JP2003047494A

JP2003047494A - 分子中に芳香環を含む残基を有するアルカンからのポリヒドロキシアルカノエートの製造方法

Info

Publication number: JP2003047494A
Application number: JP2001275063A
Authority: JP
Inventors: Takeshi Imamura; 剛士今村; Takashi Kenmoku; 敬見目; Tsutomu Honma; 務本間; Etsuko Sugawa; 悦子須川; Tetsuya Yano; 哲哉矢野
Original assignee: Canon Inc
Current assignee: Canon Inc
Priority date: 2000-09-14
Filing date: 2001-09-11
Publication date: 2003-02-18

Abstract

(57)【要約】【課題】置換基を側鎖に有するPHAの簡便かつ低コス
トな生産方法の提供。【解決手段】置換芳香族アルカンを出発化合物とし,
対応するPHAを生産する工程を有することを特徴とするP
HAの製造方法。特に該出発化合物を,対応するPHAに変換
する能力とを有する微生物を用いる、前記記載の製造方
法。【化１】（式中、Rは置換芳香環を含む残基を示し、mは0〜９か
ら選択される任意の整数を表す）

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ポリエステルの一
種であるポリヒドロキシアルカノエート（以下、ＰＨＡ
と略す場合もある）を、置換アルカン誘導体を原料とし
て生産するＰＨＡの生産方法に関する。更に詳しくは、
置換アルカン誘導体を原料としてＰＨＡを生産し菌体内
に蓄積する能力を有する微生物を用いたＰＨＡの製造方
法に関する。

【０００２】

【従来の技術】これまで、多くの微生物がポリ−３−ヒ
ドロキシ酪酸（以下、ＰＨＢと略す場合もある）あるい
はその他のＰＨＡを生産し、菌体内に蓄積することが報
告されてきた（「生分解性プラスチックハンドブッ
ク」,生分解性プラスチック研究会編,（株）エヌ・ティ
ー・エス,Ｐ178−197（1995））。これらのポリマー
は、従来のプラスチックと同様に、溶融加工等により各
種製品の生産に利用することができる。更に、生分解性
であるがゆえに、自然界で微生物により完全に分解され
るという利点を有していることから、従来の多くの合成
高分子化合物のように自然環境に残留して汚染を引き起
こすことがない。また、生体適合性にも優れており、医
療用軟質部材料等としての応用も期待されている。

【０００３】このような微生物産生ＰＨＡは、その生産
に用いる微生物の種類や培地組成、培養条件等により、
様々な組成や構造のものとなり得ることが知られてお
り、これまで主に、ＰＨＡの物性の改良という観点か
ら、このような組成や構造の制御に関する研究がなされ
てきた。

【０００４】例えば、アルカリゲネス・ユウトロファス
Ｈ16株（Ａlcaligenes eutropus Ｈ16、ＡＴＣＣＮo．
17699）及びその変異株は、その培養時の炭素源を変化
させることによって、３−ヒドロキシ酪酸（以下、３Ｈ
Ｂと略す場合もある）と３−ヒドロキシ吉草酸（以下３
ＨＶと略す場合もある）との共重合体を様々な組成比で
生産することが報告されている（特表平６−15604号公
報、特表平７−14352号公報、特表平８−19227号公報
等）。

【０００５】また、特許公報第2642937号では、シュー
ドモナス・オレオボランス・ＡＴＣＣ 29347株（Pseudo
ｍonas oleovorans ＡＴＣＣ 29347）に炭素源として非
環状脂肪族炭化水素を与えることにより、炭素数６から
12 までの３−ヒドロキシアルカノエートをモノマーユ
ニットとするＰＨＡを生産することが開示されている。

【０００６】特開平５−74492号では、メチロバクテリ
ウム属（Ｍethylobacteriuｍ sp．）パラコッカス属（P
aracoccus sp．）、アルカリゲネス属（Ａlcaligenes s
p．）、シュードモナス属（Pseudoｍonas sp．）の微生
物を、炭素数３から７の第一アルコールに接触させるこ
とにより、３ＨＢと３ＨＶとの共重合体を生産させる方
法が開示されている。

【０００７】特開平５−93049号公報、及び特開平７−2
65065号公報では、アエロモナス・キャビエ（Ａeroｍon
as caviae）をオレイン酸やオリーブ油を炭素源として
培養することにより、３ＨＢと３−ヒドロキシヘキサン
酸（以下、３ＨＨxと略す場合もある）との２成分共重
合体を生産することが開示されている。

【０００８】特開平９−191893号公報では、コマモナス
・アシドボランス・IＦＯ 13852株（Ｃoｍaｍonas acid
ovorans IＦＯ 13852）が、炭素源としてグルコン酸及
び１,４−ブタンジオールを用いた培養により、３ＨＢ
と４−ヒドロキシ酪酸とをモノマーユニットに持つポリ
エステルを生産することが開示されている。

【０００９】ところで、先に述べたＰＨＡは、いずれも
アルキル基を側鎖とするＰＨＡ、即ち、「usual ＰＨ
Ａ」である。しかし、このような微生物産生ＰＨＡのよ
り広範囲な応用を考慮した場合、アルキル基以外の置換
基（例えば、フェニル基など）を側鎖に導入したＰＨＡ
が極めて有用であることが期待される。他の置換基の例
としては、不飽和炭化水素、エステル基、アリル基、シ
アノ基、ハロゲン化炭化水素、エポキシドなどが挙げら
れる。これらの中でも、特に、芳香環を有するＰＨＡの
研究が盛んになされている。

【００１０】（a）フェニル基もしくはその部分置換体
を含むものＭacroｍolecules,２４，5256−5260（1991）には、５
−フェニル吉草酸を基質として、シュードモナスオレ
オボランス（Pseudoｍonas oleovorans）が３−ヒドロ
キシ−５−フェニル吉草酸をユニットとして含むＰＨＡ
を生産することが報告されている。

【００１１】具体的には、シュードモナス・オレオボラ
ンスが５−フェニル吉草酸（以下、ＰＶＡと略す）とノ
ナン酸とを基質として（モル比２：１、総濃度 10ｍｍo
l／L）、３ＨＶ、３−ヒドロキシヘプタン酸、３−ヒド
ロキシノナン酸、３−ヒドロキシウンデカン酸、３−ヒ
ドロキシ−５−フェニル吉草酸（以下、３ＨＰＶと略
す）をモノマーユニットとして、0．6：16．0：41．1：
1．7：40．6 の量比で含むＰＨＡを、培養液１Lあたり
160ｍg（菌体に対する乾燥重量比 31．6％）生産し、ま
た、ＰＶＡとオクタン酸とを基質として（モル比１：
１、総濃度 10ｍｍol／L）、３ＨＨx、３−ヒドロキシ
オクタン酸、３−ヒドロキシデカン酸、３ＨＰＶをモノ
マーユニットとして、7．3：64．5：3．9：24．3 の量
比で含むＰＨＡを、培養液１Lあたり 200ｍg（菌体に対
する乾燥重量比 39．2％）生産することが報告されてい
る。

【００１２】関連する記述は、上記の他Ｍakroｍol．Ｃ
heｍ．,１９１，1957−1965（1990）、Ｃhirality,３,4
92−494（1991）にもあり、３ＨＰＶユニットが含まれ
ていることに起因すると思われる、ポリマー物性の変化
が認められている。

【００１３】Ｍacroｍolecules,２９，1762−1766（199
6）には、５−（４'−トリル）吉草酸を基質として、シ
ュードモナスオレオボランス（Pseudoｍonas oleovora
ns）が３−ヒドロキシ−５−（４'−トリル）吉草酸を
ユニットとして含むＰＨＡを生産することが報告されて
いる。

【００１４】Ｍacroｍolecules,３２，2889−2895（199
9）には、５−（２',４'−ジニトロフェニル）吉草酸を
基質として、シュードモナスオレオボランス（Pseudo
ｍonas oleovorans）が３−ヒドロキシ−５−（２',４'
−ジニトロフェニル）吉草酸及び３−ヒドロキシ−５−
（４'−ニトロフェニル）吉草酸をユニットとして含む
ＰＨＡを生産することが報告されている。

【００１５】（b）フェノキシ基もしくはその部分置換
体を含むものＭacroｍol．Ｃheｍ．Ｐhys．,１９５，1665−1672（19
94）には、11−フェノキシウンデカン酸を基質として、
シュードモナスオレオボランス（Pseudoｍonas oleovo
rans）が３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸と３−
ヒドロキシ−９−フェノキシノナン酸のＰＨＡコポリマ
ーを生産することが報告されている。

【００１６】また、Ｍacroｍolecules,２９，3432−343
5（1996）には、シュードモナス・オレオボランスを用
いて、６−フェノキシヘキサン酸から３−ヒドロキシ−
４−フェノキシ−n−酪酸および３−ヒドロキシ−６−
フェノキシ−n−ヘキサン酸をユニットとして含むＰＨ
Ａを、８−フェノキシオクタン酸から３−ヒドロキシ−
４−フェノキシ−n−酪酸、３−ヒドロキシ−６−フェ
ノキシ−n−ヘキサン酸および３−ヒドロキシ−８−フ
ェノキシ−n−オクタン酸をユニットとして含むＰＨＡ
を、11−フェノキシウンデカン酸から３−ヒドロキシ−
５−フェノキシ−n−吉草酸および３−ヒドロキシ−７
−フェノキシ−n−ヘプタン酸をユニットとして含むＰ
ＨＡを生産することが報告されている。この報告におけ
るポリマーの収率を抜粋すると以下のとおりである。

【００１７】

【表１】

【００１８】特許公報第 2989175号には、３−ヒドロキ
シ−５−（モノフルオロフェノキシ）ペンタノエート
（３Ｈ５（ＭＦＰ）Ｐ）ユニットあるいは３−ヒドロキ
シ−５−（ジフルオロフェノキシ）ペンタノエート（３
Ｈ５（ＤＦＰ）Ｐ）ユニットからなるホモポリマー、少
なくとも３Ｈ５（ＭＦＰ）Ｐユニットあるいは３Ｈ５
（ＤＦＰ）Ｐユニットを含有するコポリマー；これらの
ポリマーを合成するシュードモナス・プチダ；シュード
モナス属を用いた前記のポリマーの製造法に関する発明
が開示されており、特許第 2989175号公報には、３−ヒ
ドロキシ−５−（モノフルオロフェノキシ）ペンタノエ
ート（３Ｈ５（ＭＦＰ）Ｐ）ユニットあるいは３−ヒド
ロキシ−５−（ジフルオロフェノキシ）ペンタノエート
（３Ｈ５（ＤＦＰ）Ｐ）ユニットからなるホモポリマ
ー、少なくとも３Ｈ５（ＭＦＰ）Ｐユニットあるいは３
Ｈ５（ＤＦＰ）Ｐユニットを含有するコポリマー；これ
らのポリマーを合成するシュードモナス・プチダ；シュ
ードモナス属を用いた前記のポリマーの製造法に関する
発明が開示されている。

【００１９】これらの生産は以下の様な「二段階培養」
で行なわれている。培養時間：一段目、24時間；二段目、96時間各段における基質と得られるポリマーを以下に示す。（１）得られるポリマー：３−ヒドロキシ−５−（モノ
フルオロフェノキシ）ペンタノエートホモポリマー一段目の基質：クエン酸、イーストエキス二段目の基質：モノフルオロフェノキシウンデカン酸（２）得られるポリマー：３−ヒドロキシ−５−（ジフ
ルオロフェノキシ）ペンタノエートホモポリマー一段目の基質：クエン酸、イーストエキス二段目の基質：ジフルオロフェノキシウンデカン酸（３）得られるポリマー：３−ヒドロキシ−５−（モ
ノフルオロフェノキシ）ペンタノエートコポリマー一段目の基質：オクタン酸あるいはノナン酸、イースト
エキス二段目の基質：モノフルオロフェノキシウンデカン酸（４）得られるポリマー：３−ヒドロキシ−５−（ジ
フルオロフェノキシ）ペンタノエートコポリマー一段目の基質：オクタン酸あるいはノナン酸、イースト
エキス二段目の基質：ジフルオロフェノキシウンデカン酸その効果としては、置換基をもつ中鎖脂肪酸を資化し
て、側鎖末端が１から２個のフッ素原子で置換されたフ
ェノキシ基を有するポリマーを合成することができ、融
点が高く良い加工性を保ちながら、立体規則性、撥水性
を与えることができるとしている。

【００２０】この様なフッ素基置換体以外に、シアノ基
やニトロ基の置換体の研究もなされている。

【００２１】Ｃan．J．Ｍicrobiol．,４１，32−43（19
95）及びＰolyｍer International,３９，205−213（1
996）には、シュードモナスオレオボランス（Pseudoｍ
onasoleovorans）ＡＴＣＣ 29347株及びシュードモナス
プチダ（Pseudoｍonas putida）ＫＴ 2442株を用い
て、オクタン酸とp−シアノフェノキシヘキサン酸或い
はp−ニトロフェノキシヘキサン酸を基質として、３−
ヒドロキシ−p−シアノフェノキシヘキサン酸或いは３
−ヒドロキシ−p−ニトロフェノキシヘキサン酸をモノ
マーユニットとして含むＰＨＡの生産が報告されてい
る。

【００２２】これらの報告は側鎖がアルキル基である一
般的なＰＨＡとは異なり、いずれもＰＨＡの側鎖に芳香
環を有しており、それに由来する物性を有するポリマー
を得る上で有益である。

【００２３】（c）シクロヘキシル基をモノマーユニッ
ト中に含むＰＨＡは、通常の脂肪族ヒドロキシアルカン
酸をユニットとして含むＰＨＡとは異なる高分子物性を
示すことが期待されており、シュードモナス・オレオボ
ランスによる生産の例が報告されている（Ｍacroｍolec
ules,30,1611−1615（1997））。

【００２４】この報告によれば、シュードモナス・オレ
オボランスを、ノナン酸とシクロヘキシル酪酸あるいは
シクロヘキシル吉草酸の共存する培地中で培養すると、
シクロヘキシル基を含むユニットと、ノナン酸由来のユ
ニットを含むＰＨＡが得られている（各割合は不明）。

【００２５】その収率等に関しては、シクロヘキシル酪
酸に対して、基質濃度トータル 20ｍｍol／Lの条件で、
シクロヘキシル酪酸とノナン酸の量比を変化させ、表２
に示すような結果を得たと報告されている。

【００２６】

【表２】

【００２７】ＣＤＷ：乾燥菌体重量（ｍg／L）、ＰＤ
Ｗ：乾燥ポリマー重量（ｍg／L）、収率：ＰＤＷ／ＣＤ
Ｗ（％）しかしながら、この例では、培養液当たりのポリマー収
率は十分なものではなく、また、得られたＰＨＡ自体
も、そのモノマーユニット中にはノナン酸由来の脂肪族
ヒドロキシアルカン酸が混在しているものである。

【００２８】また新たなカテゴリーとして、単に物性の
変化に留まらず、側鎖に適当な官能基を有するＰＨＡを
生産し、その官能基を利用して新たな機能を生み出そう
とする研究も行なわれている。

【００２９】例えばＭacroｍolecules,３１，1480−148
6（1996）及び、Journal of Ｐolyｍer Ｓcience：Part
Ａ：Ｐolyｍer Ｃheｍistry,３６，2381−2387（199
8）などでは、側鎖の末端にビニル基を持つユニットを
含むＰＨＡを合成した後、酸化剤によりエポキシ化し、
側鎖末端に反応性の高いエポキシ基を含むＰＨＡを合成
出来たと報告されている。

【００３０】またビニル基以外にも、高い反応性が期待
されるスルフィドを持つユニットを含むＰＨＡの合成例
として、Ｍacroｍolecules,３２，8315−8318（1999）
においては、シュードモナスプチダ（Pseudoｍonas pu
tida）27Ｎ01株が 11−フェニルスルファニル吉草酸を
基質とし、３−ヒドロキシ−５−（フェニルスルファニ
ル）吉草酸及び３−ヒドロキシ−７−（フェニルスルフ
ァニル）ヘプタン酸のＰＨＡコポリマーを生産すること
が報告されている。

【００３１】

【発明が解決しようとする課題】以上のように、微生物
産生ＰＨＡにおいては、その生産に用いる微生物の種類
や培地組成、培養条件等を変えることにより、何通りか
の組成・構造のものが得られているが、それらの試みの
目的は専らプラスチックとしての物性の改良であった。

【００３２】一方、前述のような、置換基を側鎖に導入
した「unusual ＰＨＡ」は、導入した置換基の特性等に
起因する、極めて有用な機能・特性を具備した「機能性
ポリマー」としての展開も期待できる。よって、前記の
ような機能性と生分解性とを兼ね備えた優れたポリマー
と、当該ポリマーを生産し菌体内に蓄積し得る微生物、
並びに、当該ＰＨＡを高純度で効率的に生合成する方法
の開発は極めて有用かつ重要であると考えられた。

【００３３】ところで、様々な置換基を側鎖に導入した
「unusual ＰＨＡ」、即ち、一般式（８）で表されるモ
ノマーユニットを含むＰＨＡを微生物により生産する方
法としては、先に挙げたシュードモナス・オレオボラン
スの報告例などに示される通り、導入しようとする置換
基を有した一般式（９）で表される置換脂肪酸を化学合
成したのち、これを微生物に与えて培養し、生産された
ＰＨＡを抽出する方法が一般的である。

【００３４】

【化８】

【００３５】（式中、Ｒは、芳香環を含む残基などから
なる群から選ばれた少なくとも１つであり、xは0〜９か
ら選択される任意の整数を表す）

【００３６】

【化９】

【００３７】（式中、Ｒは、芳香環を含む残基などから
なる群から選ばれた少なくとも１つであり、xは0〜９か
ら選択される任意の整数を表す）しかしながら、基質である置換脂肪酸を化学合成して微
生物に与えることからなるＰＨＡの一般的な生産方法に
おいては、置換脂肪酸のカルボキシル基が化学反応にお
いて活性基であるため、導入しようとする置換基の種類
や数、位置等によっては、化学合成する上で大きな制約
を与える場合が数多くある。或いは、その活性基である
がゆえに、化学合成における反応段階でカルボキシル基
の保護、脱保護といった煩雑な操作が必要となり、工程
が数段階にも渡る化学反応を要する場合が多い。そのた
め、工業生産レベルでの合成が困難であったり、あるい
は、合成に多大な時間、手間及び費用を要したりするこ
となどがあった。

【００３８】一方、置換脂肪酸と比較して、化学合成の
容易な置換アルカンを原料とする「unusual ＰＨＡ」の
生産が可能となれば、上記した課題を解決することが可
能と推察された。

【００３９】これまで報告されているアルカン誘導体か
らのＰＨＡ生産は、直鎖アルカン、アルケン（二重結合
を含むアルカン）（以上Ａppl．Ｅnviron．Ｍicrobio
l．,５４，2924−2932（1988））、塩素置換アルカン
（Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２３，3705−3707
（1990））フッ素置換アルカン（Ｂiotechnol．Ｌet
t．,１６，501−506（1994））、アセトキシ残基を含む
アルカン（Ｍacroｍolecules,３３，8571−8575（200
0））を出発物質とし、対応するＰＨＡを微生物により
生合成したという例があるに過ぎず、置換基として芳香
環を含む残基を有するアルカンからの対応するＰＨＡの
合成例は報告されていない。

【００４０】

【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らは、
置換脂肪酸と比較して合成、あるいは、入手の容易な原
料を用いた「unusual ＰＨＡ」の生産方法を開発すべ
く、鋭意検討した結果、置換脂肪酸と比較して化学合成
の容易な置換アルカンを原料とする「unusual ＰＨＡ」
の生産が可能であることを見出し、当該方法を用いた新
規なＰＨＡの製造方法を発明するに至った。即ち、本発
明は、下記一般式（１）：

【００４１】

【化１０】

【００４２】（式中、Ｒは置換芳香環を含む残基を示
し、nは0〜９から選択される任意の整数を表す）で示さ
れる置換アルカン群より選ばれた少なくとも一種を出発
化合物とし、下記一般式（２）：

【００４３】

【化１１】

【００４４】（式中、Ｒは置換芳香環を含む残基を示
し、ｍは0〜９から選択される任意の整数を表す）で示
される、３−ヒドロキシ置換アルカノエートユニット群
より選ばれた少なくとも一種を分子中に含むポリヒドロ
キシアルカノエートを生産する工程を有することを特徴
とするポリヒドロキシアルカノエートの製造方法であ
る。

【００４５】更に詳しくは、一般式（１）及び（２）に
おけるＲ、即ち置換芳香環を含む残基が、化学式
（３）：

【００４６】

【化１２】

【００４７】（式中、Ｒ1は芳香環への置換基を示し、
Ｒ1はＨ原子、ＣＮ基、ＮＯ2基、ハロゲン原子、ＣＨ3
基、Ｃ2Ｈ5基、Ｃ3Ｈ7基、ＣＨ2＝ＣＨ基、ＣＦ3基、Ｃ
2Ｆ5基、Ｃ3Ｆ7基から選択された少なくとも一種であ
る。）で示される置換フェニル残基群、化学式（４）：

【００４８】

【化１３】

【００４９】（式中、Ｒ2は芳香環への置換基を示し、
Ｒ2はＨ原子、ＣＮ基、ＮＯ2基、ハロゲン原子、ＣＨ3
基、Ｃ2Ｈ5基、Ｃ3Ｈ7基、ＣＦ3基、Ｃ2Ｆ5基、Ｃ3Ｆ7
基から選択された少なくとも一種である。）で示される
置換フェノキシ残基群、化学式（５）：

【００５０】

【化１４】

【００５１】（式中、Ｒ3は芳香環への置換基を示し、
Ｒ3はＨ原子、ＣＮ基、ＮＯ2基、ハロゲン原子、ＣＨ3
基、Ｃ2Ｈ5基、Ｃ3Ｈ7基、ＣＦ3基、Ｃ2Ｆ5基、Ｃ3Ｆ7
基から選択された少なくとも一種である。）で示される
置換ベンゾイル残基群であることを特徴とするポリヒド
ロキシアルカノエートの製造方法である。

【００５２】本発明の生産工程は、一般式（１）で示さ
れる置換アルカン群より選ばれた少なくとも一種を出発
化合物とし、一般式（２）で示される３−ヒドロキシ置
換アルカノエートユニット群より選ばれた少なくとも一
種を分子中に含むポリヒドロキシアルカノエートを生産
する能力を有する微生物の存在下で行なわれるものであ
る。

【００５３】また、本発明の生産工程には、アルカン酸
化系の効果的な誘導物質であるジシクロプロピルケトン
の存在下で、微生物のアルカン酸化能力を向上せしむ工
程をさらに含んでもよい。

【００５４】

【発明の実施の形態】本発明において出発化合物として
用いられる化合物例の第一としては、化学式（10）で示
される置換フェニルアルカンから選択された少なくとも
１種を挙げることができ、その場合に製造されるポリヒ
ドロキシアルカノエートとしては、化学式（11）で示さ
れる３−ヒドロキシ（置換フェニル）アルカノエートユ
ニットから選択される少なくとも１種を分子中に含むポ
リヒドロキシアルカノエートを挙げることができる。

【００５５】

【化１５】

【００５６】（式中、Ｒ1は芳香環への置換基を示し、
Ｒ1はＨ原子、ＣＮ基、ＮＯ2基、ハロゲン原子、ＣＨ3
基、Ｃ2Ｈ5基、Ｃ3Ｈ7基、ＣＨ2＝ＣＨ基、ＣＦ3基、Ｃ
2Ｆ5基、Ｃ3Ｆ7基から選択された少なくとも一種であ
り、nは0〜９から選択される任意の整数を表す）

【００５７】

【化１６】

【００５８】（式中、Ｒ1は芳香環への置換基を示し、
Ｒ1はＨ原子、ＣＮ基、ＮＯ2基、ハロゲン原子、ＣＨ3
基、Ｃ2Ｈ5基、Ｃ3Ｈ7基、ＣＨ2＝ＣＨ基、ＣＦ3基、Ｃ
2Ｆ5基、Ｃ3Ｆ7基から選択された少なくとも一種であ
り、ｍは0〜９から選択される任意の整数を表す）本発明において出発化合物として用いられる化合物例の
第二としては、化学式（12）で示される置換フェノキシ
アルカンから選択される少なくとも１種を挙げることが
でき、その場合に製造されるポリヒドロキシアルカノエ
ートとしては、化学式（13）で示される３−ヒドロキシ
（置換フェノキシ）アルカノエートユニットから選択さ
れる少なくとも１種を分子中に含むポリヒドロキシアル
カノエートを挙げることができる。

【００５９】

【化１７】

【００６０】（式中、Ｒ2は芳香環への置換基を示し、
Ｒ2はＨ原子、ＣＮ基、ＮＯ2基、ハロゲン原子、ＣＨ3
基、Ｃ2Ｈ5基、Ｃ3Ｈ7基、ＣＦ3基、Ｃ2Ｆ5基、Ｃ3Ｆ7
基から選択された少なくとも一種であり、nは0〜９から
選択される任意の整数を表す）

【００６１】

【化１８】

【００６２】（式中、Ｒ2は芳香環への置換基を示し、
Ｒ2はＨ原子、ＣＮ基、ＮＯ2基、ハロゲン原子、ＣＨ3
基、Ｃ2Ｈ5基、Ｃ3Ｈ7基、ＣＦ3基、Ｃ2Ｆ5基、Ｃ3Ｆ7
基から選択された少なくとも一種であり、ｍは0〜９か
ら選択される任意の整数を表す）本発明において出発化合物として用いられる化合物例の
第三としては、化学式（14）で示される置換ベンゾイル
アルカンから選択される少なくとも１種を挙げることが
できでき、その場合に製造されるポリヒドロキシアルカ
ノエートとしては、化学式（15）で示される３−ヒドロ
キシ（置換ベンゾイル）アルカノエートユニットから選
択される少なくとも１種を分子中に含むポリヒドロキシ
アルカノエートを挙げることができる。

【００６３】

【化１９】

【００６４】（式中、Ｒ3は芳香環への置換基を示し、
Ｒ3はＨ原子、ＣＮ基、ＮＯ2基、ハロゲン原子、ＣＨ3
基、Ｃ2Ｈ5基、Ｃ3Ｈ7基、ＣＦ3基、Ｃ2Ｆ5基、Ｃ3Ｆ7
基から選択された少なくとも一種であり、nは０〜９か
ら選択される任意の整数を表す）

【００６５】

【化２０】

【００６６】（式中、Ｒ3は芳香環への置換基を示し、
Ｒ3はＨ原子、ＣＮ基、ＮＯ2基、ハロゲン原子、ＣＨ3
基、Ｃ2Ｈ5基、Ｃ3Ｈ7基、ＣＦ3基、Ｃ2Ｆ5基、Ｃ3Ｆ7
基から選択された少なくとも一種であり、ｍは０〜９か
ら選択される任意の整数を表す）本発明の方法を更に詳細に述べれば、前記化学式（1
0）、（12）、および（14）で示される化合物いずれか
一つ以上を含む培地中で、微生物を培養する工程を含
む、前記化学式（11）、（13）、および（15）で示され
る３−ヒドロキシアルカン酸ユニットを一種類以上分子
中に含むポリヒドロキシアルカノエートの製造方法であ
る。

【００６７】このように、本発明の製造方法において、
微生物を培養する工程、即ち微生物による該ポリヒドロ
キシアルカノエートの生産工程を含む場合、前記化学式
（10）、（12）、および（14）で示される出発物質の式
中に示すメチレン鎖長「n」と、前記化学式（11）、（1
3）、および（15）で示される、本発明の方法で製造さ
れるポリヒドロキシアルカノエートの分子中に存在する
ユニットの式中示す側鎖メチレン鎖長「ｍ」との関係は
以下の数式（１）で示すことができる。ｍ＝n−２l・・・（１）（式中lは0≦l＜（１／２）nなる任意の整数）例えば、出発物質として化学式（16）で示される、７−
フェノキシヘプタンを用いた場合には、生産されるポリ
ヒドロキシアルカノエートは、化学式（17）で示される
３−ヒドロキシ−７−フェノキシヘプタン酸ユニット及
び化学式（18）で示される３−ヒドロキシ−５−フェノ
キシ吉草酸ユニットを含むものとなる。

【００６８】

【化２１】

【００６９】

【化２２】

【００７０】また、本発明の方法で得られるＰＨＡは、
ポリマー分子中に含まれるユニットとして、下記一般式
（６）：

【００７１】

【化２３】

【００７２】（式中、pは、0〜８から選択される任意の
整数を表し、ポリマー中において、一つ以上の値をとり
得る）で示される３−ヒドロキシ−アルカン酸ユニッ
ト、あるいは、下記一般式（７）：

【００７３】

【化２４】

【００７４】（式中、zは、３および５から選択される
任意の整数を表し、ポリマー中において、一つ以上の値
をとり得る）で示される３−ヒドロキシ−アルカ−５−
エン酸ユニットのうち、少なくとも１種類をポリマー分
子中に含んでもよい。

【００７５】更に、本発明の方法で得られるＰＨＡの数
平均分子量は、5000から1000000程度である。

【００７６】以下に、本発明において利用される微生
物、培養工程、回収工程等について説明する。

【００７７】（微生物）本発明の方法で用いる微生物
は、化学式（３）、（４）、（５）で示されるような、
置換芳香環を含む残基を有する、一般式（１）で示され
る置換アルカンを出発化合物、つまりは基質原料とし、
化学式（３）、（４）、（５）で示されるような、置換
芳香環を含む残基を側鎖に有する、一般式（２）で示さ
れる３−ヒドロキシ置換アルカノエートユニットを分子
中に含むポリヒドロキシアルカノエートを生産可能であ
れば、いかなる微生物をも使用することができる。ま
た、本発明の目的を達成できる範囲内で、必要に応じて
複数の微生物を混合して用いることもできる。

【００７８】本発明の方法で用いる微生物は、少なくと
もアルカンをアルカン酸に変換する能力が必要であり、
更にはアルカン酸からＰＨＡを生産する能力を有する微
生物である。アルカンをアルカン酸に変換する能力は通
常アルカンモノオキシゲナーゼを初発酵素とする一群の
酵素系を有することにより発現される。

【００７９】この様な微生物は、シュードモナス（Pseu
doｍonas）属に属する微生物が知られており、更に詳し
くは、土壌より分離した微生物であり、特願平11−3718
63号に開示されている菌株であるシュードモナスチコ
リアイＹＮ２株（Pseudoｍonas cichorii ＹＮ２）及
び、特開昭 63−226291号公報に開示されている菌株で
あるシュードモナスオレオボランス（Pseudoｍonas ol
eovorans）ＡＴＣＣ 29347 が挙げられる。なお、ＹＮ
２株は寄託番号「ＦＥＲＭＢＰ−7375」として、経済
産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所
（ＮIＢＨ）に寄託されている。

【００８０】前記のＹＮ２株の菌学的性質を列挙すれば
以下の通りである。

【００８１】＜ＹＮ２株の菌学的性質＞（１）形態学的性質細胞の形と大きさ：桿菌、0．8μｍ×1．5〜2．0μｍ細胞の多形性：なし運動性：あり胞子形成：なしグラム染色性：陰性コロニー形状：円形、全縁なめらか、低凸状、表
層なめらか、光沢、半透明（２）生理学的性質カタラーゼ：陽性オキシダーゼ：陽性Ｏ／Ｆ試験：酸化型硝酸塩の還元：陰性インドールの生成：陽性ブドウ糖酸性化：陰性アルギニンジヒドロラーゼ：陰性ウレアーゼ：陰性エスクリン加水分解：陰性ゼラチン加水分解：陰性 β−ガラクトシダーゼ：陰性Ｋing'sＢ寒天での蛍光色素産生：陽性４％ＮaＣlでの生育：陽性（弱い生育）ポリ−β−ヒドロキシ酪酸の蓄積：陰性Ｔｗeen 80 の加水分解：陽性（３）基質資化能ブドウ糖：陽性Ｌ−アラビノース：陽性Ｄ−マンノース：陰性Ｄ−マンニトール：陰性Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン：陰性マルトース：陰性グルコン酸カリウム：陽性 n−カプリン酸：陽性アジピン酸：陰性 dl−リンゴ酸：陽性クエン酸ナトリウム：陽性酢酸フェニル：陽性（培養工程）本発明にかかるポリヒドロキシアルカノエ
ート（ＰＨＡ）の製造方法の培養工程においては、上記
するポリヒドロキシアルカノエート産生能を有する微生
物を利用して、原料の一般式（１）で示される置換アル
カン群より選ばれた少なくとも一種から、対応する前記
一般式（２）で示される３−ヒドロキシ置換アルカノエ
ートユニット群より選ばれた少なくとも一種を分子中に
含むポリヒドロキシアルカノエートを生産させる。

【００８２】この培養工程に利用する微生物の通常の培
養、例えば、保存菌株の作製、ＰＨＡの生産に必要とさ
れる菌数や活性状態を確保するための増殖などには、用
いる微生物の増殖に必要な成分を含有する培地を適宜選
択して用いる。例えば、微生物の生育や生存に悪影響を
及ぼすものでない限り、一般的な天然培地（肉汁培地、
酵母エキスなど）や、栄養源を添加した合成培地など、
いかなる種類の培地をも用いることができる。温度、通
気、攪拌などの培養条件は、用いる微生物に応じて適宜
選択する。

【００８３】一方、培養工程において、前記したような
ＰＨＡ生産微生物を用いて、目的とする一般式（２）で
示される３−ヒドロキシ置換アルカノエートユニット群
より選ばれた少なくとも一種を分子中に含むＰＨＡを製
造する際には、培地として、ＰＨＡ生産用の原料とし
て、このモノマーユニットに対応する、上記一般式
（１）で示される置換アルカン群より選ばれた少なくと
も一種に加えて、微生物の増殖用炭素源とを少なくとも
含んだ無機培地などを用いることができる。原料の一般
式（１）で示される置換アルカン群は、培地あたり 0．
01％〜１％（v／v）の範囲、より好ましくは、0．02％
〜0．2％（v／v）の範囲に初期の含有率を選択すること
が望ましい。

【００８４】また、培養工程において、アルカン酸化系
誘導物質であるジシクロプロピルケトンの存在下で微生
物を培養する工程を、その生産工程に含んでいても良
い。一般に、アルカン酸化系は、その代謝経路の基質で
ある直鎖アルカン、例えばオクタン、ノナン等の直鎖ア
ルカンにより効果的に誘導がかかることが知られてい
る。しかしながら、誘導物質として前記に例示したよう
な直鎖アルカンを用いる場合、生産されてくるＰＨＡ中
の中鎖脂肪族ＰＨＡユニット比率が増加することに留意
する必要がある。これは直鎖アルカンがアルカン酸化系
により直鎖アルカン酸に変換され、β酸化系を経由しＰ
ＨＡのモノマー基質となるためである。

【００８５】本発明のモノマー基質として利用される置
換アルカンについても、アルカン酸化系を誘導すること
が可能であり、前記直鎖アルカン同様にＰＨＡのモノマ
ーユニットとして取り込まれる。ここで、アルカン酸化
系はもともと直鎖アルカンの代謝系として進化してお
り、本発明における置換アルカンにおいては、アルカン
酸化系の誘導が不十分な場合もある。

【００８６】ジシクロプロピルケトンは、アルカン酸化
系において誘導物質として機能するが、その酸化系の基
質とはならない（アルカンモノオキシゲナーゼにより酸
化されない）、所謂、非代謝性誘導物質として知られて
いる（Journal of Bacteriology, 123, 546−556（197
5））。このため、本発明の製造方法において、アルカ
ン酸化系の誘導が不十分、あるいはさらなる活性の向上
が望ましく、また、目的とするＰＨＡにおいて中鎖脂肪
族ＰＨＡユニットの組成比が低いことが望まれるとき
に、ジシクロプロピルケトンをアルカン酸化系の好適な
誘導物質として用いることができる。この場合、ジシク
ロプロピルケトンにより効果的にアルカン酸化系の誘導
がかるとともに、その基質代謝は全て本発明の置換アル
カンの変換に充てられる。その結果、置換アルカン由来
のモノマーユニットが効果的に生産され、ＰＨＡの収率
ならびに置換アルカン由来のモノマーユニット組成比の
向上を達成することが可能である。

【００８７】ジシクロプロピルケトンは、本発明に用い
る置換アルカンとともに培地に添加しても良く、またジ
シクロプロピルケトン単独で培地に添加しても良い。こ
れらの場合、培地中の増殖用基質の種類、置換アルカン
の有無ならびに濃度、1段階培養あるいは多段階培養で
あるか、多段階培養の何段階目であるか、等の条件によ
り、その含有率を適宜選択すれば良いが、通常、培地あ
たり 0．001％〜１％（v／v）の範囲、より好ましく
は、0．01％〜0．1％（v／v）の範囲にその含有率を選
択することが望ましい。

【００８８】原料の一般式（１）で示される置換アルカ
ン群は、一般に疎水性であるため、その水溶性は必ずし
も良好ではないが、上記する微生物は、この化合物を基
質として利用できる特性を有するので、培養当初、その
溶解度を超える部分は、部分的に懸濁された状態であっ
ても、培養を継続する間に微生物が徐々にその細胞内に
取り込む結果、順次培地に溶解するので何ら問題とはな
らない。また効率的な取り込みのために微生物そのもの
が界面活性剤様の物質を分泌し、基質である置換アルカ
ンを取り込み易くする場合も見受けられる。

【００８９】なお、原料の一般式（１）で示される置換
アルカン群は、分散性を高めるため、場合によっては、
１−ヘキサデセンやn−ヘキサデカンのような溶媒に溶
解、あるいは、微細な懸濁物とした形状で培地中に添加
することも可能である。その際には、利用する１−ヘキ
サデセンやn−ヘキサデカンのような溶媒の添加濃度
は、培地に対して、その濃度は３％（v／v）以下にする
ことが必要である。

【００９０】培地には、微生物が増殖に利用する増殖用
基質を別途添加する。この増殖用基質は、酵母エキスや
ポリペプトン、肉エキスといった栄養素を用いることが
可能である。更に、糖類、ＴＣＡ回路中の中間体として
生じる有機酸ならびにＴＣＡ回路から一段階ないしは二
段階の生化学反応を経て生じる有機酸またはその塩、ア
ミノ酸またはその塩、炭素数４〜12 の直鎖アルカン酸
またはその塩などから、用いる菌株に応じて、炭素源と
しての有用性を考慮して、適宜選択することができる。

【００９１】これら種々の増殖用基質のうち、糖類とし
ては、グリセロアルデヒド、エリスロース、アラビノー
ス、キシロース、グルコース、ガラクトース、マンノー
ス、フルクトースといったアルドース、グリセロール、
エリスリトール、キシリトール等のアルジトール、グル
コン酸等のアルドン酸、グルクロン酸、ガラクツロン酸
等のウロン酸、マルトース、スクロース、ラクトースと
いった二糖等から選ばれる１つ以上の化合物が好適に利
用できる。

【００９２】また、有機酸あるいはその塩としては、ピ
ルビン酸、リンゴ酸、乳酸、クエン酸、コハク酸または
それらの塩からなる群から選ばれる１つ以上の化合物が
好適に利用できる。一方、アミノ酸またはその塩として
は、グルタミン酸、アスパラギン酸あるいはそれらの塩
からなる群から選ばれる１つ以上の化合物が好適に利用
できる。

【００９３】一般に、これら種々の増殖用基質の中で
も、ポリペプトンや糖類を用いるのがより好ましく、ま
た、糖類の中では、グルコース、フルクトース、マンノ
ースからなる群から選択される少なくとも一つを用いる
ことがさらに好ましい。これらの増殖用基質は、通常、
培地あたり 0．1％〜５％（ｗ／v）の範囲、より好まし
くは、0．2％〜２％（ｗ／v）の範囲にその含有率を選
択することが望ましい。

【００９４】微生物にＰＨＡを生産・蓄積させる培養工
程における別の方法としては、一旦十分に増殖させた後
に、塩化アンモニウムのような窒素源を制限した培地へ
菌体を移し、目的ユニットの基質となる化合物を加えた
状態でさらに培養すると生産性が向上する場合がある。
例えば、前記の異なる培養条件からなる工程を複数段接
続した多段方式の採用が挙げられる。

【００９５】より具体的には、（工程１−１）として、
一般式（１）で示される置換アルカン群、ならびに炭素
源となるポリペプトンを含む培地中で微生物を培養する
工程を対数増殖後期から定常期の時点まで続け、一旦菌
体を遠心分離等で回収した後、これに続き、（工程１−
２）として、一般式（１）で示される置換アルカン群、
ならびに炭素源となる有機酸またはその塩とを含み、窒
素源を含まない培地中で、前段の工程１−１で培養・増
殖した微生物の菌体をさらに培養する工程を行なう二段
階培養方法、あるいは、（工程１−３）として、一般式
（１）で示される置換アルカン群、ならびに炭素源とな
るグルコースを含む培地中で微生物を培養する工程を対
数増殖後期から定常期の時点まで続け、一旦菌体を遠心
分離等で回収した後、これに続き、（工程１−４）とし
て、一般式（１）で示される置換アルカン群、ならびに
炭素源となるグルコースを含み、窒素源を含まない培地
中で、前段の工程１−３で培養・増殖した微生物の菌体
をさらに培養する工程を行なう二段階培養方法、さらに
は、（工程１−５）として、一般式（１）で示される置
換アルカン群、ならびに炭素源となるポリペプトンを含
む培地中で微生物を培養する工程を対数増殖後期から定
常期の時点まで続け、一旦菌体を遠心分離等で回収した
後、これに続き、（工程１−６）として、一般式（１）
で示される置換アルカン群、ならびに炭素源となる糖類
とを含み、窒素源を含まない培地中で、前段の工程１−
５で培養・増殖した微生物の菌体をさらに培養する工程
を行なう二段階培養方法、等を利用することが一層好ま
しい。

【００９６】この二段階培養方法では、前段において、
原料の上記一般式（１）で示される置換アルカン群か
ら、対応する前記一般式（２）で示される３−ヒドロキ
シ置換アルカノエートユニット群より選ばれた少なくと
も一種を分子中に含むＰＨＡを生産させつつ、菌体の増
殖を予め行ない、後段では、窒素源を含まない培地中
で、既に培養された菌体に、主にＰＨＡの生産を行なわ
せる培養形態とすることで、細胞内に蓄積されるＰＨＡ
量をさらに高くすることができる。

【００９７】また、アルカンモノオキシゲナーゼを初発
酵素とするアルカン酸化経路の効果的な誘導物質である
ジシクロプロピルケトンを、工程１−１あるいは工程１
−２の少なくとも1工程に、また同様に工程１−３ある
いは工程１−４の少なくとも１工程に、さらに同様に工
程１−５あるいは工程１−６の少なくとも１工程に含有
せしむことで、置換アルカン群の対応する置換アルカン
酸への代謝が効果的に行われ、ＰＨＡの収量ならびに目
的ＰＨＡモノマーユニットの構成比を高くすることも可
能である。

【００９８】さらに、工程１−１、工程１−３および工
程１−５においては、置換アルカン群の代わりに、ジシ
クロプロピルケトンを単独で用いることで、アルカン酸
化系の誘導を主目的とした１段階目の培養方法とするこ
とも可能である。

【００９９】このような培養工程における温度は、上記
の菌株が良好に増殖可能な温度であればよく、例えば、
15〜40℃、好ましくは 20〜35℃の範囲、より好ましく
は 20℃〜30℃の範囲に選択するこのが適当である。

【０１００】培養は、液体培養、固体培養など、利用す
る微生物が増殖し、培地中に含有される原料の一般式
（１）で示される置換アルカン群より選ばれた少なくと
も一種から、前記一般式（２）で示される３−ヒドロキ
シ置換アルカノエートユニット群より選ばれた少なくと
も一種を分子中に含むＰＨＡを生産する培養方法なら
ば、いかなる培養方法をも用いることができる。さらに
は、原料、炭素源、さらには酸素の供給が適正に行なわ
れるならば、バッチ培養、フェドバッチ培養、半連続培
養、連続培養などの種類も問わない。例えば、液体バッ
チ培養の形態としては、振とうフラスコによって振とう
させて酸素を供給する方法、ジャーファーメンターによ
る攪拌通気方式の酸素供給方法がある。

【０１０１】上記の培養方法に用いる無機培地として
は、リン源（例えば、リン酸塩など）、窒素源（例え
ば、アンモニウム塩、硝酸塩など）等、微生物の増殖に
必要な成分を含んでいる培地であればいかなるものでも
良く、例えば、ＭＳＢ培地、Ｍ９培地等を挙げることが
できる。

【０１０２】以下に本発明の一方法で用いたＭ９培地の
組成を示す。Ｎa2ＨＰＯ4 6．2g ＫＨ2ＰＯ4 3．0g ＮaＣl 0．5g ＮＨ4Ｃl 1．0 g （培地１リットル中、ＰＨ 7．0）更に、良好な増殖
と、それに伴うＰＨＡの生産のためには、上記の無機塩
培地に、例えば、以下に示す微量成分溶液を 0．3％（v
／v）程度添加して、必須微量元素を補う必要がある。

【０１０３】［微量成分溶液］ニトリロ三酢酸：1．5g ＭgＳＯ4 ：3．0g ＭnＳＯ4 ：0．5g ＮaＣl ：1．0g ＦeＳＯ4 ：0．1g ＣaＣl2 ：0．1g ＣoＣl2 ：0．1g ＺnＳＯ4 ：0．1g ＣuＳＯ4 ：0．1g ＡlＫ（ＳＯ4）2 ：0．1g Ｈ3ＢＯ3 ：0．1g Ｎa2ＭoＯ4 ：0．1g ＮiＣl2 ：0．1g （溶液１リットル中、pＨ 7．0）また、上記の培養方法
においては、バッチ式培養、流動バッチ式培養、半連続
培養、連続培養、リアクター形式培養、固体培養等、通
常の微生物の培養に用いるいかなる方法をも用いること
ができる。

【０１０４】（抽出・精製工程）本発明にかかるＰＨＡ
生産・蓄積微生物細胞からのＰＨＡの取得には、通常行
なわれている方法を適用することができる。例えば、微
生物の培養細胞からのＰＨＡの回収には、通常行なわれ
ているクロロホルム、ジクロロメタン、アセトンなどの
有機溶媒による抽出が最も簡便ではあるが、それ以外に
ジオキサン、テトラヒドロフラン、アセトニトリルが用
いられる場合もある。また、有機溶媒が使用しにくい環
境中においては、ＳＤＳ等の界面活性剤による処理、リ
ゾチーム等の酵素による処理、ＥＤＴＡ、過酸化水素、
次亜塩素酸ナトリウム、アンモニア等の薬剤による処理
によって、或いは超音波破砕法、ホモジナイザー法、圧
力破砕法、ビーズ衝撃法、摩砕法、擂潰法、凍結融解法
のいずれかの方法を用いて微生物細胞を物理的に破砕す
ることによって、ＰＨＡ以外の菌体成分を除去して、Ｐ
ＨＡを回収する方法を用いることもできる。

【０１０５】なお、本発明の微生物の培養、本発明の微
生物によるＰＨＡの生産と菌体内への蓄積、並びに、本
発明における菌体からのＰＨＡの回収は、上記の方法に
限定されるものではない。

【０１０６】

【実施例】以下に実施例を示す。なお、以下における
「％」は特に標記した以外は質量基準である。

【０１０７】［実施例１］ポリペプトン 0．5％（ｗ／
v）及び、n−アミルベンゼン（濃度は 0．025％、0．05
％、0．1％（v／v）の三種類）を含むＭ９培地 200ｍL
を調製し、500ｍL容の振とうフラスコに入れて、オート
クレーブにより滅菌した。それぞれのフラスコを室温に
戻し、寒天プレート上のＹＮ２株を植菌した後、30℃、
125 ストローク／分で 24時間振とう培養を行なった。
培養終了後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノ
ールで一度洗浄して凍結乾燥した。この凍結乾燥ペレッ
トを秤量した後、20ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃
で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径
0．45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロ
ータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノー
ル中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥し
てＰＨＡを得、秤量した。各収率を表３に示す。

【０１０８】アミルベンゼン 0．05％の系において得ら
れたＰＨＡの分子量を、ゲルパーミエーションクロマト
グラフィー（ＧＰＣ；東ソーＨＬＣ−8020、カラム：
ポリマーラボラトリーＰＬgel ＭIＸＥＤ−Ｃ（５μ
ｍ）、溶媒：クロロホルム、ポリスチレン換算）により
測定した。その結果、数平均分子量（Ｍn）は 90000 で
あり、分子量分布は1．9であった。

【０１０９】得られたＰＨＡの組成は以下のようにして
分析した。すなわち、約10ｍgのＰＨＡを25ｍL容ナス型
フラスコに入れ、クロロホルム２ｍLに溶解させ、３％
硫酸を含むメタノール溶液２ｍLを加えて、100℃で還流
しながら3．5時間反応させた。反応終了後、脱イオン水
10ｍLを加えて激しく 10分間振とうした後に、２層に
分離した下層のクロロホルム層を取り出し、硫酸マグネ
シウムで脱水したのち、このクロロホルム層をガスクロ
マトグラフィー−質量分析装置（ＧＣ−ＭＳ,島津ＱＰ
−5050、ＥI法）にかけて、ＰＨＡモノマーユニットの
メチルエステル化物の同定を行なった。結果を表４に示
す。

【０１１０】また、アミルベンゼンを 0．1％加えた系
のＧＣ−ＭＳ分析で得られたピークのマススペクトルを
図１から図４に示す（図１：３−ヒドロキシ酪酸、図
２：３−ヒドロキシオクタン酸、図３：３−ヒドロキシ
デカン酸、図４：３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸
のメチルエステルにそれぞれ対応）。

【０１１１】

【表３】

【０１１２】ＡＭＢ：アミルベンゼン、ＣＤＷ：菌体乾
燥重量、ＰＤＷ：ポリマー乾燥重量、収率：ＰＤＷ／ＣＤＷ× 100

【０１１３】

【表４】

【０１１４】ＡＭＢ：アミルベンゼン、３ＨＢ：３−ヒ
ドロキシ酪酸、３ＨＯ：３−ヒドロキシオクタン酸、３ＨＤ：３−ヒドロキシデカン酸、３ＨＰＶ：３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸［実施例２］グルタミン酸ナトリウム 0．5％（ｗ／v）
及び、n−アミルベンゼン（0．05％、0．1％（v／v）を
含むＭ９培地 200ｍLを調製し、500ｍL容の振とうフラ
スコに入れて、オートクレーブにより滅菌した。

【０１１５】フラスコを室温に戻し、寒天プレート上の
ＹＮ２株を植菌した後、30℃、125ストローク／分で26
時間振とう培養を行なった。

【０１１６】培養終了後、菌体を遠心分離によって回収
し、ＮＨ4Ｃl成分を含まないＭ９培地（グルタミン酸ナ
トリウム及びアミルベンゼンの濃度は同様）に移し替え
て、30℃、125 ストローク／分で 20時間振とう培養を
行なった。

【０１１７】培養終了後、菌体を遠心分離によって回収
し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。

【０１１８】この凍結乾燥ペレットを秤量した後、20ｍ
Lのクロロホルムに懸濁し、60℃で20時間攪拌してＰＨ
Ａを抽出した。抽出液を孔径 0．45μｍのメンブレンフ
ィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで
濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈
殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得、秤量した。
収率を表５に示す。

【０１１９】得られたＰＨＡの組成は実施例１と同様の
方法で分析した。結果を表６に示す。

【０１２０】

【表５】

【０１２１】ＣＤＷ：菌体乾燥重量、ＰＤＷ：ポリマー
乾燥重量、収率：ＰＤＷ／ＣＤＷ×100

【０１２２】

【表６】

【０１２３】３ＨＢ：３−ヒドロキシ酪酸、３ＨＤ：３−ヒドロキシデカン酸、３ＨＰＶ：３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸［実施例３］ポリペプトン 0．5％（ｗ／v）及びn−ヘ
キサノフェノン（濃度は 0．01％、0．025％、0．05
％、0．1％（v／v）の四種類）を含むＭ９培地 200ｍL
を調製し、500ｍL容の振盪フラスコに入れて、オートク
レーブにより滅菌した。

【０１２４】それぞれのフラスコを室温に戻し、シュー
ドモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、30℃、125
ストローク／分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心
分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結
乾燥した。

【０１２５】この凍結乾燥ペレットを20ｍLクロロホル
ムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出し
た。抽出液を孔径 0．45μｍのメンブランフィルターで
濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮
液を冷メタノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収し
て真空乾燥してＰＨＡを得た。それぞれの収率を表７〜
表10（表７：n−ヘキサノフェノン 0．01％の結果、表
８： n−ヘキサノフェノン0．025％の結果、表９：n−
ヘキサノフェノン 0．05％の結果、表10： n−ヘキサノ
フェノン0．1％の結果）に示す。

【０１２６】

【表７】

【０１２７】

【表８】

【０１２８】

【表９】

【０１２９】

【表１０】

【０１３０】得られたＰＨＡの分子量（n−ヘキサノフ
ェノン 0．1％（v／v）のを使用）をゲルパーミエーシ
ョンクロマトグラフィー（ＧＰＣ；東ソーＨＬＣ−822
0、カラム；東ソーＴＳＫ−ＧＥＬＳuperＨＭ−Ｈ、
溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換算）により評価し
た結果、Ｍn＝68000、Ｍｗ＝454000 であった。

【０１３１】更に、得られたＰＨＡは、常法に従ってメ
タノリシスを行なった後、ガスクロマトグラフィー−質
量分析装置（ＧＣ−ＭＳ、島津ＱＰ−5050、ＥI法）で
分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物
の同定を行なった。結果を表７〜表10 に示す。その結
果、表７〜表10 に示す通り、当該ＰＨＡは化学式［1
9］で表される３−ヒドロキシ−５−ベンゾイル吉草酸
（以下、必要に応じ３ＨＢＶと略す）をモノマーユニッ
トとして含むＰＨＡであることが確認された。

【０１３２】

【化２５】

【０１３３】このＰＨＡについて、核磁気共鳴装置を用
いて、下記の測定条件で分析した。＜測定機器＞ＦＴ−ＮＭＲ：Ｂruker ＤＰＸ400 共鳴周波数：1Ｈ＝ 400ＭＨz ＜測定機器＞測定核種：1Ｈ使用溶媒：ＣＤＣl3 reference：キャピラリ封入ＣＤＣl3 測定温度：室温 1Ｈ−ＮＭＲスペクトルチャートを図５、その同定結果
を表11にそれぞれ示す。

【０１３４】

【表１１】

【０１３５】［実施例４］グルタミン酸ナトリウム 0．
5％（ｗ／v）及びn−ヘキサノフェノン 0．1％（v／v）
を含むＭ９培地 200ｍLを調製し、500ｍL容の振盪フラ
スコに入れて、オートクレーブにより滅菌した。

【０１３６】フラスコを室温に戻し、シュードモナス・
チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、30℃、125 ストローク
／分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により
回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。

【０１３７】この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホル
ムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出し
た。抽出液を孔径 0．45μｍのメンブランフィルターで
濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮
液を冷メタノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収し
て真空乾燥してＰＨＡを得た。

【０１３８】得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリ
シスを行なった後、ガスクロマトグラフィー−質量分析
装置（ＧＣ−ＭＳ、島津ＱＰ−5050、ＥI法）で分析
し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同
定を行なった。結果を表12 に示す。その結果、表12 に
示す通り、当該ＰＨＡは化学式［19］で表される３ＨＢ
Ｖをモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが確
認された。

【０１３９】

【表１２】

【０１４０】［実施例５］酵母エキス 0．5％（ｗ／v）
及びn−ヘキサノフェノン 0．1％（v／v）を含むＭ９培
地200ｍLを調製し、500ｍL容の振盪フラスコに入れて、
オートクレーブにより滅菌した。

【０１４１】フラスコを室温に戻し、シュードモナス・
チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、30℃、125 ストローク
／分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離により
回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。

【０１４２】この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホル
ムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出し
た。抽出液を孔径 0．45μｍのメンブランフィルターで
濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮
液を冷メタノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収し
て真空乾燥してＰＨＡを得た。

【０１４３】得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリ
シスを行なった後、ガスクロマトグラフィー−質量分析
装置（ＧＣ−ＭＳ、島津ＱＰ−5050、ＥI法）で分析
し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同
定を行なった。結果を表13 に示す。その結果、表13 に
示す通り、当該ＰＨＡは化学式［19］で表される３ＨＢ
Ｖをモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが確
認された。

【０１４４】

【表１３】

【０１４５】［実施例６］グルタミン酸ナトリウム 0．
5％（ｗ／v）及びn−フェノキシペンタン 0．1％（v／
v）を含むＭ９培地 200ｍLを調製し、500ｍL容の振盪フ
ラスコに入れて、オートクレーブにより滅菌した。

【０１４６】フラスコを室温に戻し、シュードモナス・
チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、30℃、125 ストローク
／分で振盪培養した。120時間後、菌体を遠心分離によ
り回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥し
た。

【０１４７】この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホル
ムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出し
た。抽出液を孔径 0．45μｍのメンブランフィルターで
濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮
液を冷メタノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収し
て真空乾燥してＰＨＡを 23ｍg得た。

【０１４８】このＰＨＡの分子量をゲルパーミエーショ
ンクロマトグラフィー（ＧＰＣ；東ソーＨＬＣ−8220、
カラム；東ソーＴＳＫ−ＧＥＬＳuperＨＭ−Ｈ、溶
媒；クロロホルム、ポリスチレン換算）により評価した
結果、Ｍn＝64000、Ｍｗ＝141000であった。

【０１４９】更に、得られたＰＨＡは、常法に従ってメ
タノリシスを行なった後、ガスクロマトグラフィー−質
量分析装置（ＧＣ−ＭＳ、島津ＱＰ−5050、ＥI法）で
分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物
の同定を行なった。結果を表14 に示す。

【０１５０】

【表１４】

【０１５１】その結果、表14 に示す通り、当該ＰＨＡ
は化学式［20］で表される３−ヒドロキシ−５−フェノ
キシ吉草酸（以下、３ＨＰxＶと略す）をモノマーユニ
ットとして含むＰＨＡであることが確認された。

【０１５２】

【化２６】

【０１５３】［実施例７］ポリペプトン 0．5％（ｗ／
v）及びn−フェノキシペンタン 0．1％（v／v）を含む
Ｍ９培地 200ｍLを調製し、500ｍL容の振盪フラスコに
入れて、オートクレーブにより滅菌した。

【０１５４】フラスコを室温に戻し、シュードモナス・
チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、30℃、125 ストローク
／分で振盪培養した。120時間後、菌体を遠心分離によ
り回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥し
た。

【０１５５】この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホル
ムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出し
た。抽出液を孔径 0．45μｍのメンブランフィルターで
濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮
液を冷メタノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収し
て真空乾燥してＰＨＡを２ｍg得た。

【０１５６】得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリ
シスを行なった後、ガスクロマトグラフィー−質量分析
装置（ＧＣ−ＭＳ、島津ＱＰ−5050、ＥI法）で分析
し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同
定を行なった。結果を表15 に示す。その結果、表13 に
示す通り、当該ＰＨＡは化学式［20］で表される３ＨＰ
xＶをモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが
確認された。

【０１５７】

【表１５】

【０１５８】［実施例８］（１−（４−フルオロフェニル）−１−ヘキサノン（FP
HxO）の合成）四つ口丸底フラスコに 100ｍLのテトラヒ
ドロフランを入れ、４−フルオロベンゾイルクロライド
7．92 g（0．05ｍol）及びトリス（アセチルアセト
ン）鉄（III）0．53g（1．5ｍｍol）を加え、窒素雰囲
気下で攪拌した。この溶液に、室温においてペンチルマ
グネシウムブロマイドを加えて、室温 10分間攪拌し
た。反応終了後、氷浴下において、希塩酸により酸性化
し、ジエチルエーテルにより有機相を抽出した。さらに
飽和炭酸水素ナトリウム水溶液にて中和し、飽和塩化ナ
トリウム水溶液にて、有機相を洗浄した。有機相は、無
水硫酸マグネシウムにて脱水後、ジエチルエーテルをロ
ータリーエバポレーターにより留去し、真空ポンプによ
り乾燥し、粗製のFPHxOを得た。

【０１５９】精製は、シリカゲルカラムクロマトグラフ
ィー（展開溶媒；n−ヘキサン：酢酸エチル＝30：1）に
て単離し、更にn−ヘキサンにより再結晶を行ない、FPH
xO5．23gを得た。

【０１６０】得られた化合物は、以下の条件でＮＭＲ分
析を行なった。＜測定機器＞ＦＴ−ＮＭＲ：Ｂruker ＤＰＸ400 共鳴周波数：1Ｈ＝ 400ＭＨz ＜測定機器＞測定核種：1Ｈ使用溶媒：ＣＤＣl3 reference：キャピラリ封入ＴＭＳ／ＣＤＣl3 測定温度：室温 1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図７に、その帰属結果（化学
式［21］参照）を表16 にそれぞれ示した。

【０１６１】

【表１６】

【０１６２】

【化２７】

【０１６３】また、得られた精製物は、ガスクロマトグ
ラフィー−質量分析装置（ＧＣ−ＭＳ、島津ＱＰ−505
0、ＥI法）で分析し、同定を行なった。そのＧＣ−ＭＳ
スペクトルデータを図８に示す。その結果、FPHxOは、
ＧＣ−ＭＳＴIＣエリア比で87％であった。

【０１６４】［実施例９］Ｄ−グルコース 0．5％、FPH
xO 0．05％を含むＭ９培地 200ｍLにシュードモナス・
チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、30℃、125 ストローク
／分で振盪培養した。５日間後、菌体を遠心分離によっ
て回収し、10％次亜塩素酸ナトリウム溶液に懸濁し、４
℃で２時間振盪してＰＨＡを抽出した。抽出液を遠心分
離して沈殿を回収し、これを水洗したのち、真空乾燥し
てＰＨＡを得た。

【０１６５】得られたＰＨＡについて、核磁気共鳴装置
（ＦＴ−ＮＭＲ：Ｂruker ＤＰＸ400）を用いて、下記
の測定条件で分析した。＜測定条件＞測定核種：1Ｈ使用溶媒：ＣＤＣl3（ＴＭＳ／ＣＤＣl3をキャピラリ封
入でreferenceとして使用）共鳴周波数：1Ｈ＝400ＭＨz 1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図９に、その帰属結果（化学
式［22］参照）を表17 にそれぞれ示した。

【０１６６】

【表１７】

【０１６７】

【化２８】

【０１６８】さらに、得られたＰＨＡは、常法に従って
メタノリシスを行なったのち、ガスクロマトグラフィー
−質量分析装置（ＧＣ−ＭＳ,島津ＱＰ−5050、ＥI法）
で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化
物の同定を行なった。その結果、表18 に示す通り、当
該ＰＨＡは３ＨＦＢzＶをモノマーユニットとして含む
ＰＨＡであることが確認された。

【０１６９】

【表１８】

【０１７０】このＰＨＡの分子量をゲルパーミエーショ
ンクロマトグラフィー（ＧＰＣ；東ソーＨＬＣ−822
0、カラム；ポリマーラボラトリーＰＬgel ＭIＸＥＤ
−Ｃ（５μｍ）、溶媒；クロロホルム、ポリスチレン換
算）により評価した結果、Ｍn＝26,000、Ｍｗ＝142,000
であった。

【０１７１】［実施例１０］Ｄ−グルコース 0．5％、F
PHxO 0．1％を含むＭ９培地 200ｍLにシュードモナス・
チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、30℃、125 ストローク
／分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心分離によっ
て回収し、冷メタノールで一度洗浄して真空乾燥した。

【０１７２】この真空乾燥ペレットを 20ｍLのクロロホ
ルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出し
た。抽出液を孔径 0．45μｍのメンブレンフィルターで
ろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃
縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回
収して真空乾燥してＰＨＡを得た。

【０１７３】このＰＨＡについて、常法に従ってメタノ
リシスを行なったのち、ガスクロマトグラフィー−質量
分析装置（ＧＣ−ＭＳ,島津ＱＰ−5050、ＥI法）で分析
し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同
定を行なった。その結果を表19に示す。

【０１７４】

【表１９】

【０１７５】上記の結果から、当該ＰＨＡは３ＨＦＢz
Ｖをモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが確
認された。

【０１７６】［実施例１１］グルタミン酸ナトリウム
0．5％、FPHxO 0．1％を含むＭ９培地 200ｍLにシュー
ドモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、30℃、125
ストローク／分で振盪培養した。７日間後、菌体を遠心
分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して真空
乾燥した。

【０１７７】この真空乾燥ペレットを 20ｍLのクロロホ
ルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出し
た。抽出液を孔径 0．45μｍのメンブレンフィルターで
ろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃
縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回
収して真空乾燥してＰＨＡを得た。

【０１７８】このＰＨＡについて、常法に従ってメタノ
リシスを行なったのち、ガスクロマトグラフィー−質量
分析装置（ＧＣ−ＭＳ,島津ＱＰ−5050、ＥI法）で分析
し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同
定を行なった。その結果を表20に示す。

【０１７９】

【表２０】

【０１８０】上記の結果から、当該ＰＨＡは３ＨＦＢz
Ｖをモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが確
認された。

【０１８１】［実施例１２］グルタミン酸ナトリウム
0．5％、FPHxO 0．1％を含むＭ９培地 200ｍLにシュー
ドモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、30℃、125
ストローク／分で振盪培養した。48時間後、菌体を遠心
分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して真空
乾燥した。

【０１８２】この真空乾燥ペレットを 20ｍLのクロロホ
ルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出し
た。抽出液を孔径 0．45μｍのメンブレンフィルターで
ろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃
縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回
収して真空乾燥してＰＨＡを得た。

【０１８３】このＰＨＡについて、常法に従ってメタノ
リシスを行なったのち、ガスクロマトグラフィー−質量
分析装置（ＧＣ−ＭＳ,島津ＱＰ−5050、ＥI法）で分析
し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同
定を行なった。その結果を表21に示す。

【０１８４】

【表２１】

【０１８５】上記の結果から、当該ＰＨＡは３ＨＦＢz
Ｖをモノマーユニットとして含むＰＨＡであることが確
認された。

【０１８６】［実施例１３］ポリペプトン 0．5％（ｗ
／v）及びn−フェノキシヘプタン 0．1％（v／v）を含
むＭ９培地 200ｍLを調製し、500ｍL容の振盪フラスコ
に入れて、オートクレーブにより滅菌した。

【０１８７】フラスコを室温に戻し、シュードモナス・
チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、30℃、125 ストローク
／分で振盪培養した。120時間後、菌体を遠心分離によ
り回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥し
た。

【０１８８】この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホル
ムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出し
た。抽出液を孔径 0．45μｍのメンブランフィルターで
濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮
液を冷メタノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収し
て真空乾燥してＰＨＡを４ｍg得た。

【０１８９】このＰＨＡの分子量をゲルパーミエーショ
ンクロマトグラフィー（ＧＰＣ；東ソーＨＬＣ−8220、
カラム；東ソーＴＳＫ−ＧＥＬＳuperＨＭ−Ｈ、溶
媒；クロロホルム、ポリスチレン換算）により評価した
結果、Ｍn＝52000、Ｍｗ＝122000であった。

【０１９０】得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリ
シスを行なった後、ガスクロマトグラフィー−質量分析
装置（ＧＣ−ＭＳ、島津ＱＰ−5050、ＥI法）で分析
し、ＰＨＡモノマーユットのメチルエステル化物の同定
を行なった。結果を表22 に示す。

【０１９１】その結果、表22 に示す通り、当該ＰＨＡ
は３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸及び３−ヒド
ロキシ−７−フェノキシヘプタン酸をモノマーユニット
として含むＰＨＡであることが確認された。

【０１９２】

【表２２】

【０１９３】［実施例１４］グルコース 0．5％（ｗ／
v）を含むＭ９培地 200ｍLを調製し、500ｍL容の振盪フ
ラスコに入れて、オートクレーブにより滅菌した。フラ
スコを室温に戻し、フィルター滅菌した５−（４−ビニ
ルフェニル）ペンタンを濃度 0．1％（v／v）となるよ
うに加えてよく攪拌し、シュードモナス・チコリアイ・
ＹＮ２株を植菌し、30℃、125 ストローク／分で振盪培
養した。120時間後、菌体を遠心分離により回収した。

【０１９４】次いで、グルコース 0．5％（ｗ／v）を含
み、窒素源であるＮＨ4Ｃlを含まないＭ９培地 200ｍL
を調製し、500ｍL容の振盪フラスコに入れて、オートク
レーブにより滅菌した。フラスコを室温に戻し、フィル
ター滅菌した５−（４−ビニルフェニル）ペンタンを
濃度 0．1％（v／v）となるように加えてよく攪拌し、
回収された菌体を培地中に再懸濁して、30℃、125 スト
ローク／分で振盪培養した。120時間後、菌体を遠心分
離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾
燥した。

【０１９５】この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホル
ムに懸濁し、30℃で 48時間攪拌してＰＨＡを抽出し
た。抽出液を孔径 0．45μｍのメンブランフィルターで
濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮
液を冷メタノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収し
て真空乾燥してＰＨＡを３ｍg得た。

【０１９６】得られたＰＨＡの分子量は、実施例３と同
様の方法でＧＰＣ分析を行なうことで求めた。その結
果、Ｍn＝12000、Ｍｗ＝21000 であった。また、得られ
たＰＨＡを実施例３と同様の方法で1Ｈ−ＮＭＲ分析を
行なったところ、３−ヒドロキシ−５−（４−ビニルフ
ェニル）吉草酸ユニットを 97％含み、それ以外のユニ
ットが３−ヒドロキシ酪酸であるＰＨＡであることが確
認された。

【０１９７】［実施例１５］ポリペプトン 0．5％（ｗ
／v）を含むＭ９培地 200ｍLを調製し、500ｍL容の振盪
フラスコに入れて、オートクレーブにより滅菌した。フ
ラスコを室温に戻し、フィルター滅菌した５−（４−ビ
ニルフェニル）ペンタンを濃度 0．1％（v／v）となる
ように加えてよく攪拌し、シュードモナス・チコリアイ
・ＹＮ２株を植菌し、30℃、125 ストローク／分で振盪
培養した。120時間後、菌体を遠心分離により回収し
た。

【０１９８】次いで、ピルビン酸ナトリウム 0．5％
（ｗ／v）を含み、窒素源であるＮＨ4Ｃlを含まないＭ
９培地 200ｍLを調製し、500ｍL容の振盪フラスコに入
れて、オートクレーブにより滅菌した。フラスコを室温
に戻し、フィルター滅菌した５−（４−ビニルフェニ
ル）ペンタンを濃度 0．1％（v／v）となるように加え
てよく攪拌し、回収された菌体を培地中に再懸濁して、
30℃、125 ストローク／分で振盪培養した。120時間
後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一
度洗浄して凍結乾燥した。

【０１９９】この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホル
ムに懸濁し、30℃で 48時間攪拌してＰＨＡを抽出し
た。抽出液を孔径 0．45μｍのメンブランフィルターで
濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮
液を冷メタノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収し
て真空乾燥してＰＨＡを５ｍg得た。

【０２００】得られたＰＨＡの分子量は、実施例３と同
様の方法でＧＰＣ分析を行なうことで求めた。その結
果、Ｍn＝8000、Ｍｗ＝16000 であった。また、得られ
たＰＨＡを実施例３と同様の方法で1Ｈ−ＮＭＲ分析を
行なったところ、３−ヒドロキシ−５−（４−ビニルフ
ェニル）吉草酸ユニットを 99％含み、それ以外のユニ
ットが３−ヒドロキシ酪酸であるＰＨＡであることが確
認された。

【０２０１】［実施例１６］リンゴ酸ナトリウム 0．5
％（ｗ／v）及びn−フェノキシペンタン 0．1％（v／
v）を含むＭ９培地 200ｍLを調製し、500ｍL容の振盪フ
ラスコに入れて、オートクレーブにより滅菌した。

【０２０２】フラスコを室温に戻し、シュードモナス・
チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、30℃、125 ストローク
／分で振盪培養した。120時間後、菌体を遠心分離によ
り回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥し
た。この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホルムに懸濁
し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液
を孔径 0．45μｍのメンブランフィルターで濾過した
後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メ
タノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾
燥してＰＨＡを 26ｍg得た。

【０２０３】このＰＨＡの分子量をゲルパーミエーショ
ンクロマトグラフィー（ＧＰＣ；東ソーＨＬＣ−8220、
カラム；東ソーＴＳＫ−ＧＥＬＳuperＨＭ−Ｈ、溶
媒；クロロホルム、ポリスチレン換算）により評価した
結果、Ｍn＝66000、Ｍｗ＝142000であった。

【０２０４】得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリ
シスを行なった後、ガスクロマトグラフィー−質量分析
装置（ＧＣ−ＭＳ、島津ＱＰ−5050、ＥI法）で分析
し、ＰＨＡモノマーユットのメチルエステル化物の同定
を行なった。結果を表23 に示す。

【０２０５】その結果、表23 に示す通り、当該ＰＨＡ
は３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸をモノマーユ
ニットとして含むＰＨＡであることが確認された。

【０２０６】

【表２３】

【０２０７】［実施例１７］n−ノナン酸 0．1％（v／
v）及びn−フェノキシペンタン 0．1％（v／v）を含む
Ｍ９培地 200ｍLを調製し、500ｍL容の振盪フラスコに
入れて、オートクレーブにより滅菌した。

【０２０８】フラスコを室温に戻し、シュードモナス・
チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、30℃、125 ストローク
／分で振盪培養した。120時間後、菌体を遠心分離によ
り回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥し
た。

【０２０９】この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホル
ムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出し
た。抽出液を孔径 0．45μｍのメンブランフィルターで
濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮
液を冷メタノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収し
て真空乾燥してＰＨＡを 13ｍg得た。

【０２１０】このＰＨＡの分子量をゲルパーミエーショ
ンクロマトグラフィー（ＧＰＣ；東ソーＨＬＣ−8220、
カラム；東ソーＴＳＫ−ＧＥＬＳuperＨＭ−Ｈ、溶
媒；クロロホルム、ポリスチレン換算）により評価した
結果、Ｍn＝51000、Ｍｗ＝130000であった。

【０２１１】得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリ
シスを行なった後、ガスクロマトグラフィー−質量分析
装置（ＧＣ−ＭＳ、島津ＱＰ−5050、ＥI法）で分析
し、ＰＨＡモノマーユットのメチルエステル化物の同定
を行なった。結果を表２４に示す。

【０２１２】その結果、表２４に示す通り、当該ＰＨＡ
は３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸をモノマーユ
ニットとして含むＰＨＡであることが確認された。

【０２１３】

【表２４】

【０２１４】［実施例１８］グルコース 0．5％（ｗ／
v）を含むＭ９培地 200ｍLを調製し、500ｍL容の振盪フ
ラスコに入れて、オートクレーブにより滅菌した。フラ
スコを室温に戻し、フィルター滅菌したｎ−アミルベン
ゼンを濃度 0．1％（v／v）となるように加えてよく攪
拌し、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌
し、30℃、125ストローク／分で振盪培養した。90時間
後、菌体を遠心分離により回収し、一度洗浄して凍結乾
燥した。

【０２１５】この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホル
ムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出し
た。抽出液を孔径 0．45μｍのメンブランフィルターで
濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮
液を冷メタノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収し
て真空乾燥してＰＨＡを77ｍg得た。

【０２１６】得られたＰＨＡの分子量は、実施例３と同
様の方法でＧＰＣ分析を行なうことで求めた。その結
果、Ｍn＝51000、Ｍｗ＝102000 であった。また、得ら
れたＰＨＡを実施例３と同様の方法で1Ｈ−ＮＭＲ分析
を行なったところ、３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草
酸ユニットを 71％含み、それ以外のユニットが炭素数
４から１２までの飽和・不飽和の3-ヒドロキシアルカン
酸であるＰＨＡであることが確認された。

【０２１７】［実施例１９］グルコース 0．5％（ｗ／
v）を含むＭ９培地 200ｍLを調製し、500ｍL容の振盪フ
ラスコに入れて、オートクレーブにより滅菌した。フラ
スコを室温に戻し、フィルター滅菌したｎ−アミルベン
ゼンを濃度 0．1％（v／v）となるように加えてよく攪
拌し、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌
し、30℃、125ストローク／分で振盪培養した。90時間
後、菌体を遠心分離により回収した。

【０２１８】次いで、グルコース0．5％（ｗ／v）を含
み、窒素源であるＮＨ₄Ｃlを含まないＭ９培地 200ｍL
を調製し、500ｍL容の振盪フラスコに入れて、オートク
レーブにより滅菌した。フラスコを室温に戻し、フィル
ター滅菌したｎ−アミルベンゼンを濃度 0．1％（v／
v）となるように加えてよく攪拌し、回収された菌体を
培地中に再懸濁して、30℃、125 ストローク／分で振盪
培養した。90時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷
メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。

【０２１９】この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホル
ムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出し
た。抽出液を孔径 0．45μｍのメンブランフィルターで
濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮
液を冷メタノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収し
て真空乾燥してＰＨＡを92ｍg得た。

【０２２０】得られたＰＨＡの分子量は、実施例３と同
様の方法でＧＰＣ分析を行なうことで求めた。その結
果、Ｍn＝49000、Ｍｗ＝103000 であった。また、得ら
れたＰＨＡを実施例３と同様の方法で1Ｈ−ＮＭＲ分析
を行なったところ、３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草
酸ユニットを66％含み、それ以外のユニットが炭素数4
から12までの飽和・不飽和の3-ヒドロキシアルカン酸で
あるＰＨＡであることが確認された。

【０２２１】［実施例２０］グルコース 0．5％（ｗ／
v）を含むＭ９培地 200ｍLを調製し、500ｍL容の振盪フ
ラスコに入れて、オートクレーブにより滅菌した。フラ
スコを室温に戻し、フィルター滅菌したｎ−アミルベン
ゼンを濃度 0．1％（v／v）となるように加えてよく攪
拌し、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌
し、30℃、125ストローク／分で振盪培養した。90時間
後、菌体を遠心分離により回収した。

【０２２２】次いで、グルコース0．5％（ｗ／v）を含
むＭ９培地 200ｍLを調製し、500ｍL容の振盪フラスコ
に入れて、オートクレーブにより滅菌した。フラスコを
室温に戻し、フィルター滅菌したｎ−アミルベンゼンを
濃度 0．1％（v／v）となるように加えてよく攪拌し、
回収された菌体を培地中に再懸濁して、30℃、125 スト
ローク／分で振盪培養した。90時間後、菌体を遠心分離
により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥
した。

【０２２３】この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホル
ムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出し
た。抽出液を孔径 0．45μｍのメンブランフィルターで
濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮
液を冷メタノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収し
て真空乾燥してＰＨＡを145ｍg得た。

【０２２４】得られたＰＨＡの分子量は、実施例３と同
様の方法でＧＰＣ分析を行なうことで求めた。その結
果、Ｍn＝48000、Ｍｗ＝96000 であった。また、得られ
たＰＨＡを実施例３と同様の方法で1Ｈ−ＮＭＲ分析を
行なったところ、３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸
ユニットを 72％含み、それ以外のユニットが炭素数４
から１２までの飽和・不飽和の3-ヒドロキシアルカン酸
であるＰＨＡであることが確認された。

【０２２５】［実施例２１］グルコース 0．5％（ｗ／
v）を含むＭ９培地 200ｍLを調製し、500ｍL容の振盪フ
ラスコに入れて、オートクレーブにより滅菌した。フラ
スコを室温に戻し、フィルター滅菌したｎ−アミルベン
ゼンを濃度 0．1％（v／v）となるように加えてよく攪
拌し、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌
し、30℃、125ストローク／分で振盪培養した。90時間
後、菌体を遠心分離により回収した。

【０２２６】次いで、窒素源であるＮＨ₄Ｃlを含まない
Ｍ９培地 200ｍLを調製し、500ｍL容の振盪フラスコに
入れて、オートクレーブにより滅菌した。フラスコを室
温に戻し、フィルター滅菌したｎ−アミルベンゼンを濃
度 0．1％（v／v）となるように加えてよく攪拌し、回
収された菌体を培地中に再懸濁して、30℃、125 ストロ
ーク／分で振盪培養した。90時間後、菌体を遠心分離に
より回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥し
た。

【０２２７】この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホル
ムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出し
た。抽出液を孔径 0．45μｍのメンブランフィルターで
濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮
液を冷メタノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収し
て真空乾燥してＰＨＡを64ｍg得た。

【０２２８】得られたＰＨＡの分子量は、実施例３と同
様の方法でＧＰＣ分析を行なうことで求めた。その結
果、Ｍn＝52000、Ｍｗ＝99000 であった。また、得られ
たＰＨＡを実施例３と同様の方法で1Ｈ−ＮＭＲ分析を
行なったところ、３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸
ユニットを 73％含み、それ以外のユニットが炭素数4か
ら12までの飽和・不飽和の3-ヒドロキシアルカン酸であ
るＰＨＡであることが確認された。

【０２２９】［実施例２２］ポリペプトン 0．5％（ｗ
／v）を含むＭ９培地 200ｍLを調製し、500ｍL容の振盪
フラスコに入れて、オートクレーブにより滅菌した。フ
ラスコを室温に戻し、フィルター滅菌したｎ−アミルベ
ンゼンを濃度 0．1％（v／v）となるように加えてよく
攪拌し、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌
し、30℃、125 ストローク／分で振盪培養した。48時間
後、菌体を遠心分離により回収した。

【０２３０】次いで、グルコース0．5％（ｗ／v）を含
み、窒素源であるＮＨ₄Ｃlを含まないＭ９培地 200ｍL
を調製し、500ｍL容の振盪フラスコに入れて、オートク
レーブにより滅菌した。フラスコを室温に戻し、フィル
ター滅菌したｎ−アミルベンゼンを濃度 0．1％（v／
v）となるように加えてよく攪拌し、回収された菌体を
培地中に再懸濁して、30℃、125 ストローク／分で振盪
培養した。90時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷
メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。

【０２３１】この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホル
ムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出し
た。抽出液を孔径 0．45μｍのメンブランフィルターで
濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮
液を冷メタノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収し
て真空乾燥してＰＨＡを155ｍg得た。

【０２３２】得られたＰＨＡの分子量は、実施例３と同
様の方法でＧＰＣ分析を行なうことで求めた。その結
果、Ｍn＝48000、Ｍｗ＝101000 であった。また、得ら
れたＰＨＡを実施例３と同様の方法で1Ｈ−ＮＭＲ分析
を行なったところ、３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草
酸ユニットを 78％含み、それ以外のユニットが炭素数4
から12までの飽和・不飽和の3-ヒドロキシアルカン酸で
あるＰＨＡであることが確認された。

【０２３３】［実施例２３］ポリペプトン 0．5％（ｗ
／v）を含むＭ９培地 200ｍLを調製し、500ｍL容の振盪
フラスコに入れて、オートクレーブにより滅菌した。フ
ラスコを室温に戻し、フィルター滅菌したｎ−アミルベ
ンゼンを濃度 0．1％（v／v）となるように加えてよく
攪拌し、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌
し、30℃、125 ストローク／分で振盪培養した。48時間
後、菌体を遠心分離により回収した。

【０２３４】次いで、グルコース0．5％（ｗ／v）を含
むＭ９培地 200ｍLを調製し、500ｍL容の振盪フラスコ
に入れて、オートクレーブにより滅菌した。フラスコを
室温に戻し、フィルター滅菌したｎ−アミルベンゼンを
濃度 0．1％（v／v）となるように加えてよく攪拌し、
回収された菌体を培地中に再懸濁して、30℃、125 スト
ローク／分で振盪培養した。90時間後、菌体を遠心分離
により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥
した。

【０２３５】この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホル
ムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出し
た。抽出液を孔径 0．45μｍのメンブランフィルターで
濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮
液を冷メタノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収し
て真空乾燥してＰＨＡを110ｍg得た。

【０２３６】得られたＰＨＡの分子量は、実施例３と同
様の方法でＧＰＣ分析を行なうことで求めた。その結
果、Ｍn＝46000、Ｍｗ＝97000 であった。また、得られ
たＰＨＡを実施例３と同様の方法で1Ｈ−ＮＭＲ分析を
行なったところ、３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸
ユニットを 91％含み、それ以外のユニットが炭素数4か
ら12までの飽和・不飽和の3-ヒドロキシアルカン酸であ
るＰＨＡであることが確認された。

【０２３７】［実施例２４］ポリペプトン 0．5％（ｗ
／v）を含むＭ９培地 200ｍLを調製し、500ｍL容の振盪
フラスコに入れて、オートクレーブにより滅菌した。フ
ラスコを室温に戻し、フィルター滅菌したｎ−アミルベ
ンゼンを濃度 0．1％（v／v）となるように加えてよく
攪拌し、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌
し、30℃、125 ストローク／分で振盪培養した。48時間
後、菌体を遠心分離により回収した。

【０２３８】次いで、窒素源であるＮＨ₄Ｃlを含まない
Ｍ９培地 200ｍLを調製し、500ｍL容の振盪フラスコに
入れて、オートクレーブにより滅菌した。フラスコを室
温に戻し、フィルター滅菌したｎ−アミルベンゼンを濃
度 0．1％（v／v）となるように加えてよく攪拌し、回
収された菌体を培地中に再懸濁して、30℃、125 ストロ
ーク／分で振盪培養した。90時間後、菌体を遠心分離に
より回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥し
た。

【０２３９】この凍結乾燥ペレットを20ｍLクロロホル
ムに懸濁し、60℃で20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。
抽出液を孔径 0．45μｍのメンブランフィルターで濾過
した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を
冷メタノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真
空乾燥してＰＨＡを41ｍg得た。

【０２４０】得られたＰＨＡの分子量は、実施例３と同
様の方法でＧＰＣ分析を行なうことで求めた。その結
果、Ｍn＝44000、Ｍｗ＝88000 であった。また、得られ
たＰＨＡを実施例３と同様の方法で1Ｈ−ＮＭＲ分析を
行なったところ、３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸
ユニットを 95％含み、それ以外のユニットが炭素数4か
ら12までの飽和・不飽和の3-ヒドロキシアルカン酸であ
るＰＨＡであることが確認された。

【０２４１】［実施例２５］ノナン酸0.1％(w/v)を含む
Ｍ９寒天培地上のYN2株のコロニーを滅菌した生理食塩
水に懸濁し、600nmでの濁度が1.0となるように調整し
た。予め作製しておいた、炭素源を含まないＭ９寒天倍
地40枚に、上記懸濁液を塗布し,ノナン雰囲気下で、30
℃で静置培養した。48時間後、菌体を回収した後,生理
食塩水2ｍｌに懸濁した。

【０２４２】次いで、グルコース0．5％（ｗ／v）を含
み、窒素源であるＮＨ₄Ｃlを含まないＭ９培地 200ｍL
を調製し、500ｍL容の振盪フラスコに入れて、オートク
レーブにより滅菌した。フラスコを室温に戻し、フィル
ター滅菌したｎ−アミルベンゼンを濃度 0．1％（v／
v）となるように加えてよく攪拌し、回収された菌体を
培地中に再懸濁して、30℃、125 ストローク／分で振盪
培養した。90時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷
メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。

【０２４３】この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホル
ムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出し
た。抽出液を孔径 0．45μｍのメンブランフィルターで
濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮
液を冷メタノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収し
て真空乾燥してＰＨＡを9ｍg得た。

【０２４４】得られたＰＨＡを実施例３と同様の方法で
1Ｈ−ＮＭＲ分析を行なったところ、３−ヒドロキシ−
５−フェニル吉草酸ユニットを 45％含み、それ以外の
ユニットが炭素数4から12までの飽和・不飽和の3-ヒドロ
キシアルカン酸であることが確認された。

【０２４５】［実施例２６］ノナン酸0.1％を含むM9寒
天培地上のYN2株のコロニーを滅菌した生理食塩水に懸
濁し、600nmでの濁度が1.0となるように調製した。予め
作製しておいた、炭素源を含まないM9寒天培地40枚に、
上記懸濁液を塗布し、ノナン雰囲気下で、30℃で静置培
養した。48時間後、菌体を回収した後、生理食塩水2ml
に懸濁した。

【０２４６】次いで、グルコース0．5％（ｗ／v）を含
むＭ９培地 200ｍLを調製し、500ｍL容の振盪フラスコ
に入れて、オートクレーブにより滅菌した。フラスコを
室温に戻し、フィルター滅菌したｎ−アミルベンゼンを
濃度 0．1％（v／v）となるように加えてよく攪拌し、
回収された菌体を培地中に再懸濁して、30℃、125 スト
ローク／分で振盪培養した。90時間後、菌体を遠心分離
により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥
した。

【０２４７】この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホル
ムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出し
た。抽出液を孔径 0．45μｍのメンブランフィルターで
濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮
液を冷メタノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収し
て真空乾燥してＰＨＡを83ｍg得た。

【０２４８】得られたＰＨＡを実施例３と同様の方法で
1Ｈ−ＮＭＲ分析を行なったところ、３−ヒドロキシ−
５−フェニル吉草酸ユニットを 13％含み、それ以外の
ユニットが炭素数4から12までの飽和・不飽和の3-ヒド
ロキシアルカン酸であることが確認された。

【０２４９】［実施例２７］グルコース 0．5％（ｗ／
v）を含むＭ９培地 200ｍLを調製し、500ｍL容の振盪フ
ラスコに入れて、オートクレーブにより滅菌した。フラ
スコを室温に戻し、フィルター滅菌したｎ−ヘキサノフ
ェノンを濃度 0．1％（v／v）となるように加えてよく
攪拌し、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌
し、30℃、125 ストローク／分で振盪培養した。90時間
後、菌体を遠心分離により回収した。

【０２５０】次いで、グルコース0．5％（ｗ／v）を含
み、窒素源であるＮＨ₄Ｃlを含まないＭ９培地 200ｍL
を調製し、500ｍL容の振盪フラスコに入れて、オートク
レーブにより滅菌した。フラスコを室温に戻し、フィル
ター滅菌したｎ−ヘキサノフェノンを濃度 0．1％（v／
v）となるように加えてよく攪拌し、回収された菌体を
培地中に再懸濁して、30℃、125 ストローク／分で振盪
培養した。９０時間後、菌体を遠心分離により回収し、
冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。

【０２５１】この凍結乾燥ペレットを20ｍLクロロホル
ムに懸濁し、６０℃で20時間攪拌してＰＨＡを抽出し
た。抽出液を孔径 0．45μｍのメンブランフィルターで
濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮
液を冷メタノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収し
て真空乾燥してＰＨＡを51ｍg得た。

【０２５２】得られたＰＨＡの分子量は、実施例３と同
様の方法でＧＰＣ分析を行なうことで求めた。その結
果、Ｍn＝88000、Ｍｗ＝238000であった。また、得られ
たＰＨＡを実施例３と同様の方法で1Ｈ−ＮＭＲ分析を
行なったところ、３−ヒドロキシ−５−ベンゾイル吉草
酸ユニットを 38％含み、それ以外のユニットが炭素数4
から12までの飽和・不飽和の3-ヒドロキシアルカン酸で
あるＰＨＡであることが確認された。

【０２５３】［実施例２８］グルコース 0．5％（ｗ／
v）を含むＭ９培地 200ｍLを調製し、500ｍL容の振盪フ
ラスコに入れて、オートクレーブにより滅菌した。フラ
スコを室温に戻し、フィルター滅菌したｎ−ヘキサノフ
ェノンを濃度 0．1％（v／v）となるように加えてよく
攪拌し、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌
し、30℃、125 ストローク／分で振盪培養した。90時間
後、菌体を遠心分離により回収した。

【０２５４】次いで、グルコース0．5％（ｗ／v）を含
むＭ９培地 200ｍLを調製し、500ｍL容の振盪フラスコ
に入れて、オートクレーブにより滅菌した。フラスコを
室温に戻し、フィルター滅菌したｎ−ヘキサノフェノン
を濃度 0．1％（v／v）となるように加えてよく攪拌
し、回収された菌体を培地中に再懸濁して、30℃、125
ストローク／分で振盪培養した。90時間後、菌体を遠心
分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結
乾燥した。

【０２５５】この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホル
ムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出し
た。抽出液を孔径 0．45μｍのメンブランフィルターで
濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮
液を冷メタノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収し
て真空乾燥してＰＨＡを44ｍg得た。

【０２５６】得られたＰＨＡの分子量は、実施例３と同
様の方法でＧＰＣ分析を行なうことで求めた。その結
果、Ｍn＝107000、Ｍｗ＝203000 であった。また、得ら
れたＰＨＡを実施例３と同様の方法で1Ｈ−ＮＭＲ分析
を行なったところ、３−ヒドロキシ−５−ベンゾイル吉
草酸ユニットを 32％含み、それ以外のユニットが炭素
数4から12までの飽和・不飽和の3-ヒドロキシアルカン
酸であるPHAであることが確認された。

【０２５７】［実施例２９］グルコース 0．5％（ｗ／
v）を含むＭ９培地 200ｍLを調製し、500ｍL容の振盪フ
ラスコに入れて、オートクレーブにより滅菌した。フラ
スコを室温に戻し、フィルター滅菌したｎ−フェノキシ
ペンタンを濃度 0．1％（v／v）となるように加えてよ
く攪拌し、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植
菌し、30℃、125 ストローク／分で振盪培養した。90時
間後、菌体を遠心分離により回収した。

【０２５８】次いで、グルコース0．5％（ｗ／v）を含
み、窒素源であるＮＨ₄Ｃlを含まないＭ９培地 200ｍL
を調製し、500ｍL容の振盪フラスコに入れて、オートク
レーブにより滅菌した。フラスコを室温に戻し、フィル
ター滅菌したｎ−フェノキシペンタンを濃度 0．1％（v
／v）となるように加えてよく攪拌し、回収された菌体
を培地中に再懸濁して、30℃、125 ストローク／分で振
盪培養した。90時間後、菌体を遠心分離により回収し、
冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。

【０２５９】この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホル
ムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出し
た。抽出液を孔径 0．45μｍのメンブランフィルターで
濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮
液を冷メタノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収し
て真空乾燥してＰＨＡを54ｍg得た。

【０２６０】得られたＰＨＡの分子量は、実施例３と同
様の方法でＧＰＣ分析を行なうことで求めた。その結
果、Ｍn＝72000、Ｍｗ＝158000 であった。また、得ら
れたＰＨＡを実施例３と同様の方法で1Ｈ−ＮＭＲ分析
を行なったところ、３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉
草酸ユニットを 60％含み、それ以外のユニットが炭素
数4から12までの飽和・不飽和の3-ヒドロキシアルカン
酸であるＰＨＡであることが確認された。

【０２６１】［実施例３０］グルコース 0．5％（ｗ／
v）を含むＭ９培地 200ｍLを調製し、500ｍL容の振盪フ
ラスコに入れて、オートクレーブにより滅菌した。フラ
スコを室温に戻し、フィルター滅菌したｎ−フェノキシ
ペンタンを濃度 0．1％（v／v）となるように加えてよ
く攪拌し、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植
菌し、30℃、125 ストローク／分で振盪培養した。90時
間後、菌体を遠心分離により回収した。

【０２６２】次いで、グルコース0．5％（ｗ／v）を含
むＭ９培地 200ｍLを調製し、500ｍL容の振盪フラスコ
に入れて、オートクレーブにより滅菌した。フラスコを
室温に戻し、フィルター滅菌したｎ−フェノキシペンタ
ンを濃度 0．1％（v／v）となるように加えてよく攪拌
し、回収された菌体を培地中に再懸濁して、30℃、125
ストローク／分で振盪培養した。90時間後、菌体を遠心
分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結
乾燥した。

【０２６３】この凍結乾燥ペレットを20ｍLクロロホル
ムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出し
た。抽出液を孔径 0．45μｍのメンブランフィルターで
濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮
液を冷メタノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収し
て真空乾燥してＰＨＡを42ｍg得た。

【０２６４】得られたＰＨＡの分子量は、実施例３と同
様の方法でＧＰＣ分析を行なうことで求めた。その結
果、Ｍn＝78000、Ｍｗ＝156000 であった。また、得ら
れたＰＨＡを実施例３と同様の方法で1Ｈ−ＮＭＲ分析
を行なったところ、３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉
草酸ユニットを 60％含み、それ以外のユニットが炭素
数4から12までの飽和・不飽和の3-ヒドロキシアルカン
酸であるＰＨＡであることが確認された。

【０２６５】［実施例３１］グルコース 0．5％（ｗ／
v）を含むＭ９培地 200ｍLを調製し、500ｍL容の振盪フ
ラスコに入れて、オートクレーブにより滅菌した。フラ
スコを室温に戻し、フィルター滅菌したｎ−アミルベン
ゼンを濃度 0．1％（v／v）となるように加えてよく攪
拌し、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌
し、30℃、125ストローク／分で振盪培養した。600nmで
の濁度が0．1になった時点で、さらにジシクロプロピル
ケトンを濃度0．05％（v／v）となるように加えてよく
攪拌し、振盪培養を継続した。90時間後、菌体を遠心分
離により回収し、一度洗浄して凍結乾燥した。

【０２６６】この凍結乾燥ペレットを20ｍLクロロホル
ムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出し
た。抽出液を孔径 0．45μｍのメンブランフィルターで
濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮
液を冷メタノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収し
て真空乾燥してＰＨＡを54ｍg得た。

【０２６７】得られたＰＨＡの分子量は、実施例３と同
様の方法でＧＰＣ分析を行なうことで求めた。その結
果、Ｍn＝30000、Ｍｗ＝63000であった。また、得られ
たＰＨＡを実施例３と同様の方法で1Ｈ−ＮＭＲ分析を
行なったところ、３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸
ユニットを 37％含み、それ以外のユニットが炭素数4か
ら12までの飽和・不飽和の3-ヒドロキシアルカン酸であ
るＰＨＡであることが確認された。

【０２６８】［実施例３２］ポリペプトン 0．5％（ｗ
／v）を含むＭ９培地 200ｍLを調製し、500ｍL容の振盪
フラスコに入れて、オートクレーブにより滅菌した。フ
ラスコを室温に戻し、フィルター滅菌したｎ−アミルベ
ンゼンを濃度 0．1％（v／v）となるように加えてよく
攪拌し、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌
し、30℃、125 ストローク／分で振盪培養した。600nm
での濁度が0．1になった時点で、さらにジシクロプロピ
ルケトンを濃度0．05％（v／v）となるように加えてよ
く攪拌し、振盪培養を継続した。48時間後、菌体を遠心
分離により回収し、一度洗浄して凍結乾燥した。

【０２６９】この凍結乾燥ペレットを20ｍLクロロホル
ムに懸濁し、60℃で20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。
抽出液を孔径 0．45μｍのメンブランフィルターで濾過
した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を
冷メタノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真
空乾燥してＰＨＡを67ｍg得た。

【０２７０】得られたＰＨＡの分子量は、実施例３と同
様の方法でＧＰＣ分析を行なうことで求めた。その結
果、Ｍn＝30000、Ｍｗ＝66000であった。また、得られ
たＰＨＡを実施例３と同様の方法で1Ｈ−ＮＭＲ分析を
行なったところ、３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸
ユニットを79％含み、それ以外のユニットが３−ヒドロ
キシ酪酸であるＰＨＡであることが確認された。

【０２７１】［実施例３３］グルコース 0．5％（ｗ／
v）を含むＭ９培地 200ｍLを調製し、500ｍL容の振盪フ
ラスコに入れて、オートクレーブにより滅菌した。フラ
スコを室温に戻し、フィルター滅菌したｎ−アミルベン
ゼンを濃度0．1％（v／v）となるように加えてよく攪拌
し、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、
30℃、125 ストローク／分で振盪培養した。600nmでの
濁度が0．1になった時点で、さらにジシクロプロピルケ
トンを濃度0．05％（v／v）となるように加えてよく攪
拌し、振盪培養を継続した。14時間後、菌体を遠心分離
により回収した。

【０２７２】次いで、グルコース0．5％（ｗ／v）を含
み、窒素源であるＮＨ₄Ｃlを含まないＭ９培地 200ｍL
を調製し、500ｍL容の振盪フラスコに入れて、オートク
レーブにより滅菌した。フラスコを室温に戻し、フィル
ター滅菌したｎ−アミルベンゼンを濃度 0．1％（v／
v）となるように加えてよく攪拌し、回収された菌体を
培地中に再懸濁して、30℃、125 ストローク／分で振盪
培養した。90時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷
メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。

【０２７３】この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホル
ムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出し
た。抽出液を孔径 0．45μｍのメンブランフィルターで
濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮
液を冷メタノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収し
て真空乾燥してＰＨＡを12ｍg得た。

【０２７４】得られたＰＨＡの分子量は、実施例３と同
様の方法でＧＰＣ分析を行なうことで求めた。その結
果、Ｍn＝50000、Ｍｗ＝110000 であった。また、得ら
れたＰＨＡを実施例３と同様の方法で1Ｈ−ＮＭＲ分析
を行なったところ、３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草
酸ユニットを 86％含み、それ以外のユニットが炭素数4
から12までの飽和・不飽和の3-ヒドロキシアルカン酸で
あるＰＨＡであることが確認された。

【０２７５】［実施例３４］グルコース 0．5％（ｗ
／v）を含むＭ９培地 200ｍLを調製し、500ｍL容の振盪
フラスコに入れて、オートクレーブにより滅菌した。フ
ラスコを室温に戻し、フィルター滅菌したｎ−アミルベ
ンゼンを濃度 0．1％（v／v）となるように加えてよく
攪拌し、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌
し、30℃、125 ストローク／分で振盪培養した。600nm
での濁度が0．1になった時点で、さらにジシクロプロピ
ルケトンを濃度0．05％（v／v）となるように加えてよ
く攪拌し、振盪培養を継続した。14時間後、菌体を遠心
分離により回収した。

【０２７６】次いで、グルコース0．5％（ｗ／v）を含
むＭ９培地 200ｍLを調製し、500ｍL容の振盪フラスコ
に入れて、オートクレーブにより滅菌した。フラスコを
室温に戻し、フィルター滅菌したｎ−アミルベンゼンを
濃度 0．1％（v／v）となるように加えてよく攪拌し、
回収された菌体を培地中に再懸濁して、30℃、125 スト
ローク／分で振盪培養した。90時間後、菌体を遠心分離
により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥
した。

【０２７７】この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホル
ムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出し
た。抽出液を孔径 0．45μｍのメンブランフィルターで
濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮
液を冷メタノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収し
て真空乾燥してＰＨＡを87ｍg得た。

【０２７８】得られたＰＨＡの分子量は、実施例３と同
様の方法でＧＰＣ分析を行なうことで求めた。その結
果、Ｍn＝53000、Ｍｗ＝106000 であった。また、得ら
れたＰＨＡを実施例３と同様の方法で1Ｈ−ＮＭＲ分析
を行なったところ、３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草
酸ユニットを 86％含み、それ以外のユニットが炭素数4
から12までの飽和・不飽和の3-ヒドロキシアルカン酸で
あるＰＨＡであることが確認された。

【０２７９】［実施例３５］ポリペプトン0．5％（ｗ／
v）を含むＭ９培地 200ｍLを調製し、500ｍL容の振盪フ
ラスコに入れて、オートクレーブにより滅菌した。フラ
スコを室温に戻し、フィルター滅菌したｎ−アミルベン
ゼンを濃度 0．1％（v／v）となるように加えてよく攪
拌し、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌
し、30℃、125ストローク／分で振盪培養した。600nmで
の濁度が0．1になった時点で、さらにジシクロプロピル
ケトンを濃度0．05％（v／v）となるように加えてよく
攪拌し、振盪培養を継続した。14時間後、菌体を遠心分
離により回収した。

【０２８０】次いで、グルコース0．5％（ｗ／v）を含
み、窒素源であるＮＨ₄Ｃlを含まないＭ９培地 200ｍL
を調製し、500ｍL容の振盪フラスコに入れて、オートク
レーブにより滅菌した。フラスコを室温に戻し、フィル
ター滅菌したｎ−アミルベンゼンを濃度 0．1％（v／
v）となるように加えてよく攪拌し、回収された菌体を
培地中に再懸濁して、30℃、125 ストローク／分で振盪
培養した。90時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷
メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。

【０２８１】この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホル
ムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出し
た。抽出液を孔径 0．45μｍのメンブランフィルターで
濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮
液を冷メタノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収し
て真空乾燥してＰＨＡを150ｍg得た。

【０２８２】得られたＰＨＡの分子量は、実施例３と同
様の方法でＧＰＣ分析を行なうことで求めた。その結
果、Ｍn＝66000、Ｍｗ＝145000 であった。また、得ら
れたＰＨＡを実施例３と同様の方法で1Ｈ−ＮＭＲ分析
を行なったところ、３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草
酸ユニットを 83％含み、それ以外のユニットが炭素数4
から12までの飽和・不飽和の3-ヒドロキシアルカン酸で
あるＰＨＡであることが確認された。

【０２８３】［実施例３６］ポリペプトン 0．5％（ｗ
／v）を含むＭ９培地 200ｍLを調製し、500ｍL容の振盪
フラスコに入れて、オートクレーブにより滅菌した。フ
ラスコを室温に戻し、フィルター滅菌したｎ−アミルベ
ンゼンを濃度 0．1％（v／v）となるように加えてよく
攪拌し、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌
し、30℃、125 ストローク／分で振盪培養した。600nm
での濁度が0．1になった時点で、さらにジシクロプロピ
ルケトンを濃度0．05％（v／v）となるように加えてよ
く攪拌し、振盪培養を継続した。14時間後、菌体を遠心
分離により回収した。

【０２８４】次いで、グルコース0．5％（ｗ／v）を含
むＭ９培地 200ｍLを調製し、500ｍL容の振盪フラスコ
に入れて、オートクレーブにより滅菌した。フラスコを
室温に戻し、フィルター滅菌したｎ−アミルベンゼンを
濃度 0．1％（v／v）となるように加えてよく攪拌し、
回収された菌体を培地中に再懸濁して、30℃、125 スト
ローク／分で振盪培養した。90時間後、菌体を遠心分離
により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥
した。

【０２８５】この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホル
ムに懸濁し、60℃で20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。
抽出液を孔径 0．45μｍのメンブランフィルターで濾過
した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を
冷メタノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真
空乾燥してＰＨＡを120ｍg得た。

【０２８６】得られたＰＨＡの分子量は、実施例３と同
様の方法でＧＰＣ分析を行なうことで求めた。その結
果、Ｍn＝56000、Ｍｗ＝112000であった。また、得られ
たＰＨＡを実施例３と同様の方法で1Ｈ−ＮＭＲ分析を
行なったところ、３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸
ユニットを 91％含み、それ以外のユニットが炭素数4か
ら12までの飽和・不飽和の3-ヒドロキシアルカン酸であ
るＰＨＡであることが確認された。

【０２８７】［実施例３７］グルコース0．5％（ｗ／
v）を含むＭ９培地 200ｍLを調製し、500ｍL容の振盪フ
ラスコに入れて、オートクレーブにより滅菌した。フラ
スコを室温に戻し、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ
２株を植菌し、30℃、125 ストローク／分で振盪培養し
た。600nmでの濁度が0．1になった時点で、ジシクロプ
ロピルケトンを濃度0．05％（v／v）となるように加え
てよく攪拌し、振盪培養を継続した。14時間後、菌体を
遠心分離により回収した。

【０２８８】次いで、グルコース0．5％（ｗ／v）を含
み、窒素源であるＮＨ₄Ｃlを含まないＭ９培地 200ｍL
を調製し、500ｍL容の振盪フラスコに入れて、オートク
レーブにより滅菌した。フラスコを室温に戻し、フィル
ター滅菌したｎ−アミルベンゼンを濃度 0．1％（v／
v）となるように加えてよく攪拌し、回収された菌体を
培地中に再懸濁して、30℃、125 ストローク／分で振盪
培養した。90時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷
メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。

【０２８９】この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホル
ムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出し
た。抽出液を孔径 0．45μｍのメンブランフィルターで
濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮
液を冷メタノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収し
て真空乾燥してＰＨＡを12ｍg得た。

【０２９０】得られたＰＨＡの分子量は、実施例３と同
様の方法でＧＰＣ分析を行なうことで求めた。その結
果、Ｍn＝44000、Ｍｗ＝119000 であった。また、得ら
れたＰＨＡを実施例３と同様の方法で1Ｈ−ＮＭＲ分析
を行なったところ、３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草
酸ユニットを 87％含み、それ以外のユニットが炭素数4
から12までの飽和・不飽和の3-ヒドロキシアルカン酸で
あるＰＨＡであることが確認された。

【０２９１】［実施例３８］グルコース 0．5％（ｗ／
v）を含むＭ９培地 200ｍLを調製し、500ｍL容の振盪フ
ラスコに入れて、オートクレーブにより滅菌した。フラ
スコを室温に戻し、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ
２株を植菌し、30℃、125 ストローク／分で振盪培養し
た。600nmでの濁度が0．1になった時点で、ジシクロプ
ロピルケトンを濃度0．05％（v／v）となるように加え
てよく攪拌し、振盪培養を継続した。14時間後、菌体を
遠心分離により回収した。

【０２９２】次いで、グルコース0．5％（ｗ／v）を含
むＭ９培地 200ｍLを調製し、500ｍL容の振盪フラスコ
に入れて、オートクレーブにより滅菌した。フラスコを
室温に戻し、フィルター滅菌したｎ−アミルベンゼンを
濃度 0．1％（v／v）となるように加えてよく攪拌し、
回収された菌体を培地中に再懸濁して、30℃、125 スト
ローク／分で振盪培養した。90時間後、菌体を遠心分離
により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥
した。

【０２９３】この凍結乾燥ペレットを20ｍLクロロホル
ムに懸濁し、60℃で20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。
抽出液を孔径 0．45μｍのメンブランフィルターで濾過
した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を
冷メタノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真
空乾燥してＰＨＡを47ｍg得た。

【０２９４】得られたＰＨＡの分子量は、実施例３と同
様の方法でＧＰＣ分析を行なうことで求めた。その結
果、Ｍn＝56000、Ｍｗ＝118000 であった。また、得ら
れたＰＨＡを実施例３と同様の方法で1Ｈ−ＮＭＲ分析
を行なったところ、３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草
酸ユニットを 33％含み、それ以外のユニットが炭素数4
から12までの飽和・不飽和の3-ヒドロキシアルカン酸で
あるＰＨＡであることが確認された。

【０２９５】［実施例３９］ポリペプトン 0．5％（ｗ
／v）を含むＭ９培地 200ｍLを調製し、500ｍL容の振盪
フラスコに入れて、オートクレーブにより滅菌した。フ
ラスコを室温に戻し、シュードモナス・チコリアイ・Ｙ
Ｎ２株を植菌し、30℃、125ストローク／分で振盪培養
した。600nmでの濁度が0．1になった時点で、ジシクロ
プロピルケトンを濃度0．05％（v／v）となるように加
えてよく攪拌し、振盪培養を継続した。14時間後、菌体
を遠心分離により回収した。

【０２９６】次いで、グルコース0．5％（ｗ／v）を含
み、窒素源であるＮＨ₄Ｃlを含まないＭ９培地 200ｍL
を調製し、500ｍL容の振盪フラスコに入れて、オートク
レーブにより滅菌した。フラスコを室温に戻し、フィル
ター滅菌したｎ−アミルベンゼンを濃度0．1％（v／v）
となるように加えてよく攪拌し、回収された菌体を培地
中に再懸濁して、30℃、125 ストローク／分で振盪培養
した。90時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタ
ノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。

【０２９７】この凍結乾燥ペレットを20ｍLクロロホル
ムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出し
た。抽出液を孔径 0．45μｍのメンブランフィルターで
濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮
液を冷メタノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収し
て真空乾燥してＰＨＡを150ｍg得た。

【０２９８】得られたＰＨＡの分子量は、実施例３と同
様の方法でＧＰＣ分析を行なうことで求めた。その結
果、Ｍn＝64000、Ｍｗ＝134000 であった。また、得ら
れたＰＨＡを実施例３と同様の方法で1Ｈ−ＮＭＲ分析
を行なったところ、３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草
酸ユニットを 77％含み、それ以外のユニットが炭素数4
から12までの飽和・不飽和の3-ヒドロキシアルカン酸で
あるＰＨＡであることが確認された。

【０２９９】［実施例４０］ポリペプトン 0．5％（ｗ
／v）を含むＭ９培地200ｍLを調製し、500ｍL容の振盪
フラスコに入れて、オートクレーブにより滅菌した。フ
ラスコを室温に戻し、シュードモナス・チコリアイ・Ｙ
Ｎ２株を植菌し、30℃、125 ストローク／分で振盪培養
した。600nmでの濁度が0．1になった時点で、ジシクロ
プロピルケトンを濃度0．05％（v／v）となるように加
えてよく攪拌し、振盪培養を継続した。14時間後、菌体
を遠心分離により回収した。

【０３００】次いで、グルコース0．5％（ｗ／v）を含
むＭ９培地 200ｍLを調製し、500ｍL容の振盪フラスコ
に入れて、オートクレーブにより滅菌した。フラスコを
室温に戻し、フィルター滅菌したｎ−アミルベンゼンを
濃度 0．1％（v／v）となるように加えてよく攪拌し、
回収された菌体を培地中に再懸濁して、30℃、125 スト
ローク／分で振盪培養した。90時間後、菌体を遠心分離
により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥
した。

【０３０１】この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホル
ムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出し
た。抽出液を孔径 0．45μｍのメンブランフィルターで
濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮
液を冷メタノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収し
て真空乾燥してＰＨＡを117ｍg得た。

【０３０２】得られたＰＨＡの分子量は、実施例３と同
様の方法でＧＰＣ分析を行なうことで求めた。その結
果、Ｍn＝63000、Ｍｗ＝126000 であった。また、得ら
れたＰＨＡを実施例３と同様の方法で1Ｈ−ＮＭＲ分析
を行なったところ、３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草
酸ユニットを 83％含み、それ以外のユニットが炭素数4
から12までの飽和・不飽和の3-ヒドロキシアルカン酸で
あるＰＨＡであることが確認された。

【０３０３】［実施例４１］グルコース 0．5％（ｗ／
v）を含むＭ９培地 200ｍLを調製し、500ｍL容の振盪フ
ラスコに入れて、オートクレーブにより滅菌した。フラ
スコを室温に戻し、フィルター滅菌したｎ−アミルベン
ゼンを濃度0．1％（v／v）となるように加えてよく攪拌
し、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、
30℃、125 ストローク／分で振盪培養した。600nmでの
濁度が0．1になった時点で、さらにジシクロプロピルケ
トンを濃度0．05％（v／v）となるように加えてよく攪
拌し、振盪培養を継続した。14時間後、菌体を遠心分離
により回収した。

【０３０４】次いで、グルコース0．5％（ｗ／v）を含
み、窒素源であるＮＨ₄Ｃlを含まないＭ９培地200ｍLを
調製し、500ｍL容の振盪フラスコに入れて、オートクレ
ーブにより滅菌した。フラスコを室温に戻し、フィルタ
ー滅菌したｎ−アミルベンゼンを濃度0．1％（v／v）、
ジシクロプロピルケトンを濃度0．05％（v／v）となる
ように加えてよく攪拌し、回収された菌体を培地中に再
懸濁して、30℃、125ストローク／分で振盪培養した。9
0時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノール
にて一度洗浄して凍結乾燥した。

【０３０５】この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホル
ムに懸濁し、60℃で20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。
抽出液を孔径 0．45μｍのメンブランフィルターで濾過
した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を
冷メタノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真
空乾燥してＰＨＡを3ｍg得た。

【０３０６】得られたＰＨＡの分子量は、実施例３と同
様の方法でＧＰＣ分析を行なうことで求めた。その結
果、Ｍn＝43000、Ｍｗ＝90000であった。また、得られ
たＰＨＡを実施例３と同様の方法で1Ｈ−ＮＭＲ分析を
行なったところ、３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸
ユニットを 88％含み、それ以外のユニットが炭素数4か
ら12までの飽和・不飽和の3-ヒドロキシアルカン酸であ
るＰＨＡであることが確認された。

【０３０７】［実施例４２］グルコース 0．5％（ｗ／
v）を含むＭ９培地 200ｍLを調製し、500ｍL容の振盪フ
ラスコに入れて、オートクレーブにより滅菌した。フラ
スコを室温に戻し、フィルター滅菌したｎ−アミルベン
ゼンを濃度 0．1％（v／v）となるように加えてよく攪
拌し、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌
し、30℃、125ストローク／分で振盪培養した。600nmで
の濁度が0．1になった時点で、さらにジシクロプロピル
ケトンを濃度0．05％（v／v）となるように加えてよく
攪拌し、振盪培養を継続した。14時間後、菌体を遠心分
離により回収した。

【０３０８】次いで、グルコース0．5％（ｗ／v）を含
むＭ９培地200ｍLを調製し、500ｍL容の振盪フラスコに
入れて、オートクレーブにより滅菌した。フラスコを室
温に戻し、フィルター滅菌したｎ−アミルベンゼンを濃
度 0．1％（v／v）、ジシクロプロピルケトンを濃度0．
05％（v／v）となるように加えてよく攪拌し、回収され
た菌体を培地中に再懸濁して、30℃、125ストローク／
分で振盪培養した。90時間後、菌体を遠心分離により回
収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。

【０３０９】この凍結乾燥ペレットを20ｍLクロロホル
ムに懸濁し、60℃で20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。
抽出液を孔径 0．45μｍのメンブランフィルターで濾過
した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を
冷メタノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真
空乾燥してＰＨＡを54ｍg得た。

【０３１０】得られたＰＨＡの分子量は、実施例３と同
様の方法でＧＰＣ分析を行なうことで求めた。その結
果、Ｍn＝30000、Ｍｗ＝60000であった。また、得られ
たＰＨＡを実施例３と同様の方法で1Ｈ−ＮＭＲ分析を
行なったところ、３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸
ユニットを 76％含み、それ以外のユニットが炭素数4か
ら12までの飽和・不飽和の3-ヒドロキシアルカン酸であ
るＰＨＡであることが確認された。

【０３１１】［実施例４３］グルコース 0．5％（ｗ／
v）を含むＭ９培地 200ｍLを調製し、500ｍL容の振盪フ
ラスコに入れて、オートクレーブにより滅菌した。フラ
スコを室温に戻し、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ
２株を植菌し、30℃、125 ストローク／分で振盪培養し
た。600nmでの濁度が0．1になった時点で、ジシクロプ
ロピルケトンを濃度0．05％（v／v）となるように加え
てよく攪拌し、振盪培養を継続した。14時間後、菌体を
遠心分離により回収した。

【０３１２】次いで、グルコース0．5％（ｗ／v）を含
み、窒素源であるＮＨ₄Ｃlを含まないＭ９培地 200ｍL
を調製し、500ｍL容の振盪フラスコに入れて、オートク
レーブにより滅菌した。フラスコを室温に戻し、フィル
ター滅菌したｎ−アミルベンゼンを濃度 0．1％（v／
v）、ジシクロプロピルケトンを濃度0．05％（v／v）
となるように加えてよく攪拌し、回収された菌体を培地
中に再懸濁して、30℃、125 ストローク／分で振盪培養
した。90時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタ
ノールにて一度洗浄して凍結乾燥した。

【０３１３】この凍結乾燥ペレットを 20ｍLクロロホル
ムに懸濁し、60℃で20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。
抽出液を孔径 0．45μｍのメンブランフィルターで濾過
した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を
冷メタノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真
空乾燥してＰＨＡを５ｍg得た。

【０３１４】得られたＰＨＡの分子量は、実施例３と同
様の方法でＧＰＣ分析を行なうことで求めた。その結
果、Ｍn＝40000、Ｍｗ＝84000であった。また、得られ
たＰＨＡを実施例３と同様の方法で1Ｈ−ＮＭＲ分析を
行なったところ、３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸
ユニットを 87％含み、それ以外のユニットが炭素数4か
ら12までの飽和・不飽和の3-ヒドロキシアルカン酸であ
るＰＨＡであることが確認された。

【０３１５】［実施例４４］グルコース 0．5％（ｗ／
v）を含むＭ９培地 200ｍLを調製し、500ｍL容の振盪フ
ラスコに入れて、オートクレーブにより滅菌した。フラ
スコを室温に戻し、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ
２株を植菌し、30℃、125 ストローク／分で振盪培養し
た。600nmでの濁度が0．1になった時点で、ジシクロプ
ロピルケトンを濃度0．05％（v／v）となるように加え
てよく攪拌し、振盪培養を継続した。14時間後、菌体を
遠心分離により回収した。

【０３１６】次いで、グルコース0．5％（ｗ／v）を含
むＭ９培地 200ｍLを調製し、500ｍL容の振盪フラスコ
に入れて、オートクレーブにより滅菌した。フラスコを
室温に戻し、フィルター滅菌したｎ−アミルベンゼンを
濃度 0．1％（v／v））、ジシクロプロピルケトンを
濃度0．05％（v／v）となるように加えてよく攪拌し、
回収された菌体を培地中に再懸濁して、30℃、125スト
ローク／分で振盪培養した。90時間後、菌体を遠心分離
により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して凍結乾燥
した。

【０３１７】この凍結乾燥ペレットを20ｍLクロロホル
ムに懸濁し、60℃で20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。
抽出液を孔径0．45μｍのメンブランフィルターで濾過
した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を
冷メタノールで再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真
空乾燥してＰＨＡを26ｍg得た。

【０３１８】得られたＰＨＡの分子量は、実施例３と同
様の方法でＧＰＣ分析を行なうことで求めた。その結
果、Ｍn＝43000、Ｍｗ＝77000であった。また、得られ
たＰＨＡを実施例３と同様の方法で1Ｈ−ＮＭＲ分析を
行なったところ、３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸
ユニットを30％含み、それ以外のユニットが炭素数4か
ら12までの飽和・不飽和の3-ヒドロキシアルカン酸であ
るＰＨＡであることが確認された。

【０３１９】

【発明の効果】本発明により、モノマーユニットに芳香
族置換基をもつポリヒドロキシアルカノエートを効率よ
く合成することが可能となった。

【０３２０】とりわけ、芳香族置換基をもつアルカン
を、モノマーユニットに芳香族置換基をもつポリヒドロ
キシアルカノエートに変換する能力を有する微生物を用
いることで合成効率を上げることが可能となった。また
アルカン酸化系の効果的な誘導物質であるジシクロプロ
ピルケトンによりアルカン酸化系を誘導することで、置
換アルカンから置換アルカン酸への代謝能力が向上し、
これにより生産されるポリヒドロキシアルカノエートの
収率ならびに純度を向上させることが可能となった。こ
れにより、機能性ポリマーとして有用な当該ポリヒドロ
キシアルカノエートが効率的に生産でき、医用材料、撥
水性材料等の各分野への応用が期待できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１におけるアミルベンゼン 0．1％を加
えた系において得られたＰＨＡについてメタノリシス処
理し、ＧＣ−ＭＳ測定した際の３−ヒドロキシ酪酸メチ
ルのマススペクトルを示す。

【図２】実施例１におけるアミルベンゼン 0．1％を加
えた系において得られたＰＨＡについてメタノリシス処
理し、ＧＣ−ＭＳ測定した際の３−ヒドロキシオクタン
酸メチルのマススペクトルを示す。

【図３】実施例１におけるアミルベンゼン 0．1％を加
えた系において得られたＰＨＡについてメタノリシス処
理し、ＧＣ−ＭＳ測定した際の３−ヒドロキシデカン酸
メチルのマススペクトルを示す。

【図４】実施例１におけるアミルベンゼン 0．1％加え
た系において得られたＰＨＡについてメタノリシス処理
し、ＧＣ−ＭＳ測定した際の３−ヒドロキシ−５−フェ
ニル吉草酸メチルのマススペクトルを示す。

【図５】実施例３における1Ｈ−ＮＭＲスペクトルチャ
ートを示す。

【図６】実施例６において得られたＰＨＡについてメタ
ノリシス処理し、ＧＣ−ＭＳ測定した際の３−ヒドロキ
シ−５−フェノキシ吉草酸メチルのＴIＣ及びマススペ
クトルを示す。

【図７】実施例８における1Ｈ−ＮＭＲスペクトルチャ
ートを示す。

【図８】実施例８において得られたＰＨＡについてメタ
ノリシス処理し、ＧＣ−ＭＳ測定した際の３−ヒドロキ
シ−５−（４−フルオロベンゾイル）吉草酸メチルのＴ
IＣ及びマススペクトルを示す。

【図９】実施例９における1Ｈ−ＮＭＲスペクトルチャ
ートを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｒ 1:38） (72)発明者本間務東京都大田区下丸子３丁目30番２号キヤノン株式会社内 (72)発明者須川悦子東京都大田区下丸子３丁目30番２号キヤノン株式会社内 (72)発明者矢野哲哉東京都大田区下丸子３丁目30番２号キヤノン株式会社内Ｆターム(参考） 4B064 AD83 AD85 CA02 CB25 CC01 CC03 CD05 CD06 CD07 CD09 CD10 CD13 CD19 CD20 4B065 AA41X AC20 BB06 BB07 BB08 BB10 BB15 BB16 BB18 BB19 BC01 BC50 CA12 CA54

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記一般式（１）：【化１】（式中、Ｒは置換芳香環を含む残基を示し、nは0〜９か
ら選択される任意の整数を表す）で示される置換アルカ
ン群より選ばれた少なくとも一種を出発化合物とし、下
記一般式（２）：【化２】（式中、Ｒは置換芳香環を含む残基を示し、ｍは0〜９
から選択される任意の整数を表す）で示される、３−ヒ
ドロキシ置換アルカノエートユニット群より選ばれた少
なくとも一種を分子中に含むポリヒドロキシアルカノエ
ートを生産する工程を有することを特徴とするポリヒド
ロキシアルカノエートの製造方法。
【請求項２】一般式（１）及び（２）におけるＲ、即
ち置換芳香環を含む残基が、化学式（３）：【化３】（式中、Ｒ1は芳香環への置換基を示し、Ｒ1はＨ原子、
ＣＮ基、ＮＯ2基、ハロゲン原子、ＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、
Ｃ3Ｈ7基、ＣＨ2＝ＣＨ基、ＣＦ3基、Ｃ2Ｆ5基、Ｃ3Ｆ7
基から選択された少なくとも一種である。）で示される
置換フェニル残基群、及び、化学式（４）：【化４】（式中、Ｒ2は芳香環への置換基を示し、Ｒ2はＨ原子、
ＣＮ基、ＮＯ2基、ハロゲン原子、ＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、
Ｃ3Ｈ7基、ＣＦ3基、Ｃ2Ｆ5基、Ｃ3Ｆ7基から選択され
た少なくとも一種である。）で示される置換フェノキシ
残基群、及び、化学式（５）：【化５】（式中、Ｒ3は芳香環への置換基を示し、Ｒ3はＨ原子、
ＣＮ基、ＮＯ2基、ハロゲン原子、ＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、
Ｃ3Ｈ7基、ＣＦ3基、Ｃ2Ｆ5基、Ｃ3Ｆ7基から選択され
た少なくとも一種である。）で示される置換ベンゾイル
残基群である請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】請求項１から２のいずれかに記載の生産
工程が、一般式（１）で示される置換アルカン群より選
ばれた少なくとも一種を出発化合物とし、一般式（２）
で示される３−ヒドロキシ置換アルカノエートユニット
群より選ばれた少なくとも一種を分子中に含むポリヒド
ロキシアルカノエートを生産する能力を有する微生物の
存在下で行なわれる、請求項１から２のいずれかに記載
の製造方法。
【請求項４】一般式（１）中に示されるn、一般式
（２）中に示されるｍの関係が、下記数式（１）：ｍ＝n−２l・・・（１）（式中lは0≦l＜（１／２）nなる任意の整数）で表され
る請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】該ポリヒドロキシアルカノエートが、ポ
リマー分子中に含まれるユニットとして、前記一般式
（２）で示されるユニットに加えて、下記一般式
（６）：【化６】（式中、pは、0〜８から選択される任意の整数を表し、
ポリマー中において、一つ以上の値をとり得る）で示さ
れる３−ヒドロキシ−アルカン酸ユニット、あるいは、
下記一般式（７）：【化７】（式中、zは、３および５から選択される任意の整数を
表し、ポリマー中において、一つ以上の値をとり得る）
で示される３−ヒドロキシ−アルカ−５−エン酸ユニッ
トのうち、少なくとも１種類をポリマー分子中に含む請
求項３に記載の製造方法。
【請求項６】該ポリヒドロキシアルカノエートの数平
均分子量が 5000 から 1000000 の範囲である請求項１
から５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項７】一般式（１）で示される置換アルカン群
より選ばれた少なくとも一種を含む培地中で該微生物を
培養する工程を有する、請求項３に記載の製造方法。
【請求項８】ジシクロプロピルケトンを含む培地中で
該微生物を培養する工程をさらに有する、請求項７に記
載の製造方法。
【請求項９】該培地がポリペプトンを含有している請
求項７あるいは８に記載の製造方法。
【請求項１０】該培地が酵母エキスを含有している請
求項７あるいは８に記載の製造方法。
【請求項１１】該培地が糖類を含有している請求項７
あるいは８に記載の製造方法。
【請求項１２】培地中に含有される糖類は、グリセロ
アルデヒド、エリトロース、アラビノース、キシロー
ス、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクト
ース、グリセロール、エリトリトール、キシリトール、
グルコン酸、グルクロン酸、ガラクツロン酸、マルトー
ス、スクロース、ラクトースからなる群から選択される
１種類以上の化合物である請求項１１に記載の製造方
法。
【請求項１３】該培地が有機酸またはその塩を含有し
ている請求項７あるいは８に記載の製造方法。
【請求項１４】培地中に含有される有機酸またはその
塩は、ピルビン酸、リンゴ酸、乳酸、クエン酸、コハク
酸、あるいはこれらの塩からなる群から選択される１つ
以上の化合物である請求項１３に記載の製造方法。
【請求項１５】該培地がアミノ酸またはその塩を含有
している請求項７あるいは８に記載の製造方法。
【請求項１６】培地中に含有されるアミノ酸またはそ
の塩は、グルタミン酸、アスパラギン酸あるいはこれら
の塩からなる群から選択される１つ以上の化合物である
請求項１５に記載の製造方法。
【請求項１７】該培地が炭素数４〜１２の直鎖アルカ
ン酸あるいはその塩を含有している請求項７あるいは８
に記載の製造方法。
【請求項１８】前記培養工程において、微生物の培養
は、（工程１−１）前記一般式（１）で示される置換ア
ルカン群より選ばれた少なくとも一種ならびにポリペプ
トンを含有する培地中で微生物を培養する工程と、これ
に続く、（工程１−２）前記一般式（１）で示される置
換アルカン群より選ばれた少なくとも一種ならびに有機
酸またはその塩を含有する培地中で、前記工程１−１で
培養された微生物を更に培養する工程とを有する、少な
くとも二段階以上の培養で行なう請求項７に記載の製造
方法。
【請求項１９】前記培養工程において、微生物の培養
は、（工程１−１）ジシクロプロピルケトンならびにポ
リペプトンを含有し、さらに前記一般式（１）で示され
る置換アルカン群より選ばれた少なくとも一種を含有す
ることもある培地中で微生物を培養する工程と、これに
続く、（工程１−２）前記一般式（１）で示される置換
アルカン群より選ばれた少なくとも一種ならびに有機酸
またはその塩を含有する培地中で、前記工程１−１で培
養された微生物を更に培養する工程とを有する、少なく
とも二段階以上の培養で行なう請求項８に記載の製造方
法。
【請求項２０】前記培養工程において、微生物の培養
は、（工程１−１）ジシクロプロピルケトンならびに
ポリペプトンを含有し、さらに前記一般式（１）で示さ
れる置換アルカン群より選ばれた少なくとも一種を含有
することもある培地中で微生物を培養する工程と、これ
に続く、（工程１−２）前記一般式（１）で示される置
換アルカン群より選ばれた少なくとも一種ならびに有機
酸またはその塩、さらにジシクロプロピルケトンを含有
する培地中で、前記工程１−１で培養された微生物を更
に培養する工程とを有する、少なくとも二段階以上の培
養で行なう請求項８に記載の製造方法。
【請求項２１】前記培養工程において、微生物の培養
は、（工程１−１）前記一般式（１）で示される置換ア
ルカン群より選ばれた少なくとも一種ならびにポリペプ
トンを含有する培地中で微生物を培養する工程と、これ
に続く、（工程１−２）前記一般式（１）で示される置
換アルカン群より選ばれた少なくとも一種ならびに有機
酸またはその塩、さらにジシクロプロピルケトンを含有
する培地中で、前記工程１−１で培養された微生物を更
に培養する工程とを有する、少なくとも二段階以上の培
養で行なう請求項８に記載の製造方法。
【請求項２２】前記工程１−２で用いる培地中に含有
される有機酸またはその塩は、ピルビン酸、リンゴ酸、
乳酸、クエン酸、コハク酸あるいはこれらの塩からなる
群から選択される１つ以上の化合物である請求項１８か
ら２１の何れかに記載の製造方法。
【請求項２３】前記培養工程において、微生物の培養
は、（工程１−３）前記一般式（１）で示される置換ア
ルカン群より選ばれた少なくとも一種ならびに糖類を含
有する培地中で微生物を培養する工程と、これに続く、
（工程１−４）前記一般式（１）で示される置換アルカ
ン群より選ばれた少なくとも一種ならびに糖類を含有す
る培地中で、前記工程１−３で培養された微生物を更に
培養する工程とを有する、少なくとも二段階以上の培養
で行なう請求項７に記載の製造方法。
【請求項２４】前記培養工程において、微生物の培養
は、（工程１−３）ジシクロプロピルケトンならびに糖
類を含有し、さらに前記一般式（１）で示される置換ア
ルカン群より選ばれた少なくとも一種を含有することも
ある培地中で微生物を培養する工程と、これに続く、
（工程１−４）前記一般式（１）で示される置換アルカ
ン群より選ばれた少なくとも一種ならびに糖類を含有す
る培地中で、前記工程１−３で培養された微生物を更に
培養する工程とを有する、少なくとも二段階以上の培養
で行なう請求項８に記載の製造方法。
【請求項２５】前記培養工程において、微生物の培養
は、（工程１−３）ジシクロプロピルケトンならびに糖
類を含有し、さらに前記一般式（１）で示される置換ア
ルカン群より選ばれた少なくとも一種を含有することも
ある培地中で微生物を培養する工程と、これに続く、
（工程１−４）前記一般式（１）で示される置換アルカ
ン群より選ばれた少なくとも一種ならびに糖類、さらに
ジシクロプロピルケトンを含有する培地中で、前記工程
１−３で培養された微生物を更に培養する工程とを有す
る、少なくとも二段階以上の培養で行なう請求項８に記
載の製造方法。
【請求項２６】前記培養工程において、微生物の培養
は、（工程１−３）前記一般式（１）で示される置換ア
ルカン群より選ばれた少なくとも一種ならびに糖類を含
有する培地中で微生物を培養する工程と、これに続く、
（工程１−４）前記一般式（１）で示される置換アルカ
ン群より選ばれた少なくとも一種ならびに糖類、さらに
ジシクロプロピルケトンを含有する培地中で、前記工程
１−３で培養された微生物を更に培養する工程とを有す
る、少なくとも二段階以上の培養で行なう請求項８に記
載の製造方法。
【請求項２７】前記培養工程において、微生物の培養
は、（工程１−５）前記一般式（１）で示される置換ア
ルカン群より選ばれた少なくとも一種ならびにポリペプ
トンを含有する培地中で微生物を培養する工程と、これ
に続く、（工程１−６）前記一般式（１）で示される置
換アルカン群より選ばれた少なくとも一種ならびに糖類
を含有する培地中で、前記工程１−５で培養された微生
物を更に培養する工程とを有する、少なくとも二段階以
上の培養で行なう請求項７に記載の製造方法。
【請求項２８】前記培養工程において、微生物の培養
は、（工程１−５）ジシクロプロピルケトンならびにポ
リペプトンを含有し、さらに前記一般式（１）で示され
る置換アルカン群より選ばれた少なくとも一種を含有す
ることもある培地中で微生物を培養する工程と、これに
続く、（工程１−６）前記一般式（１）で示される置換
アルカン群より選ばれた少なくとも一種ならびに糖類を
含有する培地中で、前記工程１−５で培養された微生物
を更に培養する工程とを有する、少なくとも二段階以上
の培養で行なう請求項８に記載の製造方法。
【請求項２９】前記培養工程において、微生物の培養
は、（工程１−５）ジシクロプロピルケトンならびにポ
リペプトンを含有し、さらに前記一般式（１）で示され
る置換アルカン群より選ばれた少なくとも一種を含有す
ることもある培地中で微生物を培養する工程と、これに
続く、（工程１−６）前記一般式（１）で示される置換
アルカン群より選ばれた少なくとも一種ならびに糖類、
さらにジシクロプロピルケトンを含有する培地中で、前
記工程１−５で培養された微生物を更に培養する工程と
を有する、少なくとも二段階以上の培養で行なう請求項
８に記載の製造方法。
【請求項３０】前記培養工程において、微生物の培養
は、（工程１−５）前記一般式（１）で示される置換ア
ルカン群より選ばれた少なくとも一種ならびにポリペプ
トンを含有する培地中で微生物を培養する工程と、これ
に続く、（工程１−６）前記一般式（１）で示される置
換アルカン群より選ばれた少なくとも一種ならびに糖
類、さらにジシクロプロピルケトンを含有する培地中
で、前記工程１−５で培養された微生物を更に培養する
工程とを有する、少なくとも二段階以上の培養で行なう
請求項８に記載の製造方法。
【請求項３１】前記工程１−３、工程１−４、工程１
−５ならびに工程１−６で用いる培地中に含有される糖
類は、グリセロアルデヒド、エリトロース、アラビノー
ス、キシロース、グルコース、ガラクトース、マンノー
ス、フルクトース、グリセロール、エリトリトール、キ
シリトール、グルコン酸、グルクロン酸、ガラクツロン
酸、マルトース、スクロース、ラクトースからなる群か
ら選択される１つ以上の化合物である請求項２３から３
０の何れかに記載の製造方法。
【請求項３２】該微生物が、アルカンモノオキシゲナ
ーゼを有している微生物である請求項３から３１のいず
れかに記載の製造方法。
【請求項３３】該微生物が、シュードモナス・チコリ
アイＹＮ２株（Pseudoｍonas cichorii ＹＮ２；ＦＥ
ＲＭＢＰ−7375）である請求項３２に記載の製造方
法。