KR100462543B1

KR100462543B1 - 폴리하이드록시알카노에이트 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR100462543B1
Application number: KR10-2001-0056592A
Authority: KR
Inventors: 혼마쯔토무; 스가와에쯔코; 야노테쯔야; 이마무라타게시; 켄모쿠타카시
Original assignee: 캐논 가부시끼가이샤
Priority date: 2000-09-14
Filing date: 2001-09-13
Publication date: 2004-12-17
Also published as: US7078200B2; EP1188782A3; KR20020021611A; DE60127628T2; KR100487876B1; KR20040080393A; US20020160467A1; US20040092702A1; EP1188782A2; US6635782B2; EP1188782B1; DE60127628D1

Abstract

본 발명은, 신규의 폴리하이드록시알카노에이트 및 목적외의 모노머유닛을 거의 감소시켜, 폴리하이드록시알카노에이트를 고수율로 얻을 수 있는 미생물에 의한 제조방법을 제공하기 위한 것이다. 치환된 벤조일알칸산을 함유하는 배지에서, 원료로서 치환된 벤조일알칸산을 이용해서 3-하이드록시-치환 벤조일알칸산을 모노머유닛으로서 지닌 신규의 폴리하이드록시알카노에이트을 합성할 수 있는 미생물을 배양한 후, 배양된 균체내에 생산된 폴리하이드록시알카노에이트를 추출해서 회수한다.

Description

폴리하이드록시알카노에이트 및 그 제조방법{POLYHYDROXYALKANOATE AND MANUFACTURING METHOD THEREOF}

본 발명은 신규의 폴리하이드록시알카노에이트(이하, "PHA"라 약칭할 경우도 있음) 및 PHA를 생산해서 균체내에 축적시킬 수 있는 능력을 지닌 미생물을 이용해서 매우 효율적으로 PHA를 제조하는 방법에 관한 것이다.

또, 본 발명은 치환된 알칸유도체를 원료로서 이용해서 PHA를 생산하는 방법에 관한 것이다.

이제까지, 많은 미생물이 폴리-3-하이드록시부티르산(이하, 간단히 "PHB"라 약칭할 경우도 있음) 혹은 기타 PHA를 생산하여 균체내에 축적하는 것이 보고되어 있다(「생분해성 플라스틱 핸드북」, 생분해성 플라스틱연구회편, (주) 엔.티.에스.(N.T.S.)발행, p178-197). 종래의 플라스틱의 경우와 마찬가지로, 이들 폴리머는, 용융가공 등을 통해서 각종 제품을 제조하는 데 사용될 수 있다. 또한, 이들은, 생분해성이므로, 자연계에 있어서 미생물에 의해 완전히 분해된다고 하는 이점이 있어, 많은 종래의 합성폴리머와는 달리 자연환경에 잔류해서 오염시키는 일은 없다. 또, 양호한 생체적합성을 지녀, 의료용 연질재료 등으로서의 응용도 기대되고 있다.

또, 이러한 미생물에 의해 생산되는 PHA는 미생물의 종류나 배지조성, 배양조건 등에 따라 각종 조성이나 구조를 지니는 것으로 알려져 있고, 또, PHA물성의 개량이라고 하는 관점에서, 이들의 조성이나 구조의 제어에 관한 많은 연구가 행해져 왔다.

<<1>> 먼저, 3-하이드록시부티르산(이하, "3HB"라 약칭할 경우도 있음) 등의 비교적 간단한 구조와 모노머유닛을 중합시킴으로써 얻어진 PHA의 생합성에는 다음과 같은 것이 포함된다.

예를 들면, 알칼리게네스 유트로퍼스(Alcaligenes eutropus) H16균주(ATCC No.17699) 및 그 변이체는, 그 배양시의 탄소원을 변화시킴으로써, 3-하이드록시부티르산 및 3-하이드록시발레르산의 공중합체를 다양한 조성비로 생산하는 것이 보고되어 있다(미국 특허 제 4,393,167호 및 제 4,876,331호 등).

미국특허 제 5,200,332호에는, 메틸로박테리움속(Methylobacteriumsp.), 파라코커스속(Paracoccussp.), 알칼리게네스속(Alcaligenessp.) 또는 슈도모나스속(Pseudomonassp.)의 미생물을, 탄소수 3 내지 7의 1급 알콜에 접촉시킴으로써, 3-하이드록시부티르산과 3-하이드록시발레르산과의 공중합체를 생산시키는 방법이 개시되어 있다.

미국 특허 제 5,292,860호 및 일본국 공개특허 평 7-265065호 공보에는, 아에로모나스 카비에(Aeromonas caviae)를, 올레산이나 올리브유를 탄소원으로 해서 배양함으로써, 3-하이드록시부티르산과 3-하이드록시헥산산의 2성분 공중합체를 생산하는 것이 개시되어 있다.

일본국 공개특허 평 9-191893호 공보에는, 글루콘산 및 1,4-부탄디올을 탄소원으로서 이용해서 코마모나스 아시도보란스(Comamonas acidovorans) IFO 13852를 배양하면, 3-하이드록시부티르산과 4-하이드록시부티르산을 모노머유닛으로서 지니는 폴리에스테르를 생산하는 것이 개시되어 있다.

또, 현재, 탄소수를 대략 12개까지 지닌 중간사슬길이(이하, "mcl"이라 약칭함)의 3-하이드록시알칸산으로 이루어진 PHA에 대해서 예의 연구를 행하고 있다. 이러한 PHA의 합성경로는 크게 2가지 형태로 분류될 수 있고, 그 구체적인 예로서 이하의 (1)항 및 (2)항 기재를 들 수 있다.

(1) β-산화를 이용한 합성

미국 특허 제 5,135,859호에서는, 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovorans) ATCC 29347균주에, 탄소원으로서 비고리식 지방족 탄화수소를 공급할 경우, 탄소수 6 내지 12의 3-하이드록시알칸산의 모노머유닛을 지닌 PHA가 생산되는 것이 개시되어 있다. 또, Appl. Environ. Microbiol, 58(2), 746(1992)에는, 슈도모나스 레시노보란스(Pseudomonas resinovorans)가 옥탄산을 단일 탄소원으로 해서, 3-하이드록시부티르산, 3-하이드록시헥산산, 3-하이드록시옥탄산 및 3-하이드록시데칸산(양비: 1:15:75:9)을 모노머유닛으로서 지닌 폴리에스테르를 생산하고, 또, 헥산산을 단일 탄소원으로 해서, 3-하이드록시부티르산, 3-하이드록시헥산산, 3-하이드록시옥탄산 및 3-하이드록시데칸산(양비: 8:62:23:7)을 모노머유닛으로서 지닌 폴리에스테르를 생산하는 것이 보고되어 있다. 여기서, 원료 지방산보다도 사슬길이가 긴 3-하이드록시알칸산의 모노머유닛은 하기 (2)항에 기재된 지방산 합성경로에 의한 것으로 추정된다.

(2) 신규의 지방산 생합성경로를 이용한 합성

Int. J. Biol. Macromol., 16(3), 119(1994)에는, 슈도모나스속 61-3 균주가 글루콘산나트륨을 단일 탄소원으로 해서, 3-하이드록시부티르산, 3-하이드록시헥산산, 3-하이드록시옥탄산, 3-하이드록시데칸산, 3-하이드록시도데칸산 등의 3-하이드록시알칸산과, 3-하이드록시-5-시스-데센산, 3-하이드록시-5-시스-도데센산 등의 3-하이드록시알켄산을 모노머유닛으로 지닌 폴리에스테르를 생산하는 것이 보고되어 있다.

그런데, PHA의 생합성은, 통상, 균체내에서 각종 대사경로의 중간체로서 형성된 "D-3-하이드록시아실-CoA"를 기질로서 사용하는 PHA신타제(synthase: 합성효소)에 의해 수행된다.

여기서, "CoA"란 "보조효소(coenzyme) A"를 의미한다. 그리고, 상기 (1)항의 종래기술에서 설명한 바와 같이, 탄소원으로서 옥탄산, 노난산 등의 지방산을 사용할 경우, PHA의 생합성은, 출발물질로서 "β-산화경로"동안 형성된 "D-3-하이드록시아실-CoA"에 의해 행해진다고 말할 수 있다.

"β-산화경로"에 의해 PHA가 생합성되는 반응을 표시하면, 다음과 같다.

한편, 상기 (2)항의 종래기술에 있어서 기재한 바와 같이, 글루코스 등의 당류를 이용해서 PHA를 생합성할 경우, 출발물질로서 "신규의 지방산 생합성경로"에서 형성된 "D-3-하이드록시아실-ACP"로부터 변환된 "D-3-하이드록시아실-CoA"를 이용해서 생합성을 행한다.

여기서, "ACP"란 "아실 담지 단백질(acyl carrier protein)"을 의미한다.

그런데, 전술한 바와 같이, 상기 (1)항 및 (2)항에 있어서 합성되는 PHA는 모두, "통상의(usual) PHA"인 곁사슬에 알킬기를 지닌 모노머유닛으로 이루어진 PHA이다.

<<2>> 그러나, 이와 같이 미생물에 의해 생산된 PHA의 보다 광범위한 응용, 예를 들면, 기능성 폴리머로서의 응용을 고려하면, 곁사슬에 도입되는 알킬기이외의 다른 치환기를 지닌 PHA("특이한(unusual) PHA")는 극히 유용한 것으로 기대된다. 다른 치환기의 예로서는, 방향족 고리(페닐기, 페녹시기, 벤조일기 등), 불포화 탄화수소, 에스테르기, 아릴기, 시아노기, 할로겐화 탄화수소, 에폭사이드 등을 들 수 있다. 이들 중, 방향족 고리를 지닌 PHA가 예의 연구되어 왔다.

(a) 페닐기를 함유하는 것 또는 부분적으로 치환된 형태

Makromol. Chem., 191, 1957-1965(1990) 및 Macromolecules, 24, 5256-5260(1991)에는, 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovorans)가, 5-페닐발레르산을 기질로서 이용해서 3-하이드록시-5-페닐발레르산을 모노머유닛으로서 함유하는 PHA를 생산하는 것이 보고되어 있다.

구체적으로는, 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovorans)가, 5-페닐발레르산 및 노난산(몰비 2:1, 총농도 10mmol/ℓ)을 기질로서 이용해서, 3-하이드록시발레르산, 3-하이드록시헵탄산, 3-하이드록시노난산, 3-하이드록시운데칸산 및 3-하이드록시-5-페닐발레르산을 모노머유닛으로서 0.6:16.0:41.1:1.7:40.6의 양비로 함유하는 PHA를 배양액 1ℓ당 160㎎(균체에 대한 건조중량비가 31.6%임) 생산하고, 또, 5-페닐발레르산 및 옥탄산(몰비 1:1, 총농도 10mmol/ℓ)을 기질로서 이용해서, 3-하이드록시헥산산, 3-하이드록시옥탄산, 3-하이드록시데칸산 및 3-하이드록시-5-페닐발레르산을 모노머유닛으로서 7.3:64.5:3.9:24.3의 양비로 함유하는 PHA를 배양액 1ℓ당 200㎎(균체질량에 대한 건조중량비가 39.2%임) 생산하는 것이 보고되어 있다. 이 보고서에 있어서의 PHA는, 노난산과 옥탄산을 사용하는 사실로부터 주로 β-산화경로에 의해 합성되는 것으로 여겨진다.

상기와 관련된 기재는, Chirality, 3, 492-494(1991)에서도 발견되며, 아마도 함유된 3-하이드록시-5-페닐발레르산유닛에 의해 폴리머물성이 변화하는 것으로 인식되고 있다.

또, Macromolecules, 29, 1762-1766(1996)에, 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovorans)가 5-(4'-톨릴)발레르산을 기질로서 사용해서 유닛으로서 3-하이드록시-5-(4'-톨릴)발레르산을 함유하는 PHA를 생산하는 것이 보고되어 있다.

또한, Macromolecules, 32, 2889-2895(1999)에는, 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovorans)가 5-(2',4'-디니트로페닐)발레르산을 기질로서 이용해서 3-하이드록시-5-(2',4'-디니트로페닐)발레르산 및 3-하이드록시-5-(4'-니트로페닐)발레르산을 유닛으로서 함유하는 PHA를 생산하는 것이 보고되어 있다.

(b) 페녹시기를 함유하는 것 또는 부분적으로 치환된 형태

Macromol. Chem. Phys., 195, 1665-1672(1994)에는, 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovorans)가 11-페녹시운데칸산을 기질로서 이용해서 3-하이드록시-5-페녹시발레르산과 3-하이드록시-9-페녹시노난산의 PHA공중합체를 생산하는 것이 보고되어 있다.

또, Macromolecules, 29, 3432-3435(1996)에는, 슈도모나스올레오보란스(Pseudomonas oleovorans)를 이용해서, 6-페녹시헥산산으로부터 3-하이드록시-4-페녹시부티르산유닛과 3-하이드록시-6-페녹시헥산산유닛을 함유하는 PHA, 8-페녹시옥탄산으로부터 3-하이드록시-4-페녹시부티르산유닛과 3-하이드록시-6-페녹시헥산산유닛과 3-하이드록시-8-페녹시옥탄산유닛을 함유하는 PHA 및 11-페녹시운데칸산으로부터 3-하이드록시-5-페녹시발레르산유닛과 3-하이드록시-7-페녹시헵탄산유닛을 함유하는 PHA를 생산하는 것이 보고되어 있다. 이 보고서에 있어서의 폴리머의 수율은 다음 표 1과 같다.

탄소원(알카노에이트)	균체의 건조중량(㎎/ℓ)	폴리머의 건조중량(㎎/ℓ)	수율(%)
6-페녹시헥산산	950	100	10.5
8-페녹시옥탄산	820	90	11
11-페녹시운데칸산	150	15	10

또한, 일본국 특허 제 2989175호 공보에는, 3-하이드록시-5-(모노플루오로페녹시)펜타노에이트(이하, "3H5(MFP)P"라 약칭함)유닛 혹은 3-하이드록시-5-(디플루오로페녹시)펜타노에이트(이하, "3H5(DFP)P"라 약칭함)유닛으로 이루어진 호모폴리머; 적어도 3H5(MFP)P유닛 또는 3H5(DFP)P유닛을 함유하는 코폴리머; 이들 폴리머를 합성할 수 있는 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida); 슈도모나스 속(Pseudomonassp.)을 이용한 상기의 폴리머의 제조방법이 기재되어 있다.

이들 생산은 이하와 같은 "2단계 배양"에 의해 행해지고 있다.

배양기간: 1단계-24시간; 2단계-96시간.

각 단계에 있어서의 기질과 얻어지는 폴리머는 다음과 같다.

(1) 얻어진 폴리머: 3-하이드록시-5-(모노플루오로페녹시)펜타노에이트 호모폴리머

1단계째의 기질: 시트르산, 효모엑스(추출물)

2단계째의 기질: 모노플루오로페녹시운데칸산

(2) 얻어진 폴리머: 3-하이드록시-5-(디플루오로페녹시)펜타노에이트 호모폴리머

1단계째의 기질: 시트르산, 효모엑스

2단계째의 기질: 디플루오로페녹시운데칸산

(3) 얻어진 폴리머: 3-하이드록시-5-(모노플루오로페녹시)펜타노에이트 코폴리머

1단계째의 기질: 옥탄산 또는 노난산, 효모엑스

2단계째의 기질: 모노플루오로페녹시운데칸산

(4) 얻어진 폴리머: 3-하이드록시-5-(디플루오로페녹시)펜타노에이트 호모폴리머

1단계째의 기질: 옥탄산 또는 노난산, 효모엑스

2단계째의 기질: 디플루오로페녹시운데칸산

치환기를 지닌 중간사슬길이의 지방산을 동화시킴으로써, 사슬말단에 1 내지 2개의 불소원자가 치환된 페녹시기를 지닌 폴리머의 합성을 실현할 수 있고, 이러한 폴리머는, 높은 융점과 양호한 가공성을 유지하면서 입체규칙성과 발수성을 부여할 수 있는 효과를 지닌다.

이러한 플루오로기로 치환된 형태이외에 기타 시아노기 및 니트로기로 치환된 화합물에 대해서도 연구되어 있다.

또, Can. J. Microbiol., 41, 32-43(1995) 및 Polymer International, 39, 205-213(1996)에는, 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovorans) ATCC 29347균주 및 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) KT 2442균주가, 옥탄산과 p-시아노페녹시헥산산 또는 p-니트로페녹시헥산산을 기질로 사용할 경우, 3-하이드록시-p-시아노페녹시헥산산 또는 3-하이드록시-p-니트로페녹시헥산산을 모노머유닛으로서 함유하는 PHA를 생산할 수 있는 것이 보고되어 있다.

이들 문헌에 있어서, 어떤 폴리머는, 곁사슬에 알킬기를 지닌 일반적인 PHA와는 달리 PHA의 곁사슬에 방향족 고리를 지니므로, 이들에 유래하는 물성을 지닌 폴리머를 얻는 데 유리하다.

(c) 시클로헥실기를 모노머유닛중에 함유하는 PHA는, 통상의 지방족 하이드록시알칸산을 유닛으로서 함유하는 PHA와는 다른 고분자물성을 나타낼 것으로 기대되고 있고, 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovorans)에 의한 생산예가 보고되어 있다(Macromolecules, 30, 1611-1615(1997)).

이 보고에 의하면, 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovorans)를, 노난산과 시클로헥실부티르산 혹은 시클로헥실발레르산이 공존하는 배지중에서 배양하면, 시클로헥실기와, 노난산으로부터 유래된 유닛을 함유하는 PHA가 얻어지고 있다(각 비율은 알려져 있지 않음).

수율 등에 대해서는, 시클로헥실부티르산에 대해서 기질의 총농도를 20mmol/ℓ로 해서 시클로헥실부티르산과 노난산의 양의 비를 변화시켜, 이하의 표 2에 표시한 결과가 얻어진 것이 보고되어 있다.

노난산:시클로헥실부티르산	CDW	PDW	수율	유닛
5:5	756.0	89.1	11.8	노난산,시클로헥실부티르산
1:9	132.8	19.3	14.5	노난산,시클로헥실부티르산

CDW: 균체의 건조중량(㎎/ℓ), PDW: 폴리머의 건조중량(㎎/ℓ),

수율: PDW/CDW(%)

그러나, 이 예에서는, 배양액당의 폴리머의 수율은 충분한 것은 아니고, 또 얻어진 PHA 자체에도 모노머유닛중에 노난산유래의 지방족 하이드록시알칸산이 공존하고 있다.

<<3>> 또, 새로운 범주로서, 물성의 변화뿐만 아니라 곁사슬에 적절한 작용기를 지닌 PHA를 생산하여 상기 작용기를 이용해서 이용해서 새로운 기능을 작성하는 것에 대해 연구가 행해지고 있다.

예를 들면, Macromolecules, 31, 1480-1486(1996) 및 Journal of Polymer Science: Part A: Polymer Chemistry, 36, 2381-2387(1998) 등에는, 곁사슬의 단부에 비닐기를 지닌 유닛을 함유하는 PHA를 합성한 후, 산화제로 에폭시화함으로써, 상기 곁사슬의 단부에 반응성이 높은 에폭시기를 함유하는 PHA를 합성하는 것이 보고되어 있다.

또, 비닐기이외에 반응성이 높은 것으로 기대되는 술피드를 지닌 유닛을 함유하는 PHA의 합성예로서, Macromolecules, 32, 8315-8318(1999)에는, 슈도모나스푸티다(Pseudomonas putida) 27N01균주가 11-페닐술파닐발레르산을 기질로서 사용해서 3-하이드록시-5-(페닐술파닐)발레르산과 3-하이드록시-7-(페닐술파닐)헵탄산의 PHA공중합체를 생산하는 것이 보고되어 있다.

이상 설명한 바와 같이, 미생물에 의해 생산된 PHA에 대해서는, 그 생산에 이용되는 미생물의 종류나 배지조성, 배양조건 등을 변화시킴으로써 각종 조성 및 구성의 것을 얻을 수 있으나, 플라스틱으로서의 응용을 고려할 때 물성의 점에서 아직 충분하지 않다. 또, 미생물에 의해 생산된 PHA의 응용분야를 보다 확대하기 위해서는, 물성개량을 보다 폭넓게 검토하는 것이 중요하므로, 보다 다양한 구조의 모노머유닛을 함유하는 PHA와, 그 제조방법, 나아가서는 소망의 PHA를 효율적으로 생산할 수 있는 미생물의 개발과 탐색이 필수이다.

또한, 미생물에 의해 기질로서 화학합성된 치환된 지방산으로 이루어진 PHA를 생산하는 전형적인 방법에 있어서, 도입되는 치환기의 종류, 수, 위치 등에 따라 화학합성에 중요한 제한이 부여되는 경우가 많이 있고, 화학반응시 치환된 지방산의 카르복실기가 활성기이므로, 혹은 활성기로 인해, 화학합성의 반응공정에 있어서의 카르복실기의 보호, 탈보호 등의 복잡한 조작이 필요하고, 그 프로세스에 있어서 수개의 공정에 걸친 화학반응이 필요할 경우도 있다. 따라서, 공업적인 생산수준에서의 합성이 곤란한 동시에, 시간이 많이 걸려, 합성의 곤란성 및 비용의 문제가 있었다.

한편, 치환된 지방산보다도 화학적으로 용이하게 합성되는 치환된 알칸을 원료로서 이용해서 "특이한 PHA"를 생산할 수 있다면, 상기 문제는 해결될 수 있었을 것으로 여겨진다.

지금까지 보고된 알칸유도체로부터의 PHA의 생산에 대해서는, 직선사슬의 알칸류와 알켄류(이중결합을 함유하는 알칸류)(Appl. Environ. Microbiol., 54, 2924-2932(1988)), 염소치환알칸류(Macromaolecules, 23, 3705-3707(1990)), 불소치환 알칸류(Biotechnol. Lett., 16, 501-506(1994)) 및 아세톡시잔기를 함유하는 알칸류(Macromolecules,33, 8571-8575(2000))를 출발물질로서 이용해서 미생물에 의해 대응하는 PHA를 생합성하는 예만이 있고, 보고된 치환기로서 방향족 고리를 함유하는 잔기를 지닌 알칸으로부터 대응하는 PHA를 합성하는 예는 없다.

따라서, 본 발명자들은, 디바이스재료, 의료용 재료 등으로서 유용한 작용기를 곁사슬에 지닌 PHA의 개발을 목적으로 해서, 각종 PHA를 생산해서 균체내에 축적가능한 미생물의 탐색 및 이들 미생물을 이용해서 소망의 PHA를 생산하는 방법에 대해 예의 연구를 행한 결과, 하기 화학식[8]:

[식중, m은 n, n-2, n-4 및 n-6으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개 이상으로, 1개 이상의 정수이고; n은 하기 화학식[7]:

(식중, n은 1 내지 8의 정수의 어느 하나이고; R은 할로겐원자, -CN, -NO₂, -CH₃, -C₂H₅, -C₃H₇, -CF₃, -C₂F₅및 -C₃F₇로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나임)에 있어서의 n에 대응하는 1 내지 8의 정수의 어느 하나이며; R은, 상기 화학식[7]에 있어서의 R에 대응하는 할로겐원자, -CN, -NO₂, -CH₃, -C₂H₅, -C₃H₇, -CF₃, -C₂F₅및 -C₃F₇로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나임]로 표시되는 3-하이드록시-치환 벤조일알칸산유닛을 함유하는 신규의 PHA를 생산해서, 그 균체내에 축적시킬 수 있는 미생물을 발견하였다. 또한, 상기 화학식[7]로 표시되는 치환된 벤조일알칸산과 당류, TCA사이클에 포함되는 유기산, 효모엑스 또는 폴리펩톤과의 공존하에, 미생물을 배양함으로써 PHA를 생합성할 수 있고, 그 결과 얻어진 PHA는 비교적 고순도인 것이 발견되었다. 구체적으로는, 예를 들면, 하기 화학식[9]:

(식중, R은 할로겐원자, -CN, -NO₂, -CH₃, -C₂H₅, -C₃H₇, -CF₃, -C₂F₅및 -C₃F₇로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나임)로 표시되는 치환된 벤조일발레르산을 원료로서 이용해서, 하기 화학식[5]:

(식중, R은 상기 화학식[9]에 있어서의 R에 대응하는 할로겐원자, -CN, -NO₂, -CH₃, -C₂H₅, -C₃H₇, -CF₃, -C₂F₅및 -C₃F₇로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나임)로 표시되는 3-하이드록시-치환 벤조일발레르산유닛을 함유하는 신규의 PHA를 생산해서, 그 균체내에 축적시킬 수 있는 미생물을 발견하였다. 또한, 상기 화학식[9]로 표시되는 치환된 벤조일발레르산과, 당류, TCA사이클에 포함되는 유기산, 효모엑스 또는 폴리펩톤과의 공존하에, 미생물을 배양함으로써 PHA를 생합성할 수 있고, 그 결과 얻어진 PHA는 비교적 고순도인 것이 발견되었다. 보다 구체적으로는, 예를 들면, 하기 화학식[10]:

으로 표시되는 5-(4-플루오로벤조일)발레르산(이하, "FBzVA"라 약칭함)을 원료로서이용해서, 하기 화학식[6]:

으로 표시되는 3-하이드록시-5-(4-플루오로벤조일)발레르산유닛(이하, "3HFBzV"라 약칭함)을 함유하는 신규의 PHA를 생산해서, 그 균체내에 축적시킬 수 있는 미생물을 발견하였다. 또한, 상기 치환된 벤조일발레르산과, 당류, TCA사이클에 포함되는 유기산, 효모엑스 또는 폴리펩톤과의 공존하에, 미생물을 배양함으로써 PHA를 생합성할 수 있고, 그 결과 얻어진 PH는 비교적 고순도인 것을 발견하고, 본 발명에 이르게 되었다.

즉, 본 발명은, 하기 화학식[2]:

(식중, n은 1 내지 8의 정수의 어느 하나이고; R은 할로겐원자, -CN, -NO₂, -CH₃, -C₂H₅, -C₃H₇, -CF₃, -C₂F₅및 -C₃F₇로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나임)로 표시되는 3-하이드록시-치환 벤조일알칸산유닛을 모노머유닛으로서 함유하는 PHA에 관한 것이다.

또, 본 발명은, 하기 화학식[7]:

(식중, n은 1 내지 8의 정수의 어느 하나이고; R은 할로겐원자, -CN, -NO₂, -CH₃, -C₂H₅, -C₃H₇, -CF₃, -C₂F₅및 -C₃F₇로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나임)로 표시되는 치환된 벤조일알칸산을 함유하는 배지에 미생물을 배양하는 공정과, 해당 미생물에 의해, 하기 화학식[8]:

(식중, m은 n, n-2, n-4 및 n-6으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개 이상으로, 1개 이상의 정수이고; n은 상기 화학식[7]에 있어서의 n에 대응하는 1 내지8의 정수의 어느 하나이며; R은, 상기 화학식[7]에 있어서의 R에 대응하는 할로겐원자, -CN, -NO₂, -CH₃, -C₂H₅, -C₃H₇, -CF₃, -C₂F₅및 -C₃F₇로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나임)로 표시되는 대응하는 3-하이드록시-치환 벤조일알칸산유닛을 함유하는 PHA를 생산하는 공정을 구비한 PHA의 제조방법에 관한 것이다.

즉, 본 발명의 PHA의 제조방법은, 치환된 벤조일알칸산과 당류, TCA사이클에 포함되는 유기산, 효모엑스 또는 폴리펩톤과의 공존하에, 3-하이드록시-치환 벤조일알칸산유닛을 함유하는 PHA를 생산하는 미생물을 배양하는 공정을 구비하고 있다.

참고로, 본 발명자들은, 용이하게 합성되거나 혹은 치환된 지방산보다도 용이하게 이용가능한 원료를 이용해서 "특이한 PHA"를 제조하는 방법을 개발하기 위해 예의 연구한 결과, 치환된 지방산에 비해서 화학적으로 용이하게 합성되는 치환된 알칸을 원료로서 이용해서 "특이한 PHA"를 제조할 수 있다는 것을 발견하고, 본 방법을 이용한 신규의 PHA를 제조하는 본 발명의 방법을 얻게 되었다.

또, 본 발명은, "특이한 PHA"의 신규의 제조방법을 제공하는 것이 가능하다.

참고로, 본 발명은, 하기 일반식(13):

(식중, R은 치환된 방향족 고리를 함유하는 잔기이고; n은 0 내지 9에서 선택된 임의의 정수임)으로 표시되는 치환된 알칸의 군으로부터 선택된 적어도 1종의 출발화합물을 준비하는 공정과, 분자중에 하기 일반식(14):

(식중, R은 치환된 방향족 고리를 함유하는 잔기이고; m은 0 내지 9에서 선택된 임의의 정수임)로 표시되는 3-하이드록시-치환 알카노에이트유닛의 군으로부터 선택된 적어도 1종으로 이루어진 폴리하이드록시알카노에이트를 제조하는 공정을 구비한 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법을 제공할 수 있다.

보다 구체적으로는, 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법은, 상기 일반식(13) 및 (14)에 있어서의 R, 즉, 치환된 방향족 고리상의 잔기가, 하기 일반식(15):

(식중, R₁은, 방향족 고리상의 치환기로서, H원자, CN기, NO₂기, 할로겐원자, CH₃기, C₂H₅기, C₃H₇기, CH₂=CH기, CF₃기, C₂F₅기 및 C₃F₇기로부터 선택된 적어도 1종임)로 표시되는 치환된 페닐잔기, 하기 일반식(16):

(식중, R₂는, 방향족 고리상의 치환기로서, H원자, CN기, NO₂기, 할로겐원자, CH₃기, C₂H₅기, C₃H₇기, CH₂=CH기, CF₃기, C₂F₅기 및 C₃F₇기로부터 선택된 적어도 1종임)으로 표시되는 치환된 페녹시잔기 및 하기 일반식(17):

(식중, R₃은, 방향족 고리상의 치환기로서, H원자, CN기, NO₂기, 할로겐원자, CH₃기, C₂H₅기, C₃H₇기, CH₂=CH기, CF₃기, C₂F₅기 및 C₃F₇기로부터 선택된 적어도 1종임)로 표시되는 치환된 벤조일잔기인 것을 특징으로 한다.

상기 생산방법은, 분자중에 상기 일반식(14)로 표시되는 3-하이드록시-치환 알카노에이트유닛의 군으로부터 선택된 적어도 1종을 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트를 생산가능한 미생물의 존재하에, 출발화합물로서 상기 일반식(13)으로 표시되는 치환된 알칸의 군으로부터 선택된 적어도 1종을 이용해서 행한다.

도 1은 실시예 8에서 0.1%아밀벤젠을 첨가한 계에 있어서 얻어진 PHA를 메탄올라이시스처리한 후 GC-MS에 의해 측정한 경우의 3-하이드록시부티르산 메틸의 질량스펙트럼을 표시한 도면

도 2는 실시예 8에서 0.1%아밀벤젠을 첨가한 계에 있어서 얻어진 PHA를 메탄올라이시스처리한 후 GC-MS에 의해 측정한 경우의 3-하이드록시옥탄산 메틸의 질량스펙트럼을 표시한 도면

도 3은 실시예 8에서 0.1%아밀벤젠을 첨가한 계에 있어서 얻어진 PHA를 메탄올라이시스처리한 후 GC-MS에 의해 측정한 경우의 3-하이드록시데칸산 메틸의 질량스펙트럼을 표시한 도면

도 4는 실시예 8에서 0.1%아밀벤젠을 첨가한 계에 있어서 얻어진 PHA를 메탄올라이시스처리한 후 GC-MS에 의해 측정한 경우의 3-하이드록시-5-페닐발레르산 메틸의 질량스펙트럼을 표시한 도면

도 5는 실시예 10에 있어서의¹H-NMR스펙트럼도

도 6은 실시예 13에서 얻어진 PHA를 메탄올라이시스처리한 후 GC-MS에 의해 측정한 경우의 3-하이드록시-5-페녹시발레르산 메틸의 TIC 및 질량스펙트럼을 표시한 도면

도 7은 실시예 15에 있어서의¹H-NMR스펙트럼도

도 8은 실시예 15에서 얻어진 PHA를 메탄올라이시스처리한 후 GC-MS에 의해 측정한 경우의 3-하이드록시-5-(4-플루오로벤조일)발레르산 메틸의 TIC 및 질량스펙트럼을 표시한 도면

도 9는 실시예 16에 있어서의¹H-NMR스펙트럼도.

이하, 본 발명의 바람직한 실시형태예에 대해 구체적으로 설명한다.

본 발명의 PHA란, 디바이스재료, 발수재료, 의료용 재료 등에 유용한 곁사슬에 치환체를 지닌 다양한 구조의 모노머유닛을 함유하는 PHA, 보다 구체적으로는, 곁사슬에 치환 벤조일기를 지닌 PHA이다. 또, 본 발명의 PHA의 제조방법에 의하면, 미생물을 이용해서 소망의 PHA를 고순도 및 고수율로 제조하는 것이 가능하다. 또한, 본 발명의 PHA는 통상 R-체만으로 이루어진 아이소택틱(즉, 입체규칙성) 중합체이다.

<당류 및 TCA사이클에 포함되는 유기산: 종래기술과의 차이점>

본 발명의 PHA를 제조하는 방법의 하나는, 미생물을 배양할 때, 소망의 모노머유닛을 도입하기 위한 알칸산뿐만 아니라 알칸산이외의 탄소원으로서 당류 또는 TCA사이클에 포함되는 유기산을 배지에 첨가함으로써, 해당 미생물이 생산/축적하는 PHA에 있어서 목적으로 하는 모노머유닛의 함유율을 현저하게 높은 것으로 하거나, 혹은 목적으로 하는 모노머유닛만으로 PHA를 구성하는 점을 특징으로 하고 있다. 이 특정의 모노머유닛의 선점화를 촉진하는 효과는, 배지중에, 알칸산 이외의 탄소원으로서 당류 또는 TCA사이클에 포함되는 유기산을 첨가함으로써 얻어지고 있다.

즉, 본 발명자들은, 목적으로 하는 모노머유닛을 도입하기 위한 알칸산과 함께 공존하는 기질, 즉, 물질로서 당류 또는 TCA사이클에 포함되는 유기산을 사용해서 배양을 행한 경우, 공존하는 물질로서 노난산, 옥탄산 등의 mcl-알칸산을 이용하는 종래의 방법에 비해서, 목적으로 하는 PHA가 고수율 및 고순도로 얻어지는 것을 발견하였으며, 이 효과는, β-산화를 이용하지 않는 방법에 의해 미생물의 탄소원 및 에너지원인 아세틸 CoA를 생성가능한 배양법에 의해 실현되며, 이것에 의해 본 발명에 이르게 되었다.

본 발명의 방법에 있어서는, 미생물의 증식용 물질로서, 예를 들면, 글루코스, 프럭토스, 만노스 등의 당류를 사용하고, 생산되는 PHA는, 당류와 공존하는 목적으로 하는 모노머유닛을 도입하기 위한 알카노에이트로 이루어져, 글루코스 등의 당류로부터 유래된 모노머유닛은 전혀 함유하지 않거나 또는 극소량 함유한다. 이 점에 있어서, 본 발명의 방법은, PHA에 도입되는 모노머유닛의 출발물질로서 글루코스 등의 당류 자체를 사용하는 종래의 미생물에 의한 PHA생산법과는 구성과 효과가 기본적으로 다르다.

<효모엑스: 종래기술과의 차이점>

본 발명의 PHA의 생산방법의 하나는, 미생물을 배양할 때, 배지에 목적으로 하는 모노머유닛을 도입하기 위한 알칸산뿐만 아니라 알칸산이외의 탄소원으로서 효모엑스만을 첨가함으로써, 미생물이 생산/축적하는 PHA에 있어서 목적으로 하는 모노머유닛의 함유율을 현저하게 높은 것으로 하거나, 혹은 목적으로 하는 모노머유닛만으로 PHA를 구성하는 점을 특징으로 하고 있다. 이 특정의 모노머유닛의 선점화를 촉진하는 효과는, 배지중에, 알칸산 이외의 탄소원으로서, 효모엑스만을 첨가함으로써 실현되고 있다.

미생물에 의한 PHA의 생산시에, 배지에 효모엑스를 이용하는 예로서, 일본국 공개특허 평 5-49487호 공보에 기재된 바와 같이, 로도박터(Rhodobacter)속에 속하는 미생물을 이용하는 방법을 들 수 있다. 그러나, 이 종래의 방법은, 치환기를 지니지 않은 하이드록시알칸산을 모노머유닛으로 하는 일반적인 PHB 및 폴리-3-하이드록시발레르산(이하, "PHV"라 약칭할 경우도 있음)을 생산하는 방법이다. 본 발명의 목적으로 하는 PHA의 합성경로는, PHB 및 PHV를 생산하는 생합성경로와는 독립된 경로인 것이 알려져 있고, 상기 일본국 공개특허 평 5-49487호 공보에 있어서는, 본 발명의 목적으로 하는 PHA의 합성경로에 있어서의 효모엑스의 효과에 대해서도 하등 언급이 없다. 또, 효모엑스의 효과에 대해서도, 효모엑스를 첨가하면, 단지 균체내의 PHA축적량의 증대가 도모되는 효과가 있는 것을 표시하고 있을 뿐이며, 증식을 위해 효모엑스가 첨가되어 있지 않은 것이 명백히 기재되어 있다.

본 발명은, 치환된 벤조일알칸산과 효모엑스를 공존시킴으로써 증식과 동시에 PHA의 생산/축적을 행하는 것으로, 효모엑스가 발휘하는 효과가 전혀 다르다. 또, 상기 발명에는, 본 발명의 효과인, 특정의 모노머유닛의 선점화에 대해서도 하등 언급되어 있지 않고, 본 발명과는 달리, 치환된 벤조일기를 치환기로서 지닌 특정의 모노머유닛의 선점화라고 하는 효과는 표시되어 있지 않다.

또한, 미생물에 의한 PHA의 생산에 효모엑스를 이용하는 예로서는, 전술한 일본국 특허 제 2989175호 공보에 기재된, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)를 이용하는 방법을 들 수 있다. 이 특허공보에 개시되어 있는 PHA의 생산방법은, 2단계 배양을 사용하는 것으로, PHA의 축적은 2단계째의 배양에 있어서만, 탄소원 이외의 영양원의 제한하에 행하는 것만이 개시되어 있다. 이 점에서, 이 방법은, 치환된 벤조일알칸산과 효모엑스를 함유하는 배지에서의 1단계 배양만으로,소망의 PHA의 합성/축적을 행하는 본 발명의 방법과는 구성과 효과가 전혀 다르다.

또, 상기 일본국 특허 제 2989175호에 있어서의 효모엑스의 효과는, 2단계 배양을 이용할 때, 1단계째의 배양에 있어서, 단순히 2단계째의 배양에 이용되는 미생물의 증식만을 목적으로 한 것이며, 1단계째는 영양원이 풍부한 조건하에 배양되는 것으로 명확히 기재되어 있다. 여기서, PHA의 기질은, 1단계째의 배양에는 공존하고 있지 않은 반면, 본 발명에 있어서의 효모엑스의 효과는, 치환된 벤조일알칸산과 효모엑스를 공존시킴으로써 증식과 함께 PHA의 생산/축적을 행하는 것이므로, 효모엑스가 발휘하는 효과가 전혀 다르다.

또한, 상기 일본국 특허 제 2989175호에서는, 1단계째의 배양에 탄소원으로서 시트르산, 옥탄산 및 노난산의 어느 것이 공존하고 있으므로, 치환된 벤조일알칸산과 효모엑스만을 공존시키는 본 방법과는 구성에 있어서도 다른 것이다.

<폴리펩톤: 종래기술과의 차이점>

본 발명에 의한 PHA의 제조방법의 하나는, 미생물을 배양할 때, 배지에 목적으로 하는 모노머유닛을 도입하기 위한 알칸산뿐만 아니라 알칸산이외의 탄소원으로서 폴리펩톤만을 첨가함으로써, 미생물이 생산/축적하는 PHA에 있어서 목적으로 하는 모노머유닛의 함유율을 현저하게 높은 것으로 하거나, 혹은 목적으로 하는 모노머유닛만으로 PHA를 구성하는 점을 특징으로 하고 있다. 이 특정의 모노머유닛의 선점화를 촉진하는 효과는, 배지중에, 알칸산 이외의 탄소원으로서, 폴리펩톤만을 첨가함으로써 실현되고 있다.

또, 미생물에 의해 PHA를 생산하기 위해 폴리펩톤을 사용하는 예로서는, 일본국 공개특허 평 5-49487호 공보, 일본국 공개특허 평 5-64591호 공보, 일본국 공개특허 평 5-214081호 공보, 일본국 공개특허 평 6-145311호 공보, 일본국 공개특허 평 6-284892호 공보, 일본국 공개특허 평 7-48438호 공보, 일본국 공개특허 평 8-89264호 공보, 일본국 공개특허 평 9-191893호 공보 및 일본국 공개특허 평 11-32789호 공보 등에 있어서, 미생물을 이용해서 PHA를 생산할 때 배지에 폴리펩톤을 함유시키는 것이 개시되어 있으나, 상기 어느 공보에 있어서도, 폴리펩톤을 예비배양단계, 즉, 단순히 균체를 증식시키는 단계에서 사용하고, PHA의 모노머유닛으로 되는 물질을 예비배양중에 함유시키지 않는다. 또, 폴리펩톤을 PHA를 생산하는 균체를 작성하는 과정에서 사용하는 예는 없다.

이에 대해서, 본 발명은, 목적으로 하는 모노머유닛을 도입하기 위한 알칸산과 이러한 알칸산이외의 탄소원으로서 폴리펩톤만을 공존시킴으로써 증식과 동시에 PHA의 생산과 축적을 행하는 것으로, 폴리펩톤ㅇㄹ 이용하는 종래의 예와는 그 구성 및 효과가 전혀 다르다. 또, 상기 공보에 기재된 특허에는, 본 발명의 효과인, 특정의 모노머유닛의 선점화에 대해서도 하등 언급되어 있지 않고, 벤조일기를 치환기로서 치환한 특정의 모노머유닛의 선점화라고 하는 효과는 표시되어 있지 않다.

이하, 본 발명의 미생물, 배양방법 등에 대해 설명한다.

<PHA모노머유닛의 공급방식>

먼저, 소망의 PHA에 공존하게 될 mcl-3HA모노머유닛의 공급방식의 하나인 "지방산의 신규 생합성경로"에 대해 상세히 설명한다.

글루코스 등의 당류를 기질로서 사용한 경우, 세포성분으로서 필요한 알칸산은, 당류로부터 "해당계(glycolysis system)"를 통해서 생성되는 아세틸 CoA를 출발물질로 한 "지방산의 신규 생합성경로"로부터 생합성된다. 또, 지방산의 생합성경로에는, 신규 합성경로와 탄소사슬연장경로가 있으며, 이하에 이들에 대해 설명한다.

(1) 신규 합성경로

이것은, 아세틸 CoA카르복실라제(EC 6.4.1.2)와 지방산 합성효소(EC 2.3.1.85)의 2개의 효소에 의해 촉매된다. 또, 아세틸 CoA카르복실라제는, 비오틴을 개재해서, 최종적으로 이하의 반응을 촉매하여 아세틸 CoA로부터 말로닐 CoA를 생성하는 효소이며, 반응은 하기 식:

아세틸 CoA + ATP + HCO₃↔ 말로닐 CoA + ADP + Pi

으로 표시된다.

또, 지방산의 합성효소는, 전이-축합-환원-탈수-환원의 반응사이클을 촉매하는 효소이며, 전체 반응은 다음 식:

아세틸 CoA + n말로닐 CoA + 2nNADPH + 2nH⁺

⇒CH₃(CH₂)_2nCOOH + nCO₂+ 2nNADP⁺+ (n-1)CoA

으로 표시된다.

또한, 효소의 종류에 따라, 반응생성물이 유리산, CoA유도체 또는 ACP유도체인 경우가 있다. 여기서, 아세틸 CoA는 하기 화학식:

으로 표시되고, 말로닐 CoA는 하기 화학식:

으로 표시된다.

또, CoA는 "보조효소 A"의 약칭이며, 하기 화학식:

으로 표시된다.

"D-3-하이드록시아실 ACP"는, 본 반응경로중에서, 이하의 경로를 통해 PHA생합성용의 모노머기질인 중간체로서 공급된다. 또, 이하의 반응식에 표시한 바와 같이, 경로는 탄소를 2개씩 부가하여, 최종적으로는 팔미트산으로 연장된다. 따라서, PHA생합성용의 모노머기질로서는, "D-3-하이드록시부티릴 ACP"로부터 탄소수가 7개인 "D-3-하이드록시팔미틸 ACP"의 7종류의 "D-3-하이드록시아실 ACP"가 공급되는 것으로 된다.

(2) 탄소사슬연장경로

이 경로는, 크게 2개의 경로로 분류되고, 그 중 하나는, 아실 ACP에 말로닐-ACP가 부가되어, 최종적으로 탄소사슬이 2개 연장된 아실 ACP(및 CO₂)를 형성하는 경로(이하, "경로 A"라 칭함)이고, 다른 하나는, 아실 CoA에 아세틸 CoA가 부가되어, 최종적으로 탄소사슬이 2개 연장된 아실-CoA를 형성하는 경로(이하, "경로 B"라 칭함)이다. 각 경로에 대해 이하 설명한다.

·경로 A

R-COACP + 말로닐-ACP →

R-CO-CH₂-COACP + CO₂

R-CO-CH₂-COACP →

R-CHOH-CH₂-COACP →

R-CH=CH-COACP →

R-CH₂-CH₂-COACP

·경로 B

R-CO-CoA + 아세틸-CoA → R-CO-CH₂-CO-CoA

R-CO-CH₂-CO-CoA → R-CHOH-CH₂-CO-CoA →

R-CH=CH-CO-CoA →R-CH₂-CH₂-CO-CoA

상기 경로 A 및 B의 어느 방식도, 중간체로서 "D-3-하이드록시아실-CoA" 또는 "D-3-하이드록시아실 ACP"가 생성되어, "D-3-하이드록시아실-CoA"자체가 PHA생합성용의 모노머기질로서 사용되고, "D-3-하이드록시아실-ACP"는 ACP CoA트랜스퍼라제(transferase: 전이효소)에 의해 "D-3-하이드록시아실-CoA"로 전환된 후 PHA생합성용의 모노머기질로서 사용되는 것으로 여겨진다.

또, 글루코스 등의 당류를 기질로서 사용한 경우, "해당계"와 "지방산 생합성경로"에 의해 mcl-3HA모노머유닛을 생성하는 것을 고려할 수 있다. 또한, 기질로서 TCA사이클에 포함되는 유기산을 사용한 경우, 피루베이트 데히드로게나제에 의해 피루브산으로부터 아세틸 CoA가 직접 생성된다. 또, 포스포에놀피루베이트 카르복시나제에 의해 옥살로아세트산으로부터 포스포에놀피루브산이 생성된 후, 피루베이트 키나제를 촉매로 하여 피루브산이 생성되고, 또한, 상기 반응을 통해서 아세틸 CoA를 생성한다. 이들 반응에 의해 생성된 아세틸 CoA는 "지방산의 생합성경로"를 통해 mcl-3HA모노머를 생성하는 것으로 여겨진다.

여기서, 예를 들면, 옥탄산이나 노난산 등의 mcl-알칸산 혹은 5-페닐발레르산, 4-페녹시부티르산, 4-시클로헥실부티르산 등의 말단에 직선사슬의 지방족 알킬이외의 작용기가 부가된 알칸산은, CoA리가제(EC 6.2.1.3 등)에 의해 CoA유도체로 변환되어, β-산화계를 담당하는 효소군에 의해 PHA생합성의 모노머기질인 "D-3-하이드록시아실-CoA"로 직접 변환된다.

즉, 당류 또는 TCA사이클에 포함되는 유기산으로부터 생성되는 mcl-3HA모노머유닛은 극히 다단계 효소반응을 통해(즉, 간접적으로) 생성되는 한편, mcl-3HA모노머유닛은 mcl-알칸산으로부터 극히 직접 생성된다.

이제, 미생물의 증식을 담당하는 아세틸 CoA의 생성에 대해 설명한다. 목적으로 하는 모노머유닛을 도입하기 위한 알칸산이외에, mcl-알칸산을 공존시키는 방법에 있어서, 이들 알칸산은, β-산화방식을 통함으로써, 아세틸 CoA가 생성된다. 일반적으로, mcl-알칸산은, 거대한 치환기를 지닌 알칸산(페닐기, 페녹시기, 시클로헥실기 등을 지닌 알칸산)에 비해서 β-산화방식의 효소군에 대한 친화도가 높아, 아세틸 CoA는, mcl-알칸산의 공존에 의해 효율적으로 생성되는 것으로 고려할 수 있다. 따라서, 에너지원 및 탄소원으로서 아세틸 CoA를 이용하는 미생물의 증식에 유리하다.

그러나, β-산화방식을 통한 mcl-알칸산이 직접 PHA의 모노머유닛으로 변환되므로, 생산된 PHA는, 목적으로 하는 모노머유닛이외에 다량의 mcl-3HA모노머유닛을 함유하는 것이 심각한 문제이다.

이 문제를 해결하기 위해서, 아세틸 CoA 또는 에너지원 및 탄소원을 효율적으로 공급할 수 있는 mcl-알칸산이외의 물질을 선택해서 목적으로 하는 알칸산에 공존시키는 방법이 바람직하다. 이미 설명한 바와 같이, 아세틸 CoA는, 지방산의 생합성경로를 통해 PHA의 모노머유닛으로 변환될 수 있으나, 이것은, 아세틸 CoA가 mcl-알칸산에 비해서 많은 다단계반응을 경유할 필요가 있는 간접법이고, 아세틸 CoA를 생성가능한 물질의 농도 등의 배양조건을 적절하게 선택함으로써, 실질적으로 전혀 또는 거의 mcl-3HA가 공존하지 않는 제조법을 얻는 것이 가능하다.

또한, 1단계째에 있어서 미생물의 증식만을 목적으로 하는 배양을 행하고, 이어서, 2단계째에 있어서 탄소원으로서 배지에 목적으로 하는 알칸산만을 첨가하는 제조방법이 통상 이용된다. 이 때, 본 발명자들에 의하면, 알칸산이 아실- CoA로 변환되는 β-산화방식의 개시효소인 아실-CoA리가제가 ATP를 필요로 한다는 사실에 의거해서, 2단계째에 있어서도 에너지원으로서 미생물이 사용할 수 있는 물질을 공존시키는 것이 보다 효과적인 제조방법이라는 결론에 도달해, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명에 있어서, 아세틸 CoA 또는 에너지원 및 탄소원을 효율적으로 공급할 수 있는 물질로서는, 글리세르알데하이드, 에리트롤, 아라비노스, 크실로스, 글루코스, 갈락토스, 만노스, 프럭토스 등의 알도스류; 글리세롤, 에리트리톨, 자일리톨 등의 알디톨; 글루콘산 등의 알돈산; 글루쿠론산, 갈락투론산 등의 우론산;말토스, 슈크로즈, 락토스 등의 이당류 등의 당류; 락트산, 피루브산, 말산, 시트르산, 숙신산, 푸마르산 등의 TCA사이클에 포함되는 유기산 및 그들의 염류; 또한, β-산화방식을 통하지 않고 아세틸 CoA 또는 에너지원 및 탄소원을 효율적으로 공급할 수 있는 화합물인 한, 효모엑스, 폴리펩톤, 고기엑스 및 카사민산 등의 천연배양성분 등의 어느 화합물도 사용할 수 있고, 이들은 사용되는 균주용의 물질로서의 유용성에 의거해서 적절하게 선택하면 된다. 또한, 조합물이 mcl-3HA의 혼합물을 적게 지니면, 복수종의 화합물을 선택해서 사용할 수 있다.

<미생물>

본 발명에서 사용되는 미생물에 대해서는, 상기 치환된 벤조일알칸산을 원료로 해서, 상기 3-하이드록시-치환 벤조일알칸산유닛을 함유하는 PHA를 생산할 수 있는 것인 한, 어느 미생물이라도 사용가능하며, 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 범위내에서, 필요에 따라 복수종의 미생물을 혼합해서 사용해도 된다.

본 발명자들은, FBzVA 등을 원료로 해서, 상기 3HFBzV 등을 모노머유닛으로서 함유하는 PHA를 생산해서 균체내에 축적가능한 미생물의 탐색을 행한 결과, 본 발명자들이 토양으로부터 분리한 미생물인 슈도모나스 치코리이(Pseudomonas cichorii) H45, 슈도모나스 치코리이(Pseudomonas cichorii) YN2 및 슈도모나스 젯세니이(Pseudomonas jessenii) P161가 소망의 능력을 지니는 PHA를 생산가능한 것을 발견하였다. 또, 이들 균주는, 각각, 일본국 통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소 특허미생물기탁센터(전신은, 경제산업성의 생명공학연구소의 특허유기물기탁센터임)에, H45균주에 대해서는 기탁번호 "FERM BP-7374"로, YN2균주에대해서는 기탁번호 "FERM BP-7375", P161균주에 대해서는 기탁번호 "FERM BP-7376"으로 기탁되어 있다.

H45균주, YN2균주 및 P161균주의 균학적 성질은 하기와 같다. 또, P161균주에 대해서는, 16S rRNA의 염기서열이 서열번호 1로 표시되어 있다.

<H45균주의 균학적 성질>

(1) 형태학적 성질

세포의 형상과 크기: 간상균, 0.8㎛×(1.0 내지 1.2)㎛

세포의 다형성: 없음

운동성: 있음

포자형성: 없음

그램염색: 음성

콜로니형상: 원형, 전체 가장자리가 매끄러움, 저볼록형상, 표면이 원활, 광택있음, 크림색

(2) 생리학적 성질

카탈라제: 양성

옥시다제: 양성

O/F시험: 산화형

질산환원: 음성

인돌생산: 음성

글루코스 산성화: 음성

아르기닌디하이드롤라제: 음성

우레아제: 음성

에스쿨린가수분해: 음성

젤라틴가수분해: 음성

β-갈락토시다제: 음성

King's B 한천에서의 형광색생산: 양성

4%NaCl에서의 생육: 음성

폴리-β-하이드록시부티르산의 축적: 음성

(3) 기질동화능

글루코스: 양성

L-아라비노스: 음성

D-만노스: 양성

D-만니톨: 양성

N-아세틸-D-글루코사민: 양성

말토스: 음성

글루콘산 칼륨: 양성

n-카프르산: 양성

아디프산: 음성

dl-말산: 양성

시트르산 나트륨: 양성

아세트산 페닐: 양성

<YN2균주의 균학적 성질>

(1) 형태학적 성질

세포의 형상과 크기: 간상균, 0.8㎛×(1.5 내지 2.0)㎛

세포의 다형성: 없음

운동성: 양성

포자형성: 없음

그램염색: 음성

콜로니형상: 원형, 전체 가장자리가 매끄러움, 저볼록형상, 표면층이 원 활, 광택있음, 크림색의 투명함

(2) 생리학적 성질

카탈라제: 양성

옥시다제: 양성

O/F시험: 산화형

질산환원: 음성

인돌생산: 양성

글루코스 산성화: 음성

아르기닌디하이드롤라제: 음성

우레아제: 음성

에스쿨린가수분해: 음성

젤라틴가수분해: 음성

β-갈락토시다제: 음성

King's B 한천에서의 형광색생산: 양성

4%NaCl에서의 생육: 양성(약한 생육)

폴리-β-하이드록시부티르산의 축적: 양성

Tween 80의 가수분해: 양성

(3) 기질동화능

글루코스: 양성

L-아라비노스: 양성

D-만노스: 음성

D-만니톨: 음성

N-아세틸-D-글루코사민: 음성

말토스: 음성

글루콘산 칼륨: 양성

n-카프르산: 양성

아디프산: 음성

dl-말산: 양성

시트르산 나트륨: 양성

아세트산 페닐: 양성

<P161균주의 균학적 성질>

(1) 형태학적 성질

세포의 형상과 크기: 구형상, 직경 Φ0.6㎛ 또는 간상 0.6㎛×(1.5 내지 2.0)㎛

세포의 다형성: 있음(신장형)

운동성: 있음

포자형성: 없음

그램염색: 음성

콜로니형상: 원형, 전체 가장자리가 매끄러움, 저볼록형상, 표면이 원활, 광택있음, 담황색

(2)생리학적 성질

카탈라제: 양성

옥시다제: 양성

O/F시험: 산화형

질산환원: 양성

인돌생산: 음성

글루코스 산성화: 음성

아르기닌디하이드롤라제: 양성

우레아제: 음성

에스쿨린가수분해: 음성

젤라틴가수분해: 음성

β-갈락토시다제: 음성

King's B 한천에서의 형광색생산: 양성

(3) 기질동화능

글루코스: 양성

L-아라비노스: 양성

D-만노스: 양성

D-만니톨: 양성

N-아세틸-D-글루코사민: 양성

말토스: 음성

글루콘산 칼륨: 양성

n-카프르산: 양성

아디프산: 음성

dl-말산: 양성

시트르산 나트륨: 양성

아세트산 페닐: 양성

슈도모나스속이외에도, 아에로모나스속(Aeromonassp.), 코마모나스속(Comamonassp.) 또는 부르크홀데리아속(Burkholderiasp.)에 속하는 미생물을 이용해서, 상기 치환된 벤조일알칸을 원료로 해서 상기 3-하이드록시-치환 벤조일알칸산유닛을 모노머유닛으로 함유하는 PHA를 생산하는 것이 가능하다.

<배양>

본 발명의 증식용 기질 및 소망의 모노머유닛을 도입하기 위한 알칸산을 함유하는 배지에 이들 미생물을 배양함으로써 소망의 PHA를 생산하는 것이 가능하다. 이러한 PHA는 R-체만으로 이루어진, 아이소택틱 폴리머이다.

본 발명에 관한 PHA의 제조방법에 이용되는 미생물의 통상의 배양, 예를 들면, 보존균주의 작성, 균체의 수나 PHA의 생산에 필요한 활성상태를 확보하기 위한 증식 등에는, 이용하는 미생물의 증식에 필요한 성분을 함유하는 배지를 적절하게 선택해서 이용한다. 예를 들면, 미생물의 생육이나 생존에 악영향을 미치지 않는 것인 한, 일반적인 천연배지(육즙, 효모엑스 등)나 영양원을 첨가한 합성배지 등의 소정 종류의 배지를 이용하는 것이 가능하다.

배양에는, 미생물이 증식되어 PHA를 생산하는 배양법인 한 액체배양이나 고체배양 등의 어떠한 배양법을 이용해도 된다. 또, 배양의 종류로서는, 회분식(batch) 배양, 유동회분식 배양, 반연속배양, 연속배양 등을 들 수 있다. 액체회분식 배양의 형태로서는, 진탕플라스크에 의한 진탕을 통해 산소를 공급하는 방법, 자(jar)발효기를 이용하는 교반통기방식의 산소공급방법 등을 들 수 있다. 이들 공정을 복수개 접속한 다단방식을 채용해도 된다.

상기 PHA생산 미생물을 이용해서 3-하이드록시-치환 벤조일알칸산유닛을 함유하는 PHA를 생산할 경우, 적어도 PHA생산용 원료로서 각각 대응하는 치환된 벤조일알칸산과 미생물증식용 탄소원을 함유하는 무기배지 등을 사용해도 된다.

증식용 탄소원으로서는, 효모엑스, 폴리펩톤, 고기엑스, 카사미노산 등의 영양분유래의 매체성분을 사용할 수 있고, 또한, β-산화방식을 통하지 않고 아세틸 CoA를 생산하는 화합물인 한, 당류, TLC사이클에 포함된 유기산(TCA사이클에 있어서 중간체로서 생성된 유기산 및 TCA사이클로부터 1단계 또는 2단계의 생화학반응을 통해 생성된 것) 또는 그들의 염류 등을 사용할 수 있고, 사용되는 균주의 기질로서의 유용성에 의거해서 적절하게 선택해도 된다. 또한, 조합물이 mcl-3HA의 혼합물을 거의 지니지 않는다면, 복수종의 화합물을 선택해서 사용하는 것도 가능하다.

이들중, 당류에 대해서는, 글리세르알데하이드, 에리트로즈, 아라비노스, 크실로스, 글루코스, 갈락토스, 만노스, 프럭토스 등의 알도스류; 글리세롤, 에리트리톨, 자일리톨 등의 알디톨; 글루콘산 등의 알돈산; 글루쿠론산, 갈락투론산 등의 우론산; 말토스, 슈크로즈, 락토스 등의 이당류 등으로부터 선택된 1종이상의 화합물을 적절하게 사용할 수 있다.

유기산 및 그 염류의 예로서는, 피루브산, 옥살로아세트산, 시트르산, 이소시트르산, 케토글루타르산, 숙신산, 푸마르산, 말산 또는 락트산 등을 들 수 있고, 이들 염으로부터 선택된 1종이상의 화합물을 적절하게 사용할 수 있다. 이들중, 특히 당류를 사용하는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는, 글루코스, 프럭토스 및 만노스로 이루어진 군으로부터 선택된 것이다.

미생물에 의해 PHA를 생산/축적시키는 방법에 대해서는, 먼저 미생물을 충분히 증식시킨 후, 그 균체를, 염화암모늄 등의 질소원이 제한된 배지로 옮기고, 목적으로 하는 유닛의 기질로서 첨가된 화합물에 의해 배양을 행함으로써 생산성을 향상시킬 수 있다. 구체적으로는, 상기 공정을 복수단계 접속시킨 다단 방식을 채용한다. 예를 들면, D-글루코스 0.05% 내지 5.0%정도 및 치환된 벤조일알칸산 0.01% 내지 1.0%정도를 함유하는 무기배지 등에서 대수증식에서부터 정상상의 시점까지 배양하고, 균체를 원심분리 등에 의해 회수한 후, 치환된 벤조일알칸산 0.01%에서 1.0%정도 함유한, 질소원을 제한한 혹은 거의 존재하지 않는 무기배지에서 더욱 배양하는 방법이 있다.

상기의 배양방법에 이용되는 무기배지로서는, 인원(예를 들면, 인산염 등), 질소원(예를 들면, 암모늄염, 질산염 등) 등 미생물의 증식을 허용하는 성분을 함유하고 있는 것이면 어느 것이라도 되며, 예를 들면, 무기염의 배지로서는, MSB배지, E배지(J. Biol. Chem., 218: 97-106(1956)), M9배지 등을 들 수 있다. 또, 본 발명의 실시예에서 사용된 M9배지의 조성은 다음과 같다.

Na₂HPO₄: 6.2g

KH₂PO₄: 3.0g

NaCl: 0.5g

NH₄Cl: 1.0g

(배지 1ℓ중, pH 7.0)

또, PHA의 양호한 증식 및 생산을 위해서는, 상기 무기배지에 하기 미량성분용액을 약 0.3%(v/v) 첨가하는 것이 바람직하다.

미량성분용액

니트릴로트리아세트산: 1.5g

MgSO₄: 3.0g

MnSO₄: 0.5g

NaCl: 1.0g

FeSO₄: 0.1g

CaCl₂: 0.1g

CoCl₂:0.1g

ZnSO₄: 0.1g

CuSO₄: 0.1g

AlK(SO₄)₂: 0.1g

H₃BO₃: 0.1g

Na₂MoO₄: 0.1g

NiCl₂: 0.1g

(1리터당)

배양온도는, 상기 균주가 바람직하게 증식될 수 있는 온도이면 되고, 예를 들면, 15℃ 내지 40℃, 바람직하게는 20℃ 내지 35℃정도, 보다 바람직하게는 20 내지 30℃정도가 적절하다.

구체적인 예로서는, D-글루코스 0.05% 내지 5.0%정도 및 치환된 벤조일알칸산 0.01% 내지 1.0%정도를 함유하는 무기배지 등에서 대수증식상에서부터 정상상의 시점까지 균체를 배양함으로써, 목적외의 모노머유닛이 거의 또는 전혀 공존하지 않는 소망의 PHA를 추출할 수 있다. 이러한 PHA는 통상 R-체만으로 이루어진 아이소택틱 폴리머이다.

D-글루코스대신에 TCA사이클에 포함되는 유기산, 효모엑스 및 폴리펩톤을 동일량 첨가해서, 이들을 조합해서 사용해도 된다.

<PHA의 회수>

본 발명의 방법에 있어서의 배양액으로부터의 PHA의 회수는, 통상 행해지고 있는 방법을 적용할 수 있다. PHA가 배양액중에 분비될 경우에는, 배양액으로부터의 추출정제방법이 사용되고, 또, PHA가 균체에 축적되는 경우에는, 균체로부터의 추출정제방법이 이용된다. 예를 들면, 미생물의 배양균체로부터의 PHA의 회수에는, 통상 행해지고 있는 클로로포름 등의 유기용매를 이용한 추출이 가장 간편하나, 클로로포름대신에 디옥산, 테트라하이드로푸란, 아세토니트릴 또는 아세톤을 사용하는 경우도 있다. 또, 유기용매가 사용되기 어려운 환경중에 있어서는, SDS 등의 계면활성제를 이용한 처리, 리소자임 등의 효소를 이용한 처리, EDTA, 과산화수소, 차아염소산 나트륨, 암모니아 등의 약제를 이용한 처리, 초음파분쇄법, 균질화법, 가압분쇄법, 비드충격법, 분쇄법, 매싱(mashing)법, 동결-해빙법에 의해서, 미생물세포를 물리적으로 분쇄하여, PHA이외의 균체성분을 제거해서, PHA를 회수하는 방법을 이용하는 것도 가능하다.

또한, 본 발명의 미생물의 배양, 본 발명의 미생물에 의한 PHA의 생산과 균체내로의 축적, 그리고, 본 발명에 있어서의 균체로부터의 PHA의 회수는, 상기 방법으로 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 출발물질로서 사용되는 화합물의 제 2예로서는, 하기 화학식(22):

(식중, R₁은, 방향족 고리상의 치환기로서, H원자, CN기, NO₂기, 할로겐원자, CH₃기, C₂H₅기, C₃H₇기, CH₂=CH기, CF₃기, C₂F₅기 및 C₃F₇기로부터 선택된 적어도 1종이고; n은 0 내지 9로부터 선택된 임의의 정수임)로 표시되는 치환된 페닐알칸으로부터 선택된 적어도 1종을 들 수 있고, 이 경우 제조되는 폴리하이드록시알카노에이트로서는, 분자중에 하기 화학식(23):

(식중, R₁은, 방향족 고리상의 치환기로서, H원자, CN기, NO₂기, 할로겐원자, CH₃기, C₂H₅기, C₃H₇기, CH₂=CH기, CF₃기, C₂F₅기 및 C₃F₇기로부터 선택된 적어도 1종이고; m은 0 내지 9로부터 선택된 임의의 정수임)으로 표시되는 3-하이드록시(치환 페닐)알카노에이트유닛으로부터 선택된 적어도 1종을 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트를 들 수 있다.

본 발명에 있어서 출발물질로서 사용되는 화합물의 제 2예로서는, 하기 화학식(24):

(식중, R₂는, 방향족 고리상의 치환기로서, H원자, CN기, NO₂기, 할로겐원자, CH₃기, C₂H₅기, C₃H₇기, CF₃기, C₂F₅기 및 C₃F₇기로부터 선택된 적어도 1종이고; n은 0 내지 9로부터 선택된 임의의 정수임)로 표시되는 치환된 페녹시알칸으로부터 선택된 적어도 1종을 들 수 있고, 이 경우 제조되는 폴리하이드록시알카노에이트로서는,분자중에 하기 화학식(25):

(식중, R₂는, 방향족 고리상의 치환기로서, H원자, CN기, NO₂기, 할로겐원자, CH₃기, C₂H₅기, C₃H₇기, CF₃기, C₂F₅기 및 C₃F₇기로부터 선택된 적어도 1종이고; m은 0 내지 9로부터 선택된 임의의 정수임)로 표시되는 3-하이드록시(치환 페녹시)알카노에이트유닛으로부터 선택된 적어도 1종을 함유하는 것을 들 수 있다.

본 발명에 있어서 출발물질로서 사용되는 화합물의 제 3예로서는, 하기 화학식(26):

식중, R₃은, 방향족 고리상의 치환기로서, H원자, CN기, NO₂기, 할로겐원자, CH₃기, C₂H₅기, C₃H₇기, CF₃기, C₂F₅기 및 C₃F₇기로부터 선택된 적어도 1종이고; n은 0 내지 9로부터 선택된 임의의 정수임)으로 표시되는 치환된 벤조일알칸으로부터 선택된 적어도 1종을 들 수 있고, 이 경우 제조되는 폴리하이드록시알카노에이트로서는, 분자중에 하기 화학식(27):

(식중, R₃은, 방향족 고리상의 치환기로서, H원자, CN기, NO₂기, 할로겐원자, CH₃기, C₂H₅기, C₃H₇기, CF₃기, C₂F₅기 및 C₃F₇기로부터 선택된 적어도 1종이고; m은 0 내지 9로부터 선택된 임의의 정수임)로 표시되는 3-하이드록시(치환 벤조일)알카노에이트유닛으로부터 선택된 적어도 1종을 함유하는 것을 들 수 있다.

본 발명의 방법을 보다 구체적으로 설명하면, 상기 화학식(23), (25) 및 (27)로 표시되는 3-하이드록시알칸산유닛을 1종이상 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법은, 상기 화학식(22), (24) 및 (26)으로 표시되는 화합물을 1종이상 함유하는 배지중에서 미생물을 배양하는 공정을 포함한다.

따라서, 본 발명의 제조방법에 있어서는, 미생물의 배양공정, 즉, 미생물에 의한 폴리하이드록시알카노에이트의 생산공정을 함유할 경우, 상기 화학식(22), (24) 및 (26)으로 표시되는 출발물질의 식중에 표시된 메틸렌사슬길이 "n"과 본 발명의 방법에 의해 제조된 폴리하이드록시알카노에이트의 분자중에 존재하는 유닛의 상기 화학식(23), (25) 및 (27)로 표시되는 식중에 표시된 곁사슬의 메틸렌사슬길이 "m"과의 관계는, 하기 방정식(1):

m=n-2l (1)

(식중, l은 0≤l<(1/2)n의 임의의 정수임)로 규정될 수 있다.

예를 들면, 하기 화학식(28)로 표시되는 7-페녹시헵탄을 출발물질로서 이용할 경우, 제조된 폴리하이드록시알카노에이트로서는, 하기 화학식(29)로 표시되는 3-하이드록시-7-페녹시헵탄산유닛, 하기 화학식(30)으로 표시되는 3-하이드록시-5-페녹시발레르산유닛을 들 수 있다:

또, 본 발명의 방법에 의해 얻어진 PHA는, 폴리머분자중에, 하기 일반식(18):

(식중, p는 0 내지 8에서부터 선택된 임의의 정수로, 해당 폴리머중에서 1개이상의값을 취할 수 있음)로 표시되는 3-하이드록시알칸산유닛 또는 하기 일반식(19):

(식중, q는 3 또는 5로부터 선택된 임의의 정수로, 해당 폴리머중에서 1개이상의 값을 취할 수 있음)로 표시되는 3-하이드록시-알카-5-엔산유닛을 적어도 1종 함유해도 된다.

또, 본 발명의 방법에서 얻어진 PHA의 수평균분자량은 약 5,000 내지 1,000,000이다.

이하, 본 발명에서 이용하는 미생물, 배양공정, 회수공정 등에 대해서 설명한다.

(미생물)

본 발명의 방법에 있어서 이용되는 미생물은, 상기 화학식(15), (16) 및 (17)로 표시된 바와 같은 치환된 방향족 고리를 포함하는 잔기를 지닌 상기 일반식(13)에 표시한 기질물질로서 출발화합물인 치환된 알칸을 이용해서, 곁사슬에 상기 화학식(15), (16) 및 (17)로 표시한 바와 같은 치환된 방향족 고리를 포함하는 잔기를 지닌 상기 일반식(14)에 표시한 분자중에 3-하이드록시-치환 알카노에이트유닛을 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트를 생산할 수 있다면, 어느 것이라도 사용할 수 있다. 또, 필요에 따라 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 범위내에서 복수종의 미생물을 혼합해서 이용하는 것도 가능하다.

본 발명의 방법에서 사용되는 미생물은, 적어도 알칸을 알칸산으로 변환시키는 능력을 지닐 것이 필요하며, 또, 알칸산으로부터 PHA를 생상하는 능력을 지닐 필요가 있다. 알칸으로부터 알칸산으로 변환시키는 능력은, 통상, 출발 효소로서 알칸 모노옥시게나제를 지닌 효소계의 군을 지님으로써 발휘될 수 있다.

이러한 미생물에 대해서는, 슈도모나스속에 속하는 미생물이 알려져 있고, 보다 구체적으로는, 토양으로부터 분리한 미생물인, 일본국 특허출원 평 11-371863호에 개시된 슈도모나스 치코리이(Pseudomonas cichorii) YN2, 일본국 공개특허 소 63-226291호에 개시된 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovorans) ATCC 29347을 들 수 있다.

(배양공정)

본 발명에 관한 PHA의 제조방법의 배양공정에 있어서는, 폴리하이드록시알카노에이트를 생산가능한 상기 미생물을 이용해서 출발물질로서 상기 일반식(13)으로 표시되는 대응하는 치환된 알칸군으로부터 선택된 적어도 1종으로부터, 분자중에 상기 일반식(14)로 표시되는 3-하이드록시-치환 알카노에이트유닛으로부터 선택된 적어도 1종을 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트를 생산한다.

이 배양공정에서 사용되는 미생물의 통상의 배양, 예를 들면, 보존균주의 작성, 균체의 수나 PHA의 생산에 필요한 활성상태를 확보하기 위한 증식 등에는, 이용하는 미생물의 증식에 필요한 성분을 함유하는 배지를 적절하게 선택해서 이용한다. 예를 들면, 일반적인 천연배지(육즙, 효모엑스 등)나 영양원을 첨가한 합성배지 등의 소정 종류의 배지를 이용하는 것이 가능하다. 온도, 통기 및 교반 등의 배양조건은, 사용되는 미생물에 따라 적절하게 선택한다.

한편, 배양공정에 있어서, 상기 PHA생산미생물을 이용해서 분자중에 상기 일반식(14)로 표시되는 목적으로 하는 3-하이드록시-치환 알카노에이트유닛군으로부터 선택된 적어도 1종을 함유하는 PHA를 제조할 경우, 배지로서는, PHA생산용의 원료로서의 모노머유닛에 대응하는 상기 일반식(13)으로 표시되는 치환된 알칸류의 군으로부터 선택된 것이외에도 미생물의 생육용의 탄소원을 적어도 함유하는 무기배지 등을 이용해도 된다. 원료로서 상기 일반식(13)으로 표시되는 치환된 알칸류의 군의 초기함유비는, 바람직하게는 배지당 0.01 내지 1%(v/v), 보다 바람직하게는 0.02 내지 0.2%의 범위내에서 선택한다.

본 발명의 제조방법의 배양공정은, 알칸산화경로를 유도하는 디시클로프로필케톤을 함유하는 배지중에 미생물을 배양하는 공정을 포함해도 된다. 일반적으로, 옥탄, 노난과 같은 알칸산화경로의 대사경로의 물질인 직선형 알칸은, 알칸산화경로를 효율적으로 유도한다. 그러나, 이러한 직선형 알칸을 인듀서(inducer)로서 이용할 경우, 얻어지는 PHA는, 중간사슬길이의 3-하이드록시알카노에이트유닛의 조성비가 높게 된다. 그 이유는, 직선형 알칸은, 알칸산화경로를 통해 직선형알칸산으로 변환된 후, β-산화경로를 통해 PHA의 모노머물질로 변환되기 때문이다.

본 발명에 있어서의 모노머물질에 사용되는 치환된 알칸은, 알칸산화경로를 유도할 수 있으므로, 상기 직선형 알칸과 마찬가지로 PHA의 모노머유닛으로서 편입될 수 있다. 알칸산화경로를 전개하여, 직선형 알칸을 채용한 결과, 본 발명의 치환된 알칸은, 직선형 알칸에 비해서 충분히 해당 경로를 유도하지 않을 수 있다.

무상의 인듀서로서 디시클로프로필케톤이 알려져 있고, 이것은 알칸산화경로의 인듀서로서 작용한다. 그러나, 알칸모노옥시게나제에 의해 산화될 수 없으므로, 그 경로의 기질로서 작용하지 않는다(Journal of Bacteriology, 123, 546-556(1975)). 이 점에 관해서는, 알칸산화경로의 유도가 불충분하거나 증대될 경우, 또는 목적으로 하는 PHA가 낮은 조성비의 중간사슬길이의 3-하이드록시알카노에이트유닛를 필요로 할 경우, 디시클로프로필케톤은 바람직한 인듀서로서 사용될 수 있다. 이 경우, 디시클로프로필케톤은, 알칸산화경로를 효율적으로 촉진하고, 전체 대사활성을, 본 발명의 치환된 알칼의 변화에 사용할 수 있다. 그 결과, 치환된 알칸으로부터 유래된 모노머유닛은 효율적으로 생산될 수 있고, 치환된 알칸으로부터 유래된 PHA를 고수율로 얻을 수 있는 동시에 모노머유닛의 조성비를 높게 얻을 수 있다.

배지에는 디시클로프로필케톤만을 첨가하거나, 본 발명의 치환된 알칸과 함께 첨가할 수 있다. 디시클로프로필케톤의 농도는, 배지중의 영양분의 종류, 치환된 알칸의 유무와 그들의 농도, 배양공정의 수 등의 배양조건을 고려해서 선택한다. 디시클로프로필케톤의 농도는, 통상, 0.001 내지 1%(v/v), 보다 바람직하게는 0.01 내지 0.1%이다.

상기 일반식(13)으로 표시되는 치환된 알칸의 군은, 항상 그의 소수성에 기인한 양호한 수가용성을 지니는 것은 아니지만, 상기 미생물이 기질로서 이 화합물을 이용할 수 있는 특징을 지니므로 전혀 문제는 없고, 배양의 초기에 현탁상태에서 일부가 부분적으로 용해되어 있더라도, 미생물은 배양의 계속중에 점차로 균체내로 침입하므로 차례로 배지에 용해되게 된다. 또, 미생물 자체가 충분한 흡수를 위해 계면활성제같은 물질을 분비하므로, 기질로서 치환된 알칸을 용이하게 흡수하게 된다.

또한, 원료로서의 상기 일반식(13)으로 표시되는 치환된 알칸의 군은, 1-헥사데센, n-헥사데칸 등의 용제의 용액으로, 또는 미세현탁액의 형태로 배지에 첨가해서 그 분산성을 증가시켜도 된다. 이 경우, 사용되는 1-헥사데센, n-헥사데칸 등의 용제의 첨가농도는, 배지에 대해 3%(v/v)이하일 필요가 있다.

배지중에, 미생물의 증식에 이용되는 증식용 물질을 별도로 첨가해도 된다. 이 증식용 물질로서는, 효모엑스, 폴리펩톤, 고기추출물 등의 영양분을 사용할 수 있다. 또, 사용되는 균에 따라, 탄소원으로서의 유용성을 고려해서, 당류, TCA사이클에 있어서의 중간체로서 생성된 유기산 및 TCA사이클로부터 1단계 또는 2단계의 생화학반응을 통해 생성된 유기산 또는 그들의 염류, 아미노산 또는 그들의 염류, 탄소수 4 내지 12의 직선사슬의 알칸산으로부터 선택해도 된다.

이들 각종 증식용 물질중에서, 적절하게 사용가능한 당류로서는, 글리세르알데하이드, 에리트로즈, 아라비노스, 크실로스, 글루코스, 갈락토스, 만노스, 프럭토스 등의 알도스류; 글리세롤, 에리트리톨, 자일리톨 등의 알디톨; 글루콘산 등의 알돈산; 글루쿠론산, 갈락투론산 등의 우론산; 말토스, 슈크로즈, 락토스 등의 이당류로 이루어진 군으로부터 선택된 1종이상의 화합물을 들 수 있다

또, 적절하게 사용가능한 산 또는 그들의 염류로서는, 피루브산, 말산, 락트산, 시트르산, 숙신산 또는 그들의 염류로부터 선택된 1종이상의 화합물을 들 수 있다. 한편, 적절하게 사용가능한 아미노산 또는 그들의 염류로서는, 글루탐산, 아스파라긴산 또는 그들의 염류로부터 선택된 1종이상의 화합물을 들 수 있다.

일반적으로, 이들 각종 증식용 물질중, 폴리펩톤, 당류를 사용하는 것이 보다 바람직하고, 당류중, 글루코스, 프럭토스 또는 만노스로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종을 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 이들 증식용 물질의 함량비는, 통상 배지당 0.1 내지 5%(w/v), 보다 바람직하게는 0.2 내지 2%(w/v)이다.

미생물에 의해 PHA를 생산/축적시키는 배양공정의 다른 방법에 대해서는, 먼저 충분한 증식을 행한 후, 해당 균체를 염화암모늄 등의 질소원을 제한한 배지로 이식하여, 목적으로 하는 유닛의 물질로서의 화합물을 첨가한 상태에서 배양을 행할 경우, 생산성이 향상될 경우도 있다. 예를 들면, 상기한 상이한 배양조건의 공정을 복수개 접속한 다단계법을 채용하는 것을 들 수 있다.

보다 구체적으로는, 하기와 같은 2단계배양법 등을 이용하는 것이 보다 바람직하다:

제 1단계(스텝 1-1)로서, 탄소원으로서 폴리펩톤과 상기 일반식(13)으로 표시되는 치환된 알칸의 군을 함유하는 배지에서 미생물을 배양하는 공정을, 대수성장상으로부터 정상상까지 계속한 후, 일단 원심분리에 의해 균체를 회수하는 공정, 이어서;

제 2단계(스텝 1-2)로서, 전단계(스텝 1-1)에서 배양/증식된 미생물을, 탄소원으로서 유기산 또는 그 염류와 상기 일반식(13)으로 표시되는 치환된 알칸의 군을 함유하는 배지에서 더욱 배양하는 공정; 또는

제 1단계(스텝 1-3)로서, 탄소원으로서 글루코스와 상기 일반식(13)으로 표시되는 치환된 알칸의 군을 함유하는 배지에서 미생물을 배양하는 공정을, 대수성장상으로부터 정상상까지 계속한 후, 일단 원심분리에 의해 균체를 회수하는 공정, 이어서;

제 2단계(스텝 1-4)로서, 전단계(스텝 1-3)에서 배양/증식된 미생물을, 탄소원으로서 글루코스와 상기 일반식(13)으로 표시되는 치환된 알칸의 군을 함유하는 배지에서 더욱 배양하는 공정.

또, 제 1단계(스텝 1-5)로서, 탄소원으로서 폴리펩톤과 상기 일반식(13)으로 표시되는 치환된 알칸의 군을 함유하는 배지에서 미생물을 배양하는 공정을, 대수성장상으로부터 정상상까지 계속한 후, 일단 원심분리에 의해 균체를 회수하는 공정, 이어서;

제 2단계(스텝 1-6)로서, 전단계(스텝 1-5)에서 배양된 미생물을, 탄소원으로서 당류와 상기 일반식(13)으로 표시되는 치환된 알칸의 군을 함유하지만 어떠한 질소원도 함유하지 않는 배지에서 더욱 배양하는 공정으로 이루어진 2단계 배양법을 이용하는 것이 바람직하다.

상기 (스텝 1-2), (스텝 1-4) 및 (스텝 1-6)으로서 설명한 제 2단계에서는, 질소원없이 배양을 행할 수 있다.

이러한 2단계 배양법에 의하면, 전단계에서는, 분자중에 원료로서 상기 일반식(13)으로 표시되는 치환된 알칸의 군에 대응하는 상기 일반식(14)로 표시되는 3-하이드록시-치환 알카노에이트유닛의 군으로부터 선택된 적어도 1종을 함유하는 PHA를 생산할 뿐만 아니라, 균체의 예비증식을 행하고; 후단계에서는, 예비배양된 균체가 질소원없는 배지에서 PHA를 주로 생산하게 되므로, 이들 방법은 균체내에 축적된 PHA의 양을 더욱 증대시킬 수 있다.

알칸산화경로를 효율적으로 유도하는 디시클로프로필케톤은, 각각 상기 (스텝 1-1)과 (스텝 1-2); (스텝 1-3)과 (스텝 1-4); (스텝 1-5)와 (스텝 1-6)의 적어도 한 스텝에 첨가하여, 치환된 알칸을, 치환기를 지닌 대응하는 알카노에이트로 변환하므로, PHA의 수율 및 목적으로 하는 모노머유닛의 조성비를 높게 할 수 있다.

또, 상기 (스텝 1-1), (스텝 1-3) 및 (스텝 1-5)에 있어서, 치환된 알칸군대신에, 디시클로프로필케톤만을 사용하여, 알칸산화경로의 도입시 주로 목적으로 하는 제 1단계의 배양법의 역할을 하게 할 수 있다.

이러한 배양공정에서 사용되는 온도는, 상기 균주를 잘 성장시킬 수 있는 온도면 되고, 예를 들면, 15 내지 40℃, 바람직하게는 20 내지 35℃, 보다 바람직하게는 20 내지 30℃의 범위에서 적절하게 선택한다.

배양을 위해서는, 미생물을 증식하여, 배지에 함유된 원료로서 상기 일반식(13)으로 표시되는 치환된 알칸의 군으로부터 선택된 적어도 1종으로부터, 분자중에 상기 일반식(14)로 표시되는 3-하이드록시-치환 알카노에이트유닛의 군으로부터 선택된 적어도 1종을 함유하는 PHA를 생산할 수 있다면, 액체배양, 고체배양 등의 어느 배양법이라도 이용가능하다. 또, 원료인 탄소원 및 산소가 적절하게 공급된다면, 회분식 배양, 유동회분식 배양, 반연속배양, 연속배양 등의 어느 형태를 이용해도 된다. 예를 들면, 액체회분식 배양의 형태로서는, 진탕플라스크에 의한 진탕을 통해 산소를 공급하는 방법, 자(jar)발효기를 이용하는 교반통기방식 등을 들 수 있다.

상기 배양법에 사용되는 무기배지에 대해서는, 미생물을 증식할 수 있는 인원(예를 들면, 포스페이트 등), 질소원(예를 들면, 암모늄염, 질산염 등) 등의 성분을 함유하면 어느 배지라도 사용가능하며, 예를 들면, MSB배지, M9배지 등을 들 수 있다.

보다 나은 증식을 행하는 동시에 PHA생산을 수반하기 위해서는, 보조의 필수미량원소에, 예를 들면, 상기 무기염배지에 상기 미량원소를 약 3%(v/v) 첨가할 필요가 있다.

또, 상기 배양법에 대해서는, 회분식 배양, 유동회분식 배양, 반연속배양, 연속배양, 리액터형 배양, 고체배양 등의 통상의 미생물배양에 사용되는 방법을 이용할 수 있다.

(PHA의 추출/정제공정)

본 발명에 관한 축적된 미생물균체로부터 PHA를 생산/획득하기 위해서는, 통상 행해지는 상기 방법을 적용해도 된다.

이하, 실시예를 표시한다. 또, 이하의 설명중, "%"는 특별한 언급이 없는 한 중량에 의거한 것이다.

실시예

(실시예 1)

D-글루코스 0.5% 및 FBzVA 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 슈도모나스 치코리이 YN2균주를 접종하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 48시간후, 균체를 원심분리에 의해서 회수하고, D-글루코스 0.5% 및 5-(4-플루오로벤조일)발레르산(이하, "FBzVA"라 약칭할 경우도 있음) 0.1%를 함유하나 질소원(NH₄Cl)은 함유하지 않는 M9배지 200㎖에 재현탁시켜, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 40시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정해서 동결건조하였다.

이 동결건조펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반해서 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 해당 여과액을 회전식 증발기에서 농축하고, 얻어진 농축액을 냉메탄올중에서 재침전시키고, 또 침전물만을 회수하여 진공건조해서 PHA를 얻었다.

얻어진 PHA는 상법에 따라서 메탄올라이시스(methanolysis)를 행한 후, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마즈 QP-5050, EI법)로 분석해서, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정(同定)을 행하였다. 그 결과, 하기 표 3에 표시한 바와 같이, 이 PHA는, 3HFBzV를 모노머유닛으로서 함유하는 PHA로 확인되었다.

YN2균주에 의한 폴리하이드록시알카노에이트의 생산

균체의 건조중량(mg/ℓ)폴리머의 건조중량(mg/ℓ)	610150
모노머유닛의 조성(TIC피크면적비)3-하이드록시헥산산3-하이드록시옥탄산3-하이드록시데칸산3-하이드록시도데칸산3-하이드록시도데센산3-하이드록시-5-(4-플루오로벤조일)발레르산	0.2%4.5%9.8%4.0%7.1%74.4%

또, 겔투과크로마토그래피(GPC; 토소, HLC-8220, 컬럼: 폴리머래보래토리, PL겔 MIXED-C(5㎛), 용매: 클로로포름, 폴리스티렌환산)에 의한 이 PHA의 분자량의 측정결과, Mn=30,000, Mw=78,000이었다.

(실시예 2)

D-글루코스 0.5% 및 FBzVA 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 슈도모나스 치코리이 YN2균주를 접종하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 48시간후, 균체를 원심분리에 의해서 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하고, 진공건조하였다.

이 진공건조펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반해서 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 해당 여과액을 회전식 증발기에서 농축하고, 얻어진 농축액을 냉메탄올중에서 재침전시키고, 또 침전물만을 회수하여 진공건조해서 PHA를 얻었다.

얻어진 PHA는 상법에 따라서 메탄올라이시스를 행한 후, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마즈 QP-5050, EI법)로 분석해서, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 그 결과, 하기 표 4에 표시한 바와 같이, 이 PHA는, 3HFBzV를 모노머유닛으로서 함유하는 PHA로 확인되었다.

YN2균주에 의한 폴리하이드록시알카노에이트의 생산

균체의 건조중량(mg/ℓ)폴리머의 건조중량(mg/ℓ)	49036
모노머유닛의 조성(TIC피크면적비)3-하이드록시부티르산3-하이드록시헥산산3-하이드록시옥탄산3-하이드록시데칸산3-하이드록시도데칸산3-하이드록시도데센산3-하이드록시-5-(4-플루오로벤조일)발레르산	0.1%0.3%7.5%12.2%4.6%5.0%70.3%

(실시예 3)

말레산 2나트륨 0.5% 및 FBzVA 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 슈도모나스 치코리이 YN2균주를 접종하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 4일후, 균체를 원심분리에 의해서 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하고, 진공건조하였다.

얻어진 PHA는 상법에 따라서 메탄올라이시스를 행한 후,가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마즈 QP-5050, EI법)로 분석해서, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 그 결과, 하기 표 5에 표시한 바와 같이, 이 PHA는, 3HFBzV를 모노머유닛으로서 함유하는 PHA로 확인되었다.

YN2균주에 의한 폴리하이드록시알카노에이트의 생산

균체의 건조중량(mg/ℓ)폴리머의 건조중량(mg/ℓ)	480190
모노머유닛의 조성(TIC피크면적비)3-하이드록시부티르산3-하이드록시헥산산3-하이드록시옥탄산3-하이드록시데칸산3-하이드록시도데칸산3-하이드록시도데센산3-하이드록시-5-(4-플루오로벤조일)발레르산	60.7%0.8%8.3%5.1%1.9%1.5%21.7%

(실시예 4)

효모엑스(오리엔탈이스트산업사(Oriental Yeast Industry Co., Ltd.) 제품) 0.5% 및 FBzVA 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 슈도모나스 치코리이 YN2균주를 접종하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 48시간후, 균체를 원심분리에 의해서 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하고, 진공건조하였다.

얻어진 PHA는 상법에 따라서 메탄올라이시스를 행한 후, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마즈 QP-5050, EI법)로 분석해서, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 그 결과, 하기 표 6에 표시한 바와 같이, 이 PHA는, 3HFBzV를 모노머유닛으로서 함유하는 PHA로 확인되었다.

YN2균주에 의한 폴리하이드록시알카노에이트의 생산

균체의 건조중량(mg/ℓ)폴리머의 건조중량(mg/ℓ)	52060
모노머유닛의 조성(TIC피크면적비)3-하이드록시헥산산3-하이드록시옥탄산3-하이드록시데칸산3-하이드록시도데칸산3-하이드록시-5-(4-플루오로벤조일)발레르산	0.8%3.6%4.0%1.4%90.2%

(실시예 5)

폴리펩톤(닛뽄제약사(Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.) 제품) 0.5% 및 FBzVA 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 슈도모나스 치코리이 YN2균주를 접종하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 48시간후, 균체를 원심분리에 의해서 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하고, 진공건조하였다.

얻어진 PHA는 상법에 따라서 메탄올라이시스를 행한 후, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마즈 QP-5050, EI법)로 분석해서, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 그 결과, 하기 표 7에 표시한 바와 같이, 이 PHA는, 3HFBzV를 모노머유닛으로서 함유하는 PHA로 확인되었다.

YN2균주에 의한 폴리하이드록시알카노에이트의 생산

균체의 건조중량(mg/ℓ)폴리머의 건조중량(mg/ℓ)	690290
모노머유닛의 조성(TIC피크면적비)3-하이드록시부티르산3-하이드록시헥산산3-하이드록시옥탄산3-하이드록시데칸산3-하이드록시도데칸산3-하이드록시도데센산3-하이드록시-5-(4-플루오로벤조일)발레르산	1.2%0.3%4.7%9.8%3.1%3.5%77.4%

(실시예 6)

D-글루코스 0.5% 및 FBzVA 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 슈도모나스 치코리이 H45균주를 접종하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 48시간후, 균체를 원심분리에 의해서 회수하고, D-글루코스 0.5% 및 FBzVA 0.1%를 함유하나 질소원(NH₄Cl)은 함유하지 않는 M9배지 200㎖에 재현탁시켜, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 40시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정해서 동결건조하였다.

얻어진 PHA는 상법에 따라서 메탄올라이시스를 행한 후,가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마즈 QP-5050, EI법)로 분석해서, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 그 결과, 하기 표 8에 표시한 바와 같이, 이 PHA는, 3HFBzV를 모노머유닛으로서 함유하는 PHA로 확인되었다.

H45균주에 의한 폴리하이드록시알카노에이트의 생산

균체의 건조중량(mg/ℓ)폴리머의 건조중량(mg/ℓ)	49090
모노머유닛의 조성(TIC피크면적비)3-하이드록시헥산산3-하이드록시옥탄산3-하이드록시데칸산3-하이드록시도데칸산3-하이드록시도데센산3-하이드록시-5-(4-플루오로벤조일)발레르산	0.1%4.0%8.8%5.1%7.8%74.2%

또, 겔투과크로마토그래피(GPC; 토소, HLC-8220, 컬럼: 폴리머래보래토리, PL겔 MIXED-C(5㎛), 용매: 클로로포름, 폴리스티렌환산)에 의한 이 PHA의 분자량의 측정결과, Mn=26,000, Mw=61,000이었다.

(실시예 7)

D-글루코스 0.5% 및 FBzVA 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 슈도모나스 젯세니이 P161균주를 접종하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 48시간후, 균체를 원심분리에 의해서 회수하고, D-글루코스 0.5% 및 FBzVA 0.1%를 함유하나 질소원(NH₄Cl)은 함유하지 않는 M9배지 200㎖에 재현탁시켜, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 40시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정해서 동결건조하였다.

얻어진 PHA는 상법에 따라서 메탄올라이시스를 행한 후, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마즈 QP-5050, EI법)로 분석해서, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 그 결과, 하기 표 9에 표시한 바와 같이, 이 PHA는, 3HFBzV를 모노머유닛으로서 함유하는 PHA로 확인되었다.

P161균주에 의한 폴리하이드록시알카노에이트의 생산

균체의 건조중량(mg/ℓ)폴리머의 건조중량(mg/ℓ)	590110
모노머유닛의 조성(TIC피크면적비)3-하이드록시옥탄산3-하이드록시데칸산3-하이드록시도데칸산3-하이드록시도데센산3-하이드록시-5-(4-플루오로벤조일)발레르산	3.5%8.0%4.9%5.6%78.0%

또, 겔투과크로마토그래피(GPC; 토소, HLC-8220, 컬럼: 폴리머래보래토리, PL겔 MIXED-C(5㎛), 용매: 클로로포름, 폴리스티렌환산)에 의한 이 PHA의 분자량의 측정결과, Mn=41,000, Mw=110,000이었다.

(실시예 8)

폴리펩톤 0.5%(w/v) 및 n-아밀벤젠(3가지 농도: 0.025%, 0.05% 및 0.1%(v/v))을 함유하는 M9배지 200㎖를 준비하여, 500㎖체적의 진탕플라스크에 넣고, 오토클레이브에서 멸균하였다. 각 플라스크를 실온으로 복원시키고, 한천판상의 YN2균주를 접종하고 나서, 30℃, 125스트로크/분에서 24시간 진탕배양하였다. 배양완료후, 균체를 원심분리에 의해 회수하여, 냉메탄올로 한번 세정하고, 동결건조하였다.

이 동결건조펠릿을 칭량해서 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반해서 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 해당 여과액을 회전식 증발기에서 농축하고, 얻어진 농축액을 냉메탄올중에서 재침전시키고, 또 침전물만을 회수하여 진공건조해서 PHA를 얻고, 칭량하였다. 각 수율은 하기 표 10에 표시되어 있다.

또, 겔투과크로마토그래피(GPC; 토소, HLC-8220, 컬럼: 폴리머래보래토리, PL겔 MIXED-C(5㎛), 용매: 클로로포름, 폴리스티렌환산)에 의한 0.05%아밀벤젠계중에서 얻어진 이 PHA의 분자량의 측정결과, 수평균분자량(Mn)은 Mn=90,000, 분자량분포는 1.9였다.

얻어진 PHA의 조성은 다음과 같이 분석하였다. 즉, PHA 약 10㎎을 25㎖체적의 배형상 플라스크에 넣고, 클로로포름 2㎖에 용해시키고, 이 용액에, 황산 3%를 함유하는 메탄올용액 2㎖를 첨가하고, 그 혼합액을 100℃에서 3.5시간 환류하에 반응시켰다.

반응종료후, 탈이온수 10㎖를 첨가하고, 10분간 격렬하게 흔든 후, 2층으로 분리된 아래쪽의 클로로포름층을 빼내, 황산마그네슘으로 탈수시킨 후, 이 클로로포름층을 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마즈 QP-5050, EI법)로 분석해서, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 그 결과는, 하기표 11에 표시되어 있다.

또, 0.1%아밀벤젠계의 GC-MS분석에 의해 얻어진 피크의 질량스펙트럼은 도 1 내지 도 4에 표시되어 있다(각각 도 1: 3-하이드록시부티르산, 도 2: 3-하이드록시옥탄산, 도 3: 3-하이드록시데칸산, 도 4: 3-하이드록시-5-페닐발레르산의 메틸에스테르에 상당함).

AMB(%)	CDW(㎎/ℓ)	PDW(㎎/ℓ)	수율(%)
0.025	900	65	7.2
0.05	1050	200	19.0
0.1	850	65	7.6

AMB: 아밀벤젠, CDW: 건조균체중량,

PDW: 건조폴리머중량

수율: PDW/CDW×100

AMB(%)	3HB	3HO	3HD	3HPV
0.025	51.1	0.7	2.1	46.1
0.05	19.2	0.7	3.6	76.5
0.1	24.6	2.1	3.8	72.5

AMB: 아밀벤젠, 3HB: 3-하이드록시부티르산

3HO: 3-하이드록시옥탄산

3HD: 3-하이드록시데칸산

3HPV: 3-하이드록시-5-페닐발레르산

(실시예 9)

글루탐산 나트륨 0.5%(w/v) 및 n-아밀벤젠(0.05% 및 0.1%(v/v))을 함유하는M9배지 200㎖를 준비하여, 500㎖체적의 진탕플라스크에 넣고, 오토클레이브에서 멸균하였다.

상기 플라스크를 실온으로 복원시키고, 한천판상의 YN2균주를 접종하고 나서, 30℃, 125스트로크/분에서 26시간 진탕배양하였다.

배양완료후, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, NH₄Cl성분이 없는 M9배지(글루탐산나트륨 및 아밀벤젠의 농도는 동일함)로 이식해서, 30℃, 125스트로크/분에서 20시간 진탕배양하였다.

배양완료후, 균체를 원심분리에 의해 회수하여, 냉메탄올로 한번 세정하고, 동결건조하였다.

이 동결건조펠릿을 칭량한 후, 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반해서 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 해당 여과액을 회전식 증발기에서 농축하고, 얻어진 농축액을 냉메탄올중에서 재침전시키고, 또 침전물만을 회수하여 진공건조해서 PHA를 얻고, 칭량하였다. 각 수율은 하기 표 12에 표시되어 있다.

또, 얻어진 PHA의 조성은 실시예 8과 마찬가지 방법으로 분석하였다. 그 결과는, 하기 표 13에 표시되어 있다.

CDW(㎎/ℓ)	PDW(㎎/ℓ)	수율(%)
900	320	35.6

CDW: 건조균체중량,

PDW: 건조폴리머중량

수율: PDW/CDW×100

3HB	3HD	3HPV
88.7	3.1	8.2

3HB: 3-하이드록시부티르산

3HD: 3-하이드록시데칸산

3HPV: 3-하이드록시-5-페닐발레르산

(실시예 10)

폴리펩톤 0.5%(w/v) 및 n-헥사노페논(4가지 농도: 0.01%, 0.025%, 0.05% 및 0.1%(v/v))을 함유하는 M9배지 200㎖를 준비하여, 500㎖체적의 진탕플라스크에 넣고, 오토클레이브에서 멸균하였다.

상기 각 플라스크를 실온으로 복원시키고, 슈도모나스 치코리이 YN2균주를 접종하고 나서, 30℃, 125스트로크/분에서 26시간 진탕배양하였다. 48시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하여, 냉메탄올로 한번 세정하고, 동결건조하였다.

이 동결건조펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반해서 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 해당 여과액을 회전식 증발기에서 농축하고, 얻어진 농축액을 냉메탄올중에서 재침전시키고, 또 침전물만을 회수하여 진공건조해서 PHA를 얻었다. 각 수율은 하기 표 14 내지 표 17에 표시되어 있다(표 14: 0.01% n-헥사노페논의 결과, 표 15: 0.025% n-헥사노페논의 결과, 표 16: 0.05% n-헥사노페논의 결과, 표 17: 0.1% n-헥사노페논)의 결과.

균체의 건조중량폴리머의 건조중량폴리머의 건조중량/균체의 건조중량	815mg/ℓ50mg/ℓ6.1%
모노머유닛의 조성(TIC피크면적비)3-하이드록시부티르산3-하이드록시헥산산3-하이드록시옥탄산3-하이드록시데칸산3-하이드록시도데칸산3-하이드록시도데센산3-하이드록시-5-벤조일발레르산	42.4%0.0%5.2%13.8%12.1%3.7%22.8%

균체의 건조중량폴리머의 건조중량폴리머의 건조중량/균체의 건조중량	775mg/ℓ60mg/ℓ7.7%
모노머유닛의 조성(TIC피크면적비)3-하이드록시부티르산3-하이드록시헥산산3-하이드록시옥탄산3-하이드록시데칸산3-하이드록시도데칸산3-하이드록시도데센산3-하이드록시-5-벤조일발레르산	32.8%0.0%3.3%12.4%12.9%3.8%34.8%

균체의 건조중량폴리머의 건조중량폴리머의 건조중량/균체의 건조중량	685mg/ℓ80mg/ℓ11.7%
모노머유닛의 조성(TIC피크면적비)3-하이드록시부티르산3-하이드록시헥산산3-하이드록시옥탄산3-하이드록시데칸산3-하이드록시도데칸산3-하이드록시도데센산3-하이드록시-5-벤조일발레르산	21.7%0.0%4.2%12.1%12.0%2.8%47.2%

균체의 건조중량폴리머의 건조중량폴리머의 건조중량/균체의 건조중량	755mg/ℓ70mg/ℓ9.3%
모노머유닛의 조성(TIC피크면적비)3-하이드록시부티르산3-하이드록시헥산산3-하이드록시옥탄산3-하이드록시데칸산3-하이드록시도데칸산3-하이드록시도데센산3-하이드록시-5-벤조일발레르산	12.6%0.2%2.3%7.7%8.0%1.7%60.5%

또, 겔투과크로마토그래피(GPC; 토소, HLC-8220, 컬럼: 토소 TSK-GEL 수퍼 HM-H, 용매: 클로로포름, 폴리스티렌환산)에 의한 이 PHA의 분자량의 측정결과, Mn=68,000, Mw=454,000이었다.

또한, 얻어진 PHA는 상법에 따라서 메탄올라이시스를 행한 후, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마즈 QP-5050, EI법)로 분석해서, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 그 결과는, 상기 표 14 내지 표 17에 표시되어 있다. 그 결과, 상기 표 14 내지 표 17에 표시한 바와 같이, 이 PHA는, 하기 화학식(31):

로 표시되는 3-하이드록시-5-벤조일발레르산(이하, 필요에 따라 "3HBV"라 약칭함)을 모노머유닛으로서 함유하는 PHA로 확인되었다.

NMR장치를 이용해서 이하의 조건하에 상기 화합물의 분석을 행하였다.

<측정장치> FT-NMR: 브루커 DPX 400

공명주파수:¹H = 400MHz

<측정조건> 측정핵종:¹H

사용용매: CDCl₃

기준: 모세관봉입된 CDCl₃

측정온도: 실온

¹H-NMR스펙트럼차트는 도 5에 표시되어 있고, 그 귀속결과는 표 18에 표시되어 있다.

화학적 이동(ppm)	적분치	타입	위치
2.042.563.005.267.367.467.89	2221212	mmmmmtd	dbeci, kjh, l

(실시예 11)

글루탐산 나트륨 0.5%(w/v) 및 n-헥사노페논 0.1%(v/v)를 함유하는 M9배지 200㎖를 준비하여, 500㎖체적의 진탕플라스크에 넣고, 오토클레이브에서 멸균하였다.

상기 플라스크를 실온으로 복원시키고, 슈도모나스 치코리이 YN2균주를 접종하고 나서, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 48시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하여, 냉메탄올로 한번 세정하고, 동결건조하였다.

또한, 얻어진 PHA는 상법에 따라서 메탄올라이시스를 행한 후, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마즈 QP-5050, EI법)로 분석해서, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 그 결과는, 하기 표 19에 표시되어 있다. 그 결과, 하기 표 19에 표시한 바와 같이, 이 PHA는, 상기 화학식(31)로 표시되는 3HBV를 모노머유닛으로서 함유하는 PHA로 확인되었다.

균체의 건조중량폴리머의 건조중량폴리머의 건조중량/균체의 건조중량	1040mg/ℓ445mg/ℓ42.8%
모노머유닛의 조성(TIC피크면적비)3-하이드록시부티르산3-하이드록시헥산산3-하이드록시옥탄산3-하이드록시데칸산3-하이드록시도데칸산3-하이드록시도데센산3-하이드록시-5-벤조일발레르산	39.4%0.3%3.9%11.01%6.5%8.3%30.5%

(실시예 12)

효모엑스 0.5%(w/v) 및 n-헥사노페논 0.1%(v/v)를 함유하는 M9배지 200㎖를 준비하여, 500㎖체적의 진탕플라스크에 넣고, 오토클레이브에서 멸균하였다.

상기 플라스크를 실온으로 복원시키고, 한천판상의 슈도모나스 치코리이 YN2균주를 접종하고 나서, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 48시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하여, 냉메탄올로 한번 세정하고, 동결건조하였다.

또한, 얻어진 PHA는 상법에 따라서 메탄올라이시스를 행한 후, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마즈 QP-5050, EI법)로 분석해서, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 그 결과는, 하기 표 20에 표시되어 있다. 그 결과, 하기 표 20에 표시한 바와 같이, 이 PHA는, 상기 화학식(31)로 표시되는 3HBV를 모노머유닛으로서 함유하는 PHA로 확인되었다.

균체의 건조중량폴리머의 건조중량폴리머의 건조중량/균체의 건조중량	925mg/ℓ25mg/ℓ2.7%
모노머유닛의 조성(TIC피크면적비)3-하이드록시부티르산3-하이드록시헥산산3-하이드록시옥탄산3-하이드록시데칸산3-하이드록시도데칸산3-하이드록시도데센산3-하이드록시-5-벤조일발레르산	73.5%0.0%2.0%3.7%0.0%2.0%18.8%

(실시예 13)

글루탐산 나트륨 0.5%(w/v) 및 n-페녹시펜탄 0.1%(v/v)를 함유하는 M9배지 200㎖를 준비하여, 500㎖체적의 진탕플라스크에 넣고, 오토클레이브에서 멸균하였다.

상기 플라스크를 실온으로 복원시키고, 슈도모나스 치코리이 YN2균주를 접종하고 나서, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 120시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하여, 냉메탄올로 한번 세정하고, 동결건조하였다.

이 동결건조펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반해서 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 해당 여과액을 회전식 증발기에서 농축하고, 얻어진 농축액을 냉메탄올중에서 재침전시키고, 또 침전물만을 회수하여 진공건조해서 PHA를 23㎎ 얻었다.

또, 겔투과크로마토그래피(GPC; 토소, HLC-8220, 컬럼: 토소 TSK-GEL 수퍼 HM-H, 용매: 클로로포름, 폴리스티렌환산)에 의한 이 PHA의 분자량의 측정결과, Mn=64,000, Mw=141,000이었다.

또한, 얻어진 PHA는 상법에 따라서 메탄올라이시스를 행한 후, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마즈 QP-5050, EI법)로 분석해서, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 그 결과는, 하기 표 21에 표시되어 있다.

실시예 13에서 생산된 PHA의 생산 및 모노머유닛의 조성

균체의 건조중량폴리머의 건조중량폴리머의 건조중량/균체의 건조중량	570mg/ℓ115mg/ℓ20.2%
모노머유닛의 조성(TIC피크면적비)3-하이드록시부티르산3-하이드록시발레르산3-하이드록시헥산산3-하이드록시옥탄산3-하이드록시데칸산3-하이드록시도데칸산3-하이드록시도데센산3-하이드록시-5-페녹시발레르산	15.0%0.3%0.1%1.0%1.0%0.3%0.8%81.5%

따라서, 상기 표 21에 표시한 바와 같이, 이 PHA는 하기 화학식(32):

로 표시되는 3-하이드록시-5-페녹시발레르산(이하, "3HPxV"라 약칭함)을 함유하는 PHA인 것으로 확인되었다.

(실시예 14)

폴리펩톤 0.5%(w/v) 및 n-페녹시펜탄 0.1%(v/v)를 함유하는 M9배지 200㎖를 준비하여, 500㎖체적의 진탕플라스크에 넣고, 오토클레이브에서 멸균하였다.

상기 플라스크를 실온으로 복원시키고, 한천판상의 슈도모나스 치코리이 YN2균주를 접종하고 나서, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 120시간후,균체를 원심분리에 의해 회수하여, 냉메탄올로 한번 세정하고, 동결건조하였다.

이 동결건조펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반해서 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 해당 여과액을 회전식 증발기에서 농축하고, 얻어진 농축액을 냉메탄올중에서 재침전시키고, 또 침전물만을 회수하여 진공건조해서 PHA를 2㎎ 얻었다.

또한, 얻어진 PHA는 상법에 따라서 메탄올라이시스를 행한 후, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마즈 QP-5050, EI법)로 분석해서, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 그 결과는, 하기 표 22에 표시되어 있다. 그 결과, 하기 표 22에 표시한 바와 같이, 이 PHA는, 상기 화학식(32)로 표시되는 3HPxV를 모노머유닛으로서 함유하는 PHA로 확인되었다.

실시예 14에서 생산된 PHA의 생산 및 모노머유닛의 조성

균체의 건조중량폴리머의 건조중량폴리머의 건조중량/균체의 건조중량	560mg/ℓ10mg/ℓ1.8%
모노머유닛의 조성(TIC피크면적비)3-하이드록시부티르산3-하이드록시헥산산3-하이드록시옥탄산3-하이드록시데칸산3-하이드록시도데칸산3-하이드록시도데센산3-하이드록시-5-페녹시발레르산	1.8%0.0%0.0%0.0%0.0%0.0%98.2%

(실시예 15)

(1-(4-플루오로페닐)-1-헥사논(FPHxO)의 합성)

4입구의 둥근바닥 플라스크에 테트라하이드로푸란 100㎖를 넣은 후, 4-플루오로벤조일클로라이드 7.92g(0.05몰) 및 트리스(아세틸아세톤)철(III) 0.53g(1.5몰)을 첨가하고, 질소분위기하에 교반하였다. 이 용액에, 실온에서 펜틸마그네슘 브로마이드를 첨가하고 실온에서 10분간 교반하였다. 반응 종료후, 이 용액을 묽은 염산으로 산성화하고, 디에틸에테르로 유기상을 추출하였다. 또, 이 유기상을 포화 탄산수소나트륨용액으로 중화시키고, 포화 염화나트륨용액으로 세정하였다. 해당 유기상을 무수황산마그네슘으로 탈수하고 나서, 회전식 증발기에서 디에틸에테르를 증발시키고, 진공펌프로 건조시켜, 조제의(crude: 즉, 미가공의) FPHxO를 얻었다.

실리카겔컬럼크로마토그래피(전개용매: n-헥산:아세트산에틸=30:1)에 의해 분리한 후 n-헥산으로 재결정화함으로써 정제를 행하여 FPHxO 5.23g을 얻었다.

얻어진 화합물에 대해 하기 조건하에 NMR분석을 행하였다.

<측정장치> FT-NMR: 브루커 DPX 400

공명주파수:¹H = 400MHz

<측정조건> 측정핵종:¹H

사용용매: CDCl₃

기준: 모세관봉입된 TMS/CDCl₃

측정온도: 실온

¹H-NMR스펙트럼차트는 도 7에 표시되어 있고, 그 귀속결과(하기 화학식(33)참조)는 하기 표 23에 표시되어 있다.

화학적 이동(ppm)	적분치	타입	위치
0.911.361.732.927.137.99	342222	mmm4중극mm	ab, cdei, kh, l

또한, 정제된 물질에 대해서, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마즈 QP-5050, EI법)로 분석해서, 동정을 행하였다. GC-MS스펙트럼의 데이터는 도 8에 표시되어 있다. 그 결과, FPHxO의 GC-MS TIC면적비는 87%였다.

(실시예 16)

D-글루코스 0.5% 및 FPHxO 0.05%를 함유하는 M9배지 200㎖에 슈도모나스 치코리이 YN2균주를 접종하고 나서, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 5일후, 균체를 원심분리에 의해 회수하여, 10% 차아염소산나트륨용액에 현탁시키고, 4℃에서 2시간 진탕하여 PHA를 추출하였다. 추출액으로부터의 침전물을 원심분리에 의해 회수하여 물로 세정한 후, 진공건조하여 PHA를 얻었다.

또한, 얻어진 PHA에 대해, 하기 측정조건에서 NMR장치(FT-NMR: 부루커 DPX 400)를 이용해서 분석을 행하였다.

<측정조건> 측정핵종:¹H

사용용매: CDCl₃(기준으로서 모세관봉입된 TMS/CDCl₃를 사용함)

공명주파수:¹H = 400MHz

¹H-NMR스펙트럼은 도 9에 표시되어 있고, 그 귀속결과(하기 화학식(34) 참조)는 하기 표 24에 표시되어 있다.

화학적 이동(ppm)	적분치	타입	위치
2.01-2.132.44-2.702.91-3.075.20-5.326.99-7.137.87-8.01	222122	mmmmmm	dbeci, kh, l

또한, 얻어진 PHA는 상법에 따라서 메탄올라이시스를 행한 후, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마즈 QP-5050, EI법)로 분석해서, PHA모노머유닛의메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 그 결과는, 하기 표 25에 표시되어 있다. 그 결과, 하기 표 25에 표시한 바와 같이, 이 PHA는, 3-하이드록시-5-(4-플루오로벤조일)발레르산(이하, "3HFBzV"라 약칭할 경우도 있음)을 모노머유닛으로서 함유하는 PHA로 확인되었다.

YN2균주에 의한 폴리하이드록시알카노에이트의 생산

폴리머중량(mg/ℓ)	27
모노머유닛의 조성(TIC피크면적비)3-하이드록시부티르산3-하이드록시헥산산3-하이드록시헵탄산3-하이드록시옥탄산3-하이드록시노난산3-하이드록시데칸산3-하이드록시도데칸산3-하이드록시도데센산3-하이드록시테트라데칸산3-하이드록시-5-(4-플루오로벤조일)발레르산	2.7%0.6%0.1%8.1%0.1%11.0%5.1%0.1%1.9%70.4%

또, 겔투과크로마토그래피(GPC; 토소, HLC-8220, 컬럼: 폴리머래보래토리, PL겔 MIXED-C(5㎛), 용매: 클로로포름, 폴리스티렌환산)에 의한 이 PHA의 분자량의 측정결과, Mn=26,000, Mw=142,000이었다.

(실시예 17)

D-글루코스 0.5% 및 FPHxO 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 슈도모나스 치코리이 YN2균주를 접종하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 48시간후, 균체를 원심분리에 의해서 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하고, 진공건조하였다.

이 진공건조펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반해서 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후,해당 여과액을 회전식 증발기에서 농축하고, 얻어진 농축액을 냉메탄올중에서 재침전시키고, 또 침전물만을 회수하여 진공건조해서 PHA를 얻었다.

얻어진 PHA는 상법에 따라서 메탄올라이시스를 행한 후, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마즈 QP-5050, EI법)로 분석해서, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 그 결과를, 하기 표 26에 표시한다.

YN2균주에 의한 폴리하이드록시알카노에이트의 생산

균체의 건조중량(mg/ℓ)폴리머의 건조중량(mg/ℓ)	5007.5
모노머유닛의 조성(TIC피크면적비)3-하이드록시부티르산3-하이드록시헥산산3-하이드록시옥탄산3-하이드록시데칸산3-하이드록시도데칸산3-하이드록시도데센산3-하이드록시테트라데칸산3-하이드록시-5-(4-플루오로벤조일)발레르산	2.0%0.4%7.1%7.2%2.3%2.1%0.3%78.6%

상기 결과로부터, 이 PHA는 3HFBzV를 모노머유닛으로서 함유하는 PHA인 것으로 확인되었다.

(실시예 18)

글루탐산 나트륨 0.5% 및 FPHxO 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 슈도모나스 치코리이 YN2균주를 접종하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 7일후, 균체를 원심분리에 의해서 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하고, 진공건조하였다.

얻어진 PHA는 상법에 따라서 메탄올라이시스를 행한 후, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마즈 QP-5050, EI법)로 분석해서, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 그 결과를 하기 표 27에 표시한다.

YN2균주에 의한 폴리하이드록시알카노에이트의 생산

균체의 건조중량(mg/ℓ)폴리머의 건조중량(mg/ℓ)	490250
모노머유닛의 조성(TIC피크면적비)3-하이드록시부티르산3-하이드록시발레르산3-하이드록시헥산산3-하이드록시옥탄산3-하이드록시데칸산3-하이드록시도데칸산3-하이드록시도데센산3-하이드록시-5-(4-플루오로벤조일)발레르산	56.8%0.6%0.5%7.2%7.1%2.0%1.8%24.0%

(실시예 19)

글루탐산 나트륨 0.5% 및 FPHxO 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 슈도모나스 치코리이 YN2균주를 접종하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 48시간후, 균체를 원심분리에 의해서 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하고, 진공건조하였다.

얻어진 PHA는 상법에 따라서 메탄올라이시스를 행한 후, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마즈 QP-5050, EI법)로 분석해서, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 그 결과를 하기 표 28에 표시한다.

YN2균주에 의한 폴리하이드록시알카노에이트의 생산

균체의 건조중량(mg/ℓ)폴리머의 건조중량(mg/ℓ)	41038
모노머유닛의 조성(TIC피크면적비)3-하이드록시부티르산3-하이드록시발레르산3-하이드록시헥산산3-하이드록시헵탄산3-하이드록시옥탄산3-하이드록시노난산3-하이드록시데칸산3-하이드록시도데칸산3-하이드록시도데센산3-하이드록시테트라데칸산3-하이드록시-5-(4-플루오로벤조일)발레르산	17.4%0.8%0.9%0.1%12.9%0.2%14.0%5.1%3.8%0.4%44.4%

(실시예 20)

폴리펩톤 0.5%(w/v) 및 n-페녹시헵탄 0.1%(v/v)를 함유하는 M9배지 200㎖를 준비하여, 500㎖체적의 진탕플라스크에 넣고, 오토클레이브에서 멸균하였다.

상기 플라스크를 실온으로 복원시키고, 한천판상의 슈도모나스 치코리이 YN2균주를 접종하고 나서, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 120시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하여, 냉메탄올로 한번 세정하고, 동결건조하였다.

이 동결건조펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반해서 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 해당 여과액을 회전식 증발기에서 농축하고, 얻어진 농축액을 냉메탄올중에서 재침전시키고, 또 침전물만을 회수하여 진공건조해서 PHA 4㎎을 얻었다.

또, 겔투과크로마토그래피(GPC; 토소, HLC-8220, 컬럼: 토소 TSK-GEL 수퍼 HM-H, 용매: 클로로포름, 폴리스티렌환산)에 의한 이 PHA의 분자량의 측정결과, Mn=52,000, Mw=122,000이었다.

또한, 얻어진 PHA는 상법에 따라서 메탄올라이시스를 행한 후, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마즈 QP-5050, EI법)로 분석해서, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 그 결과를, 하기 표 29에 표시한다.

그 결과, 하기 표 29에 표시한 바와 같이, 이 PHA는, 3-하이드록시-5-페녹시발레르산 및 3-하이드록시-7-페녹시헵탄산을 모노머유닛으로서 함유하는 PHA로 확인되었다.

실시예 20에서 생산된 PHA의 생산 및 모노머유닛의 조성

균체의 건조중량폴리머의 건조중량폴리머의 건조중량/균체의 건조중량	620mg/ℓ20mg/ℓ3.2%
모노머유닛의 조성(TIC피크면적비)3-하이드록시부티르산3-하이드록시헥산산3-하이드록시옥탄산3-하이드록시데칸산3-하이드록시도데칸산3-하이드록시도데센산3-하이드록시-5-페녹시발레르산3-하이드록시-7-페녹시헵탄산	1.4%0.0%0.1%0.2%0.0%0.0%29.7%68.6%

(실시예 21)

글루코스 0.5%(w/v)를 함유하는 M9배지 200㎖를 준비하여, 500㎖체적의 진탕플라스크에 넣고, 오토클레이브에서 멸균하였다. 해당 플라스크를 실온으로 복원시키고, 여과기에 의해 멸균한 5-(4-비닐페닐)펜탄을 충분히 교반하에 첨가하여 그 농도를 0.1%(v/v)로 조정한 후, 슈도모나스 치코리이 YN2균주를 접종하고 나서, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 120시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하였다.

다음에, 글루코스 0.5%(w/v)를 함유하나 질소원으로서 NH₄Cl을 함유하지 않는 M9배지 200㎖를 준비하여, 500㎖체적의 진탕플라스크에 넣고, 오토클레이브에서 멸균하였다. 해당 플라스크를 실온으로 복원시키고, 여과기에 의해 멸균한 5-(4-비닐페닐)펜탄을 충분히 교반하에 첨가하여 그 농도를 0.1%(v/v)로 조정한 후, 상기 회수한 균체를 상기 배지에 재현탁시키고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 120시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하여, 냉메탄올로 한번 세정하고, 동결건조하였다.

이 동결건조펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 30℃에서 48시간 교반해서 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 해당 여과액을 회전식 증발기에서 농축하고, 얻어진 농축액을 냉메탄올중에서 재침전시키고, 또 침전물만을 회수하여 진공건조해서 PHA 3㎎을 얻었다.

또, 실시예 10과 마찬가지 방법을 이용해서 GPC분석을 행하여 얻어진 이 PHA의 분자량은, Mn=12,000, Mw=21,000이었다. 실시예 10과 마찬가지 방법을 이용해서 얻어진 PHA의¹H-NMR분석을 행한 바, 3-하이드록시-5-(4-비닐페닐)발레르산유닛 97%와 다른 유닛으로서의 3-하이드록시부티르산을 함유하는 PHA인 것으로 확인되었다.

(실시예 22)

폴리펩톤 0.5%(w/v)를 함유하는 M9배지 200㎖를 준비하여, 500㎖체적의 진탕플라스크에 넣고, 오토클레이브에서 멸균하였다. 해당 플라스크를 실온으로 복원시키고, 여과기에 의해 멸균한 5-(4-비닐페닐)펜탄을 충분히 교반하에 첨가하여 그 농도를 0.1%(v/v)로 조정한 후, 슈도모나스 치코리이 YN2균주를 접종하고 나서, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 120시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하였다.

다음에, 피루브산 나트륨 0.5%(w/v)를 함유하나 질소원으로서 NH₄Cl을 함유하지 않는 M9배지 200㎖를 준비하여, 500㎖체적의 진탕플라스크에 넣고, 오토클레이브에서 멸균하였다. 해당 플라스크를 실온으로 복원시키고, 여과기에 의해 멸균한 5-(4-비닐페닐)펜탄을 충분히 교반하에 첨가하여 그 농도를 0.1%(v/v)로 조정한 후, 상기 회수한 균체를 상기 배지에 재현탁시키고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 120시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하여, 냉메탄올로 한번 세정하고, 동결건조하였다.

이 동결건조펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 30℃에서 48시간 교반해서 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 해당 여과액을 회전식 증발기에서 농축하고, 얻어진 농축액을 냉메탄올중에서 재침전시키고, 또 침전물만을 회수하여 진공건조해서 PHA 5㎎을 얻었다.

또, 실시예 10과 마찬가지 방법을 이용해서 GPC분석을 행하여 얻어진 이 PHA의 분자량은, Mn=8,000, Mw=16,000이었다. 실시예 10과 마찬가지 방법을 이용해서 얻어진 PHA의¹H-NMR분석을 행한 바, 3-하이드록시-5-(4-비닐페닐)발레르산유닛 99%와 다른 유닛으로서의 3-하이드록시부티르산을 함유하는 PHA인 것으로 확인되었다.

(실시예 23)

말레산 나트륨 0.5%(w/v) 및 n-페녹시펜탄 0.1%(v/v)를 함유하는 M9배지 200㎖를 준비하여, 500㎖체적의 진탕플라스크에 넣고, 오토클레이브에서 멸균하였다.

이 동결건조펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반해서 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 해당 여과액을 회전식 증발기에서 농축하고, 얻어진 농축액을 냉메탄올중에서 재침전시키고, 또 침전물만을 회수하여 진공건조해서 PHA 26㎎을 얻었다.

또, 겔투과크로마토그래피(GPC; 토소, HLC-8220, 컬럼: 토소 TSK-GEL 수퍼 HM-H, 용매: 클로로포름, 폴리스티렌환산)에 의한 이 PHA의 분자량의 측정결과, Mn=66,000, Mw=142,000이었다.

또한, 얻어진 PHA는 상법에 따라서 메탄올라이시스를 행한 후, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마즈 QP-5050, EI법)로 분석해서, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 그 결과를, 하기 표 30에 표시한다.

그 결과, 하기 표 30에 표시한 바와 같이, 이 PHA는, 3-하이드록시-5-페녹시발레르산을 모노머유닛으로서 함유하는 PHA로 확인되었다.

실시예 23에서 생산된 PHA의 생산 및 모노머유닛의 조성

균체의 건조중량폴리머의 건조중량폴리머의 건조중량/균체의 건조중량	610mg/ℓ130mg/ℓ21.3%
모노머유닛의 조성(피크면적비)3-하이드록시부티르산3-하이드록시발레르산3-하이드록시헥산산3-하이드록시옥탄산3-하이드록시데칸산3-하이드록시도데칸산3-하이드록시도데센산3-하이드록시-5-페녹시발레르산	14.6%0.1%0.2%1.1%0.2%1.0%1.2%81.6%

(실시예 24)

n-노난산 0.1%(w/v) 및 n-페녹시펜탄 0.1%(v/v)를 함유하는 M9배지 200㎖를 준비하여, 500㎖체적의 진탕플라스크에 넣고, 오토클레이브에서 멸균하였다.

이 동결건조펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반해서 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 해당 여과액을 회전식 증발기에서 농축하고, 얻어진 농축액을 냉메탄올중에서 재침전시키고, 또 침전물만을 회수하여 진공건조해서 PHA 13㎎을 얻었다.

또, 겔투과크로마토그래피(GPC; 토소, HLC-8220, 컬럼: 토소 TSK-GEL 수퍼 HM-H, 용매: 클로로포름, 폴리스티렌환산)에 의한 이 PHA의 분자량의 측정결과, Mn=51,000, Mw=130,000이었다.

또한, 얻어진 PHA는 상법에 따라서 메탄올라이시스를 행한 후, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마즈 QP-5050, EI법)로 분석해서, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 그 결과를, 하기 표 31에 표시한다.

그 결과, 하기 표 31에 표시한 바와 같이, 이 PHA는, 3-하이드록시-5-페녹시발레르산을 모노머유닛으로서 함유하는 PHA로 확인되었다.

실시예 24에서 생산된 PHA의 생산 및 모노머유닛의 조성

균체의 건조중량폴리머의 건조중량폴리머의 건조중량/균체의 건조중량	370mg/ℓ65mg/ℓ17.5%
모노머유닛의 조성(피크면적비)3-하이드록시부티르산3-하이드록시발레르산3-하이드록시헥산산3-하이드록시헵탄산3-하이드록시옥탄산3-하이드록시노난산3-하이드록시데칸산3-하이드록시도데칸산3-하이드록시도데센산3-하이드록시-5-페녹시발레르산	0.6%0.0%0.2%12.4%6.1%59.1%0.2%1.0%1.0%19.4%

(실시예 25)

글루코스 0.5%(w/v)를 함유하는 M9배지 200㎖를 준비하여, 500㎖체적의 진탕플라스크에 넣고, 오토클레이브에서 멸균하였다. 해당 플라스크를 실온으로 복원시키고, 여과기에 의해 멸균한 n-비닐벤젠을 충분히 교반하에 첨가하여 그 농도를 0.1%(v/v)로 조정한 후, 슈도모나스 치코리이 YN2균주를 접종하고 나서, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 120시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하여, 세정하고, 동결건조하였다.

이 동결건조펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반해서 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 해당 여과액을 회전식 증발기에서 농축하고, 얻어진 농축액을 냉메탄올중에서 재침전시키고, 또 침전물만을 회수하여 진공건조해서 PHA 77㎎을 얻었다.

또, 실시예 16과 마찬가지 방법을 이용해서 GPR분석을 행하여 얻어진 이 PHA의 분자량은, Mn=51,000, Mw=102,000이었다. 실시예 16과 마찬가지 방법을 이용해서 얻어진 PHA의¹H-NMR분석을 행한 바, 3-하이드록시-5-페닐발레르산유닛 71%와다른 유닛으로서의 포화 혹은 불포화의 탄소수 4 내지 12의 3-하이드록시알칸산을 함유하는 PHA인 것으로 확인되었다.

(실시예 26)

글루코스 0.5%(w/v)를 함유하는 M9배지 200㎖를 준비하여, 500㎖체적의 진탕플라스크에 넣고, 오토클레이브에서 멸균하였다. 해당 플라스크를 실온으로 복원시키고, 여과기에 의해 멸균한 n-아밀벤젠을 충분히 교반하에 첨가하여 그 농도를 0.1%(v/v)로 조정한 후, 슈도모나스 치코리이 YN2균주를 접종하고 나서, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 90시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하였다.

다음에, 글루코스 0.5%(w/v)를 함유하나 질소원으로서 NH₄Cl을 함유하지 않는 M9배지 200㎖를 준비하여, 500㎖체적의 진탕플라스크에 넣고, 오토클레이브에서 멸균하였다. 해당 플라스크를 실온으로 복원시키고, 여과기에 의해 멸균한 n-아밀벤젠을 충분히 교반하에 첨가하여 그 농도를 0.1%(v/v)로 조정한 후, 상기 회수한 균체를 상기 배지에 재현탁시키고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 90시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하여, 냉메탄올로 한번 세정하고, 동결건조하였다.

이 동결건조펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반해서 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 해당 여과액을 회전식 증발기에서 농축하고, 얻어진 농축액을 냉메탄올중에서 재침전시키고, 또 침전물만을 회수하여 진공건조해서 PHA 92㎎을 얻었다.

또, 실시예 16과 마찬가지 방법을 이용해서 GPR분석을 행하여 얻어진 이 PHA의 분자량은, Mn=49,000, Mw=103,000이었다. 실시예 16과 마찬가지 방법을 이용해서 얻어진 PHA의¹H-NMR분석을 행한 바, 3-하이드록시-5-페닐발레르산유닛 66%와 다른 유닛으로서의 포화 혹은 불포화의 탄소수 4 내지 12의 3-하이드록시알칸산을 함유하는 PHA인 것으로 확인되었다.

(실시예 27)

다음에, 글루코스 0.5%(w/v)를 함유하는 M9배지 200㎖를 준비하여, 500㎖체적의 진탕플라스크에 넣고, 오토클레이브에서 멸균하였다. 해당 플라스크를 실온으로 복원시키고, 여과기에 의해 멸균한 n-아밀벤젠을 충분히 교반하에 첨가하여 그 농도를 0.1%(v/v)로 조정한 후, 상기 회수한 균체를 상기 배지에 재현탁시키고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 90시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하여, 냉메탄올로 한번 세정하고, 동결건조하였다.

이 동결건조펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반해서 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 해당 여과액을 회전식 증발기에서 농축하고, 얻어진 농축액을 냉메탄올중에서 재침전시키고, 또 침전물만을 회수하여 진공건조해서 PHA 145㎎을 얻었다.

또, 실시예 16과 마찬가지 방법을 이용해서 GPR분석을 행하여 얻어진 이 PHA의 분자량은, Mn=48,000, Mw=96,000이었다. 실시예 16과 마찬가지 방법을 이용해서 얻어진 PHA의¹H-NMR분석을 행한 바, 3-하이드록시-5-페닐발레르산유닛 72%와 다른 유닛으로서의 포화 혹은 불포화의 탄소수 4 내지 12의 3-하이드록시알칸산을 함유하는 PHA인 것으로 확인되었다.

(실시예 28)

다음에, 질소원으로서 NH₄Cl을 함유하지 않는 M9배지 200㎖를 준비하여, 500㎖체적의 진탕플라스크에 넣고, 오토클레이브에서 멸균하였다. 해당 플라스크를 실온으로 복원시키고, 여과기에 의해 멸균한 n-아밀벤젠을 충분히 교반하에 첨가하여 그 농도를 0.1%(v/v)로 조정한 후, 상기 회수한 균체를 상기 배지에 재현탁시키고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 90시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하여, 냉메탄올로 한번 세정하고, 동결건조하였다.

이 동결건조펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반해서 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 해당 여과액을 회전식 증발기에서 농축하고, 얻어진 농축액을 냉메탄올중에서 재침전시키고, 또 침전물만을 회수하여 진공건조해서 PHA 64㎎을 얻었다.

또, 실시예 16과 마찬가지 방법을 이용해서 GPR분석을 행하여 얻어진 이 PHA의 분자량은, Mn=52,000, Mw=99,000이었다. 실시예 16과 마찬가지 방법을 이용해서 얻어진 PHA의¹H-NMR분석을 행한 바, 3-하이드록시-5-페닐발레르산유닛 73%와 다른 유닛으로서의 포화 혹은 불포화의 탄소수 4 내지 12의 3-하이드록시알칸산을 함유하는 PHA인 것으로 확인되었다.

(실시예 29)

폴리펩톤 0.5%(w/v)를 함유하는 M9배지 200㎖를 준비하여, 500㎖체적의 진탕플라스크에 넣고, 오토클레이브에서 멸균하였다. 해당 플라스크를 실온으로 복원시키고, 여과기에 의해 멸균한 n-아밀벤젠을 충분히 교반하에 첨가하여 그 농도를 0.1%(v/v)로 조정한 후, 슈도모나스 치코리이 YN2균주를 접종하고 나서, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 48시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하였다.

이 동결건조펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반해서 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 해당 여과액을 회전식 증발기에서 농축하고, 얻어진 농축액을 냉메탄올중에서 재침전시키고, 또 침전물만을 회수하여 진공건조해서 PHA 155㎎을 얻었다.

또, 실시예 16과 마찬가지 방법을 이용해서 GPR분석을 행하여 얻어진 이 PHA의 분자량은, Mn=48,000, Mw=101,000이었다. 실시예 16과 마찬가지 방법을 이용해서 얻어진 PHA의¹H-NMR분석을 행한 바, 3-하이드록시-5-페닐발레르산유닛 78%와 다른 유닛으로서의 포화 혹은 불포화의 탄소수 4 내지 12의 3-하이드록시알칸산을 함유하는 PHA인 것으로 확인되었다.

(실시예 30)

이 동결건조펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반해서 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 해당 여과액을 회전식 증발기에서 농축하고, 얻어진 농축액을 냉메탄올중에서 재침전시키고, 또 침전물만을 회수하여 진공건조해서 PHA 110㎎을 얻었다.

또, 실시예 16과 마찬가지 방법을 이용해서 GPR분석을 행하여 얻어진 이 PHA의 분자량은, Mn=46,000, Mw=97,000이었다. 실시예 16과 마찬가지 방법을 이용해서 얻어진 PHA의¹H-NMR분석을 행한 바, 3-하이드록시-5-페닐발레르산유닛 91%와 다른 유닛으로서의 포화 혹은 불포화의 탄소수 4 내지 12의 3-하이드록시알칸산을 함유하는 PHA인 것으로 확인되었다.

(실시예 31)

이 동결건조펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반해서 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 해당 여과액을 회전식 증발기에서 농축하고, 얻어진 농축액을 냉메탄올중에서 재침전시키고, 또 침전물만을 회수하여 진공건조해서 PHA 41㎎을 얻었다.

또, 실시예 16과 마찬가지 방법을 이용해서 GPR분석을 행하여 얻어진 이 PHA의 분자량은, Mn=44,000, Mw=88,000이었다. 실시예 16과 마찬가지 방법을 이용해서 얻어진 PHA의¹H-NMR분석을 행한 바, 3-하이드록시-5-페닐발레르산유닛 95%와 다른 유닛으로서의 포화 혹은 불포화의 탄소수 4 내지 12의 3-하이드록시알칸산을 함유하는 PHA인 것으로 확인되었다.

(실시예 32)

노나네이트 0.1%를 함유하는 M9배지판상의 YN2콜로니를 멸균된 생리식염수에 현탁시켜, 600nm에서의 탁도가 0.1이 되도록 조정하였다. 탄소원이 없는 M9배지판 40개를 준비하고, 해당 판에 상기 현탁액을 인가해서 노난분위기하에 30℃에서 배양하였다. 48시간후, 균체를 회수하여 생리식염수 2㎖에 현탁시켰다.

이 동결건조펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반해서 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 해당 여과액을 회전식 증발기에서 농축하고, 얻어진 농축액을 냉메탄올중에서 재침전시키고, 또 침전물만을 회수하여 진공건조해서 PHA 9㎎을 얻었다.

또, 실시예 16과 마찬가지 방법을 이용해서 얻어진 PHA의¹H-NMR분석을 행한 바, 3-하이드록시-5-페닐발레르산유닛 45%와 다른 유닛으로서의 포화 혹은 불포화의 탄소수 4 내지 12의 3-하이드록시알칸산을 함유하는 PHA인 것으로 확인되었다.

(실시예 33)

이 동결건조펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반해서 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 해당 여과액을 회전식 증발기에서 농축하고, 얻어진 농축액을 냉메탄올중에서 재침전시키고, 또 침전물만을 회수하여 진공건조해서 PHA 83㎎을 얻었다.

또, 실시예 16과 마찬가지 방법을 이용해서 얻어진 PHA의¹H-NMR분석을 행한바, 3-하이드록시-5-페닐발레르산유닛 13%와 다른 유닛으로서의 포화 혹은 불포화의 탄소수 4 내지 12의 3-하이드록시알칸산을 함유하는 PHA인 것으로 확인되었다.

(실시예 34)

글루코스 0.5%(w/v)를 함유하는 M9배지 200㎖를 준비하여, 500㎖체적의 진탕플라스크에 넣고, 오토클레이브에서 멸균하였다. 해당 플라스크를 실온으로 복원시키고, 여과기에 의해 멸균한 n-헥사노페논을 충분히 교반하에 첨가하여 그 농도를 0.1%(v/v)로 조정한 후, 슈도모나스 치코리이 YN2균주를 접종하고 나서, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 90시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하였다.

다음에, 글루코스 0.5%(w/v)를 함유하나 질소원으로서 NH₄Cl을 함유하지 않는 M9배지 200㎖를 준비하여, 500㎖체적의 진탕플라스크에 넣고, 오토클레이브에서 멸균하였다. 해당 플라스크를 실온으로 복원시키고, 여과기에 의해 멸균한 n-헥사노페논을 충분히 교반하에 첨가하여 그 농도를 0.1%(v/v)로 조정한 후, 상기 회수한 균체를 상기 배지에 재현탁시키고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 90시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하여, 냉메탄올로 한번 세정하고, 동결건조하였다.

이 동결건조펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반해서 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 해당 여과액을 회전식 증발기에서 농축하고, 얻어진 농축액을 냉메탄올중에서 재침전시키고, 또 침전물만을 회수하여 진공건조해서 PHA 51㎎을 얻었다.

또, 실시예 16과 마찬가지 방법을 이용해서 GPR분석을 행하여 얻어진 이 PHA의 분자량은, Mn=88,000, Mw=238,000이었다. 실시예 16과 마찬가지 방법을 이용해서 얻어진 PHA의¹H-NMR분석을 행한 바, 3-하이드록시-5-벤조일발레르산유닛 38%와 다른 유닛으로서의 포화 혹은 불포화의 탄소수 4 내지 12의 3-하이드록시알칸산을 함유하는 PHA인 것으로 확인되었다.

(실시예 35)

다음에, 글루코스 0.5%(w/v)를 함유하는 M9배지 200㎖를 준비하여, 500㎖체적의 진탕플라스크에 넣고, 오토클레이브에서 멸균하였다. 해당 플라스크를 실온으로 복원시키고, 여과기에 의해 멸균한 n-헥사노페논을 충분히 교반하에 첨가하여 그 농도를 0.1%(v/v)로 조정한 후, 상기 회수한 균체를 상기 배지에 재현탁시키고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 90시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하여, 냉메탄올로 한번 세정하고, 동결건조하였다.

이 동결건조펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반해서 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 해당 여과액을 회전식 증발기에서 농축하고, 얻어진 농축액을 냉메탄올중에서 재침전시키고, 또 침전물만을 회수하여 진공건조해서 PHA 44㎎을 얻었다.

또, 실시예 16과 마찬가지 방법을 이용해서 GPR분석을 행하여 얻어진 이 PHA의 분자량은, Mn=107,000, Mw=203,000이었다. 실시예 16과 마찬가지 방법을 이용해서 얻어진 PHA의¹H-NMR분석을 행한 바, 3-하이드록시-5-벤조일발레르산유닛 32%와 다른 유닛으로서의 포화 혹은 불포화의 탄소수 4 내지 12의 3-하이드록시알칸산을 함유하는 PHA인 것으로 확인되었다.

(실시예 36)

글루코스 0.5%(w/v)를 함유하는 M9배지 200㎖를 준비하여, 500㎖체적의 진탕플라스크에 넣고, 오토클레이브에서 멸균하였다. 해당 플라스크를 실온으로 복원시키고, 여과기에 의해 멸균한 n-페녹시펜탄을 충분히 교반하에 첨가하여 그 농도를 0.1%(v/v)로 조정한 후, 슈도모나스 치코리이 YN2균주를 접종하고 나서, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 90시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하였다.

다음에, 글루코스 0.5%(w/v)를 함유하나 질소원으로서 NH₄Cl을 함유하지 않는 M9배지 200㎖를 준비하여, 500㎖체적의 진탕플라스크에 넣고, 오토클레이브에서 멸균하였다. 해당 플라스크를 실온으로 복원시키고, 여과기에 의해 멸균한 n-페녹시펜탄을 충분히 교반하에 첨가하여 그 농도를 0.1%(v/v)로 조정한 후, 상기 회수한 균체를 상기 배지에 재현탁시키고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 90시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하여, 냉메탄올로 한번 세정하고, 동결건조하였다.

이 동결건조펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반해서 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 해당 여과액을 회전식 증발기에서 농축하고, 얻어진 농축액을 냉메탄올중에서 재침전시키고, 또 침전물만을 회수하여 진공건조해서 PHA 54㎎을 얻었다.

또, 실시예 16과 마찬가지 방법을 이용해서 GPR분석을 행하여 얻어진 이 PHA의 분자량은, Mn=72,000, Mw=158,000이었다. 실시예 16과 마찬가지 방법을 이용해서 얻어진 PHA의¹H-NMR분석을 행한 바, 3-하이드록시-5-페녹시발레르산유닛 60%와 다른 유닛으로서의 포화 혹은 불포화의 탄소수 4 내지 12의 3-하이드록시알칸산을 함유하는 PHA인 것으로 확인되었다.

(실시예 37)

다음에, 글루코스 0.5%(w/v)를 함유하는 M9배지 200㎖를 준비하여, 500㎖체적의 진탕플라스크에 넣고, 오토클레이브에서 멸균하였다. 해당 플라스크를 실온으로 복원시키고, 여과기에 의해 멸균한 n-페녹시펜탄을 충분히 교반하에 첨가하여 그 농도를 0.1%(v/v)로 조정한 후, 상기 회수한 균체를 상기 배지에 재현탁시키고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 90시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하여, 냉메탄올로 한번 세정하고, 동결건조하였다.

이 동결건조펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반해서 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 해당 여과액을 회전식 증발기에서 농축하고, 얻어진 농축액을 냉메탄올중에서 재침전시키고, 또 침전물만을 회수하여 진공건조해서 PHA 42㎎을 얻었다.

또, 실시예 16과 마찬가지 방법을 이용해서 GPR분석을 행하여 얻어진 이 PHA의 분자량은, Mn=78,000, Mw=156,000이었다. 실시예 16과 마찬가지 방법을 이용해서 얻어진 PHA의¹H-NMR분석을 행한 바, 3-하이드록시-5-페녹시발레르산유닛 60%와 다른 유닛으로서의 포화 혹은 불포화의 탄소수 4 내지 12의 3-하이드록시알칸산을 함유하는 PHA인 것으로 확인되었다.

(실시예 38)

글루코스 0.5%(w/v)를 함유하는 M9배지 200㎖를 준비하여, 500㎖체적의 진탕플라스크에 넣고, 오토클레이브에서 멸균하였다. 해당 플라스크를 실온으로 복원시키고, 여과기에 의해 멸균한 n-아밀벤젠을 충분히 교반하에 첨가하여 그 농도를 0.1%(v/v)로 조정한 후, 슈도모나스 치코리이 YN2균주를 접종하고 나서, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 600nm에서의 탁도가 0.1이 되었을 때, 충분히 교반하에 디시클로프로필케톤을 첨가하여 그 농도를 0.05%(v/v)로 조정하고, 진탕배양을 계속하였다. 90시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 동결건조하였다.

또, 실시예 16과 마찬가지 방법을 이용해서 GPR분석을 행하여 얻어진 이 PHA의 분자량은, Mn=30,000, Mw=63,000이었다. 실시예 16과 마찬가지 방법을 이용해서 얻어진 PHA의¹H-NMR분석을 행한 바, 3-하이드록시-5-페닐발레르산유닛 37%와 다른 유닛으로서의 포화 혹은 불포화의 탄소수 4 내지 12의 3-하이드록시알칸산을 함유하는 PHA인 것으로 확인되었다.

(실시예 39)

폴리펩톤 0.5%(w/v)를 함유하는 M9배지 200㎖를 준비하여, 500㎖체적의 진탕플라스크에 넣고, 오토클레이브에서 멸균하였다. 해당 플라스크를 실온으로 복원시키고, 여과기에 의해 멸균한 n-아밀벤젠을 충분히 교반하에 첨가하여 그 농도를0.1%(v/v)로 조정한 후, 슈도모나스 치코리이 YN2균주를 접종하고 나서, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 600nm에서의 탁도가 0.1이 되었을 때, 충분히 교반하에 디시클로프로필케톤을 첨가하여 그 농도를 0.05%(v/v)로 조정하고, 진탕배양을 계속하였다. 48시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 동결건조하였다.

이 동결건조펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반해서 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 해당 여과액을 회전식 증발기에서 농축하고, 얻어진 농축액을 냉메탄올중에서 재침전시키고, 또 침전물만을 회수하여 진공건조해서 PHA 67㎎을 얻었다.

또, 실시예 16과 마찬가지 방법을 이용해서 GPR분석을 행하여 얻어진 이 PHA의 분자량은, Mn=30,000, Mw=66,000이었다. 실시예 16과 마찬가지 방법을 이용해서 얻어진 PHA의¹H-NMR분석을 행한 바, 3-하이드록시-5-페닐발레르산유닛 79%와 다른 유닛으로서의 3-하이드록시부티르산을 함유하는 PHA인 것으로 확인되었다.

(실시예 40)

글루코스 0.5%(w/v)를 함유하는 M9배지 200㎖를 준비하여, 500㎖체적의 진탕플라스크에 넣고, 오토클레이브에서 멸균하였다. 해당 플라스크를 실온으로 복원시키고, 여과기에 의해 멸균한 n-아밀벤젠을 충분히 교반하에 첨가하여 그 농도를 0.1%(v/v)로 조정한 후, 슈도모나스 치코리이 YN2균주를 접종하고 나서, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 600nm에서의 탁도가 0.1이 되었을 때, 충분히교반하에 디시클로프로필케톤을 첨가하여 그 농도를 0.05%(v/v)로 조정하고, 진탕배양을 계속하였다. 14시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하였다.

이 동결건조펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반해서 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 해당 여과액을 회전식 증발기에서 농축하고, 얻어진 농축액을 냉메탄올중에서 재침전시키고, 또 침전물만을 회수하여 진공건조해서 PHA 12㎎을 얻었다.

또, 실시예 16과 마찬가지 방법을 이용해서 GPR분석을 행하여 얻어진 이 PHA의 분자량은, Mn=50,000, Mw=110,000이었다. 실시예 16과 마찬가지 방법을 이용해서 얻어진 PHA의¹H-NMR분석을 행한 바, 3-하이드록시-5-페닐발레르산유닛 86%와 다른 유닛으로서의 포화 혹은 불포화의 탄소수 4 내지 12의 3-하이드록시알칸산을 함유하는 PHA인 것으로 확인되었다.

(실시예 41)

글루코스 0.5%(w/v)를 함유하는 M9배지 200㎖를 준비하여, 500㎖체적의 진탕플라스크에 넣고, 오토클레이브에서 멸균하였다. 해당 플라스크를 실온으로 복원시키고, 여과기에 의해 멸균한 n-아밀벤젠을 충분히 교반하에 첨가하여 그 농도를 0.1%(v/v)로 조정한 후, 슈도모나스 치코리이 YN2균주를 접종하고 나서, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 600nm에서의 탁도가 0.1이 되었을 때, 충분히 교반하에 디시클로프로필케톤을 첨가하여 그 농도를 0.05%(v/v)로 조정하고, 진탕배양을 계속하였다. 14시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하였다.

이 동결건조펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반해서 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 해당 여과액을 회전식 증발기에서 농축하고, 얻어진 농축액을 냉메탄올중에서 재침전시키고, 또 침전물만을 회수하여 진공건조해서 PHA 87㎎을 얻었다.

또, 실시예 16과 마찬가지 방법을 이용해서 GPR분석을 행하여 얻어진 이 PHA의 분자량은, Mn=53,000, Mw=106,000이었다. 실시예 16과 마찬가지 방법을 이용해서 얻어진 PHA의¹H-NMR분석을 행한 바, 3-하이드록시-5-페닐발레르산유닛 86%와 다른 유닛으로서의 포화 혹은 불포화의 탄소수 4 내지 12의 3-하이드록시알칸산을 함유하는 PHA인 것으로 확인되었다.

(실시예 42)

폴리펩톤 0.5%(w/v)를 함유하는 M9배지 200㎖를 준비하여, 500㎖체적의 진탕플라스크에 넣고, 오토클레이브에서 멸균하였다. 해당 플라스크를 실온으로 복원시키고, 여과기에 의해 멸균한 n-아밀벤젠을 충분히 교반하에 첨가하여 그 농도를 0.1%(v/v)로 조정한 후, 슈도모나스 치코리이 YN2균주를 접종하고 나서, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 600nm에서의 탁도가 0.1이 되었을 때, 충분히 교반하에 디시클로프로필케톤을 첨가하여 그 농도를 0.05%(v/v)로 조정하고, 진탕배양을 계속하였다. 14시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하였다.

이 동결건조펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반해서 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 해당 여과액을 회전식 증발기에서 농축하고, 얻어진 농축액을 냉메탄올중에서 재침전시키고, 또 침전물만을 회수하여 진공건조해서 PHA 150㎎을 얻었다.

또, 실시예 16과 마찬가지 방법을 이용해서 GPR분석을 행하여 얻어진 이 PHA의 분자량은, Mn=66,000, Mw=145,000이었다. 실시예 16과 마찬가지 방법을 이용해서 얻어진 PHA의¹H-NMR분석을 행한 바, 3-하이드록시-5-페닐발레르산유닛 83%와 다른 유닛으로서의 포화 혹은 불포화의 탄소수 4 내지 12의 3-하이드록시알칸산을 함유하는 PHA인 것으로 확인되었다.

(실시예 43)

다음에, 글루코스 0.5%(w/v)를 함유하는 M9배지 200㎖를 준비하여, 500㎖체적의 진탕플라스크에 넣고, 오토클레이브에서 멸균하였다. 해당 플라스크를 실온으로 복원시키고, 여과기에 의해 멸균한 n-아밀벤젠을 충분히 교반하에 첨가하여그 농도를 0.1%(v/v)로 조정한 후, 상기 회수한 균체를 상기 배지에 재현탁시키고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 90시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하여, 냉메탄올로 한번 세정하고, 동결건조하였다.

이 동결건조펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반해서 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 해당 여과액을 회전식 증발기에서 농축하고, 얻어진 농축액을 냉메탄올중에서 재침전시키고, 또 침전물만을 회수하여 진공건조해서 PHA 120㎎을 얻었다.

또, 실시예 16과 마찬가지 방법을 이용해서 GPR분석을 행하여 얻어진 이 PHA의 분자량은, Mn=56,000, Mw=112,000이었다. 실시예 16과 마찬가지 방법을 이용해서 얻어진 PHA의¹H-NMR분석을 행한 바, 3-하이드록시-5-페닐발레르산유닛 91%와 다른 유닛으로서의 포화 혹은 불포화의 탄소수 4 내지 12의 3-하이드록시알칸산을 함유하는 PHA인 것으로 확인되었다.

(실시예 44)

글루코스 0.5%(w/v)를 함유하는 M9배지 200㎖를 준비하여, 500㎖체적의 진탕플라스크에 넣고, 오토클레이브에서 멸균하였다. 해당 플라스크를 실온으로 복원시키고, 슈도모나스 치코리이 YN2균주를 접종하고 나서, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 600nm에서의 탁도가 0.1이 되었을 때, 충분히 교반하에 디시클로프로필케톤을 첨가하여 그 농도를 0.05%(v/v)로 조정하고, 진탕배양을 계속하였다. 14시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하였다.

또, 실시예 16과 마찬가지 방법을 이용해서 GPR분석을 행하여 얻어진 이 PHA의 분자량은, Mn=44,000, Mw=119,000이었다. 실시예 16과 마찬가지 방법을 이용해서 얻어진 PHA의¹H-NMR분석을 행한 바, 3-하이드록시-5-페닐발레르산유닛 87%와 다른 유닛으로서의 포화 혹은 불포화의 탄소수 4 내지 12의 3-하이드록시알칸산을 함유하는 PHA인 것으로 확인되었다.

(실시예 45)

이 동결건조펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반해서 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 해당 여과액을 회전식 증발기에서 농축하고, 얻어진 농축액을 냉메탄올중에서 재침전시키고, 또 침전물만을 회수하여 진공건조해서 PHA 47㎎을 얻었다.

또, 실시예 16과 마찬가지 방법을 이용해서 GPR분석을 행하여 얻어진 이 PHA의 분자량은, Mn=56,000, Mw=118,000이었다. 실시예 16과 마찬가지 방법을 이용해서 얻어진 PHA의¹H-NMR분석을 행한 바, 3-하이드록시-5-페닐발레르산유닛 33%와 다른 유닛으로서의 포화 혹은 불포화의 탄소수 4 내지 12의 3-하이드록시알칸산을 함유하는 PHA인 것으로 확인되었다.

(실시예 46)

폴리펩톤 0.5%(w/v)를 함유하는 M9배지 200㎖를 준비하여, 500㎖체적의 진탕플라스크에 넣고, 오토클레이브에서 멸균하였다. 해당 플라스크를 실온으로 복원시키고, 슈도모나스 치코리이 YN2균주를 접종하고 나서, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 600nm에서의 탁도가 0.1이 되었을 때, 충분히 교반하에 디시클로프로필케톤을 첨가하여 그 농도를 0.05%(v/v)로 조정하고, 진탕배양을 계속하였다. 14시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하였다.

또, 실시예 16과 마찬가지 방법을 이용해서 GPR분석을 행하여 얻어진 이 PHA의 분자량은, Mn=64,000, Mw=134,000이었다. 실시예 16과 마찬가지 방법을 이용해서 얻어진 PHA의¹H-NMR분석을 행한 바, 3-하이드록시-5-페닐발레르산유닛 77%와 다른 유닛으로서의 포화 혹은 불포화의 탄소수 4 내지 12의 3-하이드록시알칸산을 함유하는 PHA인 것으로 확인되었다.

(실시예 47)

이 동결건조펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반해서 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후,해당 여과액을 회전식 증발기에서 농축하고, 얻어진 농축액을 냉메탄올중에서 재침전시키고, 또 침전물만을 회수하여 진공건조해서 PHA 117㎎을 얻었다.

또, 실시예 16과 마찬가지 방법을 이용해서 GPR분석을 행하여 얻어진 이 PHA의 분자량은, Mn=63,000, Mw=126,000이었다. 실시예 16과 마찬가지 방법을 이용해서 얻어진 PHA의¹H-NMR분석을 행한 바, 3-하이드록시-5-페닐발레르산유닛 83%와 다른 유닛으로서의 포화 혹은 불포화의 탄소수 4 내지 12의 3-하이드록시알칸산을 함유하는 PHA인 것으로 확인되었다.

(실시예 48)

다음에, 글루코스 0.5%(w/v)를 함유하나 질소원으로서 NH₄Cl을 함유하지 않는 M9배지 200㎖를 준비하여, 500㎖체적의 진탕플라스크에 넣고, 오토클레이브에서 멸균하였다. 해당 플라스크를 실온으로 복원시키고, 여과기에 의해 멸균한 n-아밀벤젠을 충분히 교반하에 첨가하여 그 농도를 0.1%(v/v)로 조정하고, 또, 충분히교반하에 디시클로프로필케톤을 첨가하여 그 농도를 0.05%(v/v)로 조정한 후, 상기 회수한 균체를 상기 배지에 재현탁시키고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 90시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하여, 냉메탄올로 한번 세정하고, 동결건조하였다.

이 동결건조펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반해서 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 해당 여과액을 회전식 증발기에서 농축하고, 얻어진 농축액을 냉메탄올중에서 재침전시키고, 또 침전물만을 회수하여 진공건조해서 PHA 3㎎을 얻었다.

또, 실시예 16과 마찬가지 방법을 이용해서 GPR분석을 행하여 얻어진 이 PHA의 분자량은, Mn=43,000, Mw=90,000이었다. 실시예 16과 마찬가지 방법을 이용해서 얻어진 PHA의¹H-NMR분석을 행한 바, 3-하이드록시-5-페닐발레르산유닛 88%와 다른 유닛으로서의 포화 혹은 불포화의 탄소수 4 내지 12의 3-하이드록시알칸산을 함유하는 PHA인 것으로 확인되었다.

(실시예 49)

다음에, 글루코스 0.5%(w/v)를 함유하는 M9배지 200㎖를 준비하여, 500㎖체적의 진탕플라스크에 넣고, 오토클레이브에서 멸균하였다. 해당 플라스크를 실온으로 복원시키고, 여과기에 의해 멸균한 n-아밀벤젠을 충분히 교반하에 첨가하여 그 농도를 0.1%(v/v)로 조정하고, 또, 충분히 교반하에 디시클로프로필케톤을 첨가하여 그 농도를 0.05%(v/v)로 조정한 후, 상기 회수한 균체를 상기 배지에 재현탁시키고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 90시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하여, 냉메탄올로 한번 세정하고, 동결건조하였다.

또, 실시예 16과 마찬가지 방법을 이용해서 GPR분석을 행하여 얻어진 이 PHA의 분자량은, Mn=30,000, Mw=66,000이었다. 실시예 16과 마찬가지 방법을 이용해서 얻어진 PHA의¹H-NMR분석을 행한 바, 3-하이드록시-5-페닐발레르산유닛 76%와 다른 유닛으로서의 포화 혹은 불포화의 탄소수 4 내지 12의 3-하이드록시알칸산을 함유하는 PHA인 것으로 확인되었다.

(실시예 50)

다음에, 글루코스 0.5%(w/v)를 함유하나 질소원으로서 NH₄Cl을 함유하지 않는 M9배지 200㎖를 준비하여, 500㎖체적의 진탕플라스크에 넣고, 오토클레이브에서 멸균하였다. 해당 플라스크를 실온으로 복원시키고, 여과기에 의해 멸균한 n-아밀벤젠을 충분히 교반하에 첨가하여 그 농도를 0.1%(v/v)로 조정하고, 또, 충분히 교반하에 디시클로프로필케톤을 첨가하여 그 농도를 0.05%(v/v)로 조정한 후, 상기 회수한 균체를 상기 배지에 재현탁시키고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 90시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하여, 냉메탄올로 한번 세정하고, 동결건조하였다.

이 동결건조펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반해서 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 해당 여과액을 회전식 증발기에서 농축하고, 얻어진 농축액을 냉메탄올중에서 재침전시키고, 또 침전물만을 회수하여 진공건조해서 PHA 5㎎을 얻었다.

또, 실시예 16과 마찬가지 방법을 이용해서 GPR분석을 행하여 얻어진 이 PHA의 분자량은, Mn=40,000, Mw=84,000이었다. 실시예 16과 마찬가지 방법을 이용해서 얻어진 PHA의¹H-NMR분석을 행한 바, 3-하이드록시-5-페닐발레르산유닛 87%와 다른 유닛으로서의 포화 혹은 불포화의 탄소수 4 내지 12의 3-하이드록시알칸산을 함유하는 PHA인 것으로 확인되었다.

(실시예 51)

또, 실시예 16과 마찬가지 방법을 이용해서 GPR분석을 행하여 얻어진 이 PHA의 분자량은, Mn=43,000, Mw=77,000이었다. 실시예 16과 마찬가지 방법을 이용해서 얻어진 PHA의¹H-NMR분석을 행한 바, 3-하이드록시-5-페닐발레르산유닛 30%와 다른 유닛으로서의 포화 혹은 불포화의 탄소수 4 내지 12의 3-하이드록시알칸산을 함유하는 PHA인 것으로 확인되었다.

이상, 본 발명에 의하면, 디바이스재료, 의료용 재료 등으로서 유용한 작용기를 곁사슬에 지닌 신규의 폴리하이드록시알카노에이트와, 목적외의 모노머유닛을 거의 감소시켜, 상기 폴리하이드록시알카노에이트를 고수율로 얻을 수 있는 미생물에 의한 제조방법을 제공하는 것이 가능하다.

<110> CANON KABUSHIKI KAISHA <120> POLYHYDROXYALKANOATE AND MANUFACTURING METHOD THEREOF <150> JP2000-279900 <151> 2000-09-14 <150> JP2000-378827 <151> 2000-12-13 <150> JP2001-165238 <151> 2001-05-31 <150> JP2001-165509 <151> 2001-05-31 <150> JP2001-275063 <151> 2001-09-11 <160> 1 <170> KopatentIn 1.55 <210> 1 <211> 1501 <212> DNA <213> Pseudomonas jessenii P161 strain <400> 1 tgaacgctgg cggcaggcct aacacatgca agtcgagcgg atgacgggag cttgctcctg 60 aattcagcgg cggacgggtg agtaatgcct aggaatctgc ctggtagtgg gggacaacgt 120 ctcgaaaggg acgctaatac cgcatacgtc ctacgggaga aagcagggga ccttcgggcc 180 ttgcgctatc agatgagcct aggtcggatt agctagttgg tgaggtaatg gctcaccaag 240 gcgacgatcc gtaactggtc tgagaggatg atcagtcaca ctggaactga gacacggtcc 300 agactcctac gggaggcagc agtggggaat attggacaat gggcgaaagc ctgatccagc 360 catgccgcgt gtgtgaagaa ggtcttcgga ttgtaaagca ctttaagttg ggaggaaggg 420 cattaaccta atacgttagt gttttgacgt taccgacaga ataagcaccg gctaactctg 480 tgccagcagc cgcggtaata cagagggtgc aagcgttaat cggaattact gggcgtaaag 540 cgcgcgtagg tggtttgtta agttggatgt gaaagccccg ggctcaacct gggaactgca 600 ttcaaaactg acaagctaga gtatggtaga gggtggtgga atttcctgtg tagcggtgaa 660 atgcgtagat ataggaagga acaccagtgg cgaaggcgac cacctggact gatactgaca 720 ctgaggtgcg aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa 780 acgatgtcaa ctagccgttg ggagccttga gctcttagtg gcgcagctaa cgcattaagt 840 tgaccgcctg gggagtacgg ccgcaaggtt aaaactcaaa tgaattgacg ggggcccgca 900 caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc aggccttgac 960 atccaatgaa ctttccagag atggatgggt gccttcggga acattgagac aggtgctgca 1020 tggctgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgtaacga gcgcaaccct 1080 tgtccttagt taccagcacg taatggtggg cactctaagg agactgccgg tgacaaaccg 1140 gaggaaggtg gggatgacgt caagtcatca tggcccttac ggcctgggct acacacgtgc 1200 tacaatggtc ggtacagagg gttgccaagc cgcgaggtgg agctaatccc acaaaaccga 1260 tcgtagtccg gatcgcagtc tgcaactcga ctgcgtgaag tcggaatcgc tagtaatcgc 1320 gaatcagaat gtcgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacaccat 1380 gggagtgggt tgcaccagaa gtagctagtc taaccttcgg gaggacggtt accacggtgt 1440 gattcatgac tggggtgaag tcgtaccaag gtagccgtag gggaacctgc ggctggatca 1500 c 1501

Claims

하기 식[1]:

A_xB_(1-x)[1]

[식중, A는 하기 화학식[2]:

(식중, n은 1 내지 8중 어느 하나의 정수이고; R은 할로겐원자, -CN, -NO₂, -CH₃, -C₂H₅, -C₃H₇, -CF₃, -C₂F₅및 -C₃F₇로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나임)로 표시되는 적어도 1종이상이고; B는 하기 화학식[3]:

(식중, p는 0 내지 10중 어느 하나의 정수임) 또는 하기 화학식[4]:

(식중, q는 3 또는 5의 정수임)로 표시되는 모노머유닛으로부터 선택된 적어도 1종이상이고; x는 0.01 내지 1사이의 수임]로 표시되는 모노머유닛조성을 지닌 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트.
제 1항에 있어서, 하기 화학식[5]:

(식중, R'은 할로겐원자, -CN, -NO₂, -CH₃, -C₂H₅, -C₃H₇, -CF₃, -C₂F₅및 -C₃F₇로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나임)로 표시되는 모노머유닛을 함유해서 이루어진 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트.
제 2항에 있어서, 하기 화학식[6]:

으로 표시되는 모노머유닛을 함유해서 이루어진 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트.
제 1항에 있어서, 수평균분자량이 5,000 내지 500,000인 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트.
하기 식[1]:

A_xB_(1-x)[1]

[식중, A는 하기 화학식[2]:

(식중, n은 1 내지 8중 어느 하나의 정수이고; R은 할로겐원자, -CN, -NO₂, -CH₃, -C₂H₅, -C₃H₇, -CF₃, -C₂F₅및 -C₃F₇로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나임)로 표시되는 적어도 1종이상이고; B는 하기 화학식[3]:

(식중, p는 0 내지 10중 어느 하나의 정수임) 또는 하기 화학식[4]:

(식중, q는 3 또는 5의 정수임)로 표시되는 모노머유닛으로부터 선택된 적어도 1종이상이고; x는 0.01 내지 1사이의 수임]로 표시되는 모노머유닛조성을 지닌 폴리하이드록시알카노에이트를 제조하는 방법에 있어서,

치환된 벤조일알칸산을 함유하는 배지를 준비하는 공정; 및

상기 배지에 상기 치환된 벤조일알칸산을 이용해서 상기 조성물을 지닌 폴리하이드록시알카노에이트를 합성가능한 미생물을 배양하는 공정을 구비한 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
제 5항에 있어서, 상기 치환된 벤조일알칸산은, 하기 화학식[7]:

(식중, n은 1 내지 8의 정수의 어느 하나이고; R은 할로겐원자, -CN, -NO₂, -CH₃, -C₂H₅, -C₃H₇, -CF₃, -C₂F₅및 -C₃F₇로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나임)로 표시되는 치환된 벤조일알칸산이고, 상기 폴리하이드록시알카노에이트는, 하기 화학식[8]:

(식중, m은 n, n-2, n-4 및 n-6으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개 이상으로, 1개 이상의 정수를 나타내고; n은 상기 화학식[7]에 있어서의 n에 대응하는 1 내지 8의 정수의 어느 하나이며; R은, 상기 화학식[7]에 있어서의 R과 동일함)로 표시되는 모노머유닛을 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트인 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
제 6항에 있어서, 상기 방법은, 하기 화학식[9]:

(식중, R은 할로겐원자, -CN, -NO₂, -CH₃, -C₂H₅, -C₃H₇, -CF₃, -C₂F₅및 -C₃F₇로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나임)로 표시되는 치환된 벤조일발레르산을 함유하는 배지중의 치환된 벤조일발레르산을 이용해서, 하기 화학식[5']:

(식중, R은 상기 화학식[9]에 있어서의 R에 대응하는 할로겐원자, -CN, -NO₂, -CH₃, -C₂H₅, -C₃H₇, -CF₃, -C₂F₅및 -C₃F₇로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나임)로 표시되는 모노머유닛을 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트를 생산하는 미생물을 배양하는 공정을 포함하고, 이와 같이 해서 생산된 폴리하이드록시알카노에이트는 상기 화학식[5']로 표시되는 모노머유닛을 함유하는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
제 7항에 있어서, 상기 방법은, 하기 화학식[10]:

으로 표시되는 5-(4-플루오로벤조일)발레르산을 함유하는 배지중의 5-(4-플루오로벤조일)발레르산을 이용해서, 하기 화학식[6]:

으로 표시되는 모노머유닛을 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트를 생산하는 미생물을 배양하는 공정을 포함하고, 이와 같이 해서 생산된 폴리하이드록시알카노에이트는 상기 화학식[6]으로 표시되는 모노머유닛을 함유하는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
제 5항에 있어서, 상기 배지는 당류를 또 함유하는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
제 9항에 있어서, 상기 배양공정은, 상기 치환된 벤조일알칸산과 상기 당류를 함유하는 배지에 상기 미생물을 배양하는 하나의 공정으로 이루어진 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
제 10항에 있어서, 상기 당류가 글루코스인 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
제 9항에 있어서, 상기 배양공정은, 상기 치환된 벤조일알칸산과 상기 당류를 함유하는 배지에 상기 미생물을 배양하는 공정과, 이어서, 상기 치환된 벤조일알칸산과 당류를 함유하는 배지에서 상기 미생물을 배양하는 후속의 배양공정의 적어도 2개의 공정으로 이루어진 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
제 12항에 있어서, 상기 당류가 글루코스인 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
제 12항에 있어서, 상기 후속의 배양공정은 질소원의 부재하에 행하는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
제 9항에 있어서, 상기 당류가 글루코스인 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
제 5항에 있어서, 상기 배지는, TCA사이클에 포함되는 유기산을 또 함유하는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
제 16항에 있어서, 상기 배양공정은, 상기 치환된 벤조일알칸산과 TCA사이클에 포함되는 유기산을 함유하는 배지에서 상기 미생물을 배양하는 하나의 공정으로 이루어진 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
제 17항에 있어서, 상기 TCA사이클에 포함되는 유기산이 말산 또는 그 염인 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
제 16항에 있어서, 상기 배양공정은, 상기 배지에서 상기 미생물을 배양하는 공정과, 이어서, 상기 배지에서 상기 미생물을 배양하는 후속의 배양공정으로 이루어진 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
제 19항에 있어서, 상기 TCA사이클에 포함되는 유기산이 말산 또는 그 염인 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
제 19항에 있어서, 상기 후속의 배양공정은 질소원의 부재하에 행하는 것을특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
제 16항에 있어서, 상기 TCA사이클에 포함되는 유기산이 말산 또는 그 염인 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
제 5항에 있어서, 상기 배지는 효모엑스를 또 함유하는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
제 5항에 있어서, 상기 배지는 폴리펩톤을 또 함유하는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
제 5항에 있어서, 상기 미생물에 의해 생산된 폴리하이드록시알카노에이트를 분리하는 공정을 또 구비한 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
제 5항에 있어서, 상기 미생물이 슈도모나스(Pseudomonas)속에 속하는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
제 26항에 있어서, 상기 미생물이 슈도모나스 치코리이(Pseudomonas cichorii) H45균주(FERM BP-7374), 슈도모나스 치코리이(Pseudomonas cichorii)YN2균주(FERM BP-7375) 및 슈도모나스 젯세니이(Pseudomonas jessenii) P161균주(FERM BP-7376)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 균주인 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
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