wie E. coli, als Wirt erhalten worden ist, kann das für die Züchtung verwendete Medium ein komplettes Medium oder ein synthetisches Medium, wie das Medium LB oder das Medium M9, sein. Ein Mikroorganismus kann durch eine 8- bis 72stündige aerobe Züchtung bei einer Züchtungstemperatur von 25 bis 37°C gezüchtet werden. Dann werden die Bakterien aufgefangen, um die in diesen gespeicherte PHA-Synthase zu erhalten. Zu Beispielen einer Kohlenstoffquelle für den Mikroorganismus gehören Zucker, wie Glucose, Fructose, Saccharose, Maltose, Galactose und Stärken; niedere Alkohole, wie Ethanol, Propanol und Butanol; Polyalkohole, wie Glycerol; organische Säuren, wie Essigsäure, Citronensäure, Succinsäure, Weinsäure, Milchsäure und Gluconsäure; und aliphatische Säuren, wie Propionsäure, Butansäure, Pentansäure, Hexansäure, Heptansäure, Octansäure, Nonansäure, Decansäure, Undecansäure und Dodecansäure.
Zu Beispielen einer Stickstoffquelle gehören Ammoniak; Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat und Ammoniumphosphat; und Derivate von Naturprodukten, wie Pepton, Fleischextrat, Hefeextrakt, Malzextrakt, Zersetzungsprodukte von Casein und die Quellflüssigkeit von Mais. Zu Beispielen eines anorganischen Materials gehören Kaliumdihydrogenphosphat, Kaliummonohydrogenphosphat, Magnesiumphosphat, Magnesiumsulfat und Natriumchlorid. Das Kulturmedium kann irgendein Antibiotikum, wie Kanamycin, Ampicillin, Tetracyclin, Chloramphenicol und Streptomycin, enthalten, wobei dies zum Beispiel von der Art des als Markergen verwendeten Wirkstoffresistenzgens abhängt.
Wenn ein induzierbarer Promotor in einem Expressionsvektor verwendet wird, kann die Expression verbessert werden, wenn während der Züchtung eines transformierten Mikroorganismus in Abhängigkeit von der Art des Promotors ein geeigneter Induktor zugesetzt wird. Der Induktor kann zum Beispiel Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG), Tetracyclin oder Indolacrylsäure (IAA) sein.
Die PHA-Synthase kann abgetrennt und gereinigt werden, indem die erhaltene Kultur zentrifugiert und aufgefangen und nach einem Verfahren, wie der Affinitätschromatographie, der Kationen- oder Anionenaustauschchromatographie und der Gelfiltration, entsprechend der jeweiligen Anwendung allein oder in Kombination behandelt wird. Ob das gereinigte Material ein gewünschtes Enzym darstellt, wird nach einem üblichen Verfahren, wie der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und dem Western-Blotting, festgestellt.
Diese Erfindung ist nicht auf die Verfahren begrenzt, wie sie vorstehend für die Züchtung eines erfindungsgemäßen transformierten Mikroorganismus, die erfindungsgemäße Produktion einer PHA-Synthase durch den transformierten Mikroorganismus und dessen Speicherung in Bakterienzellen und das Auffangen und Reinigen der PHA-Synthase aus den Zellen beschrieben worden sind.
Ein erfindungsgemäßer transformierter Mikroorganismus kann für die Expression einer rekombinanten PHA-Synthase verwendet werden, wodurch durch dessen Züchtung ein gewünschtes PHA erzeugt wird. Der Mikroorganismus kann zum Beispiel unter den vorstehend genannten Züchtungsbedingungen gezüchtet werden, wodurch eine rekombinante PHA-Synthase erzeugt wird, während dem Medium ein Substrat zugesetzt wird, das dem gewünschten PHA entspricht, auf das die PHA-Synthase einwirkt. Am bequemsten kann das PHA durch Extraktion mit einem gewöhnlich verwendeten organischen Lösungsmittel, wie Chloroform, aus der Kultur und den erzeugenden Bakterien aufgefangen werden. In einer Umgebung, in der die Verwendung eines organischen Lösungsmittels, wie Chloroform, unerwünscht ist, kann die Kultur mit einem oberflächenaktiven Mittel, wie SDS, einem Enzym, wie Lysozym, oder einem Mittel, wie EDTA, Natriumhypochlorit und Ammoniak, behandelt werden, um die vom PHA verschiedenen Bakterienkomponenten zu entfernen, wodurch das PHA aufgefangen wird. Diese Erfindung ist nicht auf die vorstehend genannten erfindungsgemäßen Verfahren für die Züchtung eines transformierten Mikroorganismus für die Erzeugung eines PHA, die Produktion eines PHA durch einen gezüchteten Mikroorganismus und dessen Speicherung in einem gezüchteten Mikroorganismus und das Auffangen des PHA aus einem rekombinanten Mikroorganismus begrenzt.
Beispiele
Die Erfindung wird unter Bezugnahme auf Beispiele ausführlicher beschrieben, obwohl diese Beispiele als beste Ausführungsformen dieser Erfindung erläutert werden und den technischen Bereich dieser Erfindung nicht einschränken.
(Beispiel 1) Klonen eines PHA-Synthase-Gens des Stamms YN2
Der Stamm YN2 wurde über Nacht bei 30°C in 100 ml Medium LB (1% Polypeton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% Natriumchlorid, pH = 7,4) gezüchtet, und danach wurde eine Chromosomen-DNA abgetrennt und aufgefangen, wie es bei Marmer beschrieben ist. Die erhaltene Chromosomen-DNA wurde unter Verwendung des Restriktionsenzyms BgIII vollständig aufgeschlossen. Der Vektor pUC18 wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI gespalten. Nach der Dephosphorylierung der Termini (Molecular Cloning, Bd. 1, S. 5.7.2 (1989), Cold Spring Harbor Laboratory) wurden die Spaltstelle des Vektors (Klonierungsstelle) und das Chromosomen-DNA-Fragment nach dem vollständigen Aufschließen mit BgIII vereinigt, wobei das DNA-Ligations-Kit Ver. II (Takara Shuzo Co., Ltd.) verwendet wurde. Der Plasmidvektor, in den das Chromosomen-DNA-Fragment integriert worden war, wurde für die Transformation von Escherichia coli HB101 verwendet, um eine Chromosomen-DNA-Bank für den Stamm YN2 herzustellen.
Um ein DNA-Fragment auszuwählen, das ein PHA-Synthase-Gen des Stamms YN2 enthält, wurde dann eine Probe für die Koloniehybridisierung hergestellt. Es wurde ein Oligonucleotid hergestellt, das aus den Sequenzen mit den Sequenzidentifizierungsnummern 5 und 6 bestand (Amersham-Pharmaca Biotech), und als Primer für die PCR benutzt, wobei die Chromosomen-DNA als Templat verwendet wurde. Als Probe wurde ein durch PCR amplifiziertes DNA-Fragment verwendet. Das Markieren der Probe erfolgte unter Verwendung eines handelsüblichen Markerenzymsystems AlkPhosDirect (Amersham-Pharmacia Biotech). Die so erhaltene markierte Probe wurde verwendet, um durch Koloniehybridisierung aus der Chromosomen-DNA-Bank des Stamms YN2 einen Stamm E. coli auszuwählen, der ein rekombinantes Plasmid enthält, das das PNA-Synthase-Gen umfaßt. Aus dem ausgewählten Stamm wurde das Plasmid durch ein Alkaliverfahren aufgefangen, wodurch ein DNA-Fragment erzeugt wurde, das ein PHA-Synthase-Gen umfaßt.
Das so erhaltene Gen-DNA-Fragment wurde in den Vektor pBBR122 (Mo BiTec) rekombiniert, der einen weiten Wirtsbereich der Replikationsregion umfaßt, die in einer inkompatiblen Gruppe nicht zu IncP, IncQ oder IncW gehört. Das rekombinante Plasmid wurde durch Elektroporation in den Stamm Pseudomonas cichorii YN2m1 transformiert (ein Stamm, bei dem das PHA-Synthesevermögen stark verringert ist), und danach gewann der Stamm YN2m1 das PHA-Synthesevermögen wieder zurück und zeigte sich komplementär. Das zeigt, daß das ausgewählte Gen-DNA-Fragment eine Region eines PHA-Synthase-Gens umfaßt, die in eine PHA-Synthase in Pseudomonas cichorii YN2m1 translatiert werden kann.
Das DNA-Fragment, das ein PHA-Synthase-Gen umfaßt, wurde nach dem Sanger-Sequenzierungsverfahren sequenziert. Somit wurde festgestellt, daß die bestimmte Sequenz die Sequenzen der Sequenzidentifizierungsnummern 2 und 4 umfaßt, die jede eine Peptidkette codieren. Wie nachfolgend beschrieben wurde festgestellt, daß beide Proteine, die aus einer Peptidkette bestehen, eine Enzymaktivität aufwiesen und daß die Sequenzen der Sequenzidentifizierungsnummern 2 und 4 folglich PHA-Synthase-Gene waren. Insbesondere wurde festgestellt, daß die Sequenzen der Sequenzidentifizierungsnummern 2 und 4 die Aminosäuresequenzen der Sequenzidentifizierungsnummern 1 bzw. 3 codierten und daß ein Protein, das eine dieser Aminosäuresequenzen allein umfaßt, ein PHA erzeugen kann.
(Beispiel 2) Rekombination eines PHA-Synthase-Gens des Stamms YN2 zu einem Expressionsvektor
Ein PHA-Synthase-Gen mit der Sequenz der Sequenzidentifizierungsnummer 2 wurde der PCR unterzogen, wobei eine Chromosomen-DNA als Templat verwendet wurde, wodurch die gesamte Länge eines PHA-Synthase-Gens reproduziert wurde. Ein Oligonucleotid mit einer Sequenz, die einen stromaufwärtigen Primer zur Sequenz der Sequenzidentifizierungsnummer 2 war und stromaufwärts ihres Startcodons eine Sequenz aufwies (Sequenzidentifizierungsnummer 7), und ein Oligonucleotid mit einer Sequenz, die ein stromabwärtiger Primer zur Sequenz der Sequenzidentifizierungsnummer 2 war und stromabwärts ihres Stopcodons eine Sequenz aufwies (Sequenzidentifizierungsnummer 8) wurden gestaltet und hergestellt (Amersham-Pharmacia Biotech). Unter Verwendung dieser Oligonucleotide als Primer wurde eine PCR durchgeführt, um die gesamte Länge des PHA-Synthase-Gens zu amplifizieren (LA-PCR-Kit; Takara Shuzo Co., Ltd.).
In ähnlicher Weise wurde ein PHA-Synthase-Gen mit der Sequenz der Sequenzidentifizierungsnummer 4 der PCR unterzogen, wobei eine Chromosomen-DNA als Templat verwendet wurde, um die gesamte Länge eines PHA-Synthase-Gens zu reproduzieren. Ein Oligonucleotid mit einer Sequenz, die ein stromaufwärtiger Primer zur Sequenz der Sequenzidentifizierungsnummer 4 war und stromaufwärts ihres Startcodons eine Sequenz aufwies (Sequenzidentifizierungsnummer 9), und ein Oligonucleotid mit einer Sequenz, die ein stromabwärtiger Primer zur Sequenz der Sequenzidentifizierungsnummer 4 war und stromabwärts ihres Stopcodons eine Sequenz aufwies (Sequenzidentifizierungsnummer 10), wurden gestaltet und erzeugt (Amersham-Pharmacia Biotech). Mit diesen Oligonucleotiden als Primer wurde eine PCR durchgeführt, um die gesamte Länge des PHA-Synthase-Gens zu amplifizieren (LA-PCR-Kit; Takara Shuzo Co., Ltd.).
Jedes erhaltene, durch PCR amplifizierte Fragment, das die gesamte Länge des PHA-Synthase-Gens enthielt, wurde unter Verwendung des Restriktionsenzyms HindIII vollständig aufgeschlossen. Getrennt davon wurde auch ein Expressionsvektor pTrc99A mit dem Restriktionsenzym HindIII abgeschnitten und dephosphoryliert (Molecular Cloning, Bd. 1, S. 5.7.2 (1989), Cold Spring Harbor Laboratory). Mit der Schnittstelle des Expressionsvektors pTic99A wurde das DNA-Fragment ligiert, das die gesamte Menge des PHA-Synthase-Gens umfaßt, von dem die unnötigen Sequenzen an beiden Enden entfernt worden waren, wobei ein DNA-Ligations-Kit Ver. II (Takara Shuzo Co., Ltd.) verwendet wurde.
Unter Verwendung der erhaltenen rekombinanten Plasmide wurde Escherichia coli HB101 (Takara Shuzo Co., Ltd.) nach dem Calciumchloridverfahren transformiert. Die Rekombinanten wurden gezüchtet, und die rekombinanten Plasmide wurden amplifiziert und einzeln aufgefangen. Das rekombinante Plasmid, das die Gen-DNA der Sequenzidentifizierungsnummer 2 zurückbehält, wurde als pYN2-C1 bezeichnet (stammt von der Sequenzidentifizierungsnummer 2), während das rekombinante Plasmid, das die Gen-DNA der Sequenzidentifizierungsnummer 4 zurückbehält, als pYN2-C2 bezeichnet wurde (stammt von der Sequenzidentifizierungsnummer 4).
(Beispiel 3) PHA-Produktion (1) unter Verwendung eines PHA-Synthase-Gens von rekombinantem E. coli
Unter Verwendung der in Beispiel 2 erhaltenen rekombinanten Plasmide pYN2-C1 (stammt von der Sequenzidentifizierungsnummer 2) und pYN2-C2 (stammt von der Sequenzidentifizierungsnummer 4) wurde Escherichia coli HB101fB (Stamm mit fadB-Mangel) nach dem Calciumchloridverfahren transformiert, wodurch rekombinante Stämme E. coli, die das rekombinante Plasmid beibehielten, die rekombinanten Stämme pYN2-C1 bzw. pYN2-C2, erzeugt wurden.
Jeder der rekombinanten Stämme pYN2-C1 und pYN2-C2 wurde in 200 ml Medium M9 geimpft, das 0,5% Hefeextrakt und 0,1% FPVA enthielt, und das Medium wurde bei 37°C mit einer Rate von 125 Ausschlägen/min geschüttelt. Nach 24 Stunden wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet.
Das gefriergetrocknete Pellet wurde in 100 ml Chloroform suspendiert, und die Suspension wurde 20 Stunden bei 60°C gerührt, um ein PHA herauszulösen. Nach dem Filtrieren des Extraktes durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm wurde das Filtrat durch Rotationsverdampfen eingeengt. Dann wurde das Konzentrat erneut in kaltem Methanol suspendiert, und der Niederschlag wurde aufgefangen und vakuumgetrocknet, wodurch ein PHA bereitgestellt wurde. Das so erhaltene PHA wurde wie üblich der Methanolyse unterzogen und unter Verwendung einer Gaschromatographie-Massenspektrometrie-Vorrichtung (GC-MS, Shimadzu QP-5050, EI-Methode) analysiert, wodurch mit Methyl veresterte PHA-Monomereinheiten identifiziert wurden. Tabelle 1 zeigt das Trockengewicht der Zelle, das Trockengewicht des Polymers für das aufgefangene PHA, die Polymerausbeute pro Zelle (Trockengewicht des Polymers/Trockengewicht der Zelle) sowie die Identität der Monomereinheiten für jeden Stamm.
Tabelle 1
Diese Ergebnisse zeigen, daß die rekombinanten Stämme pYN2-C1 als auch pYN2-C2 aus dem Substrat 5-(4-Fluorphenyl)valeriansäure PHA produzieren, die als Hauptkomponente eine Monomereinheit der Formel (I) umfassen, die von der entsprechenden 3-Hydroxy-5-(4-fluorphenyl)valeriansäure stammt. Es wird folglich nachgewiesen, daß beide Stämme, obwohl die rekombinanten Stämme pYN2-C1 und pYN2-C2 ausschließlich PHA-Synthasen mit den Aminosäuresequenzen der Sequenzidentifizierungsnummern 1 und 3 produzieren, die aus den PHA-Synthase-Genen translatiert wurden, die die Sequenzen der Sequenzidentifizierungsnummer 2 bzw. 4 umfassen, das Substrat 5-(4-Fluorphenyl)valeriansäure in ähnlicher Weise in die Monomereinheit überführen, die mit der Formel (I) angegeben wird, die von der entsprechenden 3-Hydroxy-5-(4-fluorphenyl)valeriansäure stammt, und ein PHA produzieren, das diese Monomereinheit enthält.
(Beispiel 4) PHA-Produktion (2) unter Verwendung eines PHA-Synthase-Gens von rekombinantem E. coli
Unter Verwendung der in Beispiel 2 erhaltenen rekombinanten Plasmide YN2-C1 (stammt von der Sequenzidentifizierungsnummer 2) und YN2-C2 (stammt von der Sequenzidentifizierungsnummer 4) wurde Escherichia coli HB101fB (Stamm mit fadB-Mangel) nach dem Calciumchloridverfahren transformiert, wodurch aus dem vorstehend genannten rekombinanten Plasmid die rekombinanten Stämme E. coli erzeugt wurden.
Jeder der rekombinanten Stämme pYN2-C1 und pYN2-C2 wurde in 200 ml Medium M9 geimpft, das 0,5% Hefeextrakt und 0,1% 4-Cyclohexylbuttersäure enthielt, und das Medium wurde bei 37°C mit einer Rate von 125 Ausschlägen/min geschüttelt. Nach 24 Stunden wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, einmal mit kaltem Methanol gewaschen und gefriergetrocknet.
Das gefriergetrocknete Pellet wurde in 100 ml Chloroform suspendiert, und die Suspension wurde 20 Stunden bei 60°C gerührt, um ein PHA herauszulösen. Nach dem Filtrieren des Extraktes durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm wurde das Filtrat durch Rotationsverdampfen eingeengt. Dann wurde das Konzentrat erneut in kaltem Methanol suspendiert, und der Niederschlag wurde aufgefangen und vakuumgetrocknet, wodurch ein PHA bereitgestellt wurde. Das so erhaltene PHA wurde wie üblich der Methanolyse unterzogen und unter Verwendung einer Gaschromatographie- Massenspektrometrie-Vorrichtung (GC-MS, Shimadzu QP-5050, EI-Methode) analysiert, wodurch mit Methyl veresterte PHA-Monomereinheiten identifiziert wurden. Tabelle 2 zeigt das Trockengewicht der Zelle, das Trockengewicht des Polymers für das aufgefangene PHA, die Polymerausbeute pro Zelle (Trockengewicht des Polymers/Trockengewicht der Zelle) sowie die Identität der Monomereinheiten für jeden Stamm.
Tabelle 2
Diese Ergebnisse zeigen, daß die rekombinanten Stämme pYN2-C1 als auch pYN2-C2 aus dem Substrat 4-Cyclohexylbuttersäure PHA produzieren, die als Hauptkomponente eine Monomereinheit der Formel (VI) umfassen, die von der entsprechenden 3-Hydroxy-4-cyclohexylbuttersäure stammt. Es wird folglich nachgewiesen, daß beide Stämme, obwohl die rekombinanten Stämme pYN2-C1 und pYN2-C2 ausschließlich PHA-Synthasen mit den Aminosäuresequenzen der Sequenzidentifizierungsnummern 1 und 3 produzieren, die aus den PHA-Synthase-Genen translatiert wurden, die die Sequenzen der Sequenzidentifizierungsnummer 2 bzw. 4 umfassen, das Substrat 4-Cyclohexylbuttersäure in ähnlicher Weise in die Monomereinheit überführen, die mit der Formel (IX) angegeben wird, die von der entsprechenden 3-Hydroxy-4-cyclohexylbuttersäure stammt, und ein PHA produzieren, das diese Monomereinheit enthält.
Die Ergebnisse zeigen zusammen mit denen in Beispiel 3, daß die PHA-Synthasen mit den Aminosäuresequenzen der Sequenzidentifizierungsnummern 1 und 3 eine Enzymaktivität aufweisen, die der Substratspezifität wechselseitig ähnlich ist.
SEQUENZAUFSTELLUNG

Claims

Polyhydroxyalkanoat-Synthase, die die Aminosäuresequenz mit der Sequenzidentifizierungsnummer 1 aufweist.
Polyhydroxyalkanoat-Synthase, die eine Aminosäuresequenz aufweist, wobei die Aminosäuresequenz der Sequenzidentifizierungsnummer 1 durch Deletion, Substitution oder Hinzufügen von Aminosäuren soweit modifiziert worden ist, daß die entstandene Polyhydroxyalkanoat-Synthase noch die Aktivität aufweist, um 5-(4-Fluorphenyl)valeriansäure in ein Polymer zu überführen, das eine Monomerzusammensetzung hat, bei der die Hauptkomponente aus 3-Hydroxy-5-(4-fluorphenyl)valeriansäure erzeugt worden ist.
Polyhydroxyalkanoat-Synthase, die eine Aminosäuresequenz aufweist, wobei die Aminosäuresequenz der Sequenzidentifizierungsnummer 1 durch Deletion, Substitution oder Hinzufügen von Aminosäuren soweit modifiziert worden ist, daß die entstandene Polyhydroxyalkanoat-Synthase noch die Aktivität aufweist, um 4-Cyclohexylbuttersäure in ein Polymer zu überführen, das eine Monomerzusammensetzung hat, bei der die Hauptkomponente aus 3-Hydroxy-4-cyclohexylbuttersäure erzeugt worden ist.
Polyhydroxyalkanoat-Synthase-Gen, umfassend eine DNA-Sequenz, die die Aminosäuresequenz der Polyhydroxyalkanoat-Synthase nach Anspruch 2 oder 3 codiert.
Polyhydroxyalkanoat-Synthase-Gen, umfassend eine DNA-Sequenz der Sequenzidentifizierungsnummer 2, die die Aminosäuresequenz der Sequenzidentifizierungsnummer 1 codiert.
Polyhydroxyalkanoat-Synthase, die die Aminosäuresequenz der Sequenzidentifizierungsnummer 3 aufweist.
Polyhydroxyalkanoat-Synthase, die eine Aminosäuresequenz aufweist, wobei die Aminosäuresequenz der Sequenzidentifizierungsnummer 3 durch Deletion, Substitution oder Hinzufügen von Aminosäuren soweit modifiziert worden ist, daß die entstandene Polyhydroxyalkanoat-Synthase noch die Aktivität aufweist, um 5-(4-Fluorphenyl)valeriansäure in ein Polymer zu überführen, das eine Monomerzusammensetzung hat, bei der die Hauptkomponente aus 3-Hydroxy-5-(4-fluorphenyl)valeriansäure erzeugt worden ist.
Polyhydroxyalkanoat-Synthase, die eine Aminosäuresequenz aufweist, wobei die Aminosäuresequenz der Sequenzidentifizierungsnummer 3 durch Deletion, Substitution oder Hinzufügen von Aminosäuren soweit modifiziert worden ist, daß die entstandene Polyhydroxyalkanoat-Synthase noch die Aktivität aufweist, um 4-Cyclohexylbuttersäure in ein Polymer zu überführen, das eine Monomerzusammensetzung hat, bei der die Hauptkomponente aus 3-Hydroxy-4-cyclohexylbuttersäure erzeugt worden ist.
Polyhydroxyalkanoat-Synthase-Gen, umfassend eine DNA-Sequenz, die die Aminosäuresequenz der Polyhydroxyalkanoat-Synthase nach Anspruch 7 oder 8 codiert.
Polyhydroxyalkanoat-Synthase-Gen, umfassend eine DNA-Sequenz der Sequenzidentifizierungsnummer 4, die die Aminosäuresequenz der Sequenzidentifizierungsnummer 3 codiert.
Rekombinanter Vektor, umfassend das Gen nach Anspruch 4, 5, 9 oder 10 als ein Polyhydroxyalkanoat-Synthase-Gen.
Transformierter Mikroorganismus, der durch Einführen des rekombinanten Vektors nach Anspruch 11 transformiert worden ist.
Verfahren zur Herstellung eines Polyhydroxyalkanoats, umfassend die Schritte: Züchten des transformierten Mikroorganismus nach Anspruch 12 in einem Medium, das ein Substrat für eine Polyhydroxyalkanoat-Synthase enthält, und Abtrennen des Polyhydroxyalkanoats von der erhaltenen Kultur.
Verfahren zur Herstellung von Polyhydroxyalkanoat-Synthase, umfassend die Schritte: Züchten des transformierten Mikroorganismus nach Anspruch 12 und Bewirken, daß der transformierte Mikroorganismus die Polyhydroxyalkanoat-Synthase produziert.