BR112021003402A2 - composição de polímero biodegradável e método de produção da mesma - Google Patents
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Abstract
COMPOSIÇÃO DE POLÍMERO BIODEGRADÁVEL E MÉTODO DE PRODUÇÃO DA MESMA, compreendendo poli-hidroxibutirato e poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidróxi-hexanoato) combinado com amido termoplástico, um ou mais compatibilizantes selecionados a partir do grupo que consiste em di-hexil sulfossuccinato de sódio e anidrido maleico, e um ou mais aditivos selecionados a partir do grupo que consiste em celulose microcristalina e celulose. Os métodos de produção de um polímero biodegradável usam resíduo de cânabis processado como uma fonte de carbono.
Description
“COMPOSIÇÃO DE POLÍMERO BIODEGRADÁVEL E MÉTODO DE PRODUÇÃO DA MESMA” Campo da Invenção
[001] A presente invenção se refere a polímeros biodegradáveis, em particular, a composições de polímero biodegradável e métodos de produção das mesmas usando resíduo de cânabis como uma fonte de carbono.
Fundamentos da Invenção
[002] O plástico é um material leve, durável e versátil e é uma parte integral de muitas indústrias desde construção até de cuidados médicos, e de bens de consumo para materiais de embalagem. A produção de muitos materiais plásticos depende de recursos não renováveis, tornando a viabilidade em longo prazo tanto econômica quanto ambientalmente insustentável. O tempo necessário para a degradação ambiental de muitos tipos de plástico também agravou este problema. Normalmente, os plásticos usados em produtos de consumo, como canudinhos de plástico levam cerca de 200 anos para degradar no ambiente. Os plásticos mais duráveis, como os usados em linha de acabamento levam até 600 anos para degradar.
[003] Como um resultado, o acúmulo ambiental de resíduo de plástico se tornou uma preocupação pública cada vez mais urgente, resultando em esforços para reduzir o resíduo de plástico, como a proibição de itens plásticos de uso único, incluindo canudos. Outros esforços, como o aumento dos programas de reciclagem de plástico, são limitados por considerações de custo e porque a maioria dos plásticos pode ser reciclada apenas um número limitado de vezes antes que suas propriedades físicas se tornem inadequadas para uso posterior. Outra opção para abordar a questão do acúmulo ambiental de resíduo de plástico é a produção de plásticos que se degradem mais rapidamente no meio ambiente.
[004] Plásticos biodegradáveis são plásticos que podem ser degradados por micro-organismos em moléculas simples, como água, dióxido de carbono ou metano e biomassa em um tempo muito menor do que o necessário para os plásticos típicos. Muitos plásticos biodegradáveis também podem ser produzidos a partir de fontes renováveis, ao invés de fontes petroquímicas não renováveis. No entanto, os plásticos biodegradáveis são conhecidos por sofrerem de uma série de características indesejáveis, como ser quebradiços ou ter baixa estabilidade térmica. Outros plásticos biodegradáveis conhecidos têm um custo proibitivamente alto de produção, o que impediu sua adoção generalizada.
[005] Por conseguinte, há uma necessidade de novos plásticos biodegradáveis com características mecânicas melhoradas. Além disso, há necessidade de novos métodos para produzir plásticos biodegradáveis a partir de matérias-primas renováveis para reduzir o custo da produção.
[006] Projeta-se que o resíduo de cânabis, e a sua eliminação, se tornará um grande desafio para a indústria, uma vez que várias jurisdições começam a legalizar o uso recreativo da cânabis. A produção de um quilograma de cânabis para os consumidores resulta em oito quilogramas de resíduos. Os métodos de descarte atuais para resíduo de cânabis consistem em práticas estritamente regulamentadas, incluindo a mistura do resíduo de cânabis com produtos químicos e outros materiais para disposição.
[007] Desta forma, há uma necessidade de desenvolver aplicações úteis para as quantidades crescentes de resíduo de cânabis produzidos por esta nova indústria.
Sumário da Invenção
[008] Uma composição de polímero biodegradável, de acordo com a presente invenção, compreende poli-hidroxibutirato e poli(3- hidroxibutirato-co-3-hidróxi-hexanoato) combinado com amido termoplástico, um ou mais compatibilizantes selecionados a partir do grupo que consiste em di- hexil sulfossuccinato de sódio e anidrido maleico, e um ou mais aditivos selecionados a partir do grupo que consiste em celulose microcristalina e celulose.
[009] Em uma outra modalidade, a composição de polímero biodegradável compreende entre 5 % em peso e 70 % em peso de poli- hidroxibutirato, entre 5 % em peso e 70 % em peso de poli(3-hidroxibutirato-co- 3-hidróxi-hexanoato), entre 5 % em peso e 45 % em peso de amido termoplástico, entre 0,5 % em peso e 35 % em peso do um ou mais compatibilizantes, e entre 0,5 % em peso e 15 % em peso do um ou mais aditivos.
[010] Em uma outra modalidade, a composição de polímero biodegradável compreende entre 10 % em peso e 30 % em peso de poli-hidroxibutirato, entre 20 % em peso e 60 % em peso de poli(3-hidroxibutirato- co-3-hidróxi-hexanoato), entre 10 % em peso e 30 % em peso de amido termoplástico, entre 10 % em peso e 20 % em peso do um ou mais compatibilizantes, e entre 1 % em peso e 10 % em peso do um ou mais aditivos.
[011] Em uma outra modalidade, a composição de polímero biodegradável compreende 20 % em peso de poli-hidroxibutirato, 40 % em peso de poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidróxi-hexanoato), 20 % em peso de amido termoplástico, 15 % em peso do um ou mais compatibilizantes, e 5 % em peso do um ou mais aditivos.
[012] De acordo com um outro aspecto da presente invenção, um método de produção de um polímero biodegradável, usando resíduo de cânabis como uma fonte de carbono, compreendendo as etapas de: a) processar o resíduo de cânabis por ruptura mecânica; b) aquecer o resíduo de cânabis em uma solução de ácido mineral por pelo menos 25 minutos a uma temperatura de pelo menos 121 °C, para produzir uma solução cânabis/ácido; c) resfriar, neutralizar e filtrar a solução cânabis/ácido para produzir um filtrado; d) misturar o filtrado com um meio de sal mineral em uma razão entre 1:1 e 1:2 para produzir um meio de produção; e) inocular o meio de produção com uma cultura- mãe de um micro-organismo selecionado a partir do grupo que consiste em cepas de ocorrência natural e modificadas por engenharia Bacillus subtilis, Cupriavidus necator, Bacillus cereus, Bacillus brevis, Caulobacter cresentus, Bacillus sphaericus, Bacillus coagulans, Bacillus megaterium, Bacilllus circulans, Bacillus licheniformis, Escherichia coli, Microlanatus phosphovorous, Rhizobium meliloti, Rhizobium leguminosarum viciae, Bradyrhizobium japonicum, Burkholderia cepacia, Burkholderia sacchari, Cupriavidus necator, Neptunamonas Antarctica, Azobacter vinelandii, Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas caviae, Aeromonas hidrophila, Aeromonas punctata, Alcaligenes latus, Halomonas boliviensis, Lactobacillus rhamnosus, e Fermicutes bacterium e incubar a uma temperatura de pelo menos 30 °C por entre 48 e 72 horas para produzir uma cultura; e f) extrair um polímero biodegradável da cultura.
[013] Em uma outra modalidade, a etapa de extrair um polímero biodegradável da cultura compreende as etapas de: a) filtrar a cultura através de uma membrana com um tamanho de poro de cerca de 1 mm; b) separar as células do micro-organismo da cultura filtrada; c) suspender as células em uma solução de NaOH e incubar a uma temperatura de pelo menos 30 °C por pelo menos 1,5 hora para liberar o polímero biodegradável das células; d) separar o polímero biodegradável da solução de NaOH e ressuspender o polímero biodegradável em água; e) separar o polímero biodegradável da água e ressuspender o polímero biodegradável em uma solução de etanol; e f) separar o polímero biodegradável da solução de etanol.
[014] De acordo com um outro aspecto da presente invenção, um método de produção de um meio de produção do resíduo de cânabis para uso na produção de um polímero biodegradável compreende as etapas de: a) processar resíduo bruto de cânabis por ruptura mecânica para aumentar a área de superfície disponível do resíduo de cânabis; b) aquecer o resíduo de cânabis em uma solução de ácido mineral por pelo menos 25 minutos a uma temperatura de pelo menos 121 °C, para produzir uma solução cânabis/ácido; c) resfriar, neutralizar e filtrar a solução cânabis/ácido para produzir um filtrado; e d) misturar o filtrado com um meio de sal mineral em uma razão entre 1:1 e 1:2.
[015] Em uma outra modalidade, o método compreende ainda as etapas de agitar o resíduo de cânabis processado em água para quebrar o resíduo de cânabis. Filtrar a mistura resultante e então aquecer e agitar o filtrado em hidróxido de sódio e peróxido de hidrogênio. Filtrar a pasta resultante, neutralizar o pH e secar para produzir uma biomassa seca, antes da etapa de aquecer o resíduo de cânabis em uma solução de ácido mineral.
[016] Em uma outra modalidade, a etapa de resfriar, neutralizar e filtrar a solução cânabis/ácido compreende interromper a reação adicionando água desionizada fria. Centrifugar a mistura resultante e lavar o precipitado com água desionizada até que um pH neutro seja alcançado. Hidrolisar a celulose por hidrólise ácida a 0,5M a 70 °C em 67% de cloreto de zinco e diluir o produto final em salina tamponada de fosfato estéril.
[017] De acordo com um outro aspecto da presente invenção, um método de produção de um polímero biodegradável compreende as etapas de: a) inocular meio de produção limitado por nitrogênio com material de resíduo de planta processado como uma fonte de carbono com uma cultura- mãe de um micro-organismo selecionado a partir do grupo que consiste em cepas de ocorrência natural e modificadas por engenharia Bacillus subtilis, Cupriavidus necator, Bacillus cereus, Bacillus brevis, Caulobacter cresentus, Bacillus sphaericus, Bacillus coagulans, Bacillus megaterium, Bacilllus circulans, Bacillus licheniformis, Escherichia coli, Microlanatus phosphovorous, Rhizobium meliloti, Rhizobium leguminosarum viciae, Bradyrhizobium japonicum, Burkholderia cepacia, Burkholderia sacchari, Cupriavidus necator, Neptunamonas Antarctica, Azobacter vinelandii, Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas caviae, Aeromonas hidrophila, Aeromonas punctata, Alcaligenes latus, Halomonas boliviensis, Lactobacillus rhamnosus, e Fermicutes bacterium e incubar a uma temperatura de pelo menos 30 °C por entre 48 e 72 horas para produzir uma cultura; b) filtrar a cultura através de uma membrana com um tamanho de poro de cerca de 1 mm; c) separar as células do micro-organismo da cultura filtrada; d) suspender as células em uma solução de NaOH e incubar a uma temperatura de pelo menos 30 °C por pelo menos 1,5 hora para liberar o polímero biodegradável das células; e) separar o polímero biodegradável da solução de NaOH e ressuspender o polímero biodegradável em água; f) separar o polímero biodegradável da água e ressuspender o polímero biodegradável em uma solução de etanol; e g) separar o polímero biodegradável da solução de etanol.
[018] Em uma outra modalidade, o método produz PHB usando um meio de produção produzido do resíduo de cânabis e compreende as etapas de cultivar um ou mais micro-organismos capazes de produzir PHB em caldo nutriente a partir do estoque. Inocular o meio de produção com o um ou mais micro-organismos. Suplementar o meio de produção com uma fonte limitada de nitrogênio e permitir que um ou mais micro-organismos cresçam no meio de produção. Centrifugar o meio de produção para separar as células dos um ou mais micro-organismos do meio de produção e secar as células. Ressuspender as células secas em água destilada e adicionar hidróxido de sódio para extrair o PHB das células. Interromper a reação ajustando o pH para 7,0 e centrifugar a mistura resultante para separar os grânulos de PHB da suspensão. Enxaguar os grânulos com água destilada e centrifugar novamente a mistura resultante, conforme necessário. Separar os grânulos pela adição de um ácido mineral e centrifugar a mistura. Descartar a fase líquida e lavar o produto em um banho alcalino para p purificar o PHB. Enxaguar o PHB com água e centrifugar, conforme necessário.
Descrição da Invenção
[019] A presente invenção se refere a composições de polímero biodegradável e métodos de produção das mesmas. As composições de polímero biodegradável compreendem poli-hidroxibutirato (PHB) e poli(3- hidroxibutirato-co-3-hidróxi-hexanoato) (PHBHHx) combinado com amido termoplástico (TPS), um ou mais compatibilizantes, e um ou mais aditivos.
[020] Um ou tanto o PHB quanto PHBHHx usado nas composições de polímero biodegradável descritas neste documento são preferivelmente produzidos por micro-organismos que são tanto de ocorrência natural quanto modificados por engenharia para produzir PHB e/ou PHBHHx. O PHBHHx pode ser um copolímero aleatório ou não aleatório de monômeros PHB e HHx. Preferivelmente, as unidades de 3-hidróxi-hexanoato do copolímero PHBHHx biossintetizado permanece na fase amorfa do PHBHHx semicristalino.
[021] Os micro-organismos adequados para produzir os polímeros biodegradáveis, incluindo PHB e/ou PHBHHx, incluem cepas de ocorrência natural ou modificadas por engenharia de: Bacillus subtilis, Cupriavidus necator, Bacillus cereus, Bacillus brevis, Caulobacter cresentus, Bacillus sphaericus, Bacillus coagulans, Bacillus megaterium, Bacilllus circulans, Bacillus licheniformis, Escherichia coli, Microlanatus phosphovorous, Rhizobium meliloti, Rhizobium leguminosarum viciae, Bradyrhizobium japonicum, Burkholderia cepacia, Burkholderia sacchari, Cupriavidus necator, Neptunamonas Antarctica, Azobacter vinelandii, Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas caviae, Aeromonas hidrophila, Aeromonas punctata, Alcaligenes latus, Halomonas boliviensis, Lactobacillus rhamnosus, e Fermicutes bacterium. Preferivelmente, uma cepa modificada por engenharia de Bacillus subtilis, Cupriavidus necator, Lactobacillus rhamnosus, ou Firmicutes bacterium é usada para produzir PHB e PHBHHx para as composições de polímero biodegradável, conforme descrito neste documento. Bacillus subtilis é preferido porque ele é uma bactéria Gram positiva e, desta forma, não contém lipídeo A tóxico, que está presente nas bactérias Gram negativas. A contaminação do polímero biodegradável com lipídeo A é indesejável em certas aplicações, como em embalagem de alimento, dispositivos ou embalagens médicas, embalagem higiênica, e produtos para crianças pequenas.
[022] Os micro-organismos modificados por engenharia usados nos métodos descritos neste documento são geneticamente modificados para expressar os genes, incluindo transgenes, necessários para a produção de um ou mais polímeros biodegradáveis. Preferivelmente, o polímero biodegradável produzido é PHB. Os genes adequados incluem um ou mais dos genes phaA, phaB, phaC, phaJ, e phaP que codificam um acetil-CoA acetiltransferase, um acetil-CoA redutase, e PHB polimerase. Muitos micro- organismos naturalmente expressam um ou mais destes genes. Alguns micro- organismos também podem expressar genes que codificam um ou mais depolimerases que degradam um ou mais polímeros biodegradáveis, incluindo PHB. Preferivelmente, um micro-organismo modificado por engenharia usado nos métodos descritos neste documento expressariam os genes necessários para a produção de PHB e não expressariam os genes que codificam uma depolimerase capaz de degradar PHB ou quaisquer outros polímeros biodegradáveis desejados produzidos pelo micro-organismo selecionado.
[023] Uma vez sintetizado e extraído, por exemplo, de acordo com um dos métodos descritos neste documento, o PHB é combinado com PHBHHx, amido termoplástico, um ou mais compatibilizantes, e um ou mais aditivos. O amido termoplástico usado nas composições de plástico biodegradável da presente invenção é um polímero natural plastificado, preferivelmente com baixas concentrações de ácido ascórbico e ácido cítrico, 30% de glicerol como um plastificante, e água em cerca de 20 % em peso com relação ao amido. O amido termoplástico pode estar presente em quantidades de até 45 % em peso da composição de polímero biodegradável.
[024] O amido termoplástico pode ser preparado por qualquer método adequado de preparação de polímeros naturais plastificados, como misturando amido nativo com um plastificante em uma extrusora de parafuso gêmeo em temperaturas elevadas entre cerca de 30 °C a cerca de 200 °C. Uma mistura de água e glicerol é preferivelmente usada como o plastificante. A plastificação do amido termoplástico pode ser alcançada seja antes da mistura de amido termoplástico na composição de polímero biodegradável ou adicionando todos os componentes de uma vez (isto é, amido, glicerol, água,
com os outros componentes da composição de polímero biodegradável) para produzir uma combinação final.
[025] Os compatibilizantes podem incluir um ou mais de succinato de di-hexila, di-hexil sulfossuccinato de sódio, anidrido maleico, difenildi-isocianato de metileno, fumarato de dioctila, ou outras poliolefinas enxertadas de monômero polar. Preferivelmente, tanto succinato de di-hexila quanto anidrido maleico estão presentes na quantidade de 0,5 a 35 % em peso.
[026] Os aditivos podem incluir um ou mais de celulose microcristalina ou celulose. Preferivelmente, tanto celulose microcristalina quanto celulose estão presentes nas quantidades de 0,5 a 35 % em peso.
[027] A quantidade de tempo necessária para as composições de polímero biodegradável degradar pode ser seletivamente aumentada ou diminuída manipulando as quantidades de amido termoplástico, celulose microcristalina, e/ou celulose nas composições. Na medida em que a quantidade relativa de amido termoplástico, celulose microcristalina, e/ou celulose aumenta, o tempo necessário para as composições degradarem diminui. Preferivelmente, a quantidade relativa de amido termoplástico é ajustada para aumentar ou diminuir seletivamente o tempo de degradação das composições, e não a quantidade relativa de celulose microcristalina ou celulose. Além do mais, a quantidade de tempo necessária para as composições de polímero biodegradável degradarem pode ser seletivamente aumentada ou diminuída manipulando as quantidades de PHBHHx nas composições. Na medida em que a quantidade relativa de PHBHHx aumenta, o tempo necessário para as composições de degradarem aumenta.
[028] A fonte de carbono usada para produzir o polímero biodegradável pode incluir: resíduo de cânabis, folhas, resíduo sólido de peixe, seiva de carvalho, sementes de abóbora, bagaço de uva ou bagaços uva, ou resíduo de produção de vinho/cerveja/destilaria. Preferivelmente, material de resíduo de cânabis é usado como uma fonte de carbono para a produção de PHB. O resíduo de cânabis consiste em raízes, aparas, folhas e caules das plantas, essencialmente toda parte, exceto para o florescimento do bulbo da planta de Cannabis sativa L.
[029] O resíduo de cânabis é particularmente adequado para uso como uma fonte de carbono na produção de PHB por micro-organismos porque a planta de cânabis tem um alto teor de biomassa e cresce rapidamente na maioria dos climas somente com requerimentos de água e fertilizante moderados. Em comparação com outras fontes de carbono em potencial, como biomassa agrícola e florestal, carvão, resíduos de petróleo, e ossos, o resíduo de cânabis tem estruturas hierárquicas de poro exclusivas e macroporos conectados. Como um resultado, o resíduo de cânabis tem características desejáveis para uso como uma fonte de carbono, incluindo sua porosidade, capacidade de adsorção e grau de reatividade na superfície. Em relação a outras fontes de carbono em potencial, o resíduo de cânabis também tem uma maior concentração de carbono e menor teor de nitrogênio, potássio e fósforo, o que é favorável para a produção de PHB por micro-organismos.
[030] O resíduo de cânabis é inicialmente processado para uso na produção de PHB por ruptura mecânica, de acordo com o seguinte método. O resíduo bruto de cânabis pode ser processado por retalhamento, moagem, prensagem ou outros meios adequados de ruptura mecânica para aumentar a área de superfície disponível para a remoção de celulose e ácidos graxos. A separação de ácidos graxos do resíduo de cânabis processado é então realizada para fornecer uma fonte de carbono para a síntese de PHB, por exemplo, como se segue.
Exemplo: Meio de produção 1
[031] O resíduo de cânabis processado é misturado em uma solução de ácido sulfúrico 1% a uma proporção de 10 g de resíduo de planta por 100 mL de solução ácida. A solução é aquecida, preferivelmente em uma autoclave, por 25 minutos a 121 °C, então resfriada à temperatura ambiente. A solução é então neutralizada com solução de NaOH 2M e filtrada através de uma peneira para remover partículas grandes de resíduo de planta. A solução é então centrifugada por 20 minutos a 1.500 g e o sobrenadante é filtrado através de uma membrana tendo um tamanho de poro de cerca de 1 mm. O filtrado resultante, um hidrolisado de resíduo de cânabis, pode ser imediatamente usado ou armazenado a 4 °C até que necessário.
[032] O Meio de produção 1 é preparado misturando o filtrado com 2X meio de sal mineral (0,9 g (NH4)2SO4, 0,3 g KH2PO4, 1,32 g Na2HPO4, 0,06 g MgSO4.7H2O, 300 uL de solução de microelemento (0,97 g FeCl3, 0,78 g CaCl2, 0,0156 g CuSO4.5H2O, 0,326 g NiCl2.6H2O em 100 mL de 0,1 M HCl)) em uma razão de 1:1. O meio é autoclavado imediatamente por 10 minutos a 121 °C.
Exemplo: Extração 1
[033] A síntese e extração de polímero biodegradável pode ser realizada de acordo com o seguinte método. Um micro-organismo adequado é cultivado em caldo nutriente a partir de um estoque a 30 °C agitando a 150 rpm por 72 horas para produzir uma cultura-mãe. Após 72 horas, a cultura-mãe é inoculada no meio de produção 1 a 1/10 (v/v) e incubada a 30 °C agitando a 150 rpm por 72 horas para produzir uma cultura.
[034] A cultura é então filtrada através de uma membrana tendo um tamanho de poro de cerca de 1 mm para remover matéria de planta insolúvel. As células dos micro-organismos são então separadas da cultura filtrada por centrifugação a 1.500 g por 20 minutos. O sobrenadante é descartado e as células são então lavadas ressuspendendo as células em meio de sal mineral e repetindo a centrifugação e novamente descartando o sobrenadante.
[035] As células são então ressuspensas em 150 mL de solução de NaOH 0,2M, vortexadas vigorosamente para homogeneizar a solução e incubadas a 30 °C por 1.5 horas. Isto faz com que as células lisem e liberem o plástico biodegradável na solução de NaOH. O polímero biodegradável é então separado da solução de NaOH por centrifugação a 1.500 g por 20 minutos e descartando o sobrenadante.
[036] O polímero biodegradável é ressuspenso em 150 mL de água milliQ e então separado da água por centrifugação a 1.500 g por 20 minutos. O sobrenadante é descartado para remover as impurezas. O polímero biodegradável é então ressuspenso em 150 mL de 1% de solução de etanol e separado da solução de etanol por centrifugação a 1.500 g por 20 minutos. O sobrenadante é novamente descartado para remover mais impurezas.
Exemplo: Meio de produção 2
[037] Sonicar 5 g de resíduo de planta com 300 mL água desionizada à temperatura ambiente. Filtrar com papel de filtro Whatman No. 1, então aquecer e vigorosamente agitar o filtrado a 55 °C usando 100 mL solução de hidróxido de sódio (5%, p/v) e peróxido de hidrogênio (11%, v/v) por 90 min. Filtrar a pasta, neutralizar o pH e secar a 50 °C. Adicionar 5 g da biomassa seca a 100 mL de ácido sulfúrico 6M sob agitação vigorosa por 30 min e interromper a reação adicionando 500 mL de água desionizada fria. Centrifugar a 10.000 rpm por 10 min e lavar com água desionizada até que pH neutro seja alcançado. A aquisição de monômeros simples de celulose é realizada por meio da aplicação de 67% de cloreto de zinco e hidrólise ácida a 0,5M e 70 °C, isto idealmente resulta em um rendimento >80% de açúcares solúveis. O produto de glicose final é então diluído em 1 L de salina tamponada de fosfato estéril pH 7,0, produzindo assim o meio de produção 2 (Concentrações finais: 8 g/L de NaCl, 0,2 g/L de KCl, 1,44 g/L de Na2HPO4, 0,24 g/L de K2HPO4).
Exemplo: Extração 2
[038] A síntese e extração de PHB para uso nas composições de polímero biodegradável da presente invenção podem ser realizadas de acordo com o seguinte método. Um Bacillus spp. adequado é cultivado em caldo nutriente de um estoque durante a noite a 37 °C agitando a 120 rpm. Uma densidade de 1,5 × 108 células/mL pode ser adicionada a 1/10 v/v ao meio de produção 2 suplementado com uma fonte limitada de nitrogênio, como Licor de Maceração de Milho (CSL) ou um sal de amônio, a uma concentração equivalente a 0,05% de NH4Cl e cultivadas a 37 °C com agitação em 120 rpm por 72 horas. As células são então centrifugadas a 6.500 g por 10 min e secas a 50 °C.
[039] A massa de células secas pode ser medida e então PHB pode ser extraída usando extração por hidróxido de sódio e dissolução seletiva. A extração por hidróxido de sódio é realizada ressuspendendo as células em água destilada e adicionando NaOH (NaOH 0,2N a 30C por 1 a 5 horas). Ajustar o pH a 7,0 com HCl para interromper a reação. Centrifugar a
2.500 g por 20 minutos. Recuperar os grânulos de PHB enxaguando suavemente com água destilada, centrifugar novamente e secar em ar.
[040] A dissolução seletiva é realizada aplicando um ácido mineral, como ácido sulfúrico, à mistura resultando em grânulos separando em uma fase sólida, enquanto o material indesejado é separado em uma fase líquida. Estas fases podem ainda ser separadas por centrifugação a 5.000 g. O sobrenadante indesejado (fase líquida) é descartado, enquanto a fase sólida continua no processamento. O ácido mineral isola com sucesso o PHB da mistura, mas a pureza é preferivelmente melhorada antes de ser usada. Isto é realizado lavando o produto em um banho alcalino, como NaOH (pH 10). Após a lavagem haveria um alto rendimento e pureza (>97%). Para descolorir o produto, um alvejante comercialmente disponível pode ser usado. Após uma centrifugação final e um enxague com água e o produto PHB está pronto para uso.
[041] Para medir a produção de PHB, centrifugar e lavar o precipitado com álcool. Dissolver o precipitado em clorofórmio e transferir para tubos de soro limpos e pré-pesados. Permitir que o clorofórmio evapore e pesar os tubos para calcular a quantidade de PHB obtido. O presente método pode produzir entre 2 e 5g/L de PHB na forma de uma massa de células secas 7 a 9 g/L. Este método de crescimento pode ser adaptado para uso com Bacillus spp. também para gerar grandes quantidades de PHB de menos volume de meio de cultura e menos tempo. Alternativamente, uma cepa modificada por engenharia de forma semelhante de Cupriavidus necator pode ser usada em vez disso.
Exemplo: Extração 3
[042] Em uma outra modalidade, o PHB pode ser sintetizado e extraído, usando Cupriavidus necator como o micro-organismo e resíduo de cânabis como a fonte de carbono, de acordo com o seguinte método. Uma cepa de C. necator que é capaz de produzir PHB é usada, referida como Alcaligenes eutrophus H16 (C. necator foi anteriormente conhecido como Alcaligenes eutrophus). O A. eutrophus H16 é cultivado a 30 °C em um meio de sal mineral limitado em nitrogênio com 1% (v/v) de óleo de cânabis e 0,05% (p/v) NH4Cl por 72 horas. A canamicina (50 mg/L) é adicionada para manter o plasmídeo de faixa ampla de hospedeiro inserido em A. eutrophus H16. Após o crescimento, as células são colhidas e lavadas duas vezes com água destilada e liofilizadas. O PHB é extraído usando clorofórmio quente em um aparelho Soxhlet e purificado por reprecipitação em metanol.
[043] O PHB pode ser produzido pelo método de Extração 3, a uma taxa de cerca de 0,0128 g de PHB por g de óleo de cânhamo por hora.
Exemplo: Extração 4
[044] Em uma outra modalidade, o PHB pode ser sintetizado e extraído usando C. necator como o micro-organismo e o resíduo de cânabis como a fonte de carbono, de acordo com o seguinte método. Opcionalmente, o tensoativo goma arábica pode ser adicionado ao meio de reação para melhorar a capacidade de C. necator de interagir/utilizar o óleo de cânabis, uma vez que é não tóxico e não inibe o crescimento de C. necator. O C. necator pode ser cultivado a partir do estoque em um meio mínimo contendo 2% de frutose e 0,1% de NH4Cl (16 g/L), NaH2PO4 (4 g/L), Na2HPO4 (4,6 g/L), K2SO4 (0,45 g/L), MgSO4 (0,39 g/L), CaCl2 (62 mg/L), e 1 ml/L de uma solução de elemento traço (15 g/L de FeSO4•7H2O, 2,4 g/L de MnSO4•H2O, 2,4 g/L de ZnSO4•7H2O, e 0,48 g/L de CuSO4•5H2O dissolvido em ácido clorídrico 0,1 M). As células do meio mínimo são usadas para inocular cada fermentador para atingir um OD600 de 0,1. Cada vaso de reação contém 400 mL de meio de óleo de cânabis emulsificado. Para o meio mínimo com 0,1% de NH4Cl, usar aproximadamente 2% de óleo de cânabis. Para preparar o meio, usar uma solução 10X de goma arábica misturada em água e agitada rapidamente. Centrifugar a 10.500 g para separar as partículas insolúveis. Água, solução clarificada de goma arábica, e óleo de cânabis são combinados com o fosfato de sódio (4,0 g/L) e K2SO4 (0,45 g/L). Emulsificar a mistura por meio de homogeneização ou sonicação. A quantidade de água adicionada antes da emulsificação depende do aparelho particular usado para preparar a emulsão. Após a emulsificação, autoclave, resfriar e adicionar MgSO4 (0,39 g/L), CaCl2 (62 mg/L), elementos traços (15 g/litro de FeSO4•7H2O, 2,4 g/litro de MnSO4•H2O, 2,4 g/litro de ZnSO4•7H2O, e 0,48 g/litro de CuSO4•5H2O dissolvido em ácido clorídrico 0,1 M), e gentamicina (10 μg/mL). Cada vaso de reação é mantido a 30°C, com um pH de 6,8 (controlado com NaOH 2 M) e agitado a uma taxa de 500 a 900 rpm com uma concentração de oxigênio dissolvido de 40% por 72 horas. Preferivelmente, uma técnica de cultura alimentada em lotes é usada para manter um excesso de carbono para aumentar a produção de PHB.
[045] O PHB pode ser produzido pelo método de Extração 4, a uma taxa de cerca de 0,2415 g de PHB por g óleo de cânabis.
Exemplo: Extração 5
[046] Em uma outra modalidade, o PHB pode ser sintetizado e extraído, usando uma mistura de Cupriavidus necator e uma cepa modificada por engenharia de Escherichia coli e, opcionalmente, uma cepa modificada por engenharia de Aeromonas hidrophila tendo os genes phbA e phbB, como os micro-organismos e resíduo de cânabis como a fonte de carbono, de acordo com o seguinte método. Primeiro, o resíduo de cânabis é retalhado e colocado em água em cerca de 2% (p/v) e a uma temperatura de cerca de 30 °C. A mistura cânabis-água é inoculada com a cultura mistas de C. necator e. coli e, opcionalmente, A. hidrophila e fertilizante é adicionado, como extrato de farelo de arroz a 0,1%. O meio de reação é então agitado por 20 horas para permitir o crescimento. Após o período de crescimento inicial, o meio de reação é agitado por mais 15 horas, sem a adição de nenhum fertilizante adicional para induzir um estado de privação de nitrogênio e promover a produção de PHB.
[047] A extração de PHB é realizada adicionando um ácido mineral, como ácido sulfúrico, ao meio de reação após cerca de 35 horas. Os grânulos de PHB são separados por centrifugação a 5.000 g. O sobrenadante indesejado (fase líquida) é descartado, enquanto a fase sólida continua em processamento. O ácido mineral isola o PHB da mistura. A pureza dos compostos pode ser melhorada lacando em um banho alcalino, como NaOH (pH 10), seguido por uma centrifugação final e um enxágue de água. O método fornece um alto rendimento e pureza de PHB (>97%). Opcionalmente, um alvejante comercialmente disponível pode ser usado para descolorir o produto.
Exemplo: Meio de produção 3
[048] Em uma outra modalidade, o PHB pode ser sintetizado e extraído, usando Pseudomonas putida GPp104 como o micro- organismos e resíduo de cânabis como a fonte de carbono, de acordo com o seguinte método. O P. putida é cultivado durante a noite em meio LB contendo 50 mg/L de canamicina a 30 °C agitando a 200 rpm. A solução de salina tamponada de fosfato para cultivar esta cepa é composta de 9,0 g/L de Na2HPO4·12H2O, 1,5 g/L de KH2PO4, 1,0 g/L de (NH4)2SO4, e 0,4 g/L de MgSO4·7-H2O com um pH de 7,0.
Exemplo: Extração 6
[049] Uma densidade de 1,5 × 108 células/mL cultura de P. putida durante a noite pode ser adicionada a 1/10 v/v a 1 L de meio de produção 3 e cultivada a 30 °C com agitação a 200 rpm por 72 horas. O PHB pode ser extraído usando hipoclorito de sódio como se segue. A 8 g de biomassa, adicionar 100 mL de hipoclorito de sódio (30 %) e incubar por 90 min a 37 °C. Centrifugar e lavar o precipitado com álcool. Dissolver o precipitado em clorofórmio e, opcionalmente, transferir para tubos de soro limpos e pré-pesados. Permitir que o clorofórmio evapore e pesar os tubos para calcular a quantidade de PHB obtida.
[050] A presente invenção foi descrita com referência a uma modalidade exemplificativa, entretanto, será entendido pelos versados na técnica que várias mudanças podem ser feitas, e equivalentes podem ser substituídos pelos elementos dos mesmos, sem se afastar do escopo da invenção, conforme salientado nas seguintes reivindicações.
Desta forma, pretende-se que a invenção não seja limitada às modalidades particulares reveladas neste documento.
Claims (23)
1. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UM POLÍMERO BIODEGRADÁVEL, usando resíduo de cânabis como uma fonte de carbono, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: a. processar o resíduo de cânabis por ruptura mecânica; b. aquecer o resíduo de cânabis em uma solução de ácido mineral por pelo menos 25 minutos a uma temperatura de pelo menos 121 °C, para produzir uma solução cânabis/ácido; c. resfriar, neutralizar e filtrar a solução cânabis/ácido para produzir um filtrado; d. misturar o filtrado com um meio de sal mineral em uma razão entre 1:1 e 1:2 para produzir um meio de produção; e. inocular o meio de produção com uma cultura-mãe de um micro-organismo selecionado a partir do grupo que consiste em cepas de ocorrência natural e modificadas por engenharia de Bacillus subtilis, Cupriavidus necator, Bacillus cereus, Bacillus brevis, Caulobacter cresentus, Bacillus sphaericus, Bacillus coagulans, Bacillus megaterium, Bacilllus circulans, Bacillus licheniformis, Escherichia coli, Microlanatus phosphovorous, Rhizobium meliloti, Rhizobium leguminosarum viciae, Bradyrhizobium japonicum, Burkholderia cepacia, Burkholderia sacchari, Cupriavidus necactor, Neptunamonas Antarctica, Azobacter vinelandii, Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas caviae, Aeromonas hidrophila, Aeromonas punctata, Alcaligenes latus, Halomonas boliviensis, Lactobacillus rhamnosus e Fermicutes bacterium, e incubar a uma temperatura de pelo menos 30 °C por entre 48 e 72 horas para produzir uma cultura; e f. extrair um polímero biodegradável da cultura.
2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a etapa de extrair um polímero biodegradável da cultura compreender as etapas de:
a. filtrar a cultura através de uma membrana com um tamanho de poro de cerca de 1 mm; b. separar as células do micro-organismo da cultura filtrada; c. suspender as células em uma solução de NaOH e incubar a uma temperatura de pelo menos 30 °C por pelo menos 1,5 horas para liberar o polímero biodegradável das células; d. separar o polímero biodegradável da solução de NaOH e ressuspender o polímero biodegradável em água; e. separar o polímero biodegradável da água e ressuspender o polímero biodegradável em uma solução de etanol; e f. separar o polímero biodegradável da solução de etanol.
3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de o polímero biodegradável ser poli-hidroxibutirato.
4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de o micro-organismo não expressar um gene que codifica uma depolimerase capaz de degradar poli-hidroxibutirato.
5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de o micro-organismo ser uma cepa modificada por engenharia de Bacillus subtilis que expressa um ou mais genes que codificam um acetil-CoA acetiltransferase, um acetil-CoA redutase e poli-hidroxibutirato polimerase.
6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de um ou mais genes serem selecionados a partir do grupo que consiste em phaA, phaB, phaC, phaJ, phaP.
7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de o micro-organismo ser uma cepa modificada por engenharia de Cupriavidus Necator que expressa um ou mais genes que codificam um acetil-CoA acetiltransferase, um acetil-CoA redutase e poli- hidroxibutirato polimerase.
8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de um ou mais genes serem selecionados a partir do grupo que consiste em phaA, phaB, phaC, phaJ, phaP.
9. MÉTODO de produção de um meio de produção do resíduo de cânabis para uso na produção de um polímero biodegradável, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: a. processar o resíduo de cânabis por ruptura mecânica; b. aquecer o resíduo de cânabis em uma solução de ácido mineral por pelo menos 25 minutos a uma temperatura de pelo menos 121 °C, para produzir uma solução cânabis/ácido; c. resfriar, neutralizar e filtrar a solução cânabis/ácido para produzir um filtrado; e d. misturar o filtrado com um meio de sal mineral em uma razão entre 1:1 e 1:2.
10. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UM POLÍMERO BIODEGRADÁVEL, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: a. inocular meio de produção limitado por nitrogênio tendo material de resíduo de planta processado como uma fonte de carbono com uma cultura-mãe de um micro-organismo selecionado a partir do grupo que consiste em cepas de ocorrência natural e modificadas por engenharia de Bacillus subtilis, Cupriavidus necator, Bacillus cereus, Bacillus brevis, Caulobacter cresentus, Bacillus sphaericus, Bacillus coagulans, Bacillus megaterium, Bacilllus circulans, Bacillus licheniformis, Escherichia coli, Microlanatus phosphovorous, Rhizobium meliloti, Rhizobium leguminosarum viciae, Bradyrhizobium japonicum, Burkholderia cepacia, Burkholderia sacchari, Cupriavidus necactor, Neptunamonas Antarctica, Azobacter vinelandii, Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas caviae, Aeromonas hidrophila,
Aeromonas punctata, Alcaligenes latus, Halomonas boliviensis, Lactobacillus rhamnosus, e Fermicutes bacterium e incubar a uma temperatura de pelo menos 30 °C por entre 48 e 72 horas para produzir uma cultura; b. filtrar a cultura através de uma membrana com um tamanho de poro de cerca de 1 mm; c. separar as células do micro-organismo da cultura filtrada; d. suspender as células em uma solução de NaOH e incubar a uma temperatura de pelo menos 30 °C por pelo menos 1,5 horas para liberar o polímero biodegradável das células; e. separar o polímero biodegradável da solução de NaOH e ressuspender o polímero biodegradável em água; f. separar o polímero biodegradável da água e ressuspender o polímero biodegradável em uma solução de etanol; e g. separar o polímero biodegradável da solução de etanol.
11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de o polímero biodegradável ser poli-hidroxibutirato.
12. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de o micro-organismo não expressar um gene que codifica uma depolimerase capaz de degradar poli-hidroxibutirato.
13. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de o micro-organismo ser uma cepa modificada por engenharia de Bacillus subtilis que expressa um ou mais genes que codificam um acetil-CoA acetiltransferase, um acetil-CoA redutase, e poli-hidroxibutirato polimerase.
14. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de um ou mais genes serem selecionados a partir do grupo que consiste em phaA, phaB, phaC, phaJ, phaP.
15. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de o micro-organismo ser uma cepa modificada por engenharia de Cupriavidus Necator que expressa um ou mais genes que codificam um acetil-CoA acetiltransferase, um acetil-CoA redutase e poli- hidroxibutirato polimerase.
16. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de um ou mais genes serem selecionados a partir do grupo que consiste em phaA, phaB, phaC, phaJ, phaP.
17. POLÍMERO BIODEGRADÁVEL, caracterizado pelo fato de compreender entre 5 % em peso e 70 % em peso de poli-hidroxibutirato, entre 5 % em peso e 70 % em peso de poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidróxi- hexanoato), entre 5 % em peso e 45 % em peso de amido termoplástico, entre 0,5 % em peso e 35 % em peso de um ou mais compatibilizantes e entre 0,5 % em peso e 15 % em peso de um ou mais aditivos.
18. POLÍMERO BIODEGRADÁVEL, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de um ou mais compatibilizantes serem selecionados a partir do grupo que consiste em succinato de di-hexila, di- hexil sulfossuccinato de sódio, anidrido maleico, difenildi-isocianato de metileno e fumarato de dioctila e um ou mais aditivos serem selecionados a partir do grupo que consiste em celulose microcristalina e celulose.
19. POLÍMERO BIODEGRADÁVEL, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de um ou mais compatibilizantes serem selecionados a partir do grupo que consiste em di-hexil sulfossuccinato de sódio e anidrido maleico e o um ou mais aditivos serem selecionados a partir do grupo que consiste em celulose microcristalina e celulose.
20. POLÍMERO BIODEGRADÁVEL, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de um ou mais compatibilizantes serem di-hexil sulfossuccinato de sódio e anidrido maleico e um ou mais aditivos serem celulose microcristalina e celulose.
21. POLÍMERO BIODEGRADÁVEL, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de o amido termoplástico ser um polímero natural plastificado compreendendo cerca de 30 % em peso glicerol como um plastificante e cerca de 20 % em peso água.
22. POLÍMERO BIODEGRADÁVEL, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de compreender entre 20 % em peso e 60 % em peso de poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidróxi-hexanoato), entre 10 % em peso e 30 % em peso de amido termoplástico, entre 10 % em peso e 20 % em peso de um ou mais compatibilizantes, e entre 1 % em peso e 10 % em peso de um ou mais aditivos.
23. POLÍMERO BIODEGRADÁVEL, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de compreender 20 % em peso de poli-hidroxibutirato, 40 % em peso de poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidróxi- hexanoato), 20 % em peso de amido termoplástico, 15 % em peso de um ou mais compatibilizantes, e 5 % em peso do um ou mais aditivos.
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