KR20210049865A

KR20210049865A - 생분해성 폴리머 조성물 및 이를 생산하는 방법

Info

Publication number: KR20210049865A
Application number: KR1020217008610A
Authority: KR
Inventors: 타렉 모하람; 파이살 사울 하미드; 아쉬딥 싱; 패틱 다세쉬쿠마르 파텔; 데본 브리안 그레이; 니콜 린제이 코허; 매튜 더글라스 찰스 하틴; 나와 즈비안
Original assignee: 모하람 벤처스 인크.
Priority date: 2018-08-24
Filing date: 2019-08-23
Publication date: 2021-05-06
Also published as: PH12021550367A1; ZA202101421B; WO2020037394A8; US20210317302A1; MX2021002172A; AU2019324739A1; CA3110841A1; WO2020037394A1; JP2021534820A; EP3841169A1; CO2021003495A2; CN113330068A; IL281041A; BR112021003402A2; JP2024133076A; EP3841169A4

Abstract

본 발명에 따른 생분해성 폴리머 조성물은 열가소성 전분, 디헥실 소듐 설포석시네이트와 말레산 무수물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 상용화제, 및 미세결정상 셀룰로오즈와 셀룰로오즈로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 첨가제와 배합된 폴리하이드록시부티레이트 및 폴리(3-하이드록시부티레이트-코-3-하이드록시헥사노에이트)를 포함한다. 생분해성 폴리머를 생성시키는 방법은 탄소 공급원으로서 가공된 대마 폐기물을 사용한다.

Description

생분해성 폴리머 조성물 및 이를 생산하는 방법

본 발명은 생분해성 폴리머, 특히, 생분해성 폴리머 조성물 및 대마 폐기물(cannabis waste)을 탄소 공급원으로 사용하여 이를 생산하는 방법에 관한 것이다.

플라스틱은 가볍고 내구성이 있는 다용도 재료이고, 건설로부터 의료에 이르기까지 그리고 소비재로부터 포장 재료에 이르기까지 많은 산업에서 필수적인 부분이다. 많은 플라스틱 재료의 생산은 비-재생 가능한 자원에 의존하여, 경제적 및 환경적으로 장기적인 생존 가능성을 지속되지 않게 한다. 많은 종류의 플라스틱의 환경 파괴에 요구되는 시간도 이들 문제를 악화시킨다. 전형적으로는, 플라스틱 빨대와 같은 소비재에 사용되는 플라스틱은 환경에서 분해되는데 약 200년이 소요된다. 낚시줄에 사용되는 것들과 같은 더욱 내구성인 플라스틱은 분해되는데 600년까지도 소요될 수 있다.

그 결과, 플라스틱 폐기물의 환경적 축적은 점점 더 긴급한 대중의 관심사가 되어, 빨대를 포함한 일회용 플라스틱 품목을 금지하는 등 폴리스틱 폐기물을 줄이기 위한 노력을 기울이고 있다. 다른 노력, 예컨대, 플라스틱 재생 프로그램을 증가시키는 것은 비용 문제에 의해서 제한되며, 그리고 대부분의 플라스틱이, 그 물리적인 성질이 추가의 사용에 적합하지 않게 되기 전에, 단지 제한된 횟수로 재생될 수 있기 때문에, 제한된다. 플라스틱 폐기물의 환경적 축적의 문제를 처리하기 위한 또 다른 옵션은 환경에서 보다 빠르게 분해되는 플라스틱을 생산하는 것이다.

생분해성 플라스틱은 전형적인 플라스틱에 요구되는 시간보다 훨씬 더 짧은 시간 내에 미생물에 의해서 작은 분자, 예컨대, 물, 이산화탄소 또는 메탄 및 바이오매스(biomass)로 분해될 수 있는 플라스틱이다. 많은 생분해성 플라스틱은 또한 비-재생 가능한 석유화학 공급원이 아닌 재생 가능한 공급원으로부터 생산될 수 있다. 그러나, 생분해성 플라스틱은 부서지기 쉽거나 낮은 열 안정성을 갖는 것과 같은 많은 바람직하지 않은 특성을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 다른 공지된 생분해성 플라스틱은 생산 비용이 매우 높아서 이들의 광범위한 채택을 방해하였다.

따라서, 개선된 기계적 특성을 갖는 새로운 생분해성 플라스틱에 대한 요구가 있다. 추가로, 생산 비용을 낮추기 위해서 재생 가능한 원료로부터 생분해성 플라스틱을 생산하는 새로운 방법에 대한 요구가 있다.

다양한 관할권이 대마의 레크리에이션적 사용(recreational use)을 합법화하기 시작함에 따라서, 대마 폐기물, 및 이의 처분은 산업에 대한 상당한 도전이 될 것으로 예상된다. 소비자를 위한 1 킬로그램의 대마를 생산하는 데는 8 킬로그램의 폐기물을 발생시킨다. 대마 폐기물의 현재의 처리 방법은 대마 폐기물과 화학물질 및 그 밖의 가공를 위한 재료와 혼합함을 포함하는 엄격하게-규제되는 관행들로 이루어진다.

따라서, 이러한 새로운 산업에 의해서 생산된 증가하는 양의 대마 폐기물에 대한 유용한 응용분야를 개발할 필요가 있다.

본 발명에 따른 생분해성 폴리머 조성물은 열가소성 전분, 디헥실 소듐 설포석시네이트와 말레산 무수물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 상용화제, 및 미세결정상 셀룰로오즈와 셀룰로오즈로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 첨가제와 배합된 폴리하이드록시부티레이트 및 폴리(3-하이드록시부티레이트-코-3-하이드록시헥사노에이트)를 포함한다.

또 다른 구체예에서, 생분해성 폴리머 조성물은 5 중량% 내지 70 중량%의 폴리하이드록시부티레이트, 5 중량% 내지 70 중량%의 폴리(3-하이드록시부티레이트-코-3-하이드록시헥사노에이트), 5 중량% 내지 45 중량%의 열가소성 전분, 0.5 중량% 내지 35 중량%의 하나 이상의 상용화제(compatibilizer), 및 0.5 중량% 내지 15 중량%의 하나 이상의 첨가제를 포함한다.

또 다른 구체예에서, 생분해성 폴리머 조성물은 10 중량% 내지 30 중량%의 폴리하이드록시부티레이트, 20 중량% 내지 60 중량%의 폴리(3-하이드록시부티레이트-코-3-하이드록시헥사노에이트), 10 중량% 내지 30 중량%의 열가소성 전분, 10 중량% 내지 20 중량%의 하나 이상의 상용화제, 및 1 중량% 내지 10 중량%의 하나 이상의 첨가제를 포함한다.

또 다른 구체예에서, 생분해성 폴리머 조성물은 20 중량%의 폴리하이드록시부티레이트, 40 중량%의 폴리(3-하이드록시부티레이트-코-3-하이드록시헥사노에이트), 20 중량%의 열가소성 전분, 15 중량%의 하나 이상의 상용화제, 및 5 중량%의 하나 이상의 첨가제를 포함한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 대마 폐기물을 탄소 공급원으로 사용하여 생분해성 폴리머를 생산하는 방법은 a) 대마 폐기물을 기계적 파쇄에 의해서 가공하는 단계; b) 무기 산 용액 중의 대마 폐기물을 적어도 121℃의 온도에서 적어도 25분 동안 가열하여 대마/산 용액을 생성시키는 단계; c) 대마/산 용액을 냉각시키고, 중화하고, 여과하여 여액을 생성시키는 단계; d) 여액을 무기 염 배지와 1:1 내지 1:2의 비율로 혼합하여 생산 배지를 생성시키는 단계; e) 생산 배지를 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis), 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 브레비스(Bacillus brevis), 카울로박터 크레센투스(Caulobacter cresentus), 바실러스 스파에리쿠스(Bacillus sphaericus), 바실러스 코아굴란스(Bacillus coagulans), 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium), 바실러스 서큐란스(Bacilllus circulands), 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis), 대장균(Escherichia coli), (마이크로라나투스 포스포보로우스(Microlanatus phosphovorous), 리조비움 멜리로티(Rhizobium meliloti), 리조비움 비시애(Rhizobium viciae), 브레디리조비움 자포니쿰(Bredyrhizobium japonicum), 버크홀데리아 세파시아(Burkholderia cepacia), 버크홀데리아 사카리(Burkholderia sacchari), 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necactor), 넵투나모나스 안타르티카(Neptunamonas Antarctica), 아조토박터 비넬란디이이(Azobacter vinelandii), 슈도모다스 푸티다(Pseudomonas putida), 슈도모다스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 에어로모나스 카비애(Aeromonas caviae), 에어로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila), 에어로모나스 펑타타(Aeromonas punctate), 알칼리게네스 라투스(Alcaligenes latus), 할로모나스 볼리비엔시스(Halomonas boliviensis), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 및 피르미쿠테스 박테리움(Fermicutes bacterium)의 천연 및 조작된 균주로 이루어진 군으로부터 선택된 미생물의 종균 배양물(starter culture)로 접종하고, 적어도 30℃의 온도에서 48 내지 72 시간 동안 인큐베이션(incubation)하여 배양물을 생성시키는 단계; 및 f) 배양물로부터 생분해성 폴리머를 추출하는 단계를 포함한다.

또 다른 구체예에서, 배양물로부터 생분해성 폴리머를 추출하는 단계는 a) 배양물을 약 1 mm의 기공 크기를 갖는 막을 통해서 여과하는 단계; b) 여과된 배양물로부터 미생물의 세포를 분리하는 단계; c) 세포를 NaOH 용액에 현탁시키고, 적어도 30℃의 온도에서 적어도 1.5 시간 동안 인큐베이션하여 세포로부터 생분해성 폴리머를 방출시키는 단계; d) NaOH 용액으로부터 생분해성 폴리머를 분리하고 생분해성 폴리머를 물에 재현탁시키는 단계; e) 물로부터 생분해성 폴리머를 분리하고 생분해성 폴리머를 에탄올 용액에 재현탁시키는 단계; 및 f) 에탄올 용액으로부터 생분해성 폴리머를 분리하는 단계를 포함한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 생분해성 폴리머를 생산하는데 사용하기 위한 대마 폐기물로부터 생산 배지를 생성시키는 방법은 a) 원료 대마 폐기물을 기계적 파쇄에 의해서 가공하여 대마 폐기물의 이용 가능한 표면적을 증가시키는 단계; b) 무기 산 용액 중의 대마 폐기물을 적어도 121℃의 온도에서 적어도 25분 동안 가열하여 대마/산 용액을 생성시키는 단계; c) 대마/산 용액을 냉각시키고, 중화하고, 여과하여 여액을 생성시키는 단계; 및 d) 여액을 무기 염 배지와 1:1 내지 1:2의 비율로 혼합하는 단계를 포함한다.

또 다른 구체예에서, 상기 방법은 가공된 대마 폐기물을 물 중에서 진탕시켜 대마 폐기물을 분해하는 단계를 추가로 포함한다. 생성되는 혼합물을 여과하고, 이어서, 수산화나트륨 및 과산화수소 중의 여액을 가열 및 교반한다. 무기 산 용액 중의 대마 폐기물을 가열하는 단계 전에, 생성되는 슬러리를 여과하고, pH를 중화시키고, 건조시켜 건조된 바이오매스(dried biomass)를 생성시킨다.

또 다른 구체예에서, 대마/산 용액을 냉각시키고, 중화시키고, 여과하는 단계는 차가운 탈이온수를 첨가함으로써 반응을 중지시킴을 포함한다. 생성되는 혼합물을 원심분리하고, 중성 pH가 도달할 때까지, 침전물을 탈이온수로 세척한다. 67% 염화아연 중에서 70℃에서 0.5M로 산 가수분해에 의해서 셀룰로오즈를 가수분해하고, 최종 생성물을 무균의 포스페이트 완충된 염수에 희석시킨다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 생분해성 폴리머를 생성시키는 방법은 a) 탄소 공급원으로서 가공된 식물 폐기물을 갖는 질소-제한된 생산 배지를 바실러스 섭틸리스, 쿠프리아비두스 네카토르, 바실러스 세레우스, 바실러스 브레비스, 카울로박터 크레센투스, 바실러스 스파에리쿠스, 바실러스 코아굴란스, 바실러스 메가테리움, 바실러스 서큐란스, 바실러스 리체니포르미스, 대장균, 마이크로라나투스 포스포보로우스, 리조비움 멜리로티, 리조비움 비시애, 브레디리조비움 자포니쿰, 버크홀데리아 세파시아, 버크홀데리아 사카리, 쿠프리아비두스 네카토르, 넵투나모나스 안타르티카, 아조토박터 비넬란디이이, 슈도모다스 푸티다, 슈도모다스 애루지노사, 에어로모나스 카비애, 에어로모나스 하이드로필라, 에어로모나스 펑타타, 알칼리게네스 라투스, 할로모나스 볼리비엔시스, 락토바실러스 람노서스, 및 피르미쿠테스 박테리움의 천연 및 조작된 균주로 이루어진 군으로부터 선택된 미생물의 종균 배양물로 접종하고, 적어도 30℃의 온도에서 48 내지 72 시간 동안 인큐베이션하여 배양물을 생성시키는 단계; b) 배양물을 약 1 mm의 기공 크기를 갖는 막을 통해서 여과하는 단계; c) 여과된 배양물로부터 미생물의 세포를 분리하는 단계; d) 세포를 NaOH 용액에 현탁시키고, 적어도 30℃의 온도에서 적어도 1.5 시간 동안 인큐베이션하여 세포로부터 생분해성 폴리머를 방출시키는 단계; e) NaOH 용액으로부터 생분해성 폴리머를 분리하고, 생분해성 폴리머를 물에 재현탁시키는 단계; f) 물로부터 생분해성 폴리머를 분리하고, 생분해성 폴리머를 에탄올 용액에 재현탁시키는 단계; 및 g) 에탄올 용액으로부터 생분해성 폴리머를 분리하는 단계를 포함한다.

또 다른 구체예에서, 방법은 대마 폐기물로부터 생산된 생산 배지를 사용하여 PHB를 생성시키고, 원액으로부터 영양액(nutrient broth) 중의 PHB를 생성시킬 수 있는 하나 이상의 미생물을 성장시키는 단계를 포함한다. 생산 배지를 하나 이상의 미생물로 접종한다. 생산 배지를 제한된 질소 공급원으로 보충하고, 하나 이상의 미생물이 생산 배지에서 성장하게 한다. 생산 배지를 원심분리하여 생산 배지로부터 하나 이상의 미생물의 세포를 분리하고 세포를 건조시킨다. 건조된 세포를 증류수에 재현탁시키고, 수산화나트륨을 첨가하여 세포로부터 PHB를 추출한다. pH를 7.0으로 조절하여 반응을 중지시키고, 생성되는 혼합물을 원심분리하여 현탁액으로부터 PHB 과립을 분리해낸다. 과립을 증류수로 세정하고, 필요에 따라, 생성되는 혼합물을 재-원심분리한다. 과립을 무기 산의 첨가에 의해서 분리하고 혼합물을 원심분리한다. 액체 상을 버리고, 생성물을 알칼리 욕(alkaline bath)에서 세척하여 PHB를 정제한다. PHB를 물로 세정하고, 필요에 따라, 원심분리한다.

본 발명은 생분해성 폴리머 조성물 및 이를 생산하는 방법에 관한 것이다. 생분해성 폴리머 조성물은 열가소성 전분(TPS), 하나 이상의 상용화제, 및 하나 이상의 첨가제와 배합된 폴리하이드록시부티레이트(PHB) 및 폴리(3-하이드록시부티레이트-코-3-하이드록시헥사노에이트)(PHBHHx)를 포함한다.

본원에서 기재된 생분해성 폴리머 조성물에서 사용된 PHB 및 PHBHHx 중 하나 또는 이들 둘 모두는 바람직하게는 PHB 및/또는 PHBHHx를 생성시키기 위한 천연 또는 조작된 미생물에 의해서 생성된다. PHBHHx는 PHB 및 HHx 모노머의 무작위 또는 비-무작위 코폴리머일 수 있다. 바람직하게는, 생합성 PHBHHx 코폴리머의 3-하이드록시헥사노에이트 단위가 반결정상 PHBHHx의 비정질 상으로 유지된다.

PHB 및/또는 PHBHHx를 포함하는 생분해성 폴리머를 생성시키기에 적합한 미생물은 바실러스 섭틸리스, 쿠프리아비두스 네카토르, 바실러스 세레우스, 바실러스 브레비스, 카울로박터 크레센투스, 바실러스 스파에리쿠스, 바실러스 코아굴란스, 바실러스 메가테리움, 바실러스 서큐란스, 바실러스 리체니포르미스, 대장균, 마이크로라나투스 포스포보로우스, 리조비움 멜리로티, 리조비움 비시애, 브레디리조비움 자포니쿰, 버크홀데리아 세파시아, 버크홀데리아 사카리, 쿠프리아비두스 네카토르, 넵투나모나스 안타르티카, 아조토박터 비넬란디이이, 슈도모다스 푸티다, 슈도모다스 애루지노사, 에어로모나스 카비애, 에어로모나스 하이드로필라, 에어로모나스 펑타타, 알칼리게네스 라투스, 할로모나스 볼리비엔시스, 락토바실러스 람노서스, 및 피르미쿠테스 박테리움의 천연 및 조작된 균주를 포함한다. 바람직하게는, 바실러스 섭틸리스, 쿠프리아비두스 네카토르, 락토바실러스 람노서스, 또는 피르미쿠테스 박테리움(Firmicutes bacterium)의 조작된 균주가, 본원에서 기재된 바와 같이, 생분해성 폴리머 조성물을 위한 PHB 및 PHBHHx를 생성시키기 위해서 사용된다. 바실러스 섭틸리스가 바람직한데, 그 이유는 그것이 그램 양성 박테리아이고, 그에 따라서, 그램 음성 박테리아에 존재하는 독성 지질 A(toxic lipid A)를 함유하지 않기 때문이다. 지질 A에 의한 생분해성 폴리머의 오염은 특정의 적용, 예컨대, 식품 포장, 의료 장비 또는 포장, 위생 포장(hygienic packaging) 및 작은 어린이를 위한 제품에 바람직하지 않다.

본원에서 기재된 방법에서 사용되는 조작된 미생물은 하나 이상의 생분해성 폴리머의 생산에 필요한 형질전환 유전자(transgene)을 포함한 유전자를 발현하도록 유전적으로 변형된다. 바람직하게는, 생성된 생분해성 폴리머는 PHB이다. 적합한 유전자는 아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼라제, 아세틸-CoA 리덕타제, 및 PHB 폴리머라제를 인코딩(encoding)하는 phaA, phaB, phaC, phaJ, 및 phaP 유전자 중 하나 이상을 포함한다. 많은 미생물은 이들 유전자들 중 하나 이상을 자연적으로 발현한다. 일부 미생물은 또한 PHB를 포함한 하나 이상의 생분해성 폴리머를 분해하는 하나 이상의 데폴리머라제(depolymerase)를 인코딩하는 유전자를 발현할 수 있다. 바람직하게는, 본원에서 기재된 방법에서 사용되는 조작된 미생물은 PHB의 생산에 필요한 유전자를 발현할 수 있고, 선택된 미생물에 의해서 생성된 PHB 또는 어떠한 다른 요망되는 생분해성 폴리머를 분해시킬 수 있는 데폴리머라제를 인코딩하는 어또한 유전자를 발현하지 않을 수 있다.

예를 들어, 본원에서 기재된 방법 중 하나에 따라서 합성 및 추출된 후에, PHB는 PHBHHx, 열가소성 전분, 하나 이상의 상용화제, 및 하나 이상의 첨가제와 배합된다. 본 발명의 생분해성 플라스틱 조성물에서 사용되는 열가소성 전분은 가소화된 천연 폴리머이고, 바람직하게는 낮은 농도의 아스코르브산 및 시트르산, 가소제로서 30% 글리세롤, 및 전분에 대해서 약 20 중량%의 물을 함유한다. 열가소성 전분은 생분해성 폴리머 조성물의 45 중량%까지의 양으로 존재할 수 있다.

열가소성 전분은 가소화된 천연 폴리머를 제조하는 어떠한 적합한 방법에 의해서, 예컨대, 약 30℃ 내지 약 200℃의 상승된 온도의 이축 압출기(twin screw extruder)에서 천연 전분을 가소제와 혼합함으로써 제조될 수 있다. 물과 글리세롤의 혼합물이 바람직하게는 가소제로서 사용된다. 열가소성 전분의 가소화는 생분해성 폴리머 조성물 내로의 열가소성 전분의 혼합 전에, 또는 모든 성분들(즉, 전분, 글리세롤, 물을 생분해성 폴리머 조성물의 다른 성분들과 함께)을 한번에 첨가하여 최종 배합물을 생성시킴으로써 달성될 수 있다.

상용화제는 디헥실 석시네이트, 디헥실 소듐 설포석시네이트, 말레산 무수물, 메틸렌 디페닐디이소시아네이트, 디옥틸 푸마레이트, 또는 다른 극성 모노머 그라프팅된 폴리올레핀(polar monomer grafted polyolefin) 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 디헥실 석시네이트 및 말레산 무수물의 둘 모두는 0.5-35 중량%의 양으로 존재한다.

첨가제는 미세결정상 셀룰로오즈 또는 셀룰로오즈 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 미세결정상 셀룰로오즈 및 셀룰로오즈의 둘 모두는 0.5-35 중량%의 양으로 존재한다.

생분해성 폴리머 조성물을 분해시키는데 요구되는 시간은 조성물 내에서 열가소성 전분, 미세결정상 셀룰로오즈, 및/또는 셀룰로오즈의 양을 조작함으로써 선택적으로 증가되거나 감소될 수 있다. 열가소성 전분, 미세결정상 셀룰로오즈, 및/또는 셀룰로오즈의 상대적인 양이 증가함에 따라서, 조성물을 분해시키기 위해서 요구되는 시간이 감소한다. 바람직하게는, 미세결정상 셀룰로오즈 또는 셀룰로오즈의 상대적인 양이 아니라, 열가소성 전분의 상대적인 양이 조성물의 분해 시간을 선택적으로 증가시키거나 감소시키기 위해서 조절된다. 추가로, 분해되는 생분해성 폴리머 조성물에 요구되는 시간은 조성물 중의 PHBHHx의 양을 조작함으로써 선택적으로 증가되거나 감소될 수 있다. PHBHHx의 상대적인 양이 증가함에 따라서, 조성물을 분해시키기 위해서 요구되는 시간이 증가한다.

생분해성 폴리머를 생성시키기 위해서 사용되는 탄소 공급원은 대마 폐기물, 잎(leaves), 어류 고형 폐기물(fish solid waste), 단풍나무 수액(maple sap), 호박씨(pumpkin seed), 포도박(grape pomace) 또는 포도 마크(grape marc), 또는 와인 생산/양조장/증류소(distillery) 폐기물을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 대마 폐기물이 PHB의 생산을 위한 탄소 공급원으로서 사용된다. 대마 폐기물은 식물의 뿌리, 트리밍(trimming), 잎 및 줄기, 기본적으로는, 칸나비스 사티바 엘.(Cannabis sativa L.) 식물의 꽃봉오리(flowering bud)를 제외한 모든 부분으로 이루어진다.

대마 폐기물이 미생물에 의한 PHB의 생산에서 탄소 공급원으로서 사용하기에 특히 적합한데, 그 이유는 대마 식물이 높은 바이오매스 함량을 지니며, 단지 중간의 물 및 비료 요건으로 대부분의 기후에서 신속하게 성장하기 때문이다. 다른 잠재적인 탄소 공급원, 예컨대, 농작물 및 삼림 바이오매스, 석탄(coal), 석유 잔류물, 및 뼈에 비해서, 대마 폐기물은 독특한 계층적 기공 구조(hierarchical pore structure) 및 연결된 거대기공(macropore)을 갖는다. 그 결과, 대마 폐기물은 이의 다공성, 흡착 용량 및 표면 반응성 정도를 포함한 탄소 공급원으로서 사용하기에 요망되는 특성을 갖는다. 다른 잠재적인 탄소 공급원에 비해서, 대마 폐기물은 또한 더 높은 탄소 농도 및 더 낮은 질소, 칼륨, 및 인 함량을 지니며, 이는 미생물에 의한 PHB의 생산에 유리하다.

대마 폐기물은, 이하 방법에 따라서, 먼저 기계적 파쇄에 의해서 PHB의 생산에서 사용하기 위해서 가공된다. 원료 대마 폐기물은 쉬레딩(shredding), 그라인딩(grinding), 프레싱(pressing) 또는 다른 적합한 기계적 파쇄 수단에 의해서 처리되어 셀룰로오즈 및 지방산의 제거를 위한 이용 가능한 표면적을 증가시킬 수 있다. 이어서, 가공된 대마 폐기물로부터의 지방산의 분리가, 예를 들어, 이하와 같이, PHB의 합성을 위한 탄소 공급원을 제공하도록 수행된다.

실시예: 생산 배지 1

가공된 대마 폐기물을 100 mL의 산성 용액 당 10 g의 식물 폐기물의 비율로 1% 황산 용액 내로 혼합한다. 용액을, 바람직하게는 오토클레이브(autoclave)에서, 121℃에서 25분 동안 가열하고, 이어서, 실온으로 냉각시킨다. 이어서, 용액을 2M NaOH 용액으로 중화시키고, 체를 통해서 여과하여 식물 폐기물의 더 큰 입자들을 제거한다. 이어서, 용액을 1500 g에서 20분 동안 원심분리하고, 상등액을 약 1 mm의 기공 크기를 갖는 막을 통해서 여과한다. 생성되는 여액, 대마 폐기물 가수분해물을 즉각적으로 사용하거나, 필요할 때까지 4℃에서 저장할 수 있다.

생산 배지 1은 여액을 2X 무기 염 배지(0.9 g (NH₄)₂SO₄, 0.3 g KH₂PO₄, 1.32 g Na₂HPO₄, 0.06 g MgSO₄.7H₂O, 300 uL의 미량 원소 용액(100 mL의 0.1 M HCl 중의 0.97 g FeCl₃, 0.78 g CaCl₂, 0.0156 g CuSO₄.5H₂O, 0.326 g NiCl₂.6H₂O))와 1:1의 비율로 혼합함으로써 제조된다. 배지를 121℃에서 10분 동안 즉각적으로 오토클레이브 처리한다.

실시예: 추출 1

생분해성 폴리머의 합성 및 추출은 하기 방법에 따라서 수행될 수 있다. 적합한 미생물을 150 rpm에서 72 시간 동안 진탕시키면서 30℃에서 원액으로부터의 영양액에서 성장시켜 종균 배양물을 생성시킨다. 72 시간 후에, 종균 배양물을 1/10 (v/v)로 생산 배지 1에 접종하고, 150 rpm에서 72 시간 동안 진탕시키면서 30℃에서 인큐베이션하여 배양물을 생성시킨다.

이어서, 배양물을 약 1 mm의 기공 크기를 갖는 막을 통해서 여과하여 불용성 식물 물질을 제거한다. 이어서, 1500 g에서 20분 동안 원심분리하여 미생물의 세포를 여과된 배양물로부터 분리한다. 상등액을 버리고, 이어서, 세포를 무기 염 배지에 재현탁시키고 원심분리를 반복하고 다시 상등액을 버림으로써 세포를 세척한다.

이어서, 세포를 150 mL의 0.2 M NaOH 용액에 재현탁시키고, 격렬하게 와동시켜서 용액을 균질화시키고, 30℃에서 1.5 시간 동안 인큐베이션시킨다. 이는 세포가 용해되게 하고, 생분해성 플라스틱을 NaOH 용액 내로 방출시킨다. 이어서, 생분해성 폴리머를 1500 g에서 20분 동안 원심분리하고 상등액을 버림으로써 NaOH 용액으로부터 분리한다.

생분해성 폴리머를 150 mL의 밀리큐 워터(milliQ water)에 재현탁시키고, 이어서, 1500 g에서 20분 동안 원심분리함으로써 물로부터 분리한다. 상등액을 버려서 불순물을 제거한다. 이어서, 생분해성 폴리머를 150 mL의 1% 에탄올 용액에 재현탁시키고, 1500 g에서 20분 동안 원심분리함으로써 에탄올 용액으로부터 분리한다. 상등액을 다시 버려서 추가의 불순물을 제거한다.

실시예: 생산 배지 2

5 g의 식물 폐기물을 실온의 300 mL의 탈이온수로 초음파 처리한다. 와트만 번호 1 필터 페이퍼(Whatman No. 1 filter paper)로 여과하고, 이어서, 가열하고, 여액을 수산화나트륨 (5%, w/v) 및 과산화수소 (11%, v/v)의 100 mL 용액을 사용하여 90분 동안 55℃에서 격렬하게 교반시킨다. 슬러리를 여과하고, pH를 중화시키고, 50℃에서 건조시킨다. 5 g의 건조된 바이오매스를 30분 동안 격렬하게 교반시키면서 100 mL의 6 M 황산에 첨가하고, 500 mL의 차가운 탈이온수를 첨가함으로써 반응을 중지시킨다. 10,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하고, 중성 pH가 도달될 때까지 탈이온수로 세척한다. 셀룰로오즈로부터의 단순한 모노머의 획득은 67% 염화아연의 적용 및 0.5M 및 70℃에서의 산 가수분해를 통해서 수행되고, 이는 >80% 수율의 가용성 당을 이상적으로 생성시킨다. 이어서, 최종 글루코오스 생성물을 1 L 무균의 포스페이트 완충된 염수 pH 7.0에 희석시켜서, 생산 배지 2(최종 농도: 8 g/L NaCl, 0.2 g/L KCl, 1.44 g/L Na₂HPO₄, 0.24 g/L K₂HPO₄)를 생성시킨다.

실시예: 추출 2

본 발명의 생분해성 폴리머 조성물에 사용하기 위한 PHB의 합성 및 추출은 하기 방법에 따라서 수행될 수 있다. 적합한 바실러스 에스피피.(Bacillus spp.)를 120 rpm에서 진당시키면서 원액으로부터의 영양액 중에서 37℃에서 밤새 성장시켰다. 1.5 x 10⁸세포/mL의 밀도가 1/10 v/v로 제한된 질소 공급원, 예컨대, 옥수수 침지액(Corn Steep Liquor: CSL) 또는 암모늄 염으로 보충된 생산 배지 2에 0.05% NH₄Cl와 동등한 농도로 첨가될 수 있고, 72 시간 동안 120 rpm으로 진탕하면서 37℃에서 성장시킨다. 이어서, 세포를 6500 g에서 10분 동안 원심분리하고, 50℃에서 건조시킨다.

건조한 세포 매스(cell mass)가 측정될 수 있고, 이어서, PHB가 수산화나트륨 추출 및 선택적 용해를 사용하여 추출될 수 있다. 수산화나트륨 추출은 세포를 증류수에 재현탁시키고 NaOH를 첨가(30C에서 1-5시간 동안 0.2 N NaOH)함으로써 수행된다. pH를 HCl로 7.0으로 조절하여 반응을 중지시킨다. 2500 g에서 20분 동안 원심분리한다. 증류수로 가볍게 세정함으로써 PHB 과립을 회수하고, 다시 원심분리하고, 공기 건조시킨다.

선택적인 용해는 무기 산, 예컨대, 황산을 혼합물에 첨가하여 과립을 고형 상에 분리시키면서 원치 않는 물질을 액체 상에 분리시킴으로써 달성된다. 이들 상은 추가로 5000g에서의 원심분리에 의해서 분리될 수 있다. 원치 않는 상등액(액체 상)을 처리하면서, 고형 상을 가공한다. 무기 산은 혼합물로부터 PHB를 성공적으로 분리하지만, 순도는 바람직하게는 그것이 사용되기 전에 개선된다. 이는 생성물을 알칼리 욕, 예컨대, NaOH (pH 10)에서 세척함으로써 달성된다. 세척 후에, 높은 수율 및 순도(>97%)일 것이다. 생성물을 탈색시키기 위해서, 상업적으로 이용 가능한 표백제가 사용될 수 있다. 최종 원심분리 및 물 세정 후에, PHB 생성물이 사용 준비된다.

PHB의 생산을 측정하기 위해서, 원심분리하고 펠릿(pellet)을 알코올로 세척한다. 펠릿을 클로로포름에 용해시키고, 투명하고 사전 칭량된 혈청 튜브에 옮긴다. 클로로포름을 증발되게 하고, 튜브를 칭량하여 얻은 PHB의 양을 계산한다. 본 발명의 방법은 7-9 g/L 건조 세포 매스로부터 2-5g/L의 PHB의 수율로 생성시킬 수 있다. 이러한 성장 방법은 바실러스 에스피피.와 함께 사용하도록 조절되어 더 적은 양의 배양 배지로부터 더 짧은 시간에 더 많은 양의 PHB를 또한 생성시킬 수 있다. 대안적으로, 쿠프리아비두스 네카토르의 유사하게 조작된 균주가 대신 사용될 수 있다.

실시예: 추출 3

또 다른 구체예에서, 하기 방법에 따라서 미생물로서 쿠프리아비두스 네카토르 및 탄소 공급원으로서 대마 폐기물을 사용하여, PHB를 합성하고 추출할 수 있다. PHB를 생성시킬 수 있는 쿠프리아비두스 네카토르의 균주가 사용되고, 이는 알칼리젠네스 유트로포스 H16(Alcaligenes eutrophus H16)(쿠프리아비두스 네카토르는 이전에 알칼리젠네스 유트로포스로 공지되었다)으로 일컬어진다. 알칼리젠네스 유트로포스 H16을 질소 제한된 무기 염 배지 중의 30℃에서 1% (v/v) 대마 오일 및 0.05% (w/v) NH₄Cl와 함께 72 시간 동안 배양한다. 카나마이신(50 mg/L)을 첨가하여 알칼리젠네스 유트로포스 H16에 삽입된 광범위한-숙주 범위 플라스미드를 유지시킨다. 성장 후에, 세포를 수거하고, 증류수로 2회 세척하고, 동결건조시킨다. PHB를 Soxhlet 장치에서 고온 클로로포름을 사용하여 추출하고 메탄올 재침전에 의해서 정제한다.

PHB는, 시간 당 1g 대마유당 약 0.0128 g PHB의 속도로, 추출 3의 방법에 의해서 생성될 수 있다.

실시예: 추출 4

또 다른 구체예에서, 하기 방법에 따라서 미생물로서 쿠프리아비두스 네카토르 및 탄소 공급원으로서 대마 폐기물을 사용하여, PHB를 합성하고 추출할 수 있다. 임의로, 계면활성제 아라비아 검(surfactant gum arabic)이 반응 배지에 첨가되어 대마 오일과 상호작용하고/이를 이용하는 쿠프리아비두스 네카토르의 능력을 향상시킬 수 있는데, 그 이유는, 그것이 비독성이고, 쿠프리아비두스 네카토르의 성장을 억제하지 않기 때문이다. 쿠프리아비두스 네카토르는 2% 프룩토오스(fructose) 및 0.1% NH₄Cl(16 g/L), NaH₂PO₄(4 g/L), Na₂HPO₄(4.6 g/L), K₂SO₄(0.45 g/L), MgSO₄(0.39 g/L), CaCl₂(62 mg/L), 및 1 ml/L의 미량 원소 용액(0.1 M 염산에 용해된 15 g/L FeSO₄·7H₂O, 2.4 g/L MnSO₄·H₂O, 2.4 g/L ZnSO₄·7H₂O, 및 0.48 g/L CuSO₄·5H₂O)을 함유하는 최소 배지에서 원액으로부터 성장할 수 있다. 최소 배지로부터의 세포가 0.1의 OD600에 이르도록 각각의 발효기를 접종시키기 위해서 사용된다. 0.1% NH₄Cl을 함유하는 최소 배지의 경우에, 대략 2% 대마 오일을 사용한다. 배지를 제조하기 위해서, 물에 혼합되고 신속하게 교반된 아라비아검의 10X 용액을 사용한다. 10,500g에서 원심분리하여 불용성 입자를 분리해 낸다. 물, 정화된 아라비아검 용액, 및 대마 오일을 소듐 포스페이트(4.0 g/L) 및 K₂SO₄(0.45 g/L)와 조합한다. 혼합물을 균질화 및 초음파 처리(sonication)를 통해서 유화시킨다. 유화 전에 첨가된 물의 양은 에멀션(emulsion)을 제조하기 위해서 사용된 특정의 장치에 좌우된다. 유화 후에, 오토클레이브 처리하고, 냉각시키고, MgSO₄(0.39 g/L), CaCl₂(62 mg/L), 미량 원소(0.1 M 염산에 용해된 15 g/리터 FeSO₄·7H₂O, 2.4 g/리터 MnSO₄·H₂O, 2.4 g/리터 ZnSO₄·7H₂O, 및 0.48 g/리터 CuSO₄·5H₂O), 및 젠타마이신(10 μg/mL)을 첨가한다. 각각의 반응 용기를 pH를 6.8(2 M NaOH에 의해서 제어됨)로 하면서 30℃에서 유지시키고, 500-900 rpm의 속도에서 40%의 용존 산소 농도로 72 시간 동안 교반시킨다. 바람직하게는, 유가 배양 기술(fed batch culture technique)이 사용되어 PHB 생산을 증가시키기 위해서 과량의 탄소를 유지시킨다.

PHB는, 1g 대마 오일당 약 2415 g PHB의 속도로, 추출 4의 방법에 의해서 생성될 수 있다.

실시예: 추출 5

또 다른 구체예에서, 이하 방법에 따라서, 미생물로서 쿠프리아비두스 네카토르 및 대장균의 조작된 균주, 및 임의로, phbA 및 phbB 유전자를 갖는 에어로모나스 하이드로필라의 조작된 균주, 및 탄소 공급원으로서 대마 폐기물의 혼합물을 사용하여, PHB가 합성되고 추출될 수 있다. 먼저, 대마 폐기물을 파쇄하고 약 2% (w/v)로 그리고 약 30℃의 온도에서 물에 넣는다. 대마-물 혼합물을 쿠프리아비두스 네카토르 및 대장균의 혼합된 배양물로 접종시키고, 임의로, 에어로모나스 하이드로필라 및 미강 추출물(rice bran extract)과 같은 비료를 0.1%의 양으로 첨가한다. 이어서, 반응 배지를 20 시간 동안 교반시켜서 성장이 가능하게 한다. 초기 성장 기간 후에, 반응 배지를 어떠한 추가의 비료의 첨가 없이 추가로 15 시간 동안 교반시켜 질소 결핍 상태를 유도하고 PHB의 생산을 촉진시킨다.

PHB의 추출은 약 35 시간 후에 무기 산, 예컨대, 황산을 반응 배지에 첨가함으로써 수행된다. PHB 과립을 5000g에서 원심분리함으로써 분리한다. 원치 않는 상등액(액체 상)을 처리하면서, 고형 상을 가공한다. 무기 산은 PHB를 혼합물로부터 분리시킨다. 화합물의 순도는 알칼리 욕, 예컨대, NaOH(pH 10)에서 세척한 다음, 최종 원심분리하고 물 세정함으로써 개선될 수 있다. 방법은 PHB의 높은 수율 및 순도(>97%)를 제공한다. 임의로, 상업적으로 이용 가능한 표백제가 사용되어 생성물을 탈색시킬 수 있다.

실시예: 생산 배지 3

또 다른 구체예에서, 이하 방법에 따라서, 미생물로서 슈도모다스 푸티다 GPp104 및 탄소 공급원으로서 대마 폐기물을 사용하여, PHB를 합성하고 추출할 수 있다. 슈도모다스 푸티다(P. putida)를 200 rpm에서 진탕시키면서 30℃에서 50 mg/L 카나마이신을 함유하는 LB 배지에서 밤새 성장시킨다. 이러한 균주를 배양하기 위한 포스페이트 완충된 염수 용액은 9.0 g/L Na₂HPO₄·12H₂O, 1.5 g/L KH₂PO₄, 1.0 g/L (NH₄)₂SO₄, 및 0.4 g/L MgSO₄·7-H₂O으로 구성되고 pH는 7.0이다.

실시예: 추출 6

1.5 x 10⁸ 세포/mL 밀도의 밤새 슈도모다스 푸티다 배양물을 1/10 v/v로 1 L의 생산 배지 3에 첨가하고, 72 시간 동안 200 rpm으로 진탕시키면서 30℃에서 성장시킨다. 이하와 같이 차아염소산나트륨(sodium hypochlorite)을 사용하여 PHB를 추출할 수 있다. 8 g 바이오매스에, 100 mL 차아염소산나트륨(30%)을 첨가하고, 37℃에서 90분 동안 인큐베이션한다. 원심분리하고 펠릿을 알코올로 세척한다. 펠릿을 클로로포름에 용해시키고, 임의로, 투명하고 사전-칭량된 혈청 튜브에 옮긴다. 클로로포름을 증발되게 하고, 튜브를 칭량하여 얻은 PHB의 양을 계산한다.

본 발명이 예시적인 구체예를 참조로 하여 기재되었지만, 본 기술분야에서의 통상의 기술자는, 첨부된 청구범위에서 기재된 바와 같은 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서, 다양한 변경이 이루어질 수 있고 등가물이 그의 요소에 대해서 대체될 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명은 본원에 개시된 특정의 구체예로 제한되지 않는 것으로 의도된다.

Claims

탄소 공급원으로서 대마 폐기물(cannabis waste)을 사용하여 생분해성 폴리머를 생성시키는 방법으로서,
a. 대마 폐기물을 기계적 파쇄에 의해서 가공하는 단계;
b. 무기 산 용액 중의 대마 폐기물을 적어도 121℃의 온도에서 적어도 25분 동안 가열하여 대마/산 용액을 생성시키는 단계;
c. 대마/산 용액을 냉각시키고, 중화하고, 여과하여 여액을 생성시키는 단계;
d. 여액을 무기 염 배지와 1:1 내지 1:2의 비율로 혼합하여 생산 배지를 생성시키는 단계;
e. 생산 배지를 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis), 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 브레비스(Bacillus brevis), 카울로박터 크레센투스(Caulobacter cresentus), 바실러스 스파에리쿠스(Bacillus sphaericus), 바실러스 코아굴란스(Bacillus coagulans), 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium), 바실러스 서큐란스(Bacilllus circulands), 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis), 대장균(Escherichia coli), 마이크로라나투스 포스포보로우스(Microlanatus phosphovorous), 리조비움 멜리로티(Rhizobium meliloti), 리조비움 비시애(Rhizobium viciae), 브레디리조비움 자포니쿰(Bredyrhizobium japonicum), 버크홀데리아 세파시아(Burkholderia cepacia), 버크홀데리아 사카리(Burkholderia sacchari), 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necactor), 넵투나모나스 안타르티카(Neptunamonas Antarctica), 아조토박터 비넬란디이이(Azobacter vinelandii), 슈도모다스 푸티다(Pseudomonas putida), 슈도모다스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 에어로모나스 카비애(Aeromonas caviae), 에어로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila), 에어로모나스 펑타타(Aeromonas punctate), 알칼리게네스 라투스(Alcaligenes latus), 할로모나스 볼리비엔시스(Halomonas boliviensis), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 및 피르미쿠테스 박테리움(Fermicutes bacterium)의 천연 및 조작된 균주로 이루어진 군으로부터 선택된 미생물의 종균 배양물(starter culture)로 접종하고, 적어도 30℃의 온도에서 48 내지 72 시간 동안 인큐베이션(incubation)하여 배양물을 생성시키는 단계; 및
f. 배양물로부터 생분해성 폴리머를 추출하는 단계를 포함하는, 방법.
청구항 1에 있어서,
배양물로부터 생분해성 폴리머를 추출하는 단계가,
a. 배양물을 약 1 mm의 기공 크기를 갖는 막을 통해서 여과하는 단계;
b. 여과된 배양물로부터 미생물의 세포를 분리하는 단계;
c. 세포를 NaOH 용액에 현탁시키고, 적어도 30℃의 온도에서 적어도 1.5 시간 동안 인큐베이션하여 세포로부터 생분해성 폴리머를 방출시키는 단계;
d. NaOH 용액으로부터 생분해성 폴리머를 분리하고, 생분해성 폴리머를 물에 재현탁시키는 단계;
e. 물로부터 생분해성 폴리머를 분리하고, 생분해성 폴리머를 에탄올 용액에 재현탁시키는 단계; 및
f. 에탄올 용액으로부터 생분해성 폴리머를 분리하는 단계를 포함하는, 방법.
청구항 2에 있어서,
생분해성 폴리머가 폴리하이드록시부티레이트인, 방법.
청구항 3에 있어서,
미생물이 폴리하이드록시부티레이트를 분해할 수 있는 데폴리머라제(depolymerase)를 인코딩하는 유전자를 발현하지 않는, 방법.
청구항 4에 있어서,
미생물이 아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼라제, 아세틸-CoA 리덕타제, 및 폴리하이드록시부티레이트 폴리머라제를 인코딩하는 하나 이상의 유전자를 발현하는 바실러스 섭틸리스의 조작된 균주인, 방법.
청구항 5에 있어서,
하나 이상의 유전자가 phaA, phaB, phaC, phaJ, phaP로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
청구항 4에 있어서,
미생물이 아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼라제, 아세틸-CoA 리덕타제, 및 폴리하이드록시부티레이트 폴리머라제를 인코딩하는 하나 이상의 유전자를 발현하는 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus Necator)의 조작된 균주인, 방법.
청구항 7에 있어서,
하나 이상의 유전자가 phaA, phaB, phaC, phaJ, phaP로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
생분해성 폴리머를 생산하는데 사용하기 위한 대마 폐기물로부터 생산 배지를 생성시키는 방법으로서,
a. 대마 폐기물을 기계적 파쇄에 의해서 가공하는 단계;
b. 무기 산 용액 중의 대마 폐기물을 적어도 121℃의 온도에서 적어도 25분 동안 가열하여 대마/산 용액을 생성시키는 단계;
c. 대마/산 용액을 냉각시키고, 중화하고, 여과하여 여액을 생성시키는 단계; 및
d. 여액을 무기 염 배지와 1:1 내지 1:2의 비율로 혼합하는 단계를 포함하는, 방법.
생분해성 폴리머를 생성시키는 방법으로서,
a. 탄소 공급원으로서 가공된 식물 폐기물을 갖는 질소-제한된 생산 배지를 바실러스 섭틸리스, 쿠프리아비두스 네카토르, 바실러스 세레우스, 바실러스 브레비스, 카울로박터 크레센투스, 바실러스 스파에리쿠스, 바실러스 코아굴란스, 바실러스 메가테리움, 바실러스 서큐란스, 바실러스 리체니포르미스, 대장균, 마이크로라나투스 포스포보로우스, 리조비움 멜리로티, 리조비움 비시애, 브레디리조비움 자포니쿰, 버크홀데리아 세파시아, 버크홀데리아 사카리, 쿠프리아비두스 네카토르, 넵투나모나스 안타르티카, 아조토박터 비넬란디이이, 슈도모다스 푸티다, 슈도모다스 애루지노사, 에어로모나스 카비애, 에어로모나스 하이드로필라, 에어로모나스 펑타타, 알칼리게네스 라투스, 할로모나스 볼리비엔시스, 락토바실러스 람노서스, 및 피르미쿠테스 박테리움의 천연 및 조작된 균주로 이루어진 군으로부터 선택된 미생물의 종균 배양물로 접종시키고, 적어도 30℃의 온도에서 48 내지 72 시간 동안 인큐베이션하여 배양물을 생성시키는 단계;
b. 배양물을 약 1 mm의 기공 크기를 갖는 막을 통해서 여과하는 단계;
c. 여과된 배양물로부터 미생물의 세포를 분리하는 단계;
d. 세포를 NaOH 용액에 현탁시키고, 적어도 30℃의 온도에서 적어도 1.5 시간 동안 인큐베이션하여 세포로부터 생분해성 폴리머를 방출시키는 단계;
e. NaOH 용액으로부터 생분해성 폴리머를 분리하고, 생분해성 폴리머를 물에 재현탁시키는 단계;
f. 물로부터 생분해성 폴리머를 분리하고, 생분해성 폴리머를 에탄올 용액에 재현탁시키는 단계; 및
g. 에탄올 용액으로부터 생분해성 폴리머를 분리하는 단계를 포함하는, 방법.
청구항 10에 있어서,
생분해성 폴리머가 폴리하이드록시부티레이트인, 방법.
청구항 11에 있어서,
미생물이 폴리하이드록시부티레이트를 분해할 수 있는 데폴리머라제를 인코딩하는 유전자를 발현하지 않는, 방법.
청구항 12에 있어서,
미생물이 아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼라제, 아세틸-CoA 리덕타제, 및 폴리하이드록시부티레이트 폴리머라제를 인코딩하는 하나 이상의 유전자를 발현하는 바실러스 섭틸리스의 조작된 균주인, 방법.
청구항 13에 있어서,
하나 이상의 유전자가 phaA, phaB, phaC, phaJ, phaP로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
청구항 12에 있어서,
미생물이 아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼라제, 아세틸-CoA 리덕타제, 및 폴리하이드록시부티레이트 폴리머라제를 인코딩하는 하나 이상의 유전자를 발현하는 쿠프리아비두스 네카토르의 조작된 균주인, 방법.
청구항 15에 있어서,
하나 이상의 유전자가 phaA, phaB, phaC, phaJ, phaP로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
5 중량% 내지 70 중량%의 폴리하이드록시부티레이트, 5 중량% 내지 70 중량%의 폴리(3-하이드록시부티레이트-코-3-하이드록시헥사노에이트), 5 중량% 내지 45 중량%의 열가소성 전분, 0.5 중량% 내지 35 중량%의 하나 이상의 상용화제, 및 0.5 중량% 내지 15 중량%의 하나 이상의 첨가제를 포함하는 생분해성 폴리머.
청구항 17에 있어서,
하나 이상의 상용화제가 디헥실 석시네이트, 디헥실 소듐 설포석시네이트, 말레산 무수물, 메틸렌 디페닐디이소시아네이트, 및 디옥틸 푸마레이트로 이루어진 군으로부터 선택되고, 하나 이상의 첨가제가 미세결정상 셀룰로오즈 및 셀룰로오즈로 이루어진 군으로부터 선택되는, 생분해성 폴리머.
청구항 17에 있어서,
하나 이상의 상용화제가 디헥실 소듐 설포석시네이트 및 말레산 무수물로 이루어진 군으로부터 선택되고, 하나 이상의 첨가제가 미세결정상 셀룰로오즈 및 셀룰로오즈로 이루어진 군으로부터 선택되는, 생분해성 폴리머.
청구항 17에 있어서,
하나 이상의 상용화제가 디헥실 소듐 설포석시네이트 및 말레산 무수물이고, 하나 이상의 첨가제가 미세결정상 셀룰로오즈 및 셀룰로오즈인, 생분해성 폴리머.
청구항 20에 있어서,
열가소성 전분이 가소제로서 약 30 중량%의 글리세롤 및 약 20 중량%의 물을 포함하는 가소화된 천연 폴리머인, 생분해성 폴리머.
청구항 21에 있어서,
20 중량% 내지 60 중량%의 폴리(3-하이드록시부티레이트-코-3-하이드록시헥사노에이트), 10 중량% 내지 30 중량%의 열가소성 전분, 10 중량% 내지 20 중량%의 하나 이상의 상용화제, 및 1 중량% 내지 10 중량%의 하나 이상의 첨가제를 포함하는, 생분해성 폴리머.
청구항 21에 있어서,
20 중량%의 폴리하이드록시부티레이트, 40 중량%의 폴리(3-하이드록시부티레이트-코-3-하이드록시헥사노에이트), 20 중량%의 열가소성 전분, 15 중량%의 하나 이상의 상용화제, 및 5 중량%의 하나 이상의 첨가제를 포함하는, 생분해성 폴리머.