KR20010095185A

KR20010095185A - 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 및 상기 효소를코딩하는 유전자

Info

Publication number: KR20010095185A
Application number: KR1020010017015A
Authority: KR
Inventors: 야노데츠야; 이마무라타케시; 수다사카에; 혼마츠토무
Original assignee: 미다라이 후지오; 캐논 가부시끼가이샤
Priority date: 2000-03-30
Filing date: 2001-03-30
Publication date: 2001-11-03
Also published as: EP1138770A2; JP2001275671A; US20010055795A1; KR100479943B1; DE60123862D1; EP1138770A3; DE60123862T2; ATE342988T1; JP3848045B2; EP1138770B1

Abstract

신규한 곁사슬구조를 가지는 PHA을 생산할 수 있는 미생물로부터 유래되는 신규한 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)합성효소 및 합성효소에 대한 아미노산배열을 코딩하는 DNA를 제조한다. 슈도모나스 치코리이 YN2(FERM BP-7375) 로부터 유래되는 2개의 PHA합성효소 단백질(배열번호 1 및 3) 및 상기 PHA합성효소를 코딩하는 PHA합성효소 유전자를 각각 제공한다(일렬번호 2 및 4). 재조합미생물에 PHA 생산 능력을 부여한다.

Description

폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 및 상기 효소를 코딩하는 유전자{Polyhydroxyalkanoate Synthase and Gene Encoding the Same Enzyme}

본발명은, 폴리하이드록시알카노에이트(이하, "PHA"라 칭함) 합성효소, 이 PHA 합성효소를 코딩하는 유전자, 이 유전자를 함유하는 재조합벡터, 이 조합백터에 의해 형질전환되어 PHA 합성효소를 발현할 수 있는 형질전환체, 이 형질전환체를 이용하는 PHA합성효소의 제조방법, 및 이 형질전환체를 이용하는 PHA의 제조방법에 관한 것이다. 특히, 본발명은 폴리하이드록시알카노에이트를 제조할 수 있는 미생물-유도 PHA 합성효소 및 형질전환체에 의해 PHA 합성효소를 발현하기 위해 이용되는 PHA 합성효소를 코딩하는 유전자에 관한 것이다.

폴리-3-하이드록시부티르산(PHB)이나 다른 PHA를 제조하고 이것을 축적하는 다수의 미생물이 보고되었다(생분해성 플라스틱연구회, NTS 주식회사에 의해 발행된 "생분해성 플라스틱핸드북", p178-197). 이들의 폴리머는, 종래의 플라스틱과 같이, 예를 들면, 용해처리에 의하여 다양한 제품을 제조하는 데 이용될 수 있다. 상기 폴리머는 생분해되므로, 자연환경에서 미생물에 의하여 완전히 분해될 수 있고, 종래의 많은 폴리머 화합물처럼 자연환경에 잔류하여 오염을 유발하지 않는다. 또한, 생체 적합성이 우수하므로 의료용 연질 재료등으로 응용하여 사용될 수 있는 것이 기대되고 있다.

미생물에 의하여 제조된 PHA등의 조성 및 구조가 생산시에 이용되는 미생물의 종류, 배지조성 및 배양조건에 따라서 상당히 변화하는 것이 알려져 있다. 그러므로, PHA의 물성의 개선을 위하여 조성 또는 구조등의 제어에 관해 주로 중점적으로 연구되어 왔다.

예를 들면, 일본특허출원 제6-15604호, 제7-14352호 및 제8-19227호에, 알칼리게네스 유트로퍼스(Alcaligenes eutropus) H16(ATCC No. 17699) 및 그 변이주는 3-하이드록시부티르산(3HB) 및 3-하이드록시발레르산(3HV)의 공중합체를 배양시에 탄소원을 변경함으로써 다양한 조성비로 생산할 수 있는 것을 기재하고 있다.

또, 일본국 특허공보 제 2642937호에서는, 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovoransATCC 29347)에, 탄소원으로서 비환상 지방족 탄화수소를 부여함으로써, 탄소수 6 내지 12의 3-하이드록시알카노에이트의 모노머유닛을 지닌 PHA가 생산되는 것이 개시되어 있다.

일본국 특허공개 평 5-74492호 공보에는, 메틸로박테리움속(Methylobacteriumsp.), 파라코커스속(Paracoccussp.), 알칼리게네스속(Alcaligenessp.) 또는 슈도모나스속(Pseudomonassp.)을, 탄소수 3 내지 7의 1급 알콜에 접촉시킴으로써, 3HB와 3HV와의 공중합체를 생산시키는 방법이 개시되어 있다.

일본국 특허공개 평 5-93049호 및 평 7-265065호 공보에는, 아에로모나스 카비에(Aeromonas caviae)가, 올레산이나 올리브유를 탄소원으로서 사용하여 배양함으로써, 3HB와 3-하이드록시헥산산(3HHx)의 2성분 공중합체를 생산하는 것이 개시되어 있다.

일본국 특허공개 평 9-191893호 공보에는 코마모나스 아시도보란스(Comamonas acidovoransIFO 13852)가, 글로콘산 및 1,4-부탄디올을 탄소원으로서 사용하여 배양함으로써, 모노머유닛으로서 3HB와 4-하이드록시부티르산을 지닌 폴리에스테르를 생산하는 것이 개시되어 있다.

또한, 어느 종의 미생물에서는 불포화탄화수소, 에스테르, 아릴(아로매틱), 및 시안기, 할로겐화탄화수소 및 에폭사이드등의 다양한 치환기를 지닌 PHA를 생산하는 것이 보고되어 왔다. 최근에는, 이와 같은 처리를 이용하여 미생물에 의하여 생산된 PHA의 물성을 개선하기 위한 시도가 이루어져왔다. 예를 들면, Makromol. Chem., 191, 1957-1965(1990); Macromolecules, 24, 5256-5260(1991) 및 Chirality,3, 492-494(1991)에는, 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovorans)에 의하여 모노머 유닛으로 3-하이드록시-5-페닐발레르산(3HPV)을 이루는 PHA의 생산에 대하여 기재되어 있고, 아마도 3HPV의 존재에 기인하는 폴리머 물성의 변이가 관찰되었다.

상기에서 설명한 바와 같이, 사용된 미생물의 종류, 배지조성 및 배양조건 등의 인자를 변경함으로써, 조성과 구조를 다양하게 조합하여 미생물에 의해 생산된 PHA를 얻을 수 있다. 각각 미생물은 다른것과는 현저하게 상이한 기질특이성을 가진 내재성 PHA 합성효소를 포함한다. 따라서, 공지의 미생물이나 이와 같이 공지된 미생물의 PHA 합성효소를 사용하여 다양한 응용에 적합한 상이한 모노머 유닛을 함유하는 PHA를 생산하는 것은 어려웠다.

한편, 전술한 바와 같이, 곁사슬에 다양한 치환제를 가지는 PHA는 도입되는 치환제의 특성에 기인한 현저하게 유용한 기능이나 특성을 가진 "기능성 폴리머"가 기대될 수 있다. 또한 기능성과 생분해성의 양자를 가지는 매우 유용한 폴리머를 생산하고 저장할 수 있는 미생물의 탐색과 개발이 매우 유용하고 중요하다. 또한, 매우 유용한 PHA의 생산에 포함되는 PHA합성효소의 동정과 PHA 합성효소를 코딩하는 유전자의 획득이 소망의 PHA를 생산할 수 있는 신규한 형질 전환된 미생물을 생산할 수 있도록 한다. 즉, PHA 합성효소를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합벡터를 구축하고 이 재조합벡터에 의해 형질전환된 미생물을 획득하여, 이 형질전환된 미생물을 이용한 PHA의 제조 또는 재조합타입의 PHA를 발현할 수 있도록 한다. 전술한 바와 같이, 형질전환된 미생물은, PHA의 생산성 개선 및 PHA의 이용증진을 위한 매우 유용한 수단를 제공하기 위하여 소망의 PHA를 제조한다.

상기 문제점을 해결할 수 있는 본 발명의 목적은, 신규한 곁사슬 구조를 가지는 PHA를 생산하여 미생물에 축적할 수 있는 신규한 미생물을 탐색하고, 신규한 PHA, 즉 신규한 PHA 합성효소의 생산능력과 관련된 효소단백질을 동정화하고, 아미노산 배열을 코딩하는 유전자를 해명하는 데 있다. 더욱 상세하게는, 본발명의 목적은, 신규한 곁사슬고리구조를 가지는 PHA를 생산하는 미생물과 아미노산배열을코딩하는 DNA로부터 유도된 신규한 PHA 합성효소를 제공하는 데 있다. 본발명의 다른 목적은, 이용가능한 PHA 합성효소를 코딩하는 DNA를 도입하고 또한 미생물의 형질전환을 사용하는 재조합벡터 및 이 재조합벡터를 이용하여 생산된 형질전환된 미생물을 제공하는 데 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 형질전환된 미생물에서 재조합 PHA 합성효소를 발현 및 생산하는 방법과 형질전환된 미생물을 사용하여 소망의 PHA를 제조하는 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 전술한 바와 같이, 효소활동이 형질전환된 미생물에서 재조합 PHA 합성효소의 발현에 영향을 끼치지 않는 한 아미노산배열의 개변된 PHA 합성효소 및 개변된 아미노산배열를 코딩하는 DNA를 제공하는 데 있다.

도1은 슈도모나스 치코리이 YN2(FERM BP-7375)로부터 유래되는 제1 PHA합성효소를 코딩한 염기배열도

도2는 슈도모나스 치코리이 YN2(FERM BP-7375)로부터 유래되는 제1 PHA합성효소를 코딩한 염기배열도

도3은 슈도모나스 치코리이 YN2(FERM BP-7375)로부터 유래되는 제1 PHA합성효소를 코딩한 염기배열도

도4는 슈도모나스 치코리이 YN2(FERM BP-7375)로부터 유래되는 제1 PHA합성효소를 코딩한 염기배열도

도5는 슈도모나스 치코리이 YN2(FERM BP-7375)로부터 유래되는 제1 PHA합성효소를 코딩한 염기배열도

도6은 슈도모나스 치코리이 YN2(FERM BP-7375)로부터 유래되는 제2 PHA합성효소를 코딩한 염기배열도

도7는 슈도모나스 치코리이 YN2(FERM BP-7375)로부터 유래되는 제2 PHA합성효소를 코딩한 염기배열도

도8은 슈도모나스 치코리이 YN2(FERM BP-7375)로부터 유래되는 제2 PHA합성효소를 코딩한 염기배열도

도9는 슈도모나스 치코리이 YN2(FERM BP-7375)로부터 유래되는 제2 PHA합성효소를 코딩한 염기배열도

도10은 슈도모나스 치코리이 YN2(FERM BP-7375)로부터 유래되는 제2 PHA 합성효소를 코딩한 염기배열도

상기 문제점을 해결하는 것을 목적으로 하여, 예를 들면, 디바이스재료 또는 의료용재료로서 유용한 신규 곁사슬고리구조를 가지는 PHA를 개발하기 위하여, 본 발명자들은 소망의 PHA를 생산 및 축적할 수 있는 신규한 미생물을 탐색했다. 또한, 본 발명자들은 신규한 PHA의 생산에 포함되는 PHA 합성효소의 동정과 PHA 합성효소를 코딩하는 유전자의 획득을 위하여 신규한 PHA를 제조하는 선택된 신규의 미생물을 집중적으로 연구했다. 또한, 본발명자들은 획득한 PHA 합성효소에 대한 유전자로 재조합벡터를 구축하고, 재조합벡터를 사용하여 숙주미생물을 형질전환하고, 획득한 형질전환 미생물에서 재조합 PHA 합성효소를 발현하고 소망의 PHA의 생산 결정에 대한 조사를 행하여왔다.

상기 조사의 과정에서, 발명자들은 화학식(Ⅱ)에 의해 표시되는 5-(4-플루오르페닐) 발레르산(FPVA)를 합성하고;

원료인 상기 화합물(Ⅱ)을, 화학식(Ⅲ)에 의해 표시되는 대응 3-하이드록시-5-(4-플루오르페닐)발레르산(3HFPV)으로 변환할 수 있는 신규한 미생물을 토양으로부터 분리하고:

3HFPV에 의해 유도되는 화학식(Ⅰ)에 의해 표시되는 모노머유닛을 함유하는 신규한 PHA를 생산하고 축적하며:

분리된 신규한 미생물을 YN2균주로 표시한다. 발명자들은, FPVA을 3HFPV로 전환하는 상기 효소 활동 이외에, YN2균주는 화학식(Ⅳ)에 의해 표시되는 4-시클로헥실부티르산(CHxBA)을 사용해도 된다는 것을 또한 발견하였고;

원료(기재)로서 화학식(Ⅴ)에 의해 표시된 3-하이드록시-4-시클로헥실부티르산(3HCHxB)으로 변환하고:

3HCHxB로부터 유도되는 화학식(Ⅵ)에 의해 표시되는 모노머유닛을 지닌 PHA를 생산하여 축적하는 능력을 가지는 것도 발견하였다.:

YN2균주의 균학적 성질은 다음과 같다.

<YN2균주의 균학적 성질>

(형태학적 성질):

세포의 형태 및 크기 : 간균, 0.8㎛×1.0 내지 1.2㎛

세포의 다형성 : 없음

운동성 : 있음

포자형성 : 없음

그램 염색성 : 음성

코로니형상(Colonization): 원형, 전체원주의 매끄러움, 낮은 복록성, 매끄한 표면, 광택, 황색띤 흰색

(생리학적 특성)

카탈라아제: 양성

옥시다제: 양성

O/F테스트: 산화적

질산염의 환원: 음성

인돌의 생성 : 음성

포도당의 산성화: 음성

아르기닌디하이드롤라제 :음성

우레아제: 음성

에스쿨린가수분해: 음성

젤라틴가수분해: 음성

β-갈락토시다제: 음성

King's B 한천에서의 형광색소 생산성 : 양성

4% NaCl에서의 형성 : 음성

폴리-β-히드록시브티르산의 축적 : 음성

(기질동화능)

포도당: 양성

L-아라비노스: 음성

D-만노스: 양성

D-만니톨: 양성

N-아세틸-D-글루코사민: 양성

말토스: 음성

글루콘산 칼륨: 양성

n-카프린산: 양성

아디핀산: 음성

dl-말산: 양성

시안산 나트륨: 양성

아세트산 페닐: 양성

상기 균학적성질로부터, 본발명자는 문헌「Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 제1권(1984)」 및 문헌「Bergey's Manual of Determinative Bacteriology 제9판(1994)」에 의거하여 검토한 바 YN2균주를 분류하고 상기 균주는 슈도모나스 치코리이(Pseudomonas cichorii) YN2에 속하는 것으로 판명하였다. 따라서 상기 균주는 슈도모나스 치코리이에 속하는 것으로 명명하였다.

YN2균주에 의하여 표시되는 PHA를 생산할 수 있는 슈도모나스 치코리이의 균주에 관한 보고는 없다. 그러므로 발명자들은, YN2균주를 신규한 미생물이라고 판단하였다. 출원인들은 슈도모나스 치코리이 YN2을 기탁번호 "FERM BP-7375"로서 국립바이오과학 기관인 특허미생물기탁센타 및 인간기술, 산업과학 및 기술부, 통상산업부에 기탁했다. YN2균주는 부다페스트조약에 의거하여 국제적으로 기탁하였고, 국제승인번호는 "FERM BP-7375이다.

본발명자들은 신규 미생물 YN2균주로부터 PHA 합성효소를 위한 유전자를 클로닝하는 것에 성공하였고 유전자를 배열했다. 또한, 발명자들은 상기 유전자에 의하여 코딩된 PHA 합성효소의 아미노산배열을 판명했다. 상기 연구에 의거하여, 본발명이 완성되었다.

상세하게는, 본발명의 PHA 합성효소는 배열번호 1 또는 2의 아미노산배열을 가지는 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소이다. 또한, 본발명의 PHA 합성효소는, 배열번호 1의 아미노산배열을 실질적으로 보유하고, 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소의 활동을 손상하지 않는 한, 아미노산의 삭제, 치환 또는 부가가 이루어지는 개변 아미노산배열을 갖는 PHA 합성효소이거나, 또는 배열번호 3의 아미노산배열을 실질적으로 보유하고, 폴리히드록시알카노에이트 합성효소로서의 활성을 손상하지 않는한, 삭제, 치환 또는 부가되는 아미노산의 개변된 아미노산배열을 갖는 PHA 합성효소이기도 하다.

본발명의 PHA 합성효소 유전자는 배열번호 1의 아미노산배열 또는 그것의 변형된 아미노산의 배열을 코딩하는 DNA 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 유전자이거나, 또는 배열번호3의 아미노산배열 또는 그것의 변형된 아미노산의 배열을 코딩하는 DNA를 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 유전자이다. YN2균주의 게놈유전자로부터 유래된 본발명의 PHA 합성효소 유전자의 실시예는, 배열번호1의 아미노산배열을 코딩하는 DNA로서 배열번호2의 DNA염기배열을 함유하는 PHA 합성효소 유전자 및 배열번호3의 아미노산배열을 코딩하는 DNA로서 배열번호4의 DNA염기배열을 함유하는 PHA 합성효소 유전자를 포함한다.

본발명은 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 유전자로서 상기 아미노산배열을 코딩하는 유전자DNA를 함유하는 재조합벡터를 또한 제공한다. 본발명은 숙주로서 적합한 재조합벡터를 도입함으로써 형질전환된 형질전환미생물을 또한 제공한다.

본발명은 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소의 기재를 함유하고 배지에 재조합백터를 도입하는 형질전환 미생물을 배양하는 단계와 배양 단계로부터 폴리하이드록시알카노에이트를 취득하는 단계를 포함하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조 방법을 또한 제공한다. 본발명은, 재조합백터가 도입된 형질전환된 미생물의 배양의 단계와, 형질전환된 미생물로 하이드록시알카노에이트를 생산하는 단계를 포함하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조 방법을 또한 제공한다.

폴리하이드록시알카노에이트의 바람직한 제조방법은, YN2균주로부터 유도된 폴리히드록시알카노에이트 합성효소의 기질특이성을 이용할 수 있고: 예를 들면, 상기 형질전환된 미생물을 이용하여 3HFPV로부터 유도된 화학식(Ⅰ)에 의해 표시되는 모노머유닛을 함유하는 폴리히드록시알카노에이트의 제조 및 3HCHxB로부터 유도된 화학식(Ⅳ)에 의해 표시되는 모노머유닛을 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법이다.

본발명의 PHA 합성효소 및 이 PHA 합성효소를 코딩하는 유전자는, 신규한 미생물, 슈도모나스 치코리이 YN2균주로부터 유래되고, 신규한 곁사슬구조를 가지는 모노머유닛을 함유하는 PHA를 선택적으로 제조하도록 기질특이성을 표시한다. PHA 합성효소 유전자를 함유하는 재조합 백터 및 이 재조합벡터에 의하여 형질전환된 미생물은 슈도모나스 치코리이 YN2와 마찬가지의 기질특이성을 표시하는 PHA를 제조할 수 있다. 따라서, 본발명의 PHA 합성효소 유전자는, 신규한 곁사슬구조를 가지는 모노머유닛을 선택적으로 포함하는 PHA의 제조가 허용되고, 또한 기능적인 폴리머에 응용하도록 기대되는 다양하게 유용한 물성을 가진 PHA를 제조하는데 유용한 형질전환된 미생물을 생산할 수 있도록 하는 효소를 코딩한다.

본발명의 PHA 합성효소는, 본발명에 의하여 분리된 신규의 미생물, 슈도모나스 치코리이 YN2(FERM BP-7375)로부터 유래되는 효소단백질이다. 즉, 대응하는 5-(4-플루오르레닐)발레르산(FPVA)을 대응하는 3-하이드록시-5-(4-플루오르페닐) 발레르산(3HFPV)으로 변환하거나, 또는 4-시클로헥실부티르산(CHxB)을 대응하는 3-하이드록시-4-시클로헥실부티르산(3HCHxB)으로 변환함으로써, 대응하는 모노머유닛을 함유하는 PHA의 합성에 관계하는 효소활성을 가진다.

본발명의 PHA 합성효소 및 효소를 코딩하는 유전자에 대하여 이하에 더욱 상세하게 설명한다.

YN2균주로부터, 발명자들은 상기 기질특이성을 표시하는 PHA 합성효소로 번역되는 유전자의 클로닝을 행하게 하여, 적어도 2개의 아미노산배열을 함유하는 PHA 합성효소의 존재를 확인하였다. 즉, YN2균주의 앰색체유전자중에서 본발명의 PHA 합성효소는, 배열번호2의 염기배열을 가지는 DNA에 의하여 코딩된 배열번호1의아미노산염기배열을 함유하는 PHA 합성효소 및 배열번호4의 염기배열을 가지는 DNA에 의하여 코딩된 배열번호3의 아미노산염기배열을 함유하는 PHA합성효소등의 2개의 효소를 가진다. 배열번호2 및 4의 염기배열의 유전자 DNA는 이하의 처리에 의해 클로닝을 행한다.

PHA 합성효소는 슈도모나스 치코리이 YN2균주의 염색체유전자로부터 번역되는 효소단백질이므로, 소망의 PHA 합성효소를 함유하는 염색체DNA는 우선 획득된다. 염색체DNA는 공지의 분리방법에 의해 YN2균주 셀로부터 분리된다. 예를 들면, YN2균주는 LB 배지 또는 M9 배지에 적절한 탄소원을 부가하여 배양한후, 균체를 파쇄하고, 예를 들면 마르머등문헌(「Journal of Molecular Biology, 3권 208페이지(1961)」)에 설명된 바와 같이 염색체 DNA를 제조한다.

다음에, 상기와 같이 얻어진 염색체 DNA로부터 유전자라이브러리(library)를 제조한다. 염색체 DNA를 적합한 제한효소(즉, Sau3AI)를 이용하여 분해하고, 적당한 단편길이는 제한효소(즉, BamHI)에 의하여 절단된 연결가능한 벡터에 연결되어 유전자라이브러리를 제조한다.

라이브러리의 제조에 이용되는 벡터에 따라서, 적당한 단편길이는, 즉통상적인 플라즈미드 벡터에 대해서는 대략 4000 내지 25000bps로 변화하고, 코스미드(cosmid)나 파이지(Phage)벡터에 대해서는 대략 15000 내지 30000bps로 변화한다. 적당한 길이의 DNA단편은, 자당밀도구배를 이용한 방법 및 문헌「Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory(1982)」에 기재된 아가로우즈 겔(agarose gel)을 사용한 방법 등의 공지된 방법에 의하여 수집되어도 된다.

대장균을 유전자라이브러리의 숙주미생물로서 이용하므로, 벡터는 숙주미생물(대장균)에서 자율적으로 증식할 수 있는 파이지벡터 또는 플라즈미드벡터이다. 파이지 또는 코스믹(cosmic)벡터의 예로서는, pWE15, M13, λEMLB3, λEMBL4, λFIXⅡ, λDASHII, λZAPII, λgt10, λgt11, Charon4A 및 Charon21A를 일반적으로 포함한다. 플라즈미드벡터로서 흔히 사용되는 예는, pBR, pUC, pBluescriptII, pGEM, pTZ 및 pETr기를 포함한다. 대장균이외에, 다양한 셔틀벡터, 즉, 슈도모나스 속등의 복수의 숙주미생물을 자율적으로 증식할 수 있는 벡터가 사용될 수 있다. 또한, 상기 벡터는 그들을 연결하고 적당한 제한효소로 절단하는 염색체 DNA에 따라서 소망의 단편을 제조할 수 있다.

염색체 DNA 단편은 DNA 리가아제(ligase)를 사용하여 벡터단편으로 연결된다. 예를 들면, 시판하는 라이게션 키트(Takara Shuzo 주식회사제)가 사용된다. 따라서, 예를 들면, 다양한 염색체 DNA단편은 플라지미드 벡터단편에 의하여 연결되어 다양한 DNA단편(이하, "유전자 라이브러리"라 칭함)을 함유하는 재조합플라즈미드의 혼합물을 제조한다.

적절한 길이의 염색체 DNA 단편을 사용하는 방법이외에, 문헌「Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982」에 기재된 바와 같이, 모든 mRNA는 YN2균주로부터 추출되고 정제되어, 역전사효소를 사용한 cDNA단편의 제조를 위하여 사용되는 방법에 의하여 유전자라이브러리를 제조한다. 또는, 문헌 「Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982」에 기재된 바와 같이, 제조된 벡터는 유전자 라이브러리에 이용되어 대장균을 형질전환 또는 형질도입한 후에, 숙주대장균을 배양하여, 대량으로 유전자라이브러리를 증폭할 수 있다.

유전자 DNA 단편을 함유하는 재조합 벡터는 공지의 방법에 의하여 숙주미생물로 도입될 수 있다. 예를 들면, 숙주미생물로서 대장균을 이용하는 경우에, 재조합플라즈미드벡터는 염화칼슘법문헌(「Jourbal of Molecular Biology 53권, 159페이지 (1970)」), 염화루비듐방법문헌(「Method in Enzymology, 68권 253페이지(1979)」), 일렉트로포레이션(electroporation)(Current Protocols in Molecular Biology, 1권 1.8.4페이지(1994))을 사용하여 도입될 수 있다. 코즈미드벡터 또는 파이저벡터를 이용하는 경우에, 숙주대장균의 형질도입은 인 비트로 패키징(in vitro packaging)(문헌「Current Protocols in Molecular Biology, 1권 5.7.1페이지(1994)」)를 사용하여 이루어진다. 또는, 재조합벡터를 유지하는 균주와의 접합전달은 벡터를 보유하는 균주를 제조하도록 이용된다.

다음에, 유전자라이브러리로부터, 프로브는 YN2균주의 PHA 합성효소 유전자를 함유하는 DNA단편을 획득하기 위하여 제조한다.

몇몇의 염기배열은, 공지의 미생물에 있어서 PHA 합성효소 유전자에 대하여 보고되어 왔다. 예를 들면, 문헌「Peopels, O.P. and Sinskey, A. J., J. Biol. Chem., 264, 15293(1989)」; 문헌「Huisman, G. W. et al., J. Biol. Chem., 266, 2191(1991)」;문헌「Pieper, U. et al., FEMS Microbiol. Lett., 96, 73(1992)」; 문헌「Timm, A. and Ateinbuchel, A., Eur. J. Biochem., 209, 15(1992)」; 문헌「Matsusaki, H. et al., J. Bacteriol., 180, 6459(1998)」 등이 있다. 상기보고된 염기배열을 비교하여, 염기배열의 보존도가 높은 영역을 선택한 다음에 폴리머라제연쇄반응(이하, "PCR"이라 칭함)에 사용되는 프라이머용의 올리고누클레오티드을 설계한다. PHA 합성효소 유전자의 공통특징을 이용하는 프리머용의 상기 올리고누클레오티드는, 문헌「Timm, A. and Steinbuchel, A., Eur. J. Biochem., 209, 15(1992)」에 기재된 염기배열을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 올리고누클레오티드는, 설계된 염기배열에 따라서, 예를 들면, 「Custom Synthesis Service」, 「Amersham-Pharmacia Biotech」등의 시판하는 DNA합성장치등을 이용하여 합성화할 수 있다.

본발명의 YN2균주로부터 유래된 PHA 합성효소 유전자에 대하여, 배열번호5 및 6를 가지는 염기배열을 함유하는 합성 DNA를 설계했다.

다음에, 프라이머로서 설계한 올리고누클레오티드는 주형으로서 YN2주의 염색체DNA를 사용하여 폴리머라제(PCR) 연쇄반응을 행하여 PCR증폭된 단편을 얻는다. PCR증폭단편은, 프리머로부터 유래되고, PHA 합성효소 유전자에 공통하는 염기배열을 양단에 포함한다. 주형으로서 YN2균주의 자체의 PHA 합성효소 유전자로부터 유래된 부분염기배열은, 양단의 프라이머에서 상보적인 염기배열사이에, 함유된다.

따라서, 얻어진 PCR증폭단편은, YN2균주의 PHA 합성효소 유전자와 거의 100% 상동성이며 군체교배의 프로브로서 높은 S/N비가 표시되는 것이 기대된다. 또한, 하이브리다이제이션의 스트린전시 제어(stringency control of hybridization)가 용이하다.

상기 PCR증폭단편은 적당한 시약으로 표시하여, PHA 합성효소 유전자를 보유하는 재조합 대장균균주을 선택하여 상기 염색채의 DNA라이브러리를 컬러니하이브라이징(colony-hybridizing)하는 프로브로서 이용한다(Current Protocols in Molecular Biology, 1권, 페이지 6.0.3(1994)). 예를 들면, PCR증폭단편의 표시는 표시된 효소를 이용하는 범용검색계 또는 AlkPhosDirect(Amersham-Pharmacia Biotech)등의 시판 키트를 이용할 수 있다.

PHA 합성효소 유전자를 함유하는 유전자단편을 보유하는 재조합 대장균균주는, 유전자형을 이용하는 상기 방법이외에도, PHA의 합성효소를 직접 평가하는 표현형을 사용하는 방법에 의하여 선택한다. 즉, 재조합 대장균균주에서 보유된 PHA 합성효소 유전자로부터 PHA 합성효소의 발현에서, PHA는 PHA 합성효소에 의하여 제조된다. PHA합성은, PHA 합성효소가 발현되는 재조합 대장균균주를 선택하도록 검색된다. PHA합성은, 예를 들면, 수단블랙비(Sudan Black B)(문헌「Archives of Biotechnology, 71권 283페이지(1970)」)에 의하여 염색하거나 위상차현미경에 의하여 PHA축적의 결정에 의하여 검색된다.

플라즈미드는 알카리방법을 사용하여 상기 방법중에서 임의의 방법에 의하여 선택된 재조합 대장균으로부터 수집된다(문헌「Current Protocols in Molecular Biology, 1권, 1.6.1페이지(1994)」). 수집된 플라즈미드는 PHA 합성효소 유전자를 포함하는 DNA단편 또는 PHA 합성효소 유전자를 부분적으로 함유하는 다수의 DNA단편을 제조하기 위해 이용될 수 있다. 얻은 DNA단편은, 예를 들면, 생거의 염기배열방법에 의하여 염기배열된다(문헌「Molecular Cloning, 2권 페이지 13.3(1989)」). 구체적으로는, DNA 염기배열분석장치 377A(Parkin Elmer)등의 자동적인 염기배열분석장치를 사용하는 다이-프라이머(dye-primer)방법 또는 다이-터미네이터(dye-terminator)방법에 의하여 이루어진다. 혼합된 DNA단편의 벡터자체의 염기배열은 공지이고, 클로닝된 DNA단편의 염기배열은 일의적으로 분석이 가능하다.

PHA 합성효소 유전자를 함유하는 얻은 DNA단편을 모두 염기배열한 후에, 화학합성법, 주형으로서 염색체DNA을 사용하는 PCR 또는 제한효소에 의해 염기배열을 가지는 DNA단편의 퇴화등의 적합한 방법에 의하여 제조된 DNA단편을 사용하여 프로브로서 하이브리다이제이션하여 본발명의 PHA 합성효소 유전자 DNA를 제조한다.

본발명자는, 상기 절차에 의하여 YN2균주로부터 상기 기질특이성을 표시하는 PHA 합성효소로 번역된 유전자를 선택하고, 적어도 2개의 아미노산배열을 구비하는 PHA 합성효소를 발견하였다. 즉, 본발명자는, YN2주의 염색체 DNA로부터 수집되고 배열번호2의 염기배열 가지는 PHA 합성효소 유전자, 및 유전자에 의해 코딩되고 일련번호 4의 염기배열을 가지는 PHA 합성효소 뿐만 아니라 배열번호1의 아미노산을 가지는 PHA 합성효소, 및 유전자에 의해 코딩되고 일변번호3의 아미노산을 가지는 PHA 합성효소를 발견했다.

본발명의 PHA 합성효소 유전자는, 동일한 아미노산 배열을 가지고 상이한 축중코돈(codon)인 동일한 폴리펩티드을 코딩하는 축중이성체를 포함한다. 더욱 구체적으로는, 숙주에 의존해서 동일한 아미노산을 코딩하는 축중코돈을 더욱 빈번히 선택하여 변환함으로써 축중 이성체를 또한 포함한다. YN2균주의 고유의 일렬번호1의 아미노산배열을 가지는 PHA 합성효소 및 일렬번호3의 아미노산배열을 함유하는 PHA 합성효소이외에, 본발명의 PHA 합성효소는, PHA합성활성 및 기질특이성이 손상되지 않는 한 또는 아미노산배열을 유지하는 한, 몇몇의 아미노산의 결실, 치환 및 부가등의 변이가 있다. 결실, 치환 및 부가등의 변이는 일련번호 2 또는 4를 가지는 YN2균주의 고유의 PHA 합성효소 유전자에 의거한 사이트 돌연변이도입기술(문헌「Current Protocols in Molecular Biology 1권 8.1.1페이지(1994)」)에 의해 도입될 수 있다.

본발명의 재조합벡터는, 슈도모나스 속 또는 숙주인 대장균등의 미생물을 사용하여 본발명의 재조합 PHA 합성효소를 발현하는 용도로 이용된다. 따라서, 본발명의 재조합벡터 자체는, 발현을 위한 프로모터, 본발명의 PHA 합성효소 유전자 DNA 및 숙주에 적합한 전사종결배열을 함유하면서, 이용되는 숙주에서 자체적으로 복제할 수 있는 것이 바람직하다. 또한, 재조합벡터가 도입된 후에 선택을 위해 사용되는 다양한 마커(marker)유전자를 가지는 벡터가 이용되는 것이 바람직하다.

슈도모나스속 및 대장균등의 다양한 형태의 백터리아에 적합한 발현벡터는 광범위한 숙주에 의하여 복제 및 보유되는 RK2복제기점을 가지는 pLA2917(ATCC 37355) 또는 RSF1010복제기점을 가지는 pJRD215(ATCC 37533)을 포함할 수 있다. 이것에 제한되지 않고, 광범위한 숙주에 의하여 복제되고 보유되는 복제기점을 가지는 임의의 벡터를 사용하여도 된다. 숙주로서 세균내에 발현될 수 있는 임의의 프로모터가 사용되어도 된다.; 예를 들면, 프로모터는, trp, trc, tac, lac, Pl, Pr, T7 및 T3 프로모터등의 대장균, 파이지등으로부터 유래된다.

효모를 숙주로서 이용하는 경우에, 발현벡터는 YEp13, YCp50, pRS 또는 pYEX벡터이어도 된다. 프로모터는, 예를 들면 GAL 또는 AOD프로모터이어도 된다.

본발명의 형질전환미생물은, 본발명의 재조합벡터를 재조합벡터를 제조되는 동안 이용되는 발현벡터에 적합한 숙주로, 도입함으로써 생산될 수 있다. 숙주로서 이용되는 세균류로서, 에세리치아속, 슈도모나스속, 랄스토니아속, 알카리유전자속, 코마모나스속, 벌크홀데리아속, 아그로박테리아움속, 프라보박테리아움속, 비브리오속, 엔터로박테르속, 리조비움속, 그루코노백터속, 아시네토백터속, 모라섹라속, 니트로소모나스속, 아에로모나스속, 파라코쿠스속, 바실루스속, 크로스트리디움속, 락토바실루스속, 코리네박테리움속, 알트로박테르속, 아크로모박테르속, 미크로코쿠스속, 미코박테리움속, 스트렙토코쿠스속, 스트렙토미세스속, 액티노미세스속, 노르카디아속 및 메틸로박테리움속을 포함한다. 재조합DNA는 상기 염화칼슘방법 및 일렉트로포레이션등의 적합한 기술에 의하여 세균에 도입될 수 있다.

상기 세균이외에, 사카로미세스속 및 칸디다속 등의 효모 및 곰팡이를 숙주로서 사용하여도 된다. 재조합DNA는, 예를 들면, 일렉트로포레이션(문헌「Methods Enzymol., 194, 183-187(1990)」), 스페로프래스트방법(문헌「Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84, 1929-1933(1978)」) 및 리티움 아세테이트 방법(문헌「J. Bacteriol., 153, 163-168(1983)」)에 의하여, 효모로 도입될 수 있다.

본발명의 PHA 합성효소는, 상기 처리에 의하여 제조된 본발명의 형질전환체를 배양하고, 재조합단백질로서 합성효소를 생산하는 도입된 발현벡터에서 대응하는 PHA 합성효소 유전자를 형성함으로써 제조될 수 있다. 본발명의 PHA 합성효소는, 세균 또는 배양 부유물에서 배양된 배양물중에서 생산되어 축적되고, 재조합효소단백질의 배양에 사용되는 배양물로부터 분리된다. 상기 목적을 위하여, 본발명의 형질전환체는, 숙주를 배양하기 위해 이용되는 통상적인 처리에 의하여 배양될 수 있다. 미생물의 배양시에 이용되는 배치(batch), 유동배치, 연속적인 배양 및 리액터형식등의 임의의 통상적인 방법에 의해 배양할 수 있다. 상기 배양은, 예를 들면, 상기 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 유전자를 발현하기 위해 인듀서(inducer)를 함유하는 배지를 사용하여 배양하여도 된다.

숙주로서 대장균등의 세균을 사용하여 얻은 형질전환체에 대해서는, 배양을 위해 사용되는 배지는 LB기지 및 M9기지등의 합성배지 또는 완전배지이어도 된다. 미생물은, 8 내지 72시간동안, 25 내지 37℃의 배양온도에서 호기적으로 배양함으로써, 성장될 수 있다. 다음에, 세균은 세균내에 축적된 PHA 합성효소를 얻기 위하여 수집된다. 미생물용 탄소원의 예는, 글로코스, 프락토스, 수크로스, 말토스, 갈락토스 및 스타치등의 당류; 에탄올, 프로판올 및 부탄올등의 저급알코올; 글리세롤등의 폴리알코올; 아세트산, 시트르산, 숙신산, 타르타르산, 젖산 및 글로콘산등의 유기산; 프로피온산, 부탄산, 펜탄산, 헥산, 헵탄산, 옥탄산, 노난산, 데칸산, 운데칸산 및 도데칸산등의 지방산을 포함한다.

질소원의 예는, 암모니아; 염화암모늄 및 인산암모늄등의 암모늄염; 펩톤, 고기추출물, 효소추출물, 몰트추출물, 카세인 분해물 및 콘 스팁 리쿼(corn steep liquor)등의 자연물생산유래체를 포함한다. 무기물의 예로서, 인산제1칼륨, 인산제2칼륨, 인산마그네숨, 황산마그네슘 및 염화나트륨을 포함한다. 배지에는, 예를 들면, 마커유전자로서 이용되는 각종 약제내성유전자에 따라서, 카나미신, 암피시린, 테트라사이크린, 클로암페니콜 및 스트렙토마이신등의 항생물질을 함유할수 있다.

발현벡터에 있어서, 유도성 프로모터를 사용하는 경우, 형질전환한 미생물을 배양하는 동안 프로모터의 종류에 따라서 적합한 유도물질을 첨가함으로써 발현이 강화될 수 있다.

예를 들면, 유도물질은 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG), 테트라사이크린 또는 인돌아크릴산(IAA)을 열거할 수 있다.

얻어진 배양물을 원심분리하고 수집하며, 아피니티 크로마토그라피, 양이온 또는 음이온 교환 크로마토그라피 및 겔여과를 단독으로 또는 적합하게 조합하는등의 기술에 의하여 처리함으로서 분리되어 정제될 수 있다. 정제물질이 소망의 효소인지의 여부는 SDS폴리아크릴아미드 겔 일렉트로포레시스 및 웨스턴 브로팅(Western boltting)등의 통상적인 방법에 의하여 판정된다.

본발명의 형질전환미생물의 배양, 본발명의 형질전환미생물에 의한 PHA 합성효소의 생산 및 세균세포내의 축적, 및 셀로부터 PHA 합성효소의 수집 및 정제에 대하여 상기 설명한 방법에 제한되지 않는다.

본발명의 형질전환미생물은, 배양함으로써 재조합 PHA 합성효소를 발현시켜 소망의 PHA를 생산할 수 있다. 예를 들면, PHA 합성효소가 작용하는 소망의 PHA에 해당하는 기질을 배지에 첨가하면서, 미생물을 상기 배양조건하에서 배양하여 재조합PHA 합성효소를 생산한다. 통상적으로 사용한 클로로포름등의 유기용매에 의한 추출에 의하여 배양 및 생산균체로부터 회수되는 것이 가장 간편하다. PHA를 회수하기 위하여, 클로로포름등의 유기용매를 사용하는 사용이 바람직하지 않는 환경에서, SDS등의 계면활성제, 리조지음등의 효소, 또는 EDTA, 하이포아염소산나트륨 및 암모니아등의 약제에 의하여 배양을 처리하여 PHA이외의 다른 세균성분을 제거한다. PHA의 생산을 위한 본발명의 형질전환미생물의 배양, 배양된 미생물에 의한 PHA의 생산 및 배양된 미생물내에서의 축적, 및 재조합미생물로부터 PHA의 회수는 상기 방법에 제한되지 않는다.

(실시예)

본발명은 실시예를 참조하여 더욱 상세하게 설명하지만, 이러한 실시예는 본발명의 최선의 실시예로서 기술하고 본발명의 기술적인 범위를 제한하지 않는다.

(실시예1) YN2균주의 PHA합성효소유전자의 클로닝

YN2균주를 100ml의 LB배지(1% 폴리펩톤, 0.5%효모추출물, 0.5%염화나트륨, pH 7.4), 30℃에서 하룻밤동안 배양한 다음에 마머에 의하여 기재된 바와 같이 염색체 DNA를 분리하여 회수한다. 얻어진 염색체DNA는 제한 효소 BglⅡ를 이용하여 완전하게 분해한다. 벡터 pUC18은 제한 효소 BamHⅠ에 의하여 절단한다. 말단의 부분의 탈인산화(문헌「Molecular Cloning, 1권, 5.7.2페이지(1989), Cold Spring Harbor Laboratory」)후에, 벡터의 절단된 부분(cloning site) 및 BglⅡ의 완전한 분해후의 염색체DNA단편을, DNA연결키트Ver.Ⅱ(Takara Shuzo주식회사제)를 사용하여, 연결한다. 염색체 DNA 단편을 통합한 프라즈미드벡터는, 대장균 HB101을 형질전환하여 YN2균주의 염색체 DNA 라이브러리를 제조하기 위해 사용된다.

다음에, YN2균주의 PHA합성효소 유전자를 함유하는 DNA단편을 선택하기 위하여, 컬러니 하이브리다이제이션용 프로브가 제조된다. 배열번호 5 및 6의 염기배열을 구성하는 올리고누클레오티드를 합성하고(Amersham-Pharmacia Biotech) 염색체DAN를 주형으로서 사용한 PCR용 프라이머로서 사용한다. PCR증폭DNA단편은 프로브로서 이용한다. 프로브의 표식화는 시판가능한 표식화 효소계 AlkPhosDirect(Amersham-Pharmacia Biotech)를 이용하여 행한다. 이와 같이 얻어진 표식화된 프로브는, 컬러니하이브리다이제이션에 의하여 YN2균주의 염색체DNA라이브러리로부터 PHA합성효소 유전자를 함유하는 재조합 플라즈미드을 함유한 대장균주을 선택하기 위해 사용한다. 선택된 균주로부터, 알칼리방법에 의하여 플라스미드를 수집하여 PHA합성효소유전자를 함유하는 DNA단편을 제조한다.

이와 같이 얻어진 유전자 DNA단편은, 불화합성군의 IncP, IncQ 또는 IncW에 속하지 않는 폭넓은 균주의 복제영역을 포함하는 벡터 pBBR112에서 재조합된다. 재조합 플리즈미드는, 일렉트로포레이션에 의하여 슈도모나스 치코리이 YN2m1주(PHA합성능력이 흠결된 균주)로 형질전환된 다음에, YN2ml균주는 PHA합성능력을 다시 획득하여 상보성을 나타낸다. 선택된 유전자 DNA단편은 슈도모나스 치코리이 YN2ml에서 PHA합성효소로 번역할 수 있는 PHA합성효소유전자를 함유한다.

PHA합성효소유전자를 구비하는 DNA단편은 생거의 방법(Sanger's sequencing method)에 의해 염기배열된다. 따라서, 펩티드사슬을 코딩하는 배열번호 2 및 4의 염기배열을 각각 가지는 결정된 염기배열을 발견하였다. 이하에 설명한 바와 같이, 펩티드고리로 구성된 모든 단백질은 효소활동성을 가지고, 배열번호 2 및 4의 염기배열은 PHA합성효소유전자인 것이 판명되었다. 즉, 배열번호 2 및 4의 염기배열은 각각 배열번호 1 및 3의 아미노산염기배열을 코딩하고 상기의 아미노산염기배열을포함하는 단백질 단독으로 PHA를 합성할 수 있는 것을 확인하였다.

(실시예2) YN2균주의 PHA합성효소유전자의 발현벡터 재조합

PHA배열번호2를 가지는 PHA합성효소유전자는 주형으로서 염샘체 DNA를 사용하여 PCR되고 PHA합성효소유전자의 전체길이를 재생산한다. 배열번호2의 염기배열에 대하여 상류측프라이머이고 개시코돈의 염기배열상류측인 염기배열을 가지는 올리고누클레오티드(배열번호7) 및 배열번호2의 염기배열에 대한 하류측 프라이머이고 종료코돈의 염기배열하류측인 염기배열을 가지는 올리고누클레오티드(배열번호8)가 설계되고 제조된다(Amersham-Pharmacia Biotech). 프라이머로서 상기 올리고누클레오티드를 사용하고, PCR을 행하여 PHA합성효소유전자의 전체길이를 증폭한다(LA-PCR kit; Takara Shuzo주식회사제).

마찬가지로, 배열번호4의 염기배열을 가지는 PHA합성효소유전자는 주형으로서 염색체DNA를 사용하여 PCR되고 PHA합성효소유전자의 전체길이를 재생산한다. 배열번호4의 염기배열에 대하여 상류측프라이머이고 개시코돈의 염기배열상류측인 염기배열을 가지는 올리고누클레오티드(배열번호9) 및 배열번호4의 염기배열에 대한 하류측 프라이머이고 종료코돈의 염기배열하류측인 염기배열을 가지는 올리고누클레오티드(배열번호10)가 설계되고 제조된다(Amersham-Pharmacia Biotech). 프라이머로서 상기 올리고누클레오티드를 사용하여, PCR을 행하여 PHA합성효소유전자의 전체길이를 증폭한다(LA-PCR kit; Takara Shuzo주식회사제).

얻은 PHA합성효소유전자의 전체길이을 함유하는 PCR증폭단편의 각각은 제한효소HindⅢ을 사용하여 완전하게 분해한다. 또한, 발현벡터 pTrc99A는 제한효소HindⅢ로 절단하고 탈인산화처리(Molecular Cloning, 1권 5.7.2페이지(1989), Cold Spring Harbor Laboratory)한다. 발현벡터pTrc99A의 절단부위에, 양끝부분에서 제거된 불필요한 염기배열로부터 PHA합성효소유전자의 전체길이를 가지는 DNA단편을, DNA연결키트Ver.Ⅱ(Takara Shuzo주식회사제)을 이용하여, 연결한다.

얻어진 재조합플라스미드을 이용하여, 대장균 HB101(Takara Shuzo 주식회사제)을 염화칼슘방법에 의하여 형질전환했다. 제조합체를 배양하고, 재조합 플라스미드는 개별적으로 증폭되고 수집된다. 배열번호4의 유전자 DNA를 보유하는 재조합플라스미드는 pYN2-C2(배열번호4로부터 유래)로 표시하면서, 배열번호2의 유전자 DNA을 유지하는 재조합 플라스미드는 pYN2-C1(배열번호 2로부터 유래)로 표시한다.

(실시예3)

PHA합성효소 유전자 재조합 대장균을 이용한 PHA 생산(1)

실시예2에서 얻은 재조합플라스미드를 이용하여, pYN2-C1(배열번호2로부터 유래) 및 pYN2-C2(배열번호4로부터 유래), 대장균 HB101fB(fadB흠결균주)는 염화칼슘법에 의하여 형질전환되어 각각의 재조합플라스미드를 유지하는 재조합대장균, pYN2-C1 및 pYN2-C2재조합주를 제조한다.

pYN2-C1 및 pYN2-C2재조합주의 각각은 0.5%효소추출물 및 0.1%FPVA를 함유하는 M9 배지의 200mL로 식균하고, 배지는 125스트록스(strokes)/분의 속도로, 37℃에서 진탕배양한다. 24시간 후, 셀은 원심분리에 의하여 수집되어, 차가운 메탄올로 한 번 세정하여 동결건조한다.

상기 동결건조된 펠렛(pellet)은 100mL의 클로로포름에서 현탁하고 20시간동안 60℃에서 교반하여 PHA를 추출한다. 0.45㎛의 기공크기를 가진 멤브레인 필터를 통하여 추출물을 정제한 후에, 거른액을 회전증발에 의하여 농축한다. 다음에, 농축액을 냉 메탄올로 재현탁하고 침전물을 회수하고 진공건조하여 PHA를 생산한다. 이와 같이 얻어진 PHA는 통상적인 방법으로 메타올시스(methanolysis)를 행한후 가스 크로마토그라프질량분석기(GC-MS, Shimadzu QP-5050, EI technique)를 사용하여 분석하여 메틸-에스테르화된 PHA 모노머유닛의 동정을 행하였다. 표1은 각 균주에 대하여, 셀건조중량, 회수된 PHA에 폴리머건조중량, 셀당 폴리머수율(폴리머 건조중량/셀건조중량) 및 모노머유닛의 동정을 함께 표시한다.

	pYN2-C1 재조합균주	pYN2-C2 재조합균주
균체건조중량	1150 ㎎/L	1200 ㎎/L
폴리머건조중량	101 ㎎/L	110 ㎎/L
폴리머건조중량/균체건조중량	9%	9%
모노머유닛 조성(영역비)
3-하이드록시부티르산	0%	0%
3-하이드록시발레르산	0%	0%
3-히드록시헥산산	0%	0%
3-히드록시헵탄산	3%	3%
3-히드록시옥탑산	8%	10%
3-히드록시오난산	2%	1%
3-히드록시데칸산	12%	10%
3-히드록시-5-(4-플루오로페닐)발레르산	75%	76%

상기 결과는, pYN2-C1 및 pYN2-C2 재조합균주와 함께, 기질 5-(4-플르오로페닐) 발레르산으로부터, 대응하는 3-하이드록시-5-(4-플루오로페닐) 발레르산으로부터 유래되는 화학식(Ⅰ)으로 표시되는 모노머유닛을 주성분으로하는 PHA를 생산하는 것을 나타내고 있다. 그러므로, pYN2-C1 및 pYN2-C2재조합균주는 각각, 배열번호 2 및 4의 염기배열을 가지는 PHA합성효소유전자로부터 번역되는 배열번호 1 및3의 아미노산염기배열을 가지는 PHA합성효소만을 생산하고, 양 균주도 마찬가지로 기질 5-(4-플루오로페닐) 발레르산을 대응하는 3-히드록시-5-(4-플루오로페닐) 발레르산으로부터 유래되는 화학식(Ⅰ)에 의해 표시되는 모노머유닛으로, 변환하여 모노머유닛을 함유하는 PHA를 생산한다.

(실시예4) PHA합성효소 유전자 재조합 대장균을 이용한 PHA 생산(1)

실시예2에서 얻은 재조합플라스미드를 이용하여, pYN2-C1(배열번호2로부터 유래) 및 pYN2-C2(배열번호4로부터 유래), 대장균 HB101fB(fadB흠결주)를 염화칼슘법에 의하여 형질전환하고, 상기 재조합플라스미드로부터 재조합대장균주를 제조한다.

pYN2-C1 및 pYN2-C2 재조합균주의 각각은 0.5%효소추출물 및 0.1% 4-시클로헥실부티르산을 함유하는 M9 배지의 200mL로 식균하고, 기지는 125스트록스(strokes)/분의 속도로, 37℃에서 진탕배양한다. 24시간 후, 셀을 원심분리에 의하여 회수하고, 냉 메탄올로 한 번 세정하여 동결건조한다.

상기 동결건조된 펠렛(pellet)은 100mL의 클로로포름에서 현탁하고 20동안 60℃에서 교반하여 PHA를 추출한다. 0.45㎛의 기공크기를 가진 멤브레인 필터를 통하여 추출물을 정제한 후에, 거른액을 회전증발에 의하여 농축한다. 다음에, 농축액을 냉 메탄올로 재현탁하고 침전물을 회수하고 진공건조하여 PHA를 생산한다. 이와 같이 얻어진 PHA는 통상적인 방법으로 메타올시스(methanolysis)를 행한후 가스 크로마토그라프질량분석기(GC-MS, Shimadzu QP-5050, EI technique)를 사용하여 분석하여 메틸-에스테르화된 PHA 모노머유닛의 동정을 행하였다. 표2은 각 균주에 대하여, 셀건조중량, 회수된 PHA에 폴리머건조중량, 셀당 폴리머수율(폴리머 건조중량/셀건조중량) 및 모노머유닛의 동정을 함께 표시한다.

	pYN2-C1 재조합균주	pYN2-C2 재조합균주
균체건조중량	900㎎/L	880㎎/L
폴리머건조중량	55㎎/L	52㎎/L
폴리머건조중량/균체건조중량	6%	6%
모노머유닛 조성(영역비)
3-히드록시부티르산	0%	0%
3-히드록시발레르산	0%	0%
3-히드록시헵산산	0%	0%
3-히드록시헵탄산	1%	0%
3-히드록시옥탑산	4%	5%
3-히드록시오난산	2%	1%
3-히드록시데칸산	9%	8%
3-히드록시5-4(플루오로페닐)발레르산	84%	86%

상기 결과는 pYN2-C1 및 pYN2-C2 재조합균주와 함께, 기질 4-시클로헥실부티르산으로부터, 대응하는 3-하이드록시-4-시클로헥실부티르산으로부터 유래되는 화학식(Ⅳ)으로 표시되는 모노머유닛을 주성분으로 하는 PHA를 생산하는 것을 나타내고 있다. 그러므로, pYN2-C1 및 pYN2-C2재조합균주는 각각, 배열번호 2 및 4의 염기배열을 가지는 PHA합성효소유전자로부터 번역되는 배열번호 1 및 3의 아미노산염기배열을 가지는 PHA합성효소만을 생산하고, 양 균주도 마찬가지로 기질 4-시클로헥실부티르산에 대응하는 3-히드록시-4-시클로헥실부티르산으로부터 유래되는 화학식(Ⅸ)에 에 의해 표시되는 모노머유닛으로 유사하게 변환하여 모노머유닛을 함유하는 PHA를 생산한다.

상기 실시예3의 결과와 함께 본실시예의 결과는, 배열번호 1 및 3의 아미노산염기배열을 가지는 PHA합성효소가, 상호간의 기질의 특이성이 유사한 효소활성을 가지는 것으로 판명되었다.

본발명의 PHA 합성효소 및 이 PHA 합성효소를 코딩하는 유전자는, 신규한 미생물 슈도모나스·치코리이·YN2균주로 유래되는 것이고, 신규한 곁사슬구조를 가지는 모노머유닛을 선택적으로 함유한 PHA 합성을 행하는 기질특이성을 나타낸다. 또한, 이 PHA 합성효소 유전자를 함유한 재조합벡터 및 이 재조합벡터에 의해 형질전환된 형질전환미생물은, 슈도모나스·치코리이·YN2균주와 마찬가지의 기질특이성을 나타내는 PHA합성능을 가지는 것으로 된다. 이와 같이, 본발명의 PHA 합성효소 유전자는, 신규한 측쇄구조를 가지는 모노머유닛을 선택적으로 함유하는 PHA 합성을 가능하게 하는 효소를 코딩하고, 여러종류의 유용한 물성을 가지고, 기능성폴리머에 응용하는 것이 기대되는 PHA를 합성하므로, 유용한 형질전환미생물의 제작을 가능하게 한다.

Claims

배열번호1의 아미노산배열을 가지는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트합성효소.
배열번호1의 아미노산배열을 실질적으로 보유하고, 그 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소의 활성이 손상되지 않는 범위내에서 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되는 변형아미노산배열을 가지는 것을 특징으로 하는 폴리히드록실알카노에이트합성효소.
제2항에 기재된 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소의 아미노산배열을 코딩하는 DNA염기배열을 함유하는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트합성효소유전자.
배열번호1의 아미노산배열을 코딩하는 배열번호2의 DNA염기배열을 함유하는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 유전자.
배열번호3의 아미노산배열을 가지는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트합성효소.
배열번호3의 아미노산배열을 실질적으로 보유하고, 그 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소의 활성이 손상되지 않는 범위내에서 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되는 변형아미노산배열을 가지는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트합성효소.
제6항에 기재된 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소의 아미노산배열을 코딩하는 DNA염기배열을 함유하는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트합성효소유전자.
배열번호3의 아미노산배열을 코딩하는 배열번호4의 DNA염기배열을 함유하는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 유전자.
폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 유전자로서, 제3항, 제4항, 제7항, 제8항중 어느 한 항에 기재된 유전자를 함유하는 것을 특징으로 하는 재조합벡터.
제9항에 기재된 재조합벡터의 도입에 의해 형질전환된 것을 특징으로 하는 형질전환미생물.
제10항에 기재된 형질전환미생물을, 폴리하이드록시알카노에이트합성효소의 기질을 함유하는 배지에서, 배양하는 단계와, 얻어진 배양물로부터 폴리하이드록시알카노에이트를 유리시키는 단계로 이루어진 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
제10항에 기재된 형질전환미생물을 배양하는 단계와, 형질전환미생물이 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소를 생산하도록 하는 단계로 이루어진 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소의 제조방법.