JP2001275676A - ポリヒドロキシ酪酸合成系酵素群及び該酵素群をコードする遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ＰＨＢ合成に有用である、ＰＨＢ合成系酵素
群、これらをコードする遺伝子、これら遺伝子を組込ん
だ組換えベクター、この組換えベクターを宿主に導入し
て得られる形質転換体、この形質転換体を用いたＰＨＢ
合成系酵素群の製造方法及びＰＨＢの製造方法を提供す
ること。 【解決手段】 バルクホルデリア・セパシア（Burkhold
eria cepacia）ＫＫ０１株から得られたＰＨＢ合成系酵
素群に属する酵素の遺伝子を宿主微生物に導入して得ら
れた形質転換体を培養して、ＰＨＡ合成系酵素群に属す
る酵素あるいはＰＨＢを生産させる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ポリ−３−ヒドロ
キシ酪酸（以下ＰＨＢと記載）合成系酵素群、該酵素群
をコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター、
該ベクターにより形質転換された形質転換体、該形質転
換体を利用したＰＨＢ合成系酵素群の製造方法及び該形
質転換体を利用したＰＨＢの製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】これまで、多くの微生物がポリ−３−ヒ
ドロキシ酪酸（ＰＨＢ）あるいはその他のＰＨＡを生産
し、菌体内に蓄積することが報告されてきた（「生分解
性プラスチックハンドブック」、生分解性プラスチック
研究会編、（株）エヌ・ティー・エス発行、P178-197、1
995）。これらのポリマーは、従来のプラスチックと同
様に、溶融加工等により各種製品の生産に利用すること
ができる。さらに、生分解性であるがゆえに、自然界で
微生物により完全分解されるという利点を有しており、
従来の多くの合成高分子化合物のように自然環境に残留
して汚染を引き起こすことがない。また、生体適合性に
も優れており、医療用軟質部材等としての応用も期待さ
れている。

【０００３】このような微生物産生ＰＨＡは、その生産
に用いる微生物の種類や培地組成、培養条件等により、
様々な組成や構造のものとなり得ることが知られてお
り、これまで主に、ＰＨＡの物性の改良という観点か
ら、このような組成や構造の制御に関する研究がなされ
てきた。とりわけＰＨＢは精力的に研究が行われてきた
が、ホモポリマーの場合においては結晶性が高くかつ脆
い性質を有しているために、耐衝撃性が劣るという物性
上の問題が存在し実用的には不十分であった。このよう
な欠点を克服する方法として、コポリマーを生産する菌
株のスクリーニングが行われた。

【０００４】例えば、アルカリゲネス・ユウトロファス
Ｈ１６株（Alcaligenes eutropusH16、ATCC No.17699）
及びその変異株は、その培養時の炭素源を変化させるこ
とによって、３−ヒドロキシ酪酸（３ＨＢ）と３−ヒド
ロキシ吉草酸（３ＨＶ）との共重合体を様々な組成比で
生産することが報告されている（特表平6-15604号公
報、特表平7-14352号公報、特表平8-19227号公報
等）。

【０００５】特開平5-74492号公報では、メチロバクテ
リウム属（Methylobacterium sp.）、パラコッカス属
（Paracoccus sp.）、アルカリゲネス属（Alcaligenes
sp.）、シュードモナス属（Pseudomonas sp.）の微生物
を、炭素数３から７の第一アルコールに接触させること
により、３ＨＢと３ＨＶとの共重合体を生産させる方法
が開示されている。

【０００６】特開平5-93049号公報、及び、特開平7-265
065号公報では、アエロモナス・キャビエ（Aeromonas c
aviae）を、オレイン酸やオリーブ油を炭素源として培
養することにより、３ＨＢと３−ヒドロキシヘキサン酸
（３ＨＨｘ）の２成分共重合体を生産することが開示さ
れている。

【０００７】特開平9-191893号公報では、コマモナス・
アシドボランス・ＩＦＯ１３８５２株（Comamonas acid
ovorans IFO13852）が、炭素源としてグルコン酸及び
１，４−ブタンジオールを用いた培養により、３ＨＢと
４−ヒドロキシ酪酸とをモノマーユニットに持つポリエ
ステルを生産することが開示されている。

【０００８】しかし、このような共重合成分を加える方
法は、ポリマー生産性が低く、炭素源収率も低いという
課題が残されており、これらは安価な天然物等を炭素源
として利用した場合においても製造コストの上昇につな
がるものであった。

【０００９】また、ＰＨＢホモポリマーに延伸処理を施
して高強度フィルムを作成する試みが報告されている
が、複雑な条件設定や何段階にもわたるプロセスが必要
となる点で、やはり製造コストの上昇につながる懸念が
あり経済性が悪化するおそれがあった（Holmes, P.A.,
In:Developments in Crystalline Polymers-2, Basset
t, D.C.(ed.) p1-65, Elsevier(1988)）。

【００１０】この点に関して、特開平10-176070号公報
では、一定以上の分子量を有する特定のＰＨＢホモポリ
マーを用いる解決方法が開示されているが、ポリマー生
産性あるいは炭素源収率に関しては何ら言及されていな
い。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】以上のように、微生物
産生ＰＨＢの物性改善、生産性の向上においては、その
生産に用いる微生物の種類や培養条件等を変えることに
より、何通りかの組成・構造のものが得られているが、
微生物あるいはＰＨＢ合成系酵素群において、物性を改
善したＰＨＢのポリマー生産性が未だ望むレベルには達
しておらず、公知の微生物あるいはＰＨＢ合成系酵素群
のみでは物性を改善したＰＨＢを高収率に合成すること
は困難であった。

【００１２】したがって、物性を改善したＰＨＢを簡便
且つ再現性よく高収率に製造する方法の開発が望まれて
いた。

【００１３】すなわち、物性を改善したＰＨＢを高収率
に菌体内に蓄積し得る微生物からのＰＨＢ合成系酵素群
をコードする遺伝子の取得、該遺伝子系を含む組換えベ
クター、該ベクターにより形質転換された形質転換体、
該形質転換体を利用したＰＨＢ合成系酵素群の製造方法
及び該形質転換体を利用したＰＨＢの製造方法の開発は
極めて有用かつ重要であると考えられた。

【００１４】すなわち、本発明の目的は、新規なＰＨＢ
合成系酵素群を提供することにある。またこれらのＰＨ
Ｂ合成系酵素群をコードする遺伝子を提供することにあ
る。さらにはＰＨＢ合成酵素活性を高めるため、ＰＨＢ
合成系酵素群遺伝子を組み込んだ組換えベクター、該組
換えベクターにより形質転換された形質転換体を提供す
ることにある。また、該形質転換体を用いたＰＨＢ合成
系酵素群の製造方法、該形質転換体を用いた高収率ＰＨ
Ｂ製造方法を提供することにある。

【００１５】

【課題を解決するための手段】そこで本発明者らは、物
性を改善したＰＨＢの高収率生産を目指し、所望のＰＨ
Ｂを生産し菌体内に蓄積する能力を有する微生物の探
索、及び、このような微生物からのＰＨＢ合成系酵素群
をコードする遺伝子の取得、該遺伝子を含む組換えベク
ター、該ベクターにより形質転換された形質転換体、該
形質転換体を利用したＰＨＢ合成系酵素群の製造方法及
び該形質転換体を利用したＰＨＢの製造方法の開発につ
いて鋭意研究を重ね、高収率にＰＨＢホモポリマーを生
産可能な微生物バルクホルデリア・セパシア（Burkhold
eria cepacia）ＫＫ０１株を見出し、本発明を完成し
た。なお、ＫＫ０１株は寄託番号「ＦＥＲＭ ＢＰ−４
２３５」として、通商産業省、工業技術院、生命工学工
業技術研究所、特許微生物寄託センターに寄託されてい
る。なお、寄託時は、シュードモナス属（Pseudomona
s）に分類されている。

【００１６】本発明者らは、上記課題に基づいて鋭意研
究を行った結果、ＫＫ０１株からＰＨＢ合成系酵素群の
遺伝子をクローニングすることに成功し、本発明を完成
するに至った。

【００１７】すなわち本発明にかかるＰＨＢ合成酵素
は、配列番号：１で示されるアミノ酸配列を有すること
を特徴とするものである。また、この配列番号：１で示
されるアミノ酸配列に対して、このアミノ酸配列を有す
るＰＨＢ合成酵素のＰＨＢ合成活性を損なわない範囲
で、アミノ酸の欠失、置換及び付加の少なくとも１種の
変異を生じさせた変異アミノ酸配列を有するＰＨＢ合成
酵素も本発明に含まれる。さらに本発明には、これらの
アミノ酸配列をコードするＤＮＡを含むＰＨＢ合成酵素
遺伝子が含まれ、このＤＮＡとしては、例えば配列番
号：２で示される塩基配列を有するものが挙げられる。

【００１８】また本発明にかかるβ−ケトチオラーゼ
は、配列番号：３で示されるアミノ酸配列を有するもの
であり、さらにこの配列番号：３のアミノ酸配列に対し
て、このアミノ酸配列を有するβ−ケトチオラーゼのβ
−ケトチオラーゼ活性を損なわない範囲で、アミノ酸の
欠失、置換及び付加の少なくとも１種の変異を生じさせ
た変異アミノ酸配列を有するβ−ケトチオラーゼも本発
明に含まれる。さらに本発明にかかるβ−ケトチオラー
ゼ遺伝子は、配列番号：３のアミノ酸配列またはその変
異配列をコードするＤＮＡを含むβ−ケトチオラーゼ遺
伝子であり、このＤＮＡとしては、例えば配列番号：４
で示される塩基配列を有するものが挙げられる。

【００１９】また、本発明にかかるアセトアセチルＣｏ
Ａリダクターゼは、配列番号：５で示されるアミノ酸配
列を有するものであり、配列番号：５のアミノ酸配列に
対して、アセトアセチルＣｏＡリダクターゼ活性を損な
わない範囲で、アミノ酸の欠失、置換及び付加の少なく
とも１種の変異を生じさせた変異アミノ酸配列を有する
アセトアセチルＣｏＡリダクターゼも本発明に含まれ
る。さらに本発明は、配列番号：５のアミノ酸配列また
はその変異配列をコードするＤＮＡを含むアセトアセチ
ルＣｏＡリダクターゼ遺伝子であり、このＤＮＡとして
は、例えば配列番号：６で示される塩基配列を有するも
のが挙げられる。

【００２０】さらに本発明には、前記ＰＨＢ合成酵素遺
伝子、あるいはさらにβ−ケトチオラーゼ遺伝子及びア
セトアセチルＣｏＡリダクターゼ遺伝子の少なくとも一
方を含む組換えベクターが含まれ、この組換えベクター
によって形質転換された形質転換体も本発明に含まれ
る。

【００２１】また、本発明には、上記の形質転換体を培
養し、得られる培養物からＰＨＢ合成酵素あるいはＰＨ
Ｂ合成系酵素群を取得することを特徴とするＰＨＢ合成
酵素あるいはＰＨＢ合成系酵素群の製造方法、更には、
この形質転換体を培養し、得られる培養物からＰＨＢを
取得する工程を有することを特徴とするＰＨＢの高収率
製造方法が含まれる。

【００２２】

【発明の実施の形態】以下、本発明を更に詳細に説明す
る。

【００２３】本発明のＰＨＢ合成系酵素群遺伝子は、バ
ルクホルデリア・セパシアＫＫ０１株の菌体から分離さ
れるたものである。

【００２４】まず、ＰＨＢ合成系酵素群遺伝子を有する
菌株から染色体ＤＮＡを取得する。染色体ＤＮＡの分離
方法は公知の方法を用いることができる。例えば、ＫＫ
０１株をＬＢ培地、あるいはＭ９培地に適当な炭素源を
加えたもの等で培養した後、例えば、マーマーらの方法
（Journal of Molecular Biology，３巻，２０８頁，１
９６１年）等により染色体ＤＮＡを調製する。

【００２５】上記の方法により得られた染色体ＤＮＡを
適当な制限酵素（例えばSau3AI等）を用いて分解し、適
当な断片長を有する分解物について、これを連結可能な
制限酵素（例えばBamHI等）で切断したベクターに連結
し、遺伝子ライブラリーを作製する。ここでの適当な断
片長とは、通常のベクターを用いるときは４０００〜２
５０００塩基対程度、コスミドあるいはファージベクタ
ーを用いるときは１５０００〜３００００塩基対程度で
ある。適当な長さのＤＮＡ断片を分取する方法として
は、蔗糖密度勾配を用いる方法やアガロースゲルを用い
る方法（Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Labo
ratory出版（1982年））など公知の方法を用いれば良
い。

【００２６】ベクターは、宿主微生物において自律的に
増殖し得るファージベクターまたはプラスミドベクター
が使用される。ファージベクターあるいはコスミドベク
ターとしては、例えばpWE15、M13、λEMBL3、λEMBL4、
λFIXII、λDASHII、λZAPII、λgt10、λgt11、Charon
4A、 Charon21A等が挙げられ、プラスミドベクターとし
ては、例えばpBR系、pUC系、pBluescriptII系、pGEM
系、pTZ系、pET系等が挙げられる。その他、 大腸菌や
シュードモナス属などの複数の宿主微生物で自律的増殖
が可能なベクター等の各種シャトルベクターを使用する
こともできる。このようなベクターについても上と同様
に適当な制限酵素で切断することにより望む断片を得る
ことができる。

【００２７】染色体ＤＮＡ断片とベクター断片との連結
はＤＮＡリガーゼを用いればよく、例えばライゲーショ
ンキット（宝酒造（株）など）を用いて行うことができ
る。このようにして染色体ＤＮＡ断片とベクター断片と
を連結させ、種々の断片を含む組換えプラスミドの混合
物（以下、遺伝子ライブラリーと記載）を作製する。こ
こで遺伝子ライブラリー作製においては、適当な長さの
染色体ＤＮＡ断片を用いる方法の他に、 ＫＫ０１株か
らｍＲＮＡを抽出精製し、逆転写酵素を利用してｃＤＮ
Ａ断片を合成する方法（Molecular Cloning， Cold Spr
ing Harbor Laboratory出版，1982年）を利用すること
もできる。また、遺伝子ライブラリーを、大腸菌に一度
形質転換あるいは形質導入した後、遺伝子ライブラリー
を大量に増幅することも可能である（Molecular Clonin
g，Cold Spring Harbor Laboratory出版，1982年）。

【００２８】宿主微生物への組換えベクターの導入は、
公知の方法により行う。例えば、宿主微生物が大腸菌の
場合、塩化カルシウム法（Journal of Molecular Biolo
gy，53巻，159頁，1970年）、塩化ルビジウム法（Metho
ds in Enzymology，68巻，253頁，1979年）やエレクト
ロポレーション法（Current Protocols in MolecularBi
ology,１巻，184頁,1994年）等を利用できる。また、コ
スミドベクターやファージベクターを利用する場合の形
質導入についてはインビトロ・パッケージング法（Curr
ent Protocols in Molecular Biology,1巻，571頁，199
4年）等を用いることができる。その他、接合伝達によ
る方法も利用可能である。

【００２９】次に、ＫＫ０１株のＰＨＢ合成系酵素群遺
伝子を含むＤＮＡ断片を得るためのプローブを調製す
る。 ＰＨＢ合成系酵素群遺伝子の塩基配列について
は、既にいくつかの配列が報告されている（Steinbuche
l A. and Schlegel H.G., Mol.Microbiol., 5:535-542
(1991)）。これらの塩基配列から保存度の高い領域を選
択し、オリゴヌクレオチドを設計する。オリゴヌクレオ
チドは例えばアマシャム・ファルマシアバイオテクのカ
スタム合成サービス等を利用して合成が可能である。

【００３０】次に設計したオリゴヌクレオチドをプライ
マーとし、ＫＫ０１株の染色体ＤＮＡを鋳型としてポリ
メラーゼ連鎖反応（以下ＰＣＲと記載）を行い、ＰＨＢ
合成系酵素群遺伝子を部分的に増幅する。このようにし
て得られたＰＣＲ増幅断片はＫＫ０１株のＰＨＢ合成系
酵素群遺伝子に１００％近い相同性を有する断片であ
り、コロニーハイブリダイゼーションを行う際のプロー
ブとして高いＳ／Ｎ比を期待することができるととも
に、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー制御
を容易なものとすることが可能である。前記のＰＣＲ増
幅断片を適当な試薬を用いて標識し、前記染色体ＤＮＡ
ライブラリーについてコロニーハイブリダイゼーション
を行い、ＰＨＢ合成系酵素群遺伝子を選抜する（Curren
t Protocolsin Molecular Biology，１巻，603頁，1994
年）。ここでＰＣＲ増幅断片の標識はAlkPhosDirect
（アマシャム・ファルマシアバイオテク）などの市販の
キットを利用することができる。

【００３１】また、 ＰＨＢ合成系酵素群遺伝子を含む
遺伝子断片の選抜は、上記の遺伝子型を利用した選抜方
法以外にもＰＨＢ合成の有無を直接評価する表現型を利
用した方法に拠ることも可能である。 ＰＨＢ合成の有
無を調べる方法としては、例えば、スダンブラックＢに
より染色する方法（Archives of Biotechnology，71
巻，283頁、1970年)、位相差顕微鏡によりＰＨＢの蓄積
を調べる方法などを用いることができる。

【００３２】前記の何れかの方法により選抜した大腸菌
からアルカリ法（Current Protocols in Molecular Bio
logy，１巻，161頁，1994年)を用いてフ゜ラスミト゛を回収す
ることにより、 ＰＨＢ合成系酵素群遺伝子を含むＤＮＡ
断片を得ることができる。上記ＤＮＡ断片の塩基配列の
決定は、例えばサンガー法（Molecular Cloning，２
巻，133頁，1989年）等によって行うことが可能であ
り、塩基配列自動分析装置、例えばＤＮＡシーケンサー
３７７Ａ（パーキン・エルマー）等を用いてダイプライ
マー法あるいはダイターミネーター法により行うことが
できる。

【００３３】なお、上記方法により全塩基配列を決定し
た後は、化学合成法、染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ
法、あるいは該塩基配列を有するＤＮＡ断片の制限酵素
による分解等の任意の方法により調製したＤＮＡ断片を
プローブとしてハイブリダイズすることにより、本発明
の遺伝子を得ることが可能である。

【００３４】配列番号：２に本発明のＰＨＢ合成酵素遺
伝子の塩基配列を、配列番号：１に該遺伝子がコードす
るアミノ酸配列を示すが、先に述べたとおり、該アミノ
酸配列を有するポリペプチドがＰＨＢ合成活性を有する
限り、いくつかのアミノ酸について欠失、置換、付加等
の変異があってもよい。また、本発明の遺伝子は、配列
番号：１で示されるアミノ酸をコードする塩基配列を有
するものに加え、縮重コドンにおいてのみ異なる同一の
ポリペプチドをコードする縮重異性体も包含する。

【００３５】また、配列番号：４に本発明のβ−ケトチ
オラーゼ遺伝子の塩基配列を、配列番号：３に該遺伝子
がコードするアミノ酸配列を示すが、先に述べたとお
り、該アミノ酸配列を有するポリペプチドがβ−ケトチ
オラーゼ活性を有する限り、いくつかのアミノ酸につい
て欠失、置換、付加等の変異があってもよい。また、本
発明の遺伝子は、配列番号：３で示されるアミノ酸をコ
ードする塩基配列を有するものに加え、縮重コドンにお
いてのみ異なる同一のポリペプチドをコードする縮重異
性体も包含する。

【００３６】また、配列番号：６に本発明のアセトアセ
チルＣｏＡリダクターゼ遺伝子の塩基配列を、配列番
号：５に該遺伝子がコードするアミノ酸配列を示すが、
先に述べたとおり、該アミノ酸配列を有するポリペプチ
ドがアセトアセチルＣｏＡリダクターゼ活性を有する限
り、いくつかのアミノ酸について欠失、置換、付加等の
変異があってもよい。また、本発明の遺伝子は、配列番
号：５で示されるアミノ酸をコードする塩基配列を有す
るものに加え、縮重コドンにおいてのみ異なる同一のポ
リペプチドをコードする縮重異性体も包含する。

【００３７】ここで上述の欠失、置換、付加等の変異
は、部位突然変異導入方法（CurrentProtocols in Mole
cular Biology１巻，８.１.１頁，１９９４年）等によ
り導入可能である。

【００３８】本発明の形質転換体は、ＰＨＢ合成系酵素
群の酵素遺伝子を有する組換えベクターを、該組換えベ
クターの有する発現ベクターの種類に適合する宿主中に
導入して、これを形質転換することにより得ることがで
きる。宿主としては、エシェリチア（Esherichia）属、
シュードモナス（Pseudomonas）属、ラルストーニャ（R
alstonia）属、アルカリゲネス属（Alcaligenes）、コ
マモナス（Comamonas）属、バルクホルデリア（Burkhol
deria）属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、
フラボバクテリウム(Flabobacterium)属、ビブリオ（Vi
brio）属、エンテロバクター（Enterobacter）属、リゾ
ビウム（Rhizobium）属、グルコノバクター（Gluconoba
cter）属、アシネトバクター（Acinetobacter）属、モ
ラセラ（Moraxella）属、ニトロゾモナス（Nitrosomona
s）属、アエロモナス（Aeromonas）属、 パラコッカス
（Paracoccus）属、バチルス（Bacillus）属、クロスト
リヂウム（Clostridium）属、ラクトバチルス（Lactoba
cillus）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）
属、アルスロバクター（Arthrobacter）属、アクロモバ
クター（Achromobacter）属、ミクロコッカス（Microco
ccus）属、マイコバクテリウム（Mycobacterium）属、
ストレプトコッカス(Streptococcus）属、ストレプトマ
イセス(Streptomyces)属、アクチノマイセス(Actinomyc
es）属、ノカルジア（Nocardia）属、メチロバクテリウ
ム（Methylobacterium）属などの各種細菌が挙げられ
る。また、サッカロミセス（Saccharomyces）属、カン
ジダ（Candida）属等の酵母、各種かび等が挙げられ
る。

【００３９】さらに、これらの宿主において菌体内にＰ
ＨＢ分解酵素を持たない宿主を選択することは、きわめ
て高分子量のＰＨＢを生産するためには特に好ましい。

【００４０】バルクホルデリア属に属する微生物、大腸
菌等の細菌を宿主として用いる場合は、組換えベクター
が宿主中で自律複製可能であると同時に、プロモータ
ー、ＰＨＢ合成系酵素群遺伝子、転写終結配列等を含む
構成であることが好ましい。発現ベクターとしては、広
範囲の宿主において複製・保持されるRK2複製起点を有
するpLA2917 (ATCC 37355)やRSF1010複製起点を有するp
JRD215 (ATCC 37533)等が挙げられるが、広範囲の宿主
において複製・保持される複製起点を有するものならば
何れも使用可能である。

【００４１】プロモーターは、宿主中で発現できるもの
であれば何れも使用可能であり、例えば、trpプロモー
ター、trcプロモーター、tacプロモーター、lacプロモ
ーター、PLプロモーター、PRプロモーター、T7プロモー
ター、T3プロモーターなどの大腸菌やファージ等に由来
するプロモーターを用いることができる。細菌への組換
えＤＮＡの導入方法としては、前述した塩化カルシウム
法やエレクトロポレーション法等が利用可能である。

【００４２】酵母を宿主として用いる場合は、発現ベク
ターとして、例えばYEp13、YCp50、pRS系、pYEX系ベク
ター等が利用可能である。プロモーターとしては、例え
ばＧＡＬプロモーター、ＡＯＤプロモーター等を用いる
ことができる。酵母への組換え体ＤＮＡの導入方法とし
ては、例えばエレクトロポレーション法（Methods Enzy
mol.,194,182-187(1990))、スフェロプラスト法（Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1929-1933 (1978))、酢酸
リチウム法（J. Bacteriol., 153, 163-168 (1983)）等
が利用可能である。

【００４３】更に、組換えベクターには、発現の抑制あ
るいは増幅、または誘導のための各種の機能を有する発
現制御用の断片や、形質転換体の選択のためのマーカー
や抗生物質に対する耐性遺伝子、あるいは、菌体外への
分泌を目的としたシグナルをコードする遺伝子などを更
に有するものであってもよい。

【００４４】本発明のＰＨＢ合成系酵素群は、本発明の
形質転換体を培養し、培養物（培養菌体又は培養上清）
中に本発明のＰＨＢ合成系酵素群を生成蓄積させ、該培
養物からＰＨＢ合成系酵素群を取得する方法によって得
ることができる。本発明の形質転換体を培養する方法
は、宿主の培養に用いられる通常の方法を用いればよ
い。また培養方法は、バッチ式、流動バッチ式、連続培
養、リアクター形式等、通常の微生物の培養に用いるい
かなる方法をも用いることができる。

【００４５】大腸菌等の細菌を宿主として得られた形質
転換体を培養する培地としては、完全培地あるいは合成
培地、例えばＬＢ培地、Ｍ９培地等が挙げられる。ま
た、培養温度は２５〜３７℃の範囲で好気的に８〜７２
時間培養することによりＰＨＢ合成系酵素群を菌体内に
蓄積させ、回収する。炭素源は微生物の増殖に必要であ
り、例えばグルコース、フラクトース、スクロース、マ
ルトース、ガラクトース、でんぷん等の糖類、エタノー
ル、プロパノール、ブタノール等の低級アルコール類、
グリセリン等の多価アルコール類、酢酸、クエン酸、コ
ハク酸、酒石酸、乳酸、グルコン酸等の有機酸、プロピ
オン酸、ブタン酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、ヘプタン
酸、オクタン酸、ノナン酸、デカン酸、ウンデカン酸、
ドデカン酸等の脂肪酸等が利用できる。

【００４６】窒素源としては例えばアンモニア、塩化ア
ンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等
のアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキ
ス、麦芽エキス、カゼイン分解物、コーンスティープリ
カー等の天然物由来のものが挙げられる。また、無機物
としては例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウ
ム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナト
リウム等が挙げられる。培養液に、カナマイシン、アン
ピシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、
ストレプトマイシン等の抗生物質を添加してもよい。

【００４７】また、プロモーターが誘導性の発現ベクタ
ーを用いて形質転換した微生物を培養する場合は、プロ
モーターの種類に適した誘導物質を培地に添加すればよ
い。例えば、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラ
ノシド（ＩＰＴＧ）、テトラサイクリン、インドールア
クリル酸（ＩＡＡ）等が誘導物質として挙げられる。

【００４８】ＰＨＢ合成系酵素群の精製は、得られる培
養物から、菌体または上清を遠心・回収し、菌体破砕、
抽出、アフィニティークロマトグラフィー、陽イオン又
は陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過等を単独
でまたは適宜組み合わせることによって行うことができ
る。得られた精製物質が目的の酵素であることの確認
は、通常の方法、例えばＳＤＳポリアクリルアミドゲル
電気泳動、ウエスタンブロッティング等により行う。

【００４９】なお、宿主として微生物を用いた形質転換
体の培養、形質転換体によるＰＨＢ合成系酵素群の生産
と菌体内への蓄積、並びに、菌体からのＰＨＢ合成系酵
素群の回収は、上記の方法に限定されるものではない。

【００５０】また、ＰＨＡの製造のために、微生物を宿
主として用いた形質転換体を培養する際にも、用いた宿
主や宿主中に導入した組換えベクターの構成等に応じた
組成の培地及び培養条件を用いて形質転換体を培養し、
培養物からＰＨＡを取得する方法を用いることができ
る。培地や培養条件としては、例えば上記のＰＨＡ合成
酵素の製造において例示したものが同様に利用できる。

【００５１】菌体からのＰＨＢの回収は、通常行われて
いるクロロホルム等の有機溶媒による抽出が最も簡便で
はあるが、有機溶媒が使用しにくい環境中においては、
ＳＤＳ等の界面活性剤による処理、リゾチーム等の酵素
による処理、ＥＤＴＡ、次亜塩素酸ナトリウム、アンモ
ニア等の薬剤による処理によってＰＨＢ以外の菌体成分
を除去して、ＰＨＢを回収する方法を用いることもでき
る。

【００５２】なお、宿主として微生物を用いた形質転換
体の培養、形質転換体によるＰＨＡの生産と菌体内への
蓄積、並びに、菌体からのＰＨＡの回収は、上記の方法
に限定されるものではない。

【００５３】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。但し、本発明は、これら実施例にその技術的
範囲を限定するものではない。 （実施例１：ＫＫ０１株のＰＨＢ合成系酵素群遺伝子の
クローニング）ＫＫ０１株を１００mlのＬＢ培地（１％
ポリペプトン、０.５％酵母エキス、０.５％塩化ナトリ
ウム、ｐＨ７.４）で、３０℃、一晩培養後、マーマー
らの方法により染色体ＤＮＡを分離回収した。得られた
染色体ＤＮＡを制限酵素Sau3AIで部分分解した。ベクタ
ーはpUC18を使用し、制限酵素BamHIで切断し、脱リン酸
化処理（Molecular Cloning，１巻，572頁，1989年；Co
ld Spring Harbor Laboratory出版）の後、ＤＮＡライ
ゲーションキットVer.II（宝酒造）を用いて染色体ＤＮ
ＡのSau3AI部分分解断片と連結した。次に、この連結Ｄ
ＮＡ断片を用いて大腸菌（Escheichia coli）HB101株を
形質転換し、ＫＫ０１株の染色体ＤＮＡライブラリーを
作製した。

【００５４】次に、ＫＫ０１株のＰＨＢ合成系酵素群遺
伝子を含むＤＮＡ断片を得るための表現型スクリーニン
グを行った。選択培地には２％グルコースを含有するＬ
Ｂ培地を用い、寒天平板培地上のコロニーが適当な大き
さに生育してきた時点でスダンブラックＢ溶液を噴霧
し、ＵＶ光照射により蛍光を発するコロニーを取得し
た。取得したコロニーからアルカリ法によりプラスミド
を回収することでＰＨＢ合成系酵素群遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片を得ることができた。

【００５５】ここで取得した遺伝子断片を不和合性グル
ープであるIncP、IncQ、あるいはIncWの何れにも属さな
い広宿主域複製領域を含むベクターpBBR122（Mo Bi Te
c）に組み換え、この組み換えプラスミドをバルクホル
デリア・セパシアＫＫ０１ｍ１株（ＰＨＢ合成能欠損
株）にエレクトロポレーション法により形質転換したと
ころ、ＫＫ０１ｍ１株のＰＨＢ合成能が復帰し、相補性
を示した。

【００５６】ＰＨＢ合成系酵素群遺伝子を含む断片につ
いてサンガー法により塩基配列を決定した。その結果、
配列番号：２、４および６で示される塩基配列を有する
ＰＨＢ合成系酵素群遺伝子が該断片中に存在することを
確認することができた。また、配列番号：２、４および
６の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を配列番
号：１、３および５にそれぞれ示す。

【００５７】（実施例２：ＫＫ０１株のＰＨＢ合成系酵
素群遺伝子の発現ベクターへの組換え）配列番号：２で
示されるＰＨＢ合成酵素遺伝子の開始コドン近傍の塩基
配列を有するオリゴヌクレオチド（配列番号：７）およ
び配列番号：６で示されるアセトアセチルＣｏＡリダク
ターゼ遺伝子終止コドン近傍の塩基配列を有するオリゴ
ヌクレオチド（配列番号：８）を設計・合成し（アマシ
ャムファルマシア・バイオテク）、このオリゴヌクレオ
チドをプライマーとしてＰＣＲを行い、 ＰＨＢ合成酵
素遺伝子、β−ケトチオラーゼ遺伝子およびアセトアセ
チルＣｏＡリダクターゼ遺伝子を含む断片を増幅した
（ＬＡ−ＰＣＲキット；宝酒造）。

【００５８】次に、上のようにして得られたＰＣＲ増幅
断片について制限酵素NcoIを用いて完全分解物し、発現
ベクターpTrc99Aの制限酵素NcoIで切断、脱リン酸化処
理（Molecular Cloning，１巻，572頁，1989年；Cold S
pring Harbor Laboratory出版）したものに、ＤＮＡラ
イゲーションキットVer.II（宝酒造）を用いて連結し
た。

【００５９】得られた組換えプラスミドで大腸菌（Esch
erichia coli HB101）を塩化カルシウム法により形質転
換し（宝酒造）、得られた組換え体より回収した組換え
プラスミドをpKK01-phbとした。

【００６０】（実施例３：ＰＨＢ合成系酵素群遺伝子組
換え大腸菌によるＰＨＢ生産）実施例２で得られた組換
えプラスミド、pKK01-phbで大腸菌（Escherichia coli
HB101）を塩化カルシウム法により形質転換し、それぞ
れの組換えプラスミド由来の組換え大腸菌を得た。

【００６１】pKK01-phb組換え株をＬＢ培地２００ｍｌ
に植菌して、３７℃、１２５ストローク／分で振盪培養
した。１２時間培養の後、培養液２００ｍｌをグルコー
ス２％を含むＬＢ培地２００ｍｌに植菌して（計４００
ｍｌ）、３７℃、１２５ストローク／分で１２時間振盪
培養した。このようにして得られた菌体を遠心分離によ
って回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥し
た。

【００６２】この凍結乾燥ペレットを１００ｍｌのクロ
ロホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌してＰＨＢを
抽出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブレンフィ
ルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃
縮し、濃縮液をヘキサン中で再沈殿させ、更に沈殿のみ
を回収して真空乾燥してＰＨＢを得た。得られたＰＨＢ
は、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロ
マトグラフィー−質量分析装置（ＧＣ−ＭＳ，島津ＱＰ
−５０５０、ＥＩ法）で分析し、ＰＨＢモノマーユニッ
トのメチルエステル化物の同定を行った。その結果を表
１に示す。

【００６３】

【表１】

【００６４】さらに得られたＰＨＢホモポリマーの分子
量をＧＰＣ（東ソー ＨＬＣ−８０２０、カラム：ポリ
マーラボラトリー ＰＬｇｅｌ ＭＩＸＥＤ−Ｃ（５μ
ｍ）、溶媒：クロロホルム、ポリスチレン換算）により
評価したところ、Ｍｎ＝１,５００,０００、Ｍｗ＝３,
０００,０００であった。

【００６５】

【発明の効果】本発明によれば、ＰＨＢ合成系酵素群、
該ＰＨＢ合成系酵素群をコードする遺伝子、該遺伝子を
含む組換えベクターおよび該組換えベクターにより形質
転換された形質転換体を提供することができる。本発明
にかかる遺伝子は、高収率にＰＨＢを合成するために有
用である。

【００６６】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110>Canon INC. <120>Polyhydroxybutyrate synthase and gene encoding the same <121> <130>405103 <160>8 <210>1 <211>624 <212>PRT <213>Burkholderia cepacia KK01 <220> <223>Polyhydroxybutyrate synthase <400>1 Met Thr Ala Ser Lys Asn Ser Ser Thr Ser Ala Gln Ala Gly Thr Ser 1 5 10 15 Ala Ser Ser Thr Gly Phe Asp Gln Ala Thr Gln Pro Met Gln Gln Met 20 25 30 Phe Glu Ala Trp Leu Asn Ala Trp Arg Gly Phe Ala Asp Pro Ala Arg 35 40 45 Ala Ala Thr Ala Ala Ser Thr Ala Asn Pro Phe Ala Ala Phe Gln Leu 50 55 60 Pro Thr Ser Leu Pro Phe Gln Met Pro Ser Met Pro Asp Leu Gly Ser 65 70 75 80 Leu Gly Gly Met Ala Ser Pro Phe Ala Gly Leu Lys Leu Pro Val Ala 85 90 95 Ala Ile Pro Pro Glu Arg Leu Gln Lys Leu Gln Ala Asp Tyr Ala Arg 100 105 110 Asp Cys Ile Thr Leu Met Gln Gln Ser Val Ala Ala Lys Leu Glu Ala 115 120 125 Pro Glu Leu Lys Asp Arg Arg Phe Ser Ala Asp Ala Trp Lys Ala Ser 130 135 140 Pro Ala His Ala Phe Ala Ala Ala Trp Tyr Leu Leu Asn Ala Arg Tyr 145 150 155 160 Leu Gln Glu Leu Ala Asp Ala Leu Glu Thr Asp Pro Lys Thr Arg Glu 165 170 175 Arg Ile Arg Phe Ser Val Gln Gln Trp Thr Ala Ala Ala Ala Pro Ser 180 185 190 Asn Phe Leu Ala Leu Asn Pro Asp Ala Gln Lys Ser Ile Leu Glu Thr 195 200 205 Gln Gly Glu Ser Leu Arg Gln Gly Met Met Asn Leu Leu Gly Asp Met 210 215 220 Gln Arg Gly Lys Ile Ser Gln Thr Asp Glu Ser Gln Phe Val Val Gly 225 230 235 240 Lys Asn Leu Gly Cys Thr Glu Gly Ala Val Val Tyr Glu Asn Asp Leu 245 250 255 Ile Gln Leu Ile Gln Tyr Thr Pro Lys Thr Asp Lys Val Phe Glu Arg 260 265 270 Pro Leu Leu Ile Val Pro Pro Cys Ile Asn Lys Phe Tyr Ile Leu Asp 275 280 285 Leu Gln Pro Glu Asn Ser Leu Val Ala His Ala Leu Ser Ser Gly His 290 295 300 Gln Val Phe Leu Val Ser Trp Arg Asn Ala Asp Ala Ser Val Ala His 305 310 315 320 Lys Thr Trp Asp Asp Tyr Met Asn Glu Gly Leu Leu Ala Ala Ile Asp 325 330 335 Ala Val Gln Gln Val Ser Gly Arg Glu Gln Ile Asn Thr Leu Gly Phe 340 345 350 Cys Val Gly Gly Thr Met Leu Ala Thr Ala Leu Ser Val Leu Ala Ala 355 360 365 Arg Gly Glu His Pro Ala Ala Ser Met Thr Leu Leu Thr Ala Met Leu 370 375 380 Asp Phe Thr Asp Thr Gly Ile Leu Asp Val Phe Val Asp Glu Ala His 385 390 395 400 Val Gln Met Arg Glu Gln Thr Ile Gly Gly Lys Asn Gly Thr Pro Pro 405 410 415 Gly Leu Met Arg Gly Val Glu Phe Ala Asn Thr Phe Ser Phe Leu Arg 420 425 430 Pro Asn Asp Leu Val Trp Asn Tyr Val Val Asp Asn Tyr Leu Lys Gly 435 440 445 Arg Thr Pro Ala Pro Phe Asp Leu Leu Tyr Trp Asn Ser Asp Ser Thr 450 455 460 Ser Leu Pro Gly Pro Met Tyr Ala Trp Tyr Leu Arg Asn Thr Tyr Leu 465 470 475 480 Glu Asn Lys Leu Arg Val Pro Gly Ala Leu Thr Val Cys Gly Glu Ser 485 490 495 Val Asp Leu Ser Arg Ile Asp Val Pro Thr Phe Ile Tyr Gly Ser Arg 500 505 510 Glu Asp His Ile Val Pro Trp Gln Thr Ala Tyr Glu Ser Thr Ser Ile 515 520 525 Leu Thr Gly Pro Leu Lys Phe Val Leu Gly Ala Ser Gly His Ile Ala 530 535 540 Gly Val Ile Asn Pro Pro Ala Lys Lys Lys Arg Ser Tyr Trp Ile Asn 545 550 555 560 Asp Gly Glu Leu Pro Glu Ser Ala Asp Asp Trp Phe Ala Gly Ala Thr 565 570 575 Glu Gln Pro Gly Ser Trp Trp Thr Thr Trp Val Glu Trp Leu Asp Gln 580 585 590 Tyr Gly Gly Arg Lys Val Ala Pro Pro Ala Lys Pro Gly Ser Ala Gln 595 600 605 Phe Pro Val Ile Glu Ser Ala Pro Gly Arg Tyr Val Leu Gln Arg Asp 610 615 620 <210>2 <211>1875 <212>DNA <213>Burkholderia cepacia KK01 <220> <221>CDS <222>(1)...(1875) Polyhydroxybutyrate synthase encoding sequence <400>2 atgacagcat cgaaaaattc gtcgacgtcc gctcaggcgg gcacttccgc gagcagcacc 60 ggattcgacc aggccaccca gccgatgcag cagatgttcg aggcatggct gaacgcatgg 120 cgcggtttcg ccgatccggc gcgtgccgcc acggcggcga gcacggcaaa cccgttcgcc 180 gcattccagc tcccgacatc gcttccgttt cagatgccgt cgatgcccga cctgggcagc 240 ctcggcggca tggcgtcgcc gttcgccggg ctgaagctgc cggttgccgc gattccgccc 300 gaacggctcc agaaactgca ggccgactat gcgcgcgact gcatcacgct gatgcagcag 360 agcgtcgccg cgaagctcga agcgccggag ctgaaggacc gccgcttcag cgcggatgca 420 tggaaggctt cgcccgcgca tgcgttcgcc gcggcatggt atctgctcaa cgcgcgttat 480 ctgcaggagc tggccgacgc gctcgagacc gatccgaaga cgcgcgagcg tatccgtttc 540 tcggttcagc aatggacggc cgcggccgcg ccgagcaact tcctcgcgct caaccccgat 600 gcacagaaat cgattctcga gacgcagggc gaaagcctgc ggcaggggat gatgaacctg 660 ctcggcgaca tgcagcgcgg caagatttcg cagaccgacg aatcgcaatt cgtggtcggc 720 aagaacctcg ggtgtactga aggtgcggtc gtctacgaga acgacctgat ccagttgatc 780 cagtacacgc cgaagacgga caaggtgttc gaacggccgc tgctgatcgt gccgccgtgc 840 atcaacaagt tctacatcct cgacctgcag cccgagaatt cgctcgtcgc gcacgcgctg 900 tcgagcggcc atcaggtgtt cctcgtgtcg tggcgcaatg ccgacgcatc ggtcgcgcac 960 aagacgtggg acgactacat gaacgaaggg ctgctcgcgg cgatcgatgc cgtgcagcag 1020 gtcagcggcc gcgagcagat caacacgctc ggcttctgcg tcggcggcac gatgctcgcg 1080 acggcgctgt cggtgctcgc cgcgcgcggc gaacatccgg ccgcgtcgat gacgctgctg 1140 acggcgatgc tcgacttcac cgataccggc atcctcgacg tgttcgtcga cgaggcgcac 1200 gtgcagatgc gcgagcagac catcggcggc aagaacggca cgccgccggg gctgatgcgc 1260 ggcgttgaat tcgcgaacac gttctcgttc ctgcgaccga acgatctcgt gtggaactac 1320 gtcgtcgaca actacctgaa gggccgcacg cccgcgccgt tcgacctgct gtactggaac 1380 agcgattcga cgagcctgcc cggcccgatg tacgcgtggt acctgcgcaa tacgtatctc 1440 gagaacaagc tgcgcgtgcc cggcgcgctg acggtgtgcg gcgaatccgt cgacctgtcg 1500 cgcatcgacg tgccgacctt catctacggg tcgcgcgagg atcacatcgt gccgtggcag 1560 accgcctatg aatcgacgtc gatcctgacg gggccgctta agttcgtgct cggcgcatcg 1620 ggtcacattg caggcgtgat caatccgccg gcgaagaaaa agcgcagcta ctggatcaac 1680 gacggcgagc tgcccgaatc cgcggacgac tggtttgccg gtgcgaccga gcagccgggc 1740 agttggtgga cgacctgggt cgaatggctc gaccagtacg gcggccgcaa ggtggcgccg 1800 cccgcgaagc ccggttcggc gcagttcccg gtgatcgagt cggcgccggg ccgctacgtg 1860 ttgcagcgcg attga 1875 <210>3 <211>393 <212>PRT <213>Burkholderia cepacia KK01 <220> <223>Beta-ketothiolase <400>3 Met Thr Asp Val Val Ile Val Ser Ala Ala Arg Thr Ala Val Gly Lys 1 5 10 15 Phe Gly Gly Ser Leu Ala Lys Val Ala Ala Pro Glu Leu Gly Ala Thr 20 25 30 Val Ile Arg Ala Val Leu Glu Arg Ser Gly Val Lys Pro Asp Gln Val 35 40 45 Ser Glu Val Ile Met Gly Gln Val Leu Ala Ala Gly Ser Gly Gln Asn 50 55 60 Pro Ala Arg Gln Ser Leu Ile Lys Ala Gly Leu Pro Asn Ala Val Pro 65 70 75 80 Gly Met Thr Ile Asn Lys Val Cys Gly Ser Gly Leu Lys Ala Val Met 85 90 95 Leu Ala Ala Asn Ala Ile Ala Ala Gly Asp Ala Glu Ile Val Ile Ala 100 105 110 Gly Gly Gln Glu Asn Met Ser Ala Ser Pro His Val Leu Pro Gly Ser 115 120 125 Arg Asp Gly Phe Arg Met Gly Asp Ala Lys Leu Val Asp Thr Met Ile 130 135 140 Val Asp Gly Leu Trp Asp Val Tyr Asn Gln Tyr His Met Gly Ile Thr 145 150 155 160 Ala Glu Asn Val Ala Lys Glu Tyr Gly Ile Thr Arg Glu Glu Gln Asp 165 170 175 Ala Phe Ala Ala Leu Ser Gln Asn Lys Ala Glu Ala Ala Gln Lys Ala 180 185 190 Gly Arg Phe Asn Asp Glu Ile Val Pro Val Ser Ile Pro Gln Arg Lys 195 200 205 Gly Glu Pro Leu Gln Phe Ala Thr Asp Glu Phe Val Arg His Gly Val 210 215 220 Thr Ala Glu Ser Leu Ser Gly Leu Lys Pro Ala Phe Ser Lys Asp Gly 225 230 235 240 Thr Val Thr Ala Ala Asn Ala Ser Gly Leu Asn Asp Gly Ala Ala Ala 245 250 255 Val Leu Val Met Ser Ala Gln Lys Ala Ala Ala Leu Gly Leu Thr Pro 260 265 270 Leu Ala Arg Ile Lys Ala Tyr Ala Asn Ala Gly Val Asp Pro Ser Val 275 280 285 Met Gly Met Gly Pro Val Pro Ala Ser Arg Arg Cys Leu Glu Arg Ala 290 295 300 Gly Trp Thr Pro Gly Asp Leu Asp Leu Met Glu Ile Asn Glu Ala Phe 305 310 315 320 Ala Ala Gln Ala Leu Ala Val His Lys Gln Met Gly Trp Asp Thr Ser 325 330 335 Lys Val Asn Val Asn Gly Gly Ala Ile Ala Ile Gly His Pro Ile Gly 340 345 350 Ala Ser Gly Cys Arg Ile Leu Val Thr Leu Leu His Glu Met Val Lys 355 360 365 Arg Asp Ala Lys Arg Gly Leu Ala Ser Leu Cys Ile Gly Gly Gly Met 370 375 380 Gly Val Ala Leu Ala Val Glu Arg Pro 385 390 <210>4 <211>1182 <212>DNA <213>Burkholderia cepacia KK01 <220> <221>CDS <222>(1)...(1182) Beta-ketothiolase encoding sequence <400>4 atgacggacg tagtgatcgt atcggccgcg cggaccgcgg tcggcaaatt cgggggctcg 60 ctcgcgaagg ttgcggcacc ggagctgggc gcgacggtga ttcgcgcggt gctggagcgc 120 tcgggggtga agccggatca ggtgagcgaa gtgatcatgg gtcaggtgct ggcggcaggc 180 tcggggcaga acccggcgcg ccagtcgctg atcaaggccg gcctaccgaa tgccgtgccg 240 gggatgacga tcaacaaggt gtgcggctcg ggcctgaagg cggtgatgct ggcagcgaac 300 gcgatcgcgg caggcgacgc ggagatcgtg atcgcaggcg ggcaggaaaa catgagcgcg 360 tcgccgcacg tgctgccggg ctcgcgcgac gggttccgga tgggcgacgc gaagctggtc 420 gacacgatga tcgtcgacgg cctgtgggac gtgtacaacc agtaccacat gggcatcacg 480 gcggagaacg tcgcgaagga atacgggatc acgcgcgaag agcaggacgc attcgcggcg 540 ctgtcgcaga acaaggcgga agctgcgcag aaggccggcc gtttcaacga cgagatcgtg 600 ccggtgtcga ttccgcagcg caagggcgag ccgctgcagt tcgcgaccga cgaattcgtg 660 cgtcacggcg tgacggcgga atcgctgtcg ggcctgaagc cggcgttctc gaaggacggt 720 acggtgacgg cagcgaacgc gtcggggctg aacgacggcg cggcagcggt gctggtgatg 780 tcggcgcaga aggcggcggc gctggggctg acgccgctgg cgcggatcaa ggcgtacgcg 840 aacgcgggcg tggatccgag cgtgatgggg atgggtccgg tgccggcctc gcgccgttgt 900 ctggagcgtg cgggctggac gccgggcgac ctggacctga tggagatcaa cgaggcattt 960 gcggcgcagg cgctggcggt gcacaagcag atgggctggg acacgtcgaa ggtgaacgtg 1020 aacggcgggg cgatcgcgat cggtcacccg atcggggcat cgggctgccg gattctggtg 1080 acgctgctgc acgagatggt caagcgcgac gcgaagcgcg ggctggcatc gctgtgcatc 1140 ggcggcggga tgggcgtcgc actcgcggtc gaacgtccgt aa 1182 <210>5 <211>246 <212>PRT <213>Burkholderia cepacia KK01 <220> <223>Acetoacetyl CoA reductase <400>5 Met Ser Gln Arg Ile Ala Tyr Val Thr Gly Gly Met Gly Gly Ile Gly 1 5 10 15 Thr Ser Ile Cys Gln Arg Leu Ser Lys Asp Gly Phe Lys Val Val Ala 20 25 30 Gly Cys Gly Pro Asn Ser Pro Arg Arg Val Lys Trp Ile Glu Asp Gln 35 40 45 Lys Ala Leu Gly Tyr Asp Phe Ile Ala Ser Glu Gly Asn Val Gly Asp 50 55 60 Trp Glu Ser Thr Lys Asp Ala Phe Asp Lys Val Lys Ala Glu Val Gly 65 70 75 80 Glu Ile Asp Val Leu Val Asn Asn Ala Gly Ile Thr Arg Asp Val Val 85 90 95 Phe Arg Lys Met Thr His Glu Asp Trp Thr Ala Val Ile Asp Thr Asn 100 105 110 Leu Thr Ser Leu Phe Asn Val Thr Lys Gln Val Ile Asp Gly Met Val 115 120 125 Glu Arg Gly Trp Gly Arg Ile Ile Asn Ile Ser Ser Val Asn Gly Gln 130 135 140 Lys Gly Gln Phe Gly Gln Thr Asn Tyr Ser Thr Ala Lys Ala Gly Ile 145 150 155 160 His Gly Phe Thr Met Ser Leu Ala Gln Glu Val Ala Thr Lys Gly Val 165 170 175 Thr Val Asn Thr Val Ser Pro Gly Tyr Ile Gly Thr Asp Met Val Lys 180 185 190 Ala Ile Arg Pro Asp Val Leu Glu Lys Ile Val Ala Thr Ile Pro Val 195 200 205 Arg Arg Leu Gly Gly Pro Glu Glu Ile Gly Ser Ile Val Ala Trp Leu 210 215 220 Ala Ser Asn Asp Ser Gly Phe Ala Thr Gly Ala Asp Phe Ser Leu Asn 225 230 235 240 Gly Gly Leu His Met Gly 245 <210>6 <211>741 <212>DNA <213>Burkholderia cepacia KK01 <220> <221>CDS <222>(1)...(741) Acetoacetyl CoA reductase encoding sequence <400>6 atgtctcagc gaattgcgta cgtaacgggc gggatgggcg gcatcggcac cagcatctgc 60 cagcgtctgt cgaaagacgg cttcaaggtg gtcgcgggtt gcggcccgaa ttcgccgcgc 120 cgggtgaaat ggatcgagga ccagaaggcg ctcgggtacg atttcatcgc ttcggaaggt 180 aacgtcggcg actgggaatc gaccaaggac gcattcgaca aggtcaaggc cgaagtcggt 240 gaaatcgacg tgctggtcaa caacgcgggc atcacgcgcg acgtcgtgtt ccgcaagatg 300 acccatgaag actggacggc cgtgatcgac accaacctga cgagcctgtt caacgtgacg 360 aagcaggtga tcgacgggat ggtcgagcgc ggctggggcc ggatcatcaa tatttcgtcg 420 gtgaacggcc agaaggggca attcggccag acgaactact cgaccgcgaa ggccggcatc 480 cacgggttca cgatgtcgct tgcgcaggaa gtcgcaacga agggcgtgac ggtcaacacc 540 gtgtcgcccg gctacatcgg caccgacatg gtgaaggcga tccgtccgga cgtgctcgag 600 aagatcgtcg cgacgattcc cgtgcgacgt ctcggcggcc cggaagaaat cggttcgatc 660 gtcgcgtggc tcgcgtcgaa cgattccggt ttcgcgacgg gtgccgactt ctcgctgaac 720 ggcggcctgc acatgggctg a 741 <210>7 <211>31 <212>DNA <220> <223>Primer sequence for PCR <400>7 ggcaggccat ggcagcatcg aaaaattcgt c 31 <210>8 <211>32 <212>DNA <220> <223>Primer sequence for PCR <400>8 gcgcagcccc atggttcagc ccatgtgcag gc 32

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｃ１２Ｎ 9/10 9/02 Ｃ１２Ｐ 7/62 9/10 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 7/62 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 21/02 5/00 Ａ (72)発明者 本間 務 東京都大田区下丸子３丁目30番２号 キヤ ノン株式会社内 (72)発明者 須田 栄 東京都大田区下丸子３丁目30番２号 キヤ ノン株式会社内 Ｆターム(参考） 4B024 AA03 BA80 CA03 DA06 EA04 GA11 4B050 CC01 CC03 DD02 LL05 4B064 AD83 CA02 CA19 CC24 DA16 4B065 AA01Y AA26X AB01 AC14 BA02 CA12 CA60

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号：１で示されるアミノ酸配列を
   有することを特徴とするポリヒドロキシ酪酸合成酵素。
2. 【請求項２】 配列番号：１で示されるアミノ酸配列に
   おけるアミノ酸が、該アミノ酸配列に基づくポリヒドロ
   キシ酪酸合成酵素活性を損なわない範囲で、欠失、置換
   もしくは付加されたアミノ酸配列を有することを特徴と
   するポリヒドロキシ酪酸合成酵素。
3. 【請求項３】 請求項１あるいは２に記載のアミノ酸配
   列をコードするＤＮＡを含むことを特徴とするポリヒド
   ロキシ酪酸合成酵素遺伝子。
4. 【請求項４】 ポリヒドロキシ酪酸合成酵素活性を有す
   るポリペプチドをコードするＤＮＡが配列番号：２で示
   されるものである請求項３記載のポリヒドロキシ酪酸合
   成酵素遺伝子。
5. 【請求項５】 配列番号：３で示されるアミノ酸配列を
   有することを特徴とするβ−ケトチオラーゼ。
6. 【請求項６】 配列番号：３のアミノ酸配列におけるア
   ミノ酸が、該アミノ酸配列に基づくβ−ケトチオラーゼ
   活性を損なわない範囲で欠失、置換もしくは付加された
   アミノ酸配列を有することを特徴とするβ−ケトチオラ
   ーゼ。
7. 【請求項７】 請求項５あるいは６で示されるアミノ酸
   配列をコードするＤＮＡを含むβ−ケトチオラーゼ遺伝
   子。
8. 【請求項８】 β−ケトチオラーゼ活性を有するポリペ
   プチドをコードするＤＮＡが配列番号：４で示されるも
   のである請求項７記載のβ−ケトチオラーゼ遺伝子。
9. 【請求項９】 配列番号：５で示されるアミノ酸配列を
   有するアセトアセチルＣｏＡリダクターゼ。
10. 【請求項１０】 配列番号：５のアミノ酸配列における
    アミノ酸が、該アミノ酸配列に基づくアセトアセチルＣ
    ｏＡリダクターゼ活性を損なわない範囲で、欠失、置換
    もしくは付加されたアミノ酸配列を有するアセトアセチ
    ルＣｏＡリダクターゼ。
11. 【請求項１１】 請求項９あるいは１０で示されるアミ
    ノ酸配列をコードするＤＮＡを含むアセトアセチルＣｏ
    Ａリダクターゼ遺伝子。
12. 【請求項１２】 アセトアセチルＣｏＡリダクターゼ活
    性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡが配列番
    号：６で示されるものである請求項１１記載のアセトア
    セチルＣｏＡリダクターゼ遺伝子。
13. 【請求項１３】 請求項３または４に記載のポリヒドロ
    キシ酪酸合成酵素遺伝子を含む組換えベクター。
14. 【請求項１４】 請求項７または８に記載のβ−ケトチ
    オラーゼ遺伝子および請求項１１または１２に記載のア
    セトアセチルＣｏＡリダクターゼ遺伝子の少なくとも一
    方を含む請求項１３記載の組換えベクター。
15. 【請求項１５】 請求項１３あるいは請求項１４記載の
    組換えベクターによって形質転換された形質転換体。
16. 【請求項１６】 請求項１５記載の形質転換体を培養
    し、得られる培養物からポリヒドロキシ酪酸合成酵素あ
    るいはポリヒドロキシ酪酸合成系酵素群を取得すること
    を特徴とするポリヒドロキシ酪酸合成酵素あるいはポリ
    ヒドロキシ酪酸合成系酵素群の製造方法。
17. 【請求項１７】 請求項１５記載の形質転換体を培養
    し、得られる培養物からポリヒドロキシ酪酸を取得する
    工程を有することを特徴とするポリヒドロキシ酪酸の製
    造方法。