NL8900827A

NL8900827A - Microbiologische bereiding van polyesters.

Info

Publication number: NL8900827A
Application number: NL8900827A
Authority: NL
Original assignee: Rijksuniversiteit
Priority date: 1989-04-04
Filing date: 1989-04-04
Publication date: 1990-11-01
Also published as: CA2049953C; DE69005623D1; CA2049953A1; JP3036833B2; JPH04504205A; EP0465546B1; WO1990012104A1; EP0465546A1; DE69005623T2; US5344769A

Description

BESCHRIJVING.

Titel: microbiologische bereiding van polyesters

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het bereiden.van polyesters door aëroob kweken van microorganismen, liefst onder voedingsstoflimitatie. Meer in het bijzonder heeft de uitvinding betrekking op een werkwijze voor het bereiden van polyesters door onder aerobe condities Pseudomonas bacteriën te kweken in een voedingsmedium, dat bij voorkeur een overmaat van een koolstofbron en een beperkende hoeveelheid van ten minste één van de andere voor groei noodzakelijke voedingsstoffen bevat, waarbij de koolstofbron ten minste één assimileerbare acyclische alifatische koolwaterstofverbinding omvat, en desgewenst het gevormde biopolymeer uit de cellen te winnen.

Een dergelijke werkwijze is bekend uit de Europese octrooiaanvrage EP-A-0274151. Volgens de daarin beschreven werkwijze wordt gebruik gemaakt van Pseudomonas oleovorans bacteriën die verrassenderwijze in staat waren gebleken om onder bepaalde voedingsstoflimitaties koolwaterstofverbindingen om te zetten in polymere produkten. De gevormde polymeren bleken te verschillen van het bekende PHB, d.i. poly (3-hydroxybutyraat). ' Ze bleken opgebouwd te zijn uit eenheden met de formule (1) : -CO-CH2-CH[(CH2)mCH3]-0- en/of eenheden met de formule (2) : -C0-CH2“CH[ (CH2)m-iCH=CH2]-0-, waarin m een geheel getal van 2-8 voorstelt. De samenstelling van de door de bacteriën gevormde biopolymeren [die hierin verder zullen worden aangeduid met PHA, d.i. poly (3-hydroxyalkanoaat)] bleek afhankelijk te zijn van de aard van de in het medium aanwezige koolwaterstof-verbinding. Wanneer bijv. n-decaan als substraat werd toegepast, bleek het gevormde polymeer uit 3-hydroxydecanoaat-, 3-hydroxy-octanoaat- en 3-hydroxyhexanoaateenheden te bestaan. Wanneer n-undecaan als substraat werd toegepast, bleek het gevormde polymeer daarentegen uit 3-hydroxyundecanoaat-, 3-hydroxy-nonanoaat- en 3-hydroxyheptanoaateenheden te bestaan. Wanneer als substraat een onverzadigde koolwaterstofverbinding (1-alkenen zoals 1-octeen) werd gebruikt, bevatte het gevormde polymeer ook eenheden met formule (2).

Thans is verrassenderwijze vastgesteld, dat ook andere soorten bacteriën dan Pseudomonas oleovorans kunnen worden gebruikt, nl. bacteriën die behoren tot de pseudomonaden uit de Pseudomonas fluorescens rRNA tak volgens de door de Vos en de Ley, Int. J. of Syst. Bacteriol. 33, 1983, 487-509 gemaakte phylogenetische indeling. Volgens deze indeling kunnen naar homologie in ribosomaal RNA verschillende Pseudomonas takken worden onderscheiden, te weten de rRNA tak van Pseudomonas solanacearum. de rRNA tak van Pseudomonas acidovorans en de rRNA tak van Pseudomonas fluorescens. De tot de twee eerste takken behorende bacteriën blijken PHB vormers te zijn, terwijl de tot de laatstgenoemde tak behorende bacteriën gemeen hebben dat ze op bepaalde koolstofbronnen (niet op suikers, methanol of korte vetzuren), vooral onder voedingsstoflimitatie (verhongering) geen PHB, maar PHA's vormen.

PHB-vormende pseudomonaden uit de rRNA tak van Pseudomonas solanacearum zijn £. .sQlapa.csar.um, £. espada, £. marginata, £. caryophili en £. lemoignei. PHB-vormende pseudomonaden uit de rRNA tak van Pseudomonas acidovorans zijn £. aci^Q-YPX.anS·, £. delafieldii, £. .tfiSLasJtsrani/ £. facilis, £. pa.l-lsc.Qnii en £. flava. Pseudomonaden uit de rRNA tak van Pseudomonas fluorescens die niet PHB, maar PHA vormen, zijn £. fluorescens, biotype I (o.a. het prototype), £. fluorescens van biotype II, £. fluorescens van biotype III, £. fluopescens van biotype IV (zoals £. lemonnieri), £. putida biotype A (waartoe onder andere £. oleovorans behoort), £. put-ida biotype B, £. aureofaciens, £. syringae. £. stutzsri, £. mendOCÏna, £· chloraphls, £. cichorii, £. p-ssu-doalsallgenes, £. alealigenes en £. aeruginosa. De pseudomonaden uit de Pseudomonas fluorescens rRNA tak volgens de phylogenetische indeling van de Vos en de Ley in Int. J. of Syst. Bacteriol. 33., 1983, 487-509 stemmen overeen met de pseudomonaden uit groep I volgens de determinatie in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology.

Bij de keuze van het substraat moet er rekening mee worden gehouden dat andere soorten bacteriën uit de Pseudomonas fluorescent rRNA tak dan Pseudomonas oleovorans meestal niet in staat zijn om alkanen te metaboliseren. Het vermogen van £. oleovorans om wel alkanen te metaboliseren is te danken aan plasmide-gecodeerde (OCT-plasmide) enzymen, die betrokken zijn bij de eerste stappen van de alkaanoxydatie. Daarentegen kunnen alkaanoxydatieprodukten, zoals alkanolen, alkanalen, alkaan-carbonzuren en alkaandicarbonzuren vaak wel door deze andere soorten bacteriën worden gemetaboliseerd. Ook kan de door een gekozen bacteriesoort geprefereerde lengte van de als substraat dienende koolwaterstofverbinding verschillen van die, welke door £. oleovorans wordt geprefereerd. Terwijl bij bacteriën van de soort £. oleovorans de beste resultaten worden bereikt bij gebruik van C6-C12 alkanen en alkanolen of Οβ-Οιβ (on)verzadigde vetzuren als substraat, kunnen bij £. aeruginosa bacteriën beter Ci2-Ci6 alkanen en alkanolen of Cg-Cio alkaandicarbonzuren worden gebruikt.

De uitvinding verschaft derhalve in de eerste plaats een werkwijze voor het bereiden van polyesters door onder aerobe condities bacteriën uit de Pseudomonas fluorescens rRNA tak volgens de phylogenetische indeling van de Vos en de Ley in Int. J. of Syst. Bacteriol. ££, 1983, 487-509, met uitzondering van Pseudomonas oleovorans. te kweken in een voedingsmedium, dat als koolstofbron ten minste één assimileerbare acyclische alifatische koolwaterstofverbinding omvat, en desgewenst het gevormde biopolymeer uit de cellen te winnen.

De uitvinding verschaft in het bijzonder een werkwijze voor het bereiden van polyesters door onder aerobe condities bacteriën uit de Pseudomonas fluorescens rRNA tak volgens de phylogenetische indeling van de Vos en de Ley in Int. J. of Syst. Bacteriol. 2Λ, 1983, 487-509, met uitzondering van Pseudomonas oleovorans. te kweken in een voedingsmedium, dat een overmaat van een koolstofbron en een beperkende hoeveelheid van ten minste één van de andere voor groei noodzakelijke voedingsstoffen bevat, waarbij de koolstofbron ten minste één assimileerbare acyclische alifatische koolwaterstofverbinding omvat, en desgewenst het gevormde biopolymeer uit de cellen te winnen.

Meer in het bijzonder verschaft de uitvinding een dergelijke werkwijze, waarbij bacteriën worden toegepast, gekozen uit de groep die bestaat uit Pseudomonas fluorescens., biotype I Pseudomonas fluoresceriS, biotype II Pseudomonas fluorescent, biotype III Pseudomonas fluorescens,/· biotype IV

Pseudomonas putida biotype A (uitgezonderd £, oleovorans) Pseudomonas putida biotype B Pseudomonas .aureofaciens Pseudomonas. .sy.ripga&

Pseudomonas a.tutz.exi Es-eudorcapas. gtendoclna Pseudomonas .chloraphis.

Pseudomonas g ichor,ii Pseudomonas ps.eudoal call genes Pseudomonas alcaligepea Pseudomonas aeruginosa.

Bij de werkwijze volgens de uitvinding wordt in het algemeen als assimileerbare acyclische alifatische koolwaterstofverbinding een al dan niet onverzadigd alkaan of alkaanoxydatieprodukt met 6 of meer koolstofatomen toegepast. Meer in het bijzonder wordt als substraat een al dan niet onverzadigd alkaan of alkaanoxydatieprodukt met 6-24 koolstofatomen, bij voorkeur 6-18 koolstofatomen toegepast. Met de term "alkaanoxydatieprodukt" wordt in het bijzonder gedoeld op alkanolen, alkanalen, alkaanzuren en alkaan-dicarbonzuren, die als intermediairen in de natuurlijke alkaan-afbraak optreden. Uiteraard zullen zonodig maatregelen moeten worden getroffen om een eventueel toxisch effect van dergelijke stoffen te verhinderen. Om die reden zal bij gebruik als substraat van bijv. alkanolen of alkanalen doorgaans een inerte hulpfase, zoals dibutylftalaat, ter verdunning aan het medium worden toegevoegd. Het heeft echter de voorkeur dat een alkaancarbonzuur met 6-18, bij voorkeur 12-16 koolstofatomen, of een alkaandicarbonzuur met 6-18, bij voorkeur 6-12 koolstofatomen als substraat wordt toegepast. Desgewenst wordt daarbij tevens een surfactant zoals Brij 58 toegepast om deze substraten in oplossing te houden.

De met de werkwijze volgens de uitvinding verkregen polymeren hebben een van het gebruikte substraat afhankelijke samenstelling. Bij gebruik van een substraat met een even aantal koolstofatomen bezitten ook de eenheden, waaruit het polymeer bestaat, een even aantal koolstofatomen. Evenzo bezitten de polymeereenheden een oneven aantal koolstofatomen wanneer een substraat met een oneven aantal koolstofatomen wordt toegepast. De kleinste polymeereenheden bezitten 6 resp. 7 koolstofatomen. Ook bij gebruik van substraten met meer dan 12 koolstofatomen bevatten de verkregen polymeren in essentie echter geen eenheden met meer dan 12 koolstofatomen. De eenheden met 8 resp. 9 koolstofatomen blijken in de praktijk steeds te overheersen.

Om de bacteriën aan te zetten tot de vorming van PHA wordt bij voorkeur een voedingsstoflimitatie toegepast, d.w.z. dat de aerobe kweek in de praktijk wordt uitgevoerd onder een stikstof-, fosfor-, zwavel- of magnesiumlimitatie, bij voorkeur op een medium zoals een E2 medium onder een stikstoflimitatie.

De groei- en polymeervormingscondities zijn in essentie zoals ze in de Europese octrooiaanvrage EP-A-0274151 zijn beschreven. Volgens deze algemeen bruikbare condities wordt de aerobe kweek (fed-batch of continu) uitgevoerd bij een pH van 5-9, liefst ongeveer 7, bij een temperatuur beneden 37 °C, liefst ongeveer 30 °C, en onder adequate agitatie bij een opgeloste zuurstof-spanning boven 30 %, liefst ongeveer 50 % of hoger verzadiging met lucht. Desgewenst wordt een systeem met twee vloeistoffasen toegepast, waarvan de ene een waterfase is die de wateroplosbare voedingsstoffen en de bacteriën bevat, en de andere een apolaire fase is die de als substraat dienende koolwaterstofverbin-ding(en) bevat. Bij gebruik van meer polaire substraten, zoals de mono- en dicarbonzuren zal echter bij voorkeur onder toepassing van geschikte surfactants in een éénfase-systeem worden geopereerd.

Doorgaans zal men in de praktijk zo te werk gaan, dat de aerobe kweek onder voedingsstoflimitatie wordt uitgevoerd na een exponentiële groeifase zonder voedingsstoflimitaties tot een celdichtheid van ten minste 2 g/1. Het is echter ook mogelijk om een co-metabolisch proces te laten plaats vinden, waarbij een bij voorkeur goedkope koolstofbron zoals glucose, sucrose, melasse, e.d.) wordt toegepast voor groei (d.w.z. voor vermeerdering van celmassa) en een alkaan of alkaanoxydatieprodukt wordt gebruikt als substraat voor de gewenste polymeervorming.

De stationaire fase, waarin de biopolymeer insluitsels worden gevormd, wordt bij voorkeur niet te lang voortgezet omdat het polymeergehalte na het bereiken van een maximum weer gaat afnemen. Het heeft derhalve de voorkeur, dat de biopolymeer bevattende cellen, die in de stationaire fase onder voedingsstoflimitatie zijn gevormd, worden geoogst voordat een significante afname van het biopolymeergehalte van de cellen heeft plaatsgevonden.

Overigens is experimenteel vastgesteld, dat PHA's ook onder niet-limiterende omstandigheden kunnen worden gevormd. Zo bleken bacteriën van de stam Pseudomonas putida KT2442 gedurende de gehele fermentatie, zowel tijdens de exponentiële als tijdens de stationaire fase, PHA te vormen. De toepassing van groei-limiterende omstandigheden is derhalve niet noodzakelijk.

Het in de cellen opgesloten biopolymeer hoeft niet noodzakelijkerwijze te worden geïsoleerd, omdat de bacteriecellen met daarin de biopolymeerinsluitsels soms rechtstreeks kunnen worden gebruikt, zoals bijv. wordt voorgesteld in het Amerikaanse octrooischrift 3.107.172. Voor de meeste toepassingen zal echter isolatie en zuivering van het polymeer gewenst c.q. noodzakelijk zijn. Hiertoe kunnen vele op zichzelf bekende methodieken worden toegepast. De bacteriecellen kunnen op velerlei, aan de deskundige bekende wijzen worden opengebroken, bijv. door afschuifkrachten toe te passen (met behulp van homogenisatoren, maalinrichtingen, "French press", e.d.), door een osmotische schokbehandeling uit te voeren, door middel van geluids-trillingen of ultrasone trillingen, door enzymatische celwand-afbraak, of door sproeidrogen van de cellensuspensie. Vervolgens kan het polymeer van de overige componenten worden gescheiden op velerlei, op zichzelf bekende wijzen, waaronder oplosmiddel-extractie en centrifugeren. Een geschikte isoleringsmethode, 'aangehaald in de eerder genoemde Europese octrooiaanvrage EP-A-0274151, maakt gebruik van een isopycnische centrifugering. Voor isolering op grotere schaal heeft het de voorkeur dat het biopolymeer wordt geïsoleerd door de geoogste cellen om te zetten in sferoplasten, deze door behandeling met geluids-trillingen open te breken, de na centrifugeren gevormde toplaag af te scheiden en desgewenst te wassen en te drogen. Bij voorkeur geschiedt de omzetting in sferoplasten in tegenwoordigheid van sucrose. De centrifugering verloopt bevredigend wanneer gedurende ca. 30 min. gecentrifugeerd wordt met 10.000 g. Het polymeer vormt dan een witgekleurde toplaag op het supernatant en kan gemakkelijk worden afgescheiden. Verontreinigingen kunnen door wassen worden verwijderd, waarna het gewassen polymeer bij voorkeur door vriesdrogen in een geschikte droge vorm wordt gebracht.

Voor de isolatie van het gevormde polymeer kan verder ook de eveneens in de Europese octrooiaanvrage EP-A-0274151 beschreven oplosmiddelextractie procedure worden gebruikt. Vergeleken met de biochemische procedure, die gebruik maakt van een sucrose gradiënt en verschillende centrifugatiestappen, is extractie van gevriesdroogde cellen met bijv. chloroform eenvoudiger, sneller, en bevorderlijk voor een hogere opbrengst van een zuiverder produkt.

Voor de toepassingsmogelijkheden van de verkregen polyesters wordt verwezen naar de eerder genoemde Europese octrooiaanvrage EP-A-0274151, met inbegrip van de mogelijkheid om de verkregen biopolymeren chemisch te modificeren of met andere polymeer-ketens te verknopen, en gebruik voor de vervaardiging van voortbrengselen zoals hechtdraden, folies, huid- of bot-protheses, en dergelijke.

De uitvinding verschaft ook een werkwijze voor het bereiden van optisch actieve carbonzuren of carbonzuuresters, waarbij een met de werkwijze volgens de uitvinding verkregen polyester wordt gehydrolyseerd en desgewenst de daarbij verkregen monomeren worden veresterd. Dergelijke optisch actieve verbindingen, die bijv. als tussenprodukten in de bereiding van farmaceutische produkten of voor onderzoek van nut kunnen zijn, kunnen veelal langs chemische weg niet gemakkelijk in optisch zuivere toestand worden verkregen. Indien bij de werkwijze als gevolg van het toegepaste substraat mengsels van verschillende monomeren worden verkregen, kunnen deze desgewenst op een op zichzelf bekende wijze worden gescheiden.

De uitvinding zal nu verder aan de hand van het hierna volgende experimentele gedeelte nader worden toegelicht.

(1) Bacteriestammen en groeicondities

De in tabel A vermelde stammen werden toegepast. Als groei-media werden E-medium (Vogel en Bonner, J. Biol. Chem. ?18.

1956, 97-106), E2-medium (Lageveen et al, Appl. Env. Microbiol. JÜL, 1988, 2924-2932) of 0,5xE2 toegepast.

E-medium heeft de volgende samenstelling: trinatriumcitraat 2,0 g/1

MgS04.7H20 0,2 g/1

NaNH4HP04.4H20 3,5 g/1 K2HP04 10 g/1 1000 MT 1 ml/1 E2-medium heeft de volgende samenstelling:

NaNH4HP04.4H20 3,5 g/1 K2HP04.3H20 7,5 g/1 KH2P04 3,7 g/1 1000 MT 1 ml/1 100 mM MgS04 10 ml/1 0,5xE2 medium heeft de volgende samenstelling:

NaNH4HP04.4H20 1,8 g/1 K2HP04.3H20 3,8 g/1 KH2P04 1,9 g/1 1000 MT 1 ml/1 100 mM MgS04 10 ml/1 1000 MT (in 1 N HC1) heeft de volgende samenstelling: FeS04.7H20 2,78 g/1

MnCl2.4H20 1,98 g/1 C0SO4.7H20 2,81 g/1

CaCl2.2H20 1,47 g/1

CuCl2.2H20 0,17 g/1

ZnS04.7H20 0,29 g/1

De bovenstaand genoemde media staan groei toe tot een -bepaalde celdichtheid, waarna stikstof limiterend is. De celdichtheid, die op het 0,5xE2 medium kan worden bereikt, bedraagt naar verwachting ongeveer 0,7-0,9 mg/ml. Bij deze celdichtheid is stikstof limiterend en is verdere toename in celmassa het gevolg van een ophoping van PHA.

De vetzuren werden tot eindconcentraties van 10 mM (voor butyraat, valeraat, octanoaat, nonanoaat, decanoaat en undecanoaat), 5 mM (voor lauraat, tridecanoaat, myristaat, pentadecanoaat, oleaat, elaidaat en γ-linolenaat) en 2 mM (voor palmitaat, heptadecanoaat, stearaat en erucaat) als lOx zo geconcentreerde voorraadoplossingen opgelost in 10 % Brij 58, door toevoeging van 1 N KOH op pH 7,0 gebracht en door een filter gesteriliseerd (Jenkins en Nunn, J. Bacteriol. 169, 1987, 42-52). Een toevoeging van 3-hydroxybutyraat was tot 0,7 %.. Toevoegingen van 1-octanol en octanal (3 % v/v) geschiedden direkt aan vloeibare cultures en in dampvorm aan op vaste media groeiende cellen. Aan 1-octanol of octanal bevattende vloeibare cultures werd 17 % dibutylftalaat toegevoegd om beschadiging van de cellen te verhinderen.

Tabel A: gebruikte stamman

Stain___karakteristieken referentie £. oieaYQrans GPol OCT (a) GPol2 OCT~ Kok, thesis Groningen £. pnfclda

PpGl (b) KT2442 TOL“,Rfr (c) £. aeruoinosa PA01 prototype (d) £. fluar.esc.e.D5 prototype (e),DSM 50090 £. lemonnieri (e),DSM 50415 £. testosteron! prototype (f) afkortingen; OCT: QCT-plasmide; TOL: TOL-plasmide; Rfr: rifampicine resistentie; DSM: Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zell-kulturen GmbH, Braunschweig, BRD.

(a) : Schwartz en McCoy, Appl. Microbiol. 2£, 1973, 217-218 (b) : Grund et al, J. Bacteriol. 123. 1975, 546-556 (c) : Bagdasarian et al, Gene 1£, 1981, 237-247 (d) : Holloway, Bacter. Rev. 22, 1969, 419-443 (e) : Stanier et al, J. Gen. Microbiol. £2, 1966, 159-271 (f) : Marcus en Talalay, J. Biol. Chem. 218, 1956, 661-674

(2) bepaling ..van .PHA

Voor een kwalitatieve analyse van de aanwezigheid van PHA werden de cellen microscopisch onderzocht. Voor een kwantitatieve analyse werden de cellen op 0,5xE2 agar platen of in 50 ml 0,5xE2 cultures gekweekt en op de aanwezigheid en samenstelling van PHA onderzocht volgens de eerder door Lageveen et al beschreven methode. De samenstelling van de polymeren werd ook bepaald aan geïsoleerd polymeer, verkregen uit 1 liter cultures na chloroform extractie.

Voor het polymeeronderzoek werden cellen geoogst, gelyofili-seerd en daarna 140 min. bij 100 °C behandeld met 15 % zwavelzuur in methanol/chloroform om vetzuren in de methylesters om te zetten. De methylesters werden vervolgens met gas-vloeistof-chromatografie (GLC) geanalyseerd. De meting van methyl-3-hydroxybutyraat werd aangepast door het GLC programma bij 68 °C te starten. Na 2 min. bij deze temperatuur werd de kolom 20 min. lang met een snelheid van 5 °C/min. opgewarmd. Daarna werd de kolomtemperatuur met een snelheid van 10 °C/min. naar 278 °C verhoogd om alle hoogmoleculaire componenten te verwijderen. Op basis van de celdichtheid (Witholt, J. Bacteriol. 109. 1972, 350-364) en de piekoppervlak-verhoudingen van de monomeren en de interne standaard (methylbenzoaat) konden de door de cellen opgehoopte hoeveelheid polymeer en de samenstelling daarvan worden bepaald.

(3) vorming van PHA door. P......oleovorans .op alkaanoxvdatie- pr.Qdukt.en

Onderzocht werd de vorming van PHA door het prototype van alkaan oxyderende pseudomonaden, te weten £. oleovorans GPol, bij toepassing van 1-octanol, octanal of octanoaat als substraat. Deze koolstofbronnen werden toegevoegd tot uiteindelijke hoeveelheden van 3 % (vol/vol) of 10 mM (octanoaat). Omdat 1-octanol en octanal toxisch waren voor de cellen, werden de cultures aangevuld met 17 % dibutylftalaat. De resultaten staan in tabel B.

Bij gebruik van 1-octanol of octanoaat als substraat werd inderdaad PHA gevormd. Bij gebruik van octanal als substraat trad geen groei op. De opbrengst aan polymeer was het grootst na groei op octanoaat. De gevormde polymeren bestonden voornamelijk uit 3-hydroxyoctanoaat eenheden (90 %), terwijl de rest bestond uit 3-hydroxyhexanoaat eenheden. Dit stemt overeen met de resultaten bij gebruik van octaan.

Tabel Bi. invloed oxvdatietoestand· substraat substraat droge celmassa cellulair PHA polymeersamenstelling _(mg/.mli_gehalte f%) 30H-6_30H-8 1-octanol 1/3 3,1 0,10 0,90 octanal geen groei octanoaat 1,2 8,7 0,12 0,88

Bacteriën van de stam £. oleovorans GPol werden gegroeid in 50 ml 0,5xE2 medium op de vermelde substraten en na 20 uur groei op PHA geanalyseerd. Het cellulaire PHA gehalte is het percentage polymeermassa ten opzichte van de droge celmassa. Met 30H-6 en 30H-8 zijn resp. 3-hydroxyhexanoaat en 3-hydroxyoctanoaat bedoeld.

(4) vorming van PHA door andere pseudomonaden

Behalve voor bacteriën van de stam E. oleovorans GPol werd ook voor de niet op alkanen groeiende stammen E. oleovorans GPol2 (een 0CT~ afgeleide van GPol), £. putIda PpGl (een plasmide-loze, uit grond geïsoleerde stam) en £. putida KT2442 (een rifampicine-resistente stam, die afgeleid is van £. putida mt-2 en van het TOL-plasmide is ontdaan) polymeervorming onderzocht. Al deze stammen behoren tot de groep van £. putida, biotype A. De stammen werden gegroeid op agar platen met minimaal medium op octanol damp en microscopisch op de aanwezigheid van PHA geanalyseerd. Bij al deze stammen werd de vorming van een reserve materiaal geconstateerd uit de intracellulaire ophoping van polymeer granules die bij fasecontrastmicroscopie als transparante (witte) stippen werden waargenomen.

Om de hoeveelheid en samenstelling van het reservemateriaal te bepalen werden cellen van de platen verzameld en op PHA geanalyseerd. Zoals uit tabel C blijkt, produceerden de onderzochte stammen, met uitzondering van £. putida PpGl, PHA dat voor 90 % uit 3-hydroxyoctanoaat en voor 10 % uit 3-hydroxyhexanoaat bestond. De stam £. putida PpGl produceerde ook PHA, maar dit bleek bijna een homopolymeer te zijn doordat het voor liefst 96 % uit Ce en voor slechts 4 % uit Cg monomeren was opgebouwd. Vergeleken met de £. oleovorans stammen GPol en GPol2, bleken de £. putida stammen PpGl en KT2442 hogere intracellulaire PHA gehaltes op te hopen.

Tabel C: PHA synthese door andere Pseudomonas stammen stam_cellu3.aiE_.PHA gehalte (¾)_fractie 3QH-6 (%) GPol 2-5 9,5 ± 1,0 GPol2 2-5 9,4 ± 1,5

PpGl 10-20 4,0 ± 0,7 KT2442 10-20 9,0 ± 1,1

De stammen werden gegroeid op 1-oCtanol op 0,5xE2 platen. De samenstelling is getoond aan de hand van de fractie 3-hydroxy-hexanoaat monomeren in de polyester, waarbij de rest wordt uitgemaakt door 3-hydroxyoctanoaat.

(5) vorming van PHA door weer andere pseudomonaden

Er bestaan verschillende indelingen van pseudomonaden, zoals de indeling naar rRNA homologie (de Vos en de Ley, Int. J. Syst. Bacteriol. .12, 1983, 487-509), naar overeenkomsten tussen enzymen die bij de biosynthese van aromatische aminozuren zijn betrokken (Byng et al, J. Mol. Evol. 1£, 1983, 272-282), en naar metabolisme eigenschappen zoals beschreven in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. De fluorescente Pseudomonas stammen (de soorten £. pytida, £. aeruginosa en £. fluorescens) zijn in al deze verschillende indelingssystemen leden van dezelfde groep en hebben met elkaar gemeen, dat ze niet in staat zijn tot de vorming van PHB.

Het onderzoek naar de vorming van PHA's werd voortgezet voor verschillende Pseudomonas stammen uit de £. fluorescens rRNA tak, nl. de prototypen £. aeruginosa PAO, £. fluorescens en £, lemonnieri. alsmede de bovengenoemde £. oleovorans en £. putida stammen en voorts de niet tot deze groep behorende soort £. testosteron!. Al deze stammen werden gegroeid op 10 mM octanoaat of op 0,7 % 3-hydroxybutyraat in 50 ml 0,5xE2 cultures. De cellen werden geoogst en PHA werd bepaald aan hele cellen {tabel D) v

De £. putida stammen werden ook gegroeid in E2-medium op 30 mM octanoaat of 0,7 % 3-hydroxybutyraat in 1 1 fermentors, gevolgd door isolatie van de polyesters. De samenstelling van de polymeren bleek overeen te stemmen met die, vastgesteld bij de analyse aan hele cellen. De PHA's van op octanoaat gegroeide cellen bestonden steeds uit 3-hydroxyhexanoaat, 3-hydroxy-octanoaat, en kleine hoeveelheden 3-hydroxydecanoaat. Er werden geen 3-hydroxyvetzuren met een oneven aantal koolstofatomen gedetecteerd. Na groei op 3-hydroxybutyraat, werden noch in culturemonsters, noch in het door precipitatie van een chloroform extract van de hele cellen verkregen materiaal 3-hydroxyvetzuren gevonden.

Bacteriën van de soorten £. aeruginosa. £. fluprescens en £. lemonnieri bleken alle na groei op octanoaat PHA te vormen, terwijl ze bij groei op 3-hydroxybutyraat geen polymeer vormden. Daarentegen bleek £. testosteroni, die niet in staat was om te groeien op octanoaat, bij groei op 3-hydroxybutyraat of decano-aat PHB te vormen. Bij groei op het laatstgenoemde substraat bestond slechts 13 % van de monomeren niet uit 3-hydroxybutyraat. De door de verschillende soorten gevormde hoeveelheden PHA liepen sterk uiteen.

De £. putida en £. oleovorans stammen gaven 30-50 % PHA, £. aeruginosa gaf ongeveer 15 %, en £. fLuor.gSC.ens, het prototype van de fluorescente pseudomonaden, gaf slechts 1-2 % PHA.

De tot £. fluorescens Biotype IV behorende soort £. lemonnieri hoopte daarentegen PHA op tot bijna 40 % van zijn droge cel-massa. Deze percentages dienen overigens louter als een algemene indicatie van het PHA vormend vermogen van de al dan niet fluorescente pseudomonaden uit de £. fluorescens rRNA tak te worden gezien, omdat de kweekcondities van invloed kunnen zijn op de PHA opbrengst en de PHA synthese door de verschillende stammen nog niet geoptimaliseerd is.

label D: PHA vorming door verschillende Pseudomonas stammen stam substraat polymeer samenstelling

_gehalte 3QH-4 30H-6_30H.-8_3DEzlQ

£. oleovorans GPol HB 0 oct 29,7 - 0,07 0, 90 0,03 GPol2 HB 0 oct 34,1 - 0,06 0,91 0,03 £. puil,da

PpGl HB 0 oct 29,4 - 0,03 0,93 0,04 KT2442 HB 0 oct 47,1 - 0,08 0,91 0,01 £. aexugino.sa PAO HB 0,1 - 1,0 oct 14,4 - 0,08 0,86 0,07 £. .fLuorescens HB 0,4 - - - 1,0 oct 1, 6 - 0,14 0,63 0,22 £. lemonnierl DSM 50415 HB 0,7 - - 0,14 0,86 oct 38,5 - 0,06 0,91 0,03 £. testosteron! HB 15,4 0, 99 - - 0,01 oct geen groei dec 6,0 0,87 0,03 0,09 0,02

De voor het substraat gebruikte afkortingen zijn: HB: 3-hydroxybutyraat; oct: octanoaat/ en dec: decanoaat.

(6) effect van het substraat op de PHA vorming

Om het effect van het groeisubstraat op de samenstelling van het gevormde polymeer te bepalen werd £. oleovorans GPol gekweekt in 50 ml cultures, bevattende 0,5xE2 medium aangevuld met een vetzuur met 4-22 koolstofatomen, waarna de cellen geoogst en op de aanwezigheid van poly-3-hydroxyalkanoaten onderzocht werden. De resultaten zijn in tabel E weergegeven.

De PHA vorming was beperkt wanneer kleine vetzuren zoals 3-hydroxybutyraat, butyraat en valeraat werden gebruikt. Ondanks de beperkte produktie (minder dan 1,5 %) bevatten de gevormde PHA's Ce, Cio en C12 monomer en. Monomeren met minder dan 8 koolstofatomen werden niet waargenomen.

Wanneer carbonzuren van middelbare lengte, zoals octanoaat, nonanoaat, decanoaat en undecanoaat werden gebruikt, vond een aanzienlijke polymeervorming plaats (meer dan 8 %). De samenstelling van de polyesters stemde overeen met die van de PHA's, gevormd bij groei op de overeenkomstige n-alkanen.

Groei op langere vetzuren leidde eveneens tot PHA synthese. Bij gebruik van lauraat, tridecanoaat, myristaat, pentadecanoaat en palmitaat als koolstofbron lag de gevormde hoeveelheid polymeer in hetzelfde gebied als bij gebruik van vetzuren met middelbare lengte was gevonden (meer dan 5 %). Bij gebruik van langere verzadigde vetzuren, zoals heptadecanoaat en stearaat, groeiden de bacteriën niet goed en werd geen polymeervorming gedetecteerd. Bij gebruik van onverzadigde carbonzuren met 18 koolstofatomen vonden daarentegen wel groei en polymeervorming plaats. Dit was niet het geval bij gebruik van erucaat, een onverzadigd vetzuur met 22 koolstofatomen,

De samenstelling van de polyesters bleek bij gebruik van een substraat met meer dan 12 koolstofatomen (lauraat en hoger) niet meer zo substraat-afhankelijk te zijn: wanneer het substraat een even aantal koolstofatomen had, was 3-hydroxydodecanoaat steeds het grootste monomeer, en wanneer het substraat een oneven aantal koolstofatomen had, was 3-hydroxyundecanoaat steeds het grootste monomeer. De samenstelling van de op langere (12 en meer koolstofatomen) vetzuren met een even aantal koolstofatomen gevormde PHA's vertoonde een vaste verhouding voor de C^t Cq, C10 en C12 monomeren van ongeveer 1,3 : 8,9 : 4,7 : 1. De samenstelling van de op langere (11 en meer koolstofatomen) vetzuren met een oneven aantal koolstofatomen gevormde PHA's vertoonde een vaste verhouding voor de C7, Cg en Cu monomeren van ongeveer 2,3 : 3,4 : 1.

Tabel E: PHA ..vorming door P. oleovorans op C4-C22 vetzuren sub- polymeer- polymeer samenstelling straat gehalte ,(.%) 30H-6 30H-7 3QH-8 30H-9 3QH-10 30H-11 30H-12 verzadigde .vetzuren HB 1,2 - - 0,22 - 0, 57 - 0,21 C4 0, 6 - - - - 0,33 - 0, 67 C5 0,7 - 0,35 - 0,65 C8 8,7 0,08 - 0, 91 - 0, 01 C9 9, 1 - 0,35 - 0, 65 - - - CIO 12,5 0,08 - 0,75 - 0,17

Cll 9,8 - 0,28 - 0,59 - 0,13 C12 6, 6 0,06 - 0,57 - 0,32 - 0,05 C13 5,4 - 0,32 - 0,48 0,05 0,14 C14 10, 6 0,07 - 0,59 - 0,30 - 0,04 C15 5,3 - 0,32 - 0,47 0,08 0,13 C16 3,4 0,08 - 0,50 - 0,30 - 0,12

Cl7 en Cl8 geen groei onverzadigde vetzuren ole 7,4 0,09 - 0,57 - 0,28 - 0,06 ela 11,2 0, 10 - 0,56 - 0,27 - 0, 07 lin 5, 9 0,10 - 0,57 - 0,30 - 0,04 eru geen groei

De voor de substraten gebruikte afkortingen zijn: HB: 3-hydroxybutyraat; C4: butyraat; C5: valeraat; C8 tot C18: octanoaat tot octadecanoaat; ole: oleaat (cis-9-octadecenoaat); ela: elaidaat (trans-9-octadecenoaat); lin: γ-linolenaat (cis-6,9,12-octadecatrienoaat)/ eru: erucaat (cis-13-docosenoaat). met wordt <0,005 aangegeven.

Claims

1. Werkwijze voor het bereiden van polyesters door onder aerobe condities bacteriën uit de Pseudomonas fluorescens rRNA tak volgens de phylogenetische indeling van de Vos en de Ley in Int. J. of Syst. Bacteriol. H, 1983, 487-509, met uitzondering van Pseudomonas oleovorans. te kweken in een voedingsmedium, dat als koolstofbron ten minste één assimileerbare acyclische alifatische koolwaterstofverbinding omvat, en desgewenst het gevormde biopolymeer uit de cellen te winnen.

2. Werkwijze voor het bereiden van polyesters door onder aerobe condities bacteriën uit de Pseudomonas fluorescens rRNA tak volgens de phylogenetische indeling van de Vos en de Ley in Int. J. of Syst. Bacteriol. ll, 1983, 487-509, met uitzondering van Pseudomonas oleovorans, te kweken in een voedingsmedium, dat een overmaat van een koolstofbron en een beperkende hoeveelheid van ten minste één van de andere voor groei noodzakelijke voedingsstoffen bevat, waarbij de koolstofbron ten minste één assimileerbare acyclische alifatische koolwaterstofverbinding omvat, en desgewenst het gevormde biopolymeer uit de cellen te winnen.

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, waarbij bacteriën worden toegepast, gekozen uit de groep die bestaat uit Pseudomonas fluorescens. biotype I Pseudomonas fluorescens. biotype II Pseudomonas, fluorescens, biotype m Pseudomonas fluorescens, biotype IV Pseudomonas puilde biotype a Pseudomonas putida biotype B Pseudomonas anreofaciens Pseudomonas .syringae Pseudomonas si.ut.zeri Pseudomonas mendogliia Pseudomonas chloraphis. Pseudomonas .cisho.Eii. pseudomonas paemdoalflaligenes pseudomonas alcaligenes, pseudomonas aeruginosa

4. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-3, waarbij als assimileerbare acyclische alifatische koolwaterstofverbinding een al dan niet onverzadigd alkaan of alkaanoxydatieprodukt met 6 of meer koolstofatomen wordt toegepast.

5. Werkwijze volgens conclusie 4, waarbij een al dan niet onverzadigd alkaan of alkaanoxydatieprodukt met 6-24 koolstofatomen, bij voorkeur 6-18 koolstofatomen wordt toegepast.

6. Werkwijze volgens conclusie 5, waarbij een alkaancarbonzuur met 6-18, bij voorkeur 12-16 koolstofatomen, of een alkaandi-carbonzuur met 6-18, bij voorkeur 6-12 koolstofatomen wordt toegepast.

7. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-6, waarbij de aerobe kweek wordt uitgevoerd onder een stikstof-, fosfor-, zwavel- of magnesiumlimitatie, bij voorkeur onder stikstof-1imitatie.

8. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-7, waarbij de aerobe kweek wordt uitgevoerd bij een pH van 5-9, liefst ongeveer 7, bij een temperatuur beneden 37 °C, liefst ongeveer 30 °C, en onder adequate agitatie bij een opgeloste zuurstof-spanning boven 30 %, liefst ongeveer 50 % of hoger verzadiging met lucht.

9. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-8, waarbij de aerobe kweek onder voedingsstoflimitatie wordt uitgevoerd na een daaraan voorafgegane exponentiële groeifase zonder voedingsstof-limitaties tot een celdichtheid van ten minste 2 g/1.

10. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-9, waarbij de biopolymeer bevattende cellen, die in de stationaire fase onder voedingsstoflimitatie zijn gevormd, worden geoogst voordat een significante afname van het biopolymeergehalte van de cellen heeft plaatsgevonden.

11. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-10, waarbij het biopolymeer wordt geïsoleerd door de geoogste cellen om te zetten in sferoplasten, deze door behandeling met geluids-trillingen open te breken, de na centrifugeren gevormde toplaag af te scheiden en desgewenst te wassen en te drogen, of het biopolymeer wordt geïsoleerd door oplosmiddelextractie.

12. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-11, waarbij het verkregen biopolymeer chemisch wordt gemodificeerd.

13. Werkwijze voor het bereiden van optisch actieve carbonzuren of carbonzuuresters, waarbij een met de werkwijze volgens een van de conclusies 1-12 verkregen polyester wordt gehydrolyseerd en desgewenst de verkregen monomeren worden veresterd.

14. Polyester, verkregen onder toepassing van de werkwijze volgens een van de conclusies 1-12.

15. Voortbrengselen, zoals hechtdraden, folies, huid- of bot-protheses, e.d., geheel of gedeeltelijk bestaande uit een polyester volgens conclusie 14.