JP2021534820A - 生分解性ポリマー組成物及びその製造法 - Google Patents
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Abstract
Description
〔調製培地1〕
処理されたアサ属廃棄物は、酸性溶液100mL当たり10gの割合で1%硫酸溶液に混合される。溶液を、好ましくはオートクレーブ中で、121℃で25分間加熱した後、室温に冷却する。その後、溶液を2M NaOH溶液で中和し、ふるいを通して濾過し、植物性廃棄物のより大きな粒子を除去する。その後、溶液を1500gで20分間遠心分離し、上清を孔径約1mmのメンブレンを通して濾過する。得られた濾液、すなわちアサ属廃棄物加水分解物は、直ちに用いるか、又は必要になるまで4℃で保存しうる。
〔抽出1〕
生分解性ポリマーの合成及び抽出は、以下の方法により行ってよい。30℃、毎分150回転で72時間振盪したストックから、適当な微生物を栄養培地中で増殖させ、開始培養物を作製する。72時間後、開始培養物を調製培地1に1/10(v/v)で接種し、150rpmで72時間、30℃で振盪して培養物を作製する。
〔調製培地2〕
工場廃棄物5gに脱イオン水300mLを加え、室温で音波処理する。WhatmanNo.1ろ紙でろ過し、水酸化ナトリウム(5%、w/v)と過酸化水素(1.1%、v/v)の溶液100mLを用いて55℃で90分間激しく撹拌する。スラリーをろ過し、pHを中和し、50℃で乾燥させる。乾燥したバイオマス5gを、6M硫酸100mLに加えて、30分間激しく攪拌し、500mLの冷脱イオン水を加えて反応を停止させる。10,000rpmで10分間遠心分離し、中性pHに達するまで脱イオン水で洗浄する。67%の塩化亜鉛と0.5M及び70℃での酸加水分解により、セルロースから単モノマーを獲得し、これは理想的には可溶性糖の収率は>80%となる。その後、最終グルコース生成物を1Lの滅菌リン酸緩衝生理食塩水pH 7.0中で希釈し、それにより、調製培地2(最終濃度:8g/L NaCl、0.2g/L KC1、1.44g/L Na2HP04、0.24g/L K2HP04)を製造する。
〔抽出2〕
本発明の生分解性ポリマー組成物に用いるPHBの合成及び抽出は、以下の方法により行ってよい。適当なバシラス種を、120rpmで37℃で振盪しながら、一晩、ストックから栄養培地中で増殖させる。1.5×108細胞/mLの密度を、Com Steep Liquor(CSL)又はアンモニウム塩等の限定窒素源が補足された調製培地2に、0.05% NH4C1に相当する濃度で1/10 v/vで添加し、120rpmで72時間振盪しながら37℃で増殖させうる。その後、細胞を6500gで10分間遠心分離し、50℃で乾燥させる。
〔抽出3〕
他の実施形態では、以下の方法でPHBを合成及び抽出しうる。次の方法に従い、微生物としてのカプリアビダス・ネカトールと炭素源としてのアサ属廃棄物を用いて、PHBを産生しうる。カプリアビダス・ネカトールはAlcaligenes eutrophusH16(カプリアビダス・ネカトールは、以前、Alcaligenes eutrophusとして知られていた)という。A.euthrophusH16を、1%(v/v)アサ属油及び0.05%(w/v)NH4Clを含む窒素制限無機塩培地中で30℃72時間培養する。カナマイシン(50mg/L)を添加して、A.euthrophusH16に挿入された広宿主域プラスミドを維持する。増殖後、細胞を回収し、蒸留水で2回洗浄し、凍結乾燥する。PHBはソックスレー装置中の熱クロロホルムを用いて抽出され、メタノール再沈殿によって精製される。
[0043]PHBは、1時間当たりの麻油1g当たりのPHB約0.0128gの速度で抽出3の方法により製造しうる。
〔抽出4〕
他の実施形態では、カプリアビダス・ネカトールを微生物、アサ属廃棄物を炭素源として用いて、以下の方法により、PHBを合成及び抽出しうる。場合によっては、界面活性剤アラビアゴムを反応媒体に添加して、アサ属油と相互作用/利用するカプリアビダス・ネカトールの能力を高めうる。なぜなら、アサ属油は毒性がなく、カプリアビダス・ネカトールの増殖を阻害しないからである。カプリアビダス・ネカトールは、2%フルクトース及び0.1% NH4Cl(16g/L)、NaH2P04(4g/L)、Na2HP0(4.6g/L)、K2S04(0.45g/L)、MgS04(0.39g/L)、CaCl2(62mg/L)、及び1ml/Lの微量元素溶液(15g/L FeS04・7H20、2.4g/L MnS04・H20、2.4g/L ZnS04・7H20、及び0.1M塩酸に溶解した0.48g/L CuS04・5H20)を含む最小培地中で増殖させうる。最小培地由来の細胞を用いて、各発酵槽に接種し、OD600が0.1に達するようにする。各反応容器は、400mLの乳化アサ属油培地を含有する。0.1%のNH4Clを含む最小培地では、約2%のアサ属油を用いる。培地調製には、水に混和したアラビアゴムの10倍溶液を用いて、急速攪拌する。10,500gで遠心分離し、不溶性粒子を分離する。水、アラビアゴム透明液、アサ属油をリン酸ナトリウム(4.0g/L)及びK2S04(0.45g/L)と混合する。均質化又は超音波処理により混合物を乳化する。乳化前に添加される水の量は、エマルジョン製造に用いられる特定の装置に依存する。乳化後、高圧蒸気滅菌し、冷却後、MgS04(0.39g/L)、CaCl2(62mg/L)、微量元素(15g/L FeS04・7H20、2.4g/L MnS04・H20、2.4g/L ZnS04・7H20、及び0.1M塩酸に溶解した0.48g/L CuS04・5H20)、及びゲンタマイシン(10pg/mL)を添加する。各反応容器をpH6.8(2M NaOHで制御)で30℃に維持し、溶存酸素濃度40%で500〜900rpmの速度で72時間撹拌する。好ましくは、PHB生産を増加させるため、過剰炭素を維持するために、供給バッチ培養技術が用いられる。
[0045] PHBは、アサ属油1g当たりPHBを約0.2415gの速度で抽出4の方法により製造しうる。
〔抽出5〕
他の実施形態では、次の方法により、微生物及びアサ属廃棄物として、カプリアビダス・ネカトール及び大腸菌の遺伝子操作株、及び場合によっては、phbA及びphbB遺伝子を有するAeromonas hydrophilaの遺伝子操作株を用いて、PHBを合成及び抽出しうる。まず、アサ属廃棄物を破砕し、約2%(w/v)及び約30℃の温度で水中に投入する。アサ属−水混合物にカプリアビダス・ネカトールと大腸菌の混合培養物を接種し、場合によっては、A. hydrophilaと肥料、例えば米ぬか抽出物を0.1%添加する。
その後、反応培地を20時間撹拌し、増殖させる。初回増殖期間の後、反応培地をさらに15時間撹拌するが、窒素欠乏状態を誘導し、PHBの産生を促進するために、それ以上の肥料は添加しない。
〔調製培地3〕
他の実施形態では、Pseudomonas putida GPpl04を微生物、アサ属廃棄物を炭素源とし、以下の方法により、PHBを合成及び抽出しうる。P.putidaは、カナマイシン50mg/Lを含むLB培地中、30℃、200rpmで振盪しながら一晩増殖させる。この菌株を培養するためのリン酸塩緩衝生理食塩液は、9.0g/L Na2HP04・12H20、1.5g/L KH2PO4、1.0g/L (NH4)2S04、0.4g/L MgS04・7H20からなり、pHは7.0である。
〔抽出6〕
密度1.5×108 細胞/mLの一晩培養したP. putidaを、1/10 v/v〜1Lの調製培地3に添加し、200rpmで72時間振盪しながら30℃で増殖させた。PHBは次亜塩素酸ナトリウムを用いて以下のように抽出しうる。バイオマス8gに次亜塩素酸ナトリウム100mL(30%)を加え、37℃で90分間インキュベートする。ペレットを遠心分離し、アルコールで洗浄する。ペレットをクロロホルムに溶解し、必要に応じて、予め秤量した清潔な血清チューブに移す。クロロホルムを蒸発させ、チューブの質量を量り、PHBの量を算出する。
Claims (26)
- アサ属廃棄物を炭素源として用いる生分解性ポリマーの製造方法であって、以下の:
a.アサ属廃棄物の機械的破壊処理工程;
b.前記アサ属廃棄物を無機酸溶液中で少なくとも121℃の温度で25分間加熱してアサ属/酸溶液を生成する工程;
c.前記アサ属/酸溶液を冷却、中和、及び濾過して濾液を生成する工程;
d.前記濾液を無機塩媒体と1:1〜1:2の比で混合して調製培地を生成する工程;
e.前記調製培地を、Bacillus subtilis(枯草菌)、Cupriavidus necator(カプリアビダス・ネカトール)、Bacillus cereus、Bacillus brevis、Caulobacter cresentus、Bacillus sphaericus、Bacillus coagulans、Bacillus megaterium、Bacilllus circulands、Bacillus licheniformis、Escherichia coli、Microlanatus phosphovorous、Rhizobium meliloti、Rhizobium viciae、Bredyrhizobium japonicum、Burkholderia cepacia、Burkholderia sacchari、Cupriavidus necactor、Neptunamonas Antarctica、Azobacter vinelandii、Pseudomonas putida、Pseudomonas aeruginosa、Aeromonas caviae、Aeromonas hydrophila、Aeromonas punctate、Alcaligenes latus、Halomonas boliviensis、Lactobacillus rhamnosus、及びFermicutes bacteriumの天然株及び遺伝子操作された株からなる群から選択される微生物の開始培養物に接種し、かつ、少なくとも30℃で48〜72時間培養して培養物を産生する工程;かつ
f.前記培養物から生分解性ポリマーを抽出する工程;
を含む、方法。 - 前記生分解性ポリマーを培養物から抽出する工程は、以下の:
a.孔径約1mmのメンブレンを通して前記培養物を濾過する工程;
b.前記濾過された培養物から前記微生物の細胞を分離する工程;
c.前記細胞をNaOH溶液中に懸濁させ、かつ、少なくとも30℃の温度で少なくとも1.5時間インキュベートして、前記細胞から生分解性ポリマーを放出させる工程;
d.前記生分解性ポリマーをNaOH溶液から分離して、水中に再懸濁する工程;
e.前記生分解性ポリマーを前記水から分離して、エタノール溶液中に再懸濁する工程;かつ、
f.前記生分解性ポリマーを前記エタノール溶液から分離する工程;
を含む、請求項1に記載の方法。 - 前記生分解性ポリマーは、ヒドロキシブチレートである、請求項2に記載の方法。
- 前記微生物は、ヒドロキシブチレートを分解しうるデポリメラーゼをコードする遺伝子を発現しない、請求項3に記載の方法。
- 前記微生物は、アセチルCoAアセチルトランスフェラーゼ、アセチルCoAレダクターゼ、及びポリヒドロキシブチレートポリメラーゼをコードする1又はそれ以上の遺伝子を発現する枯草菌の遺伝子操作株である、請求項4に記載の方法。
- 前記1又はそれ以上の遺伝子は、phaA、phaB、phaC、phaJ、phaPからなる群より選択される、請求項5に記載の方法。
- 前記微生物は、アセチルCoAアセチルトランスフェラーゼ、アセチルCoAレダクターゼ、及びポリヒドロキシブチレートポリメラーゼをコードする1又はそれ以上の遺伝子を発現するカプリアビダス・ネカトールの遺伝子操作株である、請求項4に記載の方法。
- 前記1又はそれ以上の遺伝子は、phaA、phaB、phaC、phaJ、phaPからなる群より選択される、請求項7に記載の方法。
- 生分解性ポリマーの産生に用いられるアサ属廃棄物から調製培地を製造する方法であって、以下の:
a.アサ属廃棄物の機械的破壊処理工程;
b.前記アサ属廃棄物を無機酸溶液中で少なくとも121℃の温度で25分間加熱してアサ属/酸溶液を生成する工程;
c.前記アサ属/酸溶液を冷却、中和、及び濾過して濾液を生成する工程;かつ、
d.前記濾液を無機塩媒体と1:1〜1:2の比で混合して調製培地を生成する工程;
を含む、方法。 - 生分解性ポリマーの製造方法であって、以下の:
a.処理された植物性廃棄物を炭素源として含む窒素制限調製培地に、Bacillus subtilis(枯草菌)、Cupriavidus necator(カプリアビダス・ネカトール)、Bacillus cereus、Bacillus brevis、Caulobacter cresentus、Bacillus sphaericus、Bacillus coagulans、Bacillus megaterium、Bacilllus circulands、Bacillus licheniformis、Escherichia coli、Microlanatus phosphovorous、Rhizobium meliloti、Rhizobium viciae、Bredyrhizobium japonicum、Burkholderia cepacia、Burkholderia sacchari、Cupriavidus necactor、Neptunamonas Antarctica、Azobacter vinelandii、Pseudomonas putida、Pseudomonas aeruginosa、Aeromonas caviae、Aeromonas hydrophila、Aeromonas punctate、Alcaligenes latus、Halomonas boliviensis、Lactobacillus rhamnosus、及びFermicutes bacteriumの天然株及び遺伝子操作された株からなる群から選択される微生物の開始培養物に接種し、かつ、少なくとも30℃で48〜72時間培養して培養物を産生する工程;
b.孔径約1mmのメンブレンを通して培養物を濾過する工程;
c.前記濾過された培養物から前記微生物の細胞を分離する工程;
d.前記細胞をNaOH溶液中に懸濁させ、少なくとも30℃の温度で少なくとも1.5時間インキュベートして、前記細胞から生分解性ポリマーを放出させる工程;
e.前記生分解性ポリマーをNaOH溶液から分離して、水中に再懸濁する工程;
f.前記生分解性ポリマーを前記水から分離して、エタノール溶液中に再懸濁する工程;
g.前記生分解性ポリマーを前記エタノール溶液から分離する工程;
を含む、方法。 - 前記生分解性ポリマーは、ヒドロキシブチレートである、請求項10に記載の方法。
- 前記微生物は、ヒドロキシブチレートを分解しうるデポリメラーゼをコードする遺伝子を発現しない、請求項11に記載の方法。
- 前記微生物は、アセチルCoAアセチルトランスフェラーゼ、アセチルCoAレダクターゼ、及びポリヒドロキシブチレートポリメラーゼをコードする1又はそれ以上の遺伝子を発現する枯草菌の遺伝子操作株である、請求項12に記載の方法。
- 前記1又はそれ以上の遺伝子は、phaA、phaB、phaC、phaJ、phaPからなる群より選択される、請求項13に記載の方法。
- . 前記微生物が、アセチルCoAアセチルトランスフェラーゼ、アセチルCoAレダクターゼ、及びポリヒドロキシブチレートポリメラーゼをコードする1又はそれ以上の遺伝子を発現するカプリアビダス・ネカトールの操作された株である、請求項12に記載の方法。
- 前記1又はそれ以上の遺伝子は、phaA、phaB、phaC、phaJ、phaPからなる群より選択される、請求項15に記載の方法。
- 5質量%〜70質量%のヒドロキシブチレート、5質量%〜70質量%のポリ(3-ヒドロキシブチレート-コ-3-ヒドロキシヘキサノエート)、5質量%〜45質量%の熱可塑性デンプン、0.5質量%〜35質量%の1又はそれ以上の相容化剤、及び0.5質量%〜15質量%の1又はそれ以上の添加剤を含む、生分解性ポリマー。
- 前記1又はそれ以上の相容化剤は、コハク酸ジヘキシル、スルホコハク酸ジヘキシルナトリウム、無水マレイン酸、メチレンジフェニルイソシアネート及びフマル酸ジオクチルからなる群から選択され、前記1又はそれ以上の添加剤は、微結晶性セルロース及びセルロースからなる群から選択される、請求項17に記載の生分解性ポリマー。
- 前記1又はそれ以上の相容化剤は、スルホコハク酸ジヘキシルナトリウム及び無水マレイン酸からなる群より選択され、前記1又はそれ以上の添加剤は、微結晶性セルロース及びセルロースからなる群より選択される、請求項17に記載の生分解性ポリマー。
- 前記1又はそれ以上の相容化剤は、スルホコハク酸ジヘキシルナトリウム及び無水マレイン酸であり、前記1又はそれ以上の添加剤は、微結晶性セルロース及びセルロースである、請求項17に記載の生分解性ポリマー。
- 前記熱可塑性デンプンは、可塑剤として約30質量%のグリセロール及び約20質量%の水を含む、可塑化天然ポリマーである、請求項20に記載の生分解性ポリマー。
- 20質量%〜60質量%のポリ(3-ヒドロキシブチレート-コ-3-ヒドロキシヘキサノエート)、10質量%〜30質量%の熱可塑性デンプン、10質量%〜20質量%の1又はそれ以上の相容化剤、及び1質量%〜10質量%の1又はそれ以上の添加剤、を含む、請求項21に記載の生分解性ポリマー。
- 20質量%のヒドロキシブチレート、40質量%のポリ(3-ヒドロキシブチレート-コ-3-ヒドロキシヘキサノエート)、20質量%の熱可塑性デンプン、15質量%の1又はそれ以上の相容化剤、及び5質量%の1又はそれ以上の添加剤を含む、請求項21に記載の生分解性ポリマー。
- 生分解性ポリマーの製造用炭素源としてのアサ属廃棄物の使用。
- 前記アサ属廃棄物は、アサ属植物の、根、トリミング、葉、柄(stalks)及び茎(stems)の1又はそれ以上からなる、請求項24に記載の使用。
- 前記生分解性ポリマーは、ポリヒドロキシブチレートである、請求項25に記載の使用。
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