KR20210124968A

KR20210124968A - 펄프 및 종이 폐기물 스트림에서 폴리하이드록시알카노에이트의 제조

Info

Publication number: KR20210124968A
Application number: KR1020217021702A
Authority: KR
Inventors: 라제쉬와르 다얄 티야기; 라즈윈더 카우르
Original assignee: 인스터튯 내셔널 드 라 르세르슈 사이언티피크; 인스터?b 내셔널 드 라 르세르슈 사이언티피크
Priority date: 2018-12-12
Filing date: 2019-12-12
Publication date: 2021-10-15
Also published as: CL2021001548A1; JP2022514256A; WO2020118439A1; EA202191624A1; CN113474462A; CA3123104A1; US20220017692A1; EP3894573A4; BR112021011366A2; EP3894573A1

Abstract

폴리하이드록시알카노에이트(PHA)를 생산하기 위한 공정이 제공된다. 공정은 리그노셀룰로오스계 물질을 포함하는 폐기물 스트림을 제공하는 단계; 폐기물 스트림에 칼슘 함유 광물을 첨가하는 단계; 칼슘 함유 광물의 존재 하에 폐기물 스트림을 열처리하여 처리된 폐기물 스트림을 수득하는 단계; 처리된 폐기물 스트림을 탄소 공급원으로서 포함하는 배양 배지에서 적어도 하나의 PHA 생산 미생물 균주를 발효시켜 PHA를 생산하는 단계; 및 PHA 생산 미생물로부터 PHA를 추출하는 단계를 포함한다.

Description

펄프 및 제지 폐기물 스트림으로부터 폴리하이드록시알카노에이트의 생산

본 기술분야는 일반적으로 바이오플라스틱 분야에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 기술분야는 펄프 및 제지 생산으로부터 얻어진 폐기물 스트림과 같은 폐기물로부터의 폴리하이드록시알카노에이트의 생산에 관한 것이다.

폴리하이드록시알카노에이트(PHA)는 미생물에 의해 생산될 수 있는 생분해성 및 생체 적합성 열가소성 플라스틱(thermoplastics)의 패밀리이다. 전형적으로, 생체 중합체의 생산, 특히 PHA의 생산에서의 비용 효율성은 요구되는 원료에 대한 가격에 의해 결정된다. 예를 들어, 원료의 가격은 비용의 최대 50%에 해당할 수 있다. 따라서, PHA 생산의 경제적 타당성에 도달하기 위해서는 폐기 물질에서 유래한 저가의 탄소 공급원을 사용함으로써 효율적인 발효 공정을 개발할 필요가 있다.

하나의 양태에서, 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)를 생산하기 위한 공정이 제공되며, 이때 이 공정은 리그노셀룰로오스계 물질을 포함하는 폐기물 스트림을 제공하는 단계; 폐기물 스트림에 칼슘 함유 광물을 첨가하는 단계; 칼슘 함유 광물의 존재 하에 폐기물 스트림을 열처리하여 폐기물 스트림을 멸균하고, 처리된 폐기물 스트림을 수득하는 단계; 처리된 폐기물 스트림을 탄소 공급원으로서 포함하는 배양 배지에서 적어도 하나의 PHA 생산 미생물 균주를 발효시켜 PHA를 생산하는 단계; 및 PHA 생산 미생물로부터 PHA를 추출하는 단계를 포함한다.

다른 양태에서, 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)의 생산을 위한 탄소 공급원을 제조하기 위한 공정이 제공되며, 이때 이 공정은 리그노셀룰로오스계 물질을 포함하는 폐기물 스트림을 제공하는 단계; 폐기물 스트림에 칼슘 함유 광물을 첨가하는 단계; 칼슘 함유 광물의 존재 하에 폐기물 스트림을 열처리하여 폐기물 스트림을 멸균하고, 처리된 폐기물 스트림을 PHA의 생산을 위한 탄소 공급원으로서 수득하는 단계를 포함한다.

일부 구현예에서, 폐기물 스트림은 펄프 및 제지 활성 슬러지 스트림이다.

일부 구현예에서, 칼슘 함유 광물은 탄산칼슘, 수산화칼슘 및 산화칼슘 중 적어도 하나를 포함한다.

일부 구현예에서, 칼슘 함유 광물은 수산화칼슘을 포함한다.

일부 구현예에서, 칼슘 함유 광물은 석회를 포함한다.

일부 구현예에서, 폐기물 스트림에 칼슘 함유 광물을 첨가하는 단계는 폐기물 스트림을 열처리하기 전에 실시된다.

일부 구현예에서, 폐기물 스트림에 칼슘 함유 광물을 첨가하는 단계는 폐기물 스트림을 열처리하는 동안에 실시된다.

일부 구현예에서, 폐기물 스트림을 열처리하는 단계는 적어도 120℃의 온도에서 실시된다.

일부 구현예에서, 공정은 폐기물 스트림에 칼슘 함유 광물을 첨가하기 전에 폐기물 스트림을 여과하여 조대 섬유(coarse fiber)를 제거함으로써 폐기물 스트림 여과액을 수득하는 단계를 더 포함한다.

일부 구현예에서, 공정은 폐기물 스트림에 칼슘 함유 광물을 첨가하기 전에 폐기물 스트림 여과액을 침강시켜 여과되지 않은 고형물을 디캔팅함으로써 디캔팅된 폐기물 스트림을 수득하는 단계를 더 포함한다.

일부 구현예에서, 공정은 폐기물 스트림에 칼슘 함유 광물을 첨가하기 전에 디캔팅된 폐기물 스트림을 세척하여 세척된 고형물을 수득하는 단계를 더 포함한다.

일부 구현예에서, 디캔팅된 폐기물 스트림을 세척하는 단계는 디캔팅된 폐기물 스트림을 원심 분리하여 원심 분리된 고형물을 수득하는 단계를 포함한다.

일부 구현예에서, 공정은 원심 분리된 고형물을 수성 배지에 재현탁하여 현탁액을 수득하는 단계 및 현탁액을 다시 원심 분리하여 원심 분리된 고형물을 수득하는 단계를 더 포함한다.

일부 구현예에서, 공정은, 폐기물 스트림에 칼슘 함유 광물을 첨가하기 전에, 폐기물 스트림 내의 현탁된 고형물(SS) 농도를 소정의 농도로 조절하여 컨디셔닝된 폐기물 스트림을 수득하는 단계; 및 컨디셔닝된 폐기물 스트림에 칼슘 함유 광물을 첨가하는 단계를 더 포함하며, 이때 폐기물 스트림을 열처리하는 단계는 컨디셔닝된 폐기물 스트림을 열처리하는 단계를 포함한다.

일부 구현예에서, SS 농도를 조절하는 단계는 세척된 고형물에 대해 실시된다.

일부 구현예에서, 소정의 농도는 5 g/ℓ와 50 g/ℓ 사이이다.

일부 구현예에서, 소정의 농도는 10 g/ℓ와 20 g/ℓ 사이이다.

일부 구현예에서, 공정은 발효 단계 이전 및/또는 동안에 배양 배지에 2차 탄소 공급원을 첨가하는 단계를 더 포함한다.

일부 구현예에서, 2차 탄소 공급원은 카르복실산, 당류, 오일, 알코올 또는 이들의 조합을 포함한다.

일부 구현예에서, 카르복실산은 아세트산, 프로피온산, 부티르산, 발레르산, 이들의 염 또는 이들의 조합을 포함한다.

일부 구현예에서, 당류는 글루코오스, 만니톨, 수크로오스 또는 이들의 조합을 포함한다.

일부 구현예에서, 오일은 올리브 오일, 옥수수 오일, 야자수 오일 또는 이들의 조합을 포함한다.

일부 구현예에서, 알코올은 글리세롤을 포함한다.

일부 구현예에서, 발효 단계는 폐기물 스트림의 pH를 pH 6.5와 pH 7.5 사이로 유지하고/하거나, 온도를 25℃와 35℃ 사이로 유지하는 단계를 포함한다.

일부 구현예에서, 공정은 발효 단계 이전 및/또는 동안에 배양 배지에 광물 공급원을 첨가하는 단계를 더 포함한다.

일부 구현예에서, 적어도 하나의 PHA 생산 미생물 균주는 단일 PHA 생산 미생물 균주이다.

일부 구현예에서, 적어도 하나의 PHA 생산 미생물 균주는 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium), 코마모나스 테스토스테로니(Comamonas testosteroni), 쿠프리아비두스 네카토르 11599(Cupriavidus necator 11599), 쿠프리아비두스 네카토르 H16(Cupriavidus necator H16), 슈도모나스 게제네이 비오라브. 티케하우(Pseudomonas guezennei biovar. Tikehau), R. 유트로파(R. eutropha), 대장균(E. coli), 유전자 조작 대장균(engineered E. coli), 알칼리게네스 라투스(Alcaligenes latus), 스핑고박테리움 종 ATM(Sphingobacterium sp. ATM), 플라스티시쿠물란스 아시디보란스(Plasticicumulans acidivorans), 바실러스 테퀼렌시스(Bacillus tequilensis), 할로페락스 메디테라네이(Haloferax mediterranei), H. 메디테라네이(H. mediterranei), 슈도모나스 플루오레센스 A2a5(Pseudomonas fluorescens A2a5) 및 랄스토니아 유트로파 H16(Ralstonia eutropha H16)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 구현예에서, PHA 생산 미생물로부터 PHA를 추출하는 단계는 PHA 생산 미생물의 적어도 일부를 용균하기 위해 발효 혼합물을 열처리함으로써 PHA를 방출하는 단계를 포함한다.

일부 구현예에서, 발효 혼합물을 열처리하는 단계는 80℃와 125℃ 사이의 온도에서 실시된다.

일부 구현예에서, 공정은 PHA를 포함하는 추출 혼합물을 건조하는 단계를 더 포함한다.

일부 구현예에서, 공정은 배양 배지 내의 탄소 농도를 PHA 생산 미생물의 탄소 소비량을 기준으로 최적의 탄소 농도로 유지하는 단계를 포함한다.

도 1은 폐기물 스트림을 탄소 공급원으로서 사용하여 PHA를 합성하기 위한 공정의 공정 흐름도이다.
도 2는 칼슘 함유 광물을 첨가하기 전에 폐기물 스트림이 컨디셔닝되는 도 1의 공정의 공정 흐름도이다.
도 3은 컨디셔닝 공정의 다양한 단계를 보여주는 공정 흐름도이다.
도 4는 폐기물 스트림을 탄소 공급원으로서 사용하여 PHA를 합성하기 위한 다양한 단계 및 조건을 보여주는 순서도이다.
도 5는 합성 배지에서의 PHA 생산 미생물의 성장과 글루코오스로 강화(fortification)된 슬러지 배지에서의 PHA 생산 미생물의 성장을 비교한 것을 보여주는 그래프이다.
도 6은 Ca(OH)₂ 및 글루코오스로 처리된 컨디셔닝된 폐기물 스트림을 포함하는 탄소 공급원을 사용하여 유가식 발효(fed-batch fermentation) 동안의 시간의 함수로서 PHA 생산 동안에 관찰된 다양한 파라미터를 보여주는 그래프이다.
도 7은 Ca(OH)₂ 및 조질의 글리세롤로 처리된 컨디셔닝(세척)된 폐기물 스트림을 포함하는 탄소 공급원을 사용하여 유가식 발효 동안의 시간의 함수로서 PHA 생산 동안에 관찰된 다양한 파라미터를 보여주는 그래프이다.
도 8은 Ca(OH)₂ 및 조질의 글리세롤로 처리된 컨디셔닝(세척)되지 않은 폐기물 스트림을 포함하는 탄소 공급원을 사용하여 유가식 발효 동안의 시간의 함수로서 PHA 생산 동안에 관찰된 다양한 파라미터를 보여주는 그래프이다.
도 9는 Ca(OH)₂ 및 조질의 글리세롤로 처리된, 현탁된 고형물의 농도가 높은 컨디셔닝된 폐기물 스트림을 포함하는 탄소 공급원을 사용하여 유가식 발효 동안의 시간의 함수로서 PHA 생산 동안에 관찰된 다양한 파라미터를 보여주는 그래프이다.
도 10은 Ca(OH)₂ 및 아세트산으로 처리된, 현탁된 고형물의 농도가 높은 컨디셔닝된 폐기물 스트림을 포함하는 탄소 공급원을 사용하여 유가식 발효 동안의 시간의 함수로서 PHA 생산 동안에 관찰된 다양한 파라미터를 보여주는 그래프이다.

상기에서 논의된 바와 같이, 폐기물 스트림 공급원(펄프 및 제지 산업 활성 슬러지와 같은 도시 또는 산업 폐기물)로부터 PHA를 생산하는데 있어서 개선된 기법이 요구되고 있다. 이들 폐기물 스트림 공급원은, i) 영양분 및 복합 탄소 공급원 내의 이들의 높은 함량; 및 ii) 총 폐수 처리 비용의 60% 정도를 차지할 수 있는, 펄프 및 제지 산업에서의 슬러지 처리 문제의 해결 가능성으로 인해 고려될 수 있다.

이차 슬러지 처리 비용은 보다 높은 폐수 처리 기준, 매립지 용량의 감소 및 연료비의 증가에 반응하여 특히 북아메리카 및 유럽에서 증가하는 것으로 예상된다.

연구원들은, 직접적으로 PHA 생산을 위한 멸균되지 않은 펄프 및 제지 공장 활성 슬러지(PPMAS)를 사용함으로써 이차 슬러지 처리 및 높은 PHA 생산 비용 문제를 해결하는데 계속적인 노력을 해왔다. 멸균 조건의 유지비용, 합성 배지의 제조비용 및 순수한 배양액의 유지비용과 연관된 문제를 해결하기 위한 가능한 기술로서 혼합 미생물 배양액(즉, 활성 슬러지)에 기초한 PHA 생산 공정에 대한 조사가 이루어지고 있다(문헌[Singh et al., 2014]). 이러한 공정에서, 주요 문제는 PHA 농도의 배치(batch)간 변화이다. 따라서, PHA 생산(축적)은 (상이한 폐수 처리장에서 수집한 슬러지뿐만 아니라, 동일한 폐수 처리장에서 상이한 시점에 수집한 슬러지에 대해) 재현 불가능하다. PHA 축적의 변화는 슬러지 내 미생물 군집의 조성 및 활성 슬러지의 화학 조성에서의 변화에 기인할 수 있으며, 이는 펄프 및 제지 공장 내부에서 펄프 및 제지 생산을 위해 사용되는 공정의 특성에 추가로 의존한다. 게다가, 슬러지 미생물 군집은 유기 공급 부하, 화학 첨가, 작동 SRT, HRT, 온도 및 pH의 변화 등과 같은 폐수 처리 공정 파라미터의 변화에 민감하다.

본원에 기술되어 있는 다양한 기법은 폐기물 스트림 공급원을 영양분 및 탄소 공급원으로서 사용하여 PHA의 합성을 가능케 한다. 폐기물 스트림 공급원의 비제한적인 예로는 펄프 및 제지 활성 슬러지가 있다.

공정의 개요

도 1을 참고하면, 폐기물 스트림 공급원(11)을 사용하여 PHA를 합성하기 위한 공정(100)이 제공된다. 폐기물 스트림(11)은, 예를 들어 펄프 및 제지 활성 슬러지 스트림, 또는 펄프 및 제지 활성 슬러지 스트림에서 유래하는 스트림을 포함할 수 있다. "펄프 및 제지 활성 슬러지 스트림에서 유래하는 스트림"이란 표현은 여과, 침강, 디캔테이션(decantation), 원심 분리, 세척, 수성 배지(예를 들어, 물)에서의 현탁 및 현탁된 고형물 농도의 조절로 이루어진 하나의 단계 또는 몇몇 단계를 사용하여 전처리되거나 컨디셔닝된 슬러지 스트림을 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 폐기물 스트림(11)은 펄프 및 제지 제조 공장에서 유래하는 펄프 및 제지 활성 슬러지 스트림일 수 있다.

폐기물 스트림(11)은 PHA의 생산을 위한 탄소 공급원 및 기타 영양분으로서 사용될 수 있는 몇몇 탄소 함유 화합물을 포함한다. 폐기물 스트림(11)에 존재할 수 있거나 폐기물 스트림(11)의 가공 동안에 형성될 수 있는 가수분해된 리그노셀룰로오스계 물질과 같은 특정 물질의 억제 효과를 완화시키기 위해 칼슘 함유 광물(12)을 폐기물 스트림(11)에 첨가할 수 있다. 폐기물 스트림(11)을 칼슘 함유 광물(12)의 존재 하에 열처리 단계(13)(본원에서 멸균 단계 또는 해독 단계로도 지칭됨)에서 열처리하여 폐기물 스트림을 멸균하고, 처리된 폐기물 스트림(14)을 수득할 수 있다.

놀랍게도, 열처리 단계(13) 이전 또는 동안에 폐기물 스트림(11)에 칼슘 함유 광물(12)을 첨가하면 슬러지-현탁된 고형물이 가용화되고, PHA 생산 미생물이 영양분을 보다 용이하게 이용 가능하도록 하는데 도움이 될 수 있다는 것이 밝혀져 있다. 또한, 놀랍게도, 열처리 단계(13) 이전 또는 동안에 폐기물 스트림(11)에 칼슘 함유 광물(12)을 첨가하면 초기에 폐기물 스트림에 존재하는 리그노셀룰로오스계 물질의 가수분해의 결과로서 열처리 동안에 전형적으로 생성되는 억제 물질을 감소시키는데 도움이 될 수 있다는 것이 밝혀져 있다.

이어서, 처리된 폐기물 스트림(14)을 발효 단계(15)에서 발효하여 발효 혼합물(16)을 수득할 수 있으며, 추출 단계(18)에서 추출하여 PHA(24)를 포함하는 추출 혼합물(20)을 수득할 수 있다. 선택적으로, PHA(24)를 건조하기 위해 건조 단계(22)를 실시할 수 있다.

도 1의 공정(100)에 나타나 있는 바와 같이, 폐기물 스트림(11)에는 직접 열처리 단계(13)를 가할 수 있다. 대안적으로, 도 2의 공정(200)에 나타나 있는 바와 같이, 폐기물 스트림(11)을 열처리 단계(13) 이전에 컨디셔닝 공정(300)에서 컨디셔닝할 수 있다. 이 같은 경우, 컨디셔닝된 폐기물 스트림(114)에는 열처리 단계(13)가 가해진다는 것이다. 컨디셔닝 공정(300)은 본원에서 더욱 상세하게 논의될 것이다.

공정의 단계 및 PHA 생산 기법의 기타 양태가 하기에 더욱 상세하게 기술되어 있다.

폴리하이드록시알카노에이트(PHA)

"폴리하이드록시알카노에이트" 또는 "PHA"란 용어는 화학식 I의 하기 반복 단위로 표시될 수 있는 중합체를 지칭하거나, 화학식 I(여기서, R은 H, 알킬 또는 알케닐이고, m 및 n는 정수임)의 적어도 2개의 상이한 반복 단위의 단량체를 포함하는 공중합체를 지칭하는 것으로 이해되어야 한다.

[화학식 I]

일부 PHA는 산업적 응용성을 나타내며, 대표적인 비제한적인 예로는 PHB(폴리-3-하이드록시부티레이트), PHBV(폴리(하이드록시부티레이트-코-하이드록시발레레이트)), P4HB(폴리(4-하이드록시부티레이트), P3HB4HB(폴리(3-하이드록시부티레이트-코-4-하이드록시부티레이트)), PHV(폴리하이드록시발레레이트) 및 PHHx(폴리하이드록시헥사노에이트)가 있다.

선택적으로, n은 100과 30,000 사이의 정수일 수 있다. 선택적으로, m은 1과 4 사이의 정수일 수 있다. 선택적으로, R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐 또는 치환된 알케닐일 수 있다. 예를 들어, R은 H, 메틸, 에틸, 프로필 또는 부틸일 수 있다.

폐기물 스트림 공급원

폐기물 스트림(11)은 다양한 공급원으로부터 유래할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 일부 구현예에서, 폐기물 스트림(11)을 도시 폐수, 전분 제조 폐수, 치즈 제조 폐수, 펄프 및 제지 생산 시에 얻어지는 폐기물 스트림 또는 이들의 조합으로부터 수득한다. 게다가, 본원에서 지칭되는 폐기물 스트림 중 임의의 하나를 일차 슬러지, 이차 슬러지 또는 이들의 조합으로부터 수득할 수 있다. "일차 슬러지"는, 예를 들어 주로 일차 정화기에서 수행될 수 있는 중력에 의한 분리를 통해 일차 처리 공정에서 현탁된 고형물 및 유기물을 포획한 결과물인 것으로 이해된다. 또한, "이차 슬러지"는 미생물을 사용하여 폐수에 존재하는 유기물을 소비하는 이차 처리 공정에서 폐수를 처리함으로써 수득되는 것으로 이해된다. 미생물은 전형적으로 폐수, 예를 들어 폭기 탱크(aeration tank)에 존재하는 생분해성 물질을 먹고 살며, 이어서 바이오매스(biomass)가 침강될 수 있거나 이차 슬러지로서 제거될 수 있는 이차 정화기 내로 유동한다. 폐기물 스트림이 유래하는 공정의 결과로서, 미생물 활성뿐만 아니라, 폐기물 스트림(11)은 전형적으로 PHA를 생산하기 위한 PHA 생산 미생물용 탄소 공급원으로서 사용할 수 있는 유기 물질을 함유한다.

일부 구현예에서, 폐기물 스트림은 펄프 및 제지 생산으로부터 얻어진 폐기물 스트림이다. 선택적으로, 펄프 및 제지 생산으로부터 얻어진 폐기물 스트림은 이차 폐기물 스트림을 포함한다. 선택적으로, 펄프 및 제지 생산으로부터 얻어진 폐기물 스트림은 본질적으로 이차 폐기물 스트림으로 이루어져 있다. 폐수 처리장으로부터 배출된 이차 또는 활성 슬러지를 PHA 생산용 폐기 물질로서 사용할 수 있다. 일부 시나리오에서, 활성 슬러지는 기타 탄소 공급원(예를 들어, 조질의 글리세롤: 바이오디젤 산업의 폐품, 글루코오스, 아세트산, 폐 식용유 또는 유사한 도시 또는 산업 폐기물 등)과 결합할 수 있다.

폐기물 스트림의 컨디셔닝

이제, 도 3을 참고하면, 후속적인 PHA 생산을 위한 폐기물 스트림(11)을 컨디셔닝하기 위한 공정(300)이 나타나 있다. 칼슘 함유 광물을 첨가하기 전과 열처리 단계(13) 및 발효 단계(15) 이전에 폐기물 스트림(11)을 컨디셔닝할 수 있다.

일부 구현예에서, 칼슘 함유 광물(12)을 첨가하기 이전에 폐기물 스트림(11)에 여과 단계(103)를 가하여 폐기물 스트림 여과액(104)을 수득한다. 여과 단계(103)에 의해 초기에 폐기물 스트림(11)에 존재할 수 있는 목재 잔류물(wood residue) 및/또는 조대 섬유와 같은 조대 물질의 제거가 가능할 수 있다. 예를 들어, 100 ㎜ 내지 1,500 ㎜ 필터, 또는 500 ㎜ 내지 1,000 ㎜ 필터, 또는 700 ㎜ 내지 900 ㎜ 필터, 또는 800 ㎜ 필터를 사용하여 여과 단계(103)를 실시할 수 있다.

일부 구현예에서, 폐기물 스트림에 칼슘 함유 광물(12)을 첨가하기 전에 폐기물 스트림 여과액(104)에 침강 단계 또는 디캔테이션 단계(105)를 가하여 디캔팅된 폐기물 스트림(106)을 수득할 수 있다. 침강 단계 또는 디캔테이션 단계(105)는 수 시간, 예를 들어 2시간과 12시간 사이, 또는 5시간과 7시간 사이, 또는 약 6시간 동안 폐기물 스트림 여과액(104)을 디캔팅하는 단계를 포함할 수 있다. 폐기물 스트림 여과액(104)의 디캔테이션에 의해 여과되지 않은 고형물이 디캔팅될 수 있다. 일부 구현예에서, 슬러지 액체 부분을 폐기할 수 있으며, 디캔팅된 폐기물 스트림(106)은 주로 농축 침강된 슬러지 고형물을 포함할 수 있다. 일부 시나리오에서, 잔류 고형물의 추가의 건조 또는 가공 없이 슬러지 액체 부분을 폐기함으로써 농축 침강된 슬러지 고형물을 수득한다.

일부 구현예에서, 디캔팅된 폐기물 스트림(106)을 세척할 수 있다. 디캔팅된 폐기물 스트림(106)을 세척하는 단계는 원심 분리된 고형물(108)을 수득하기 위해 폐기물 스트림에 칼슘 함유 광물(12)을 첨가하기 전에 원심 분리 단계(107)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 디캔팅된 폐기물 스트림(106)을 세척하는 단계는 현탁 단계(109)에서 원심 분리된 고형물을 수성 배지(예를 들어, 물)에 재현탁하여 재현탁된 고형물(110)을 수득하는 단계를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 디캔팅된 폐기물 스트림(106)을 세척하는 단계는 제2 원심 분리 단계(111)에서 재현탁된 고형물(110)을 다시 원심 분리하여 원심 분리된 고형물(112)을 수득하는 단계를 더 포함한다.

일부 구현예에서, 디캔테이션 단계(105), 제1 원심 분리 단계(107) 및/또는 제2 원심 분리 단계(111) 이후에 수득된 액체 부분(또는 상층액)을 폐기할 수 있다. 디캔테이션 단계(105), 제1 원심 분리 단계(107) 및/또는 제2 원심 분리 단계(111) 이후에 수득된 고형물 분획을 선택적으로는 후속적인 단계 이전에 수성 배지(예를 들어, 물)에 재현탁할 수 있다.

또한, 본원에 기술되어 있는 컨디셔닝 단계들 중 각각은 선택적인 것이며, 해독 단계(13) 이후에 처리된 폐기물 스트림(14)을 수득하기 위해 반드시 실시할 필요는 없는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 일부 시나리오에서 침강 또는 디캔테이션 단계(105)를 생략할 수 있으며, 제1 원심 분리 단계(107)를 폐기물 스트림 여과액(104)에 대해 직접 실시할 수 있다. 일부 시나리오에서, 폐기물 스트림(11)은 여과 단계(103)가 요구되지 않을 수 있다(예를 들어, 여과할 조대물질이 거의 없는 경우). 다른 실시예에서, 현탁 단계(109)를 디캔팅된 폐기물 스트림(106)에 대해 직접 실시할 수 있으며, 원심 분리 단계(107)를 생략할 수 있다. 또한, 일부 시나리오에서 제2 원심 분리 단계(111)를 또한 생략할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 일부 시나리오에서, 단일 원심 분리 단계만을 실시할 수 있다. 기타 시나리오에서, 2개 이상의 원심 분리 단계를 실시할 수 있다.

일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 원심 분리 단계를 8,000x g와 10,000x g 사이에서 실시한다. 일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 원심 분리 단계를 실온(20 내지 25℃)에서 실시한다. 일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 원심 분리 단계를 5분과 20분 사이 동안 실시한다.

일부 구현예에서, 폐기물 스트림(11)을 컨디셔닝하는 단계는 현탁된 고형물(SS) 농도를 소정의 농도로 조절하는 단계를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 소정의 농도는 5 g/ℓ와 50 g/ℓ 사이, 또는 10 g/ℓ와 20 g/ℓ 사이이거나, 약 15 g/ℓ이다. 일부 구현예에서, 수성 배지(예를 들어, 물)를 첨가함으로써 현탁된 고형물 농도를 조절한다. SS 농도를 조절하는 단계를 폐기물 스트림(11)에 대해 직접 실시할 수 있거나, 컨디셔닝 공정에서 실시된 마지막 단계 이후에 실시할 수 있다. 다시 말해, 스트림이 컨디셔닝 공정(300)에서 수득된 마지막 스트림인지에 따라 SS 농도를 조절하는 단계를 폐기물 스트림(11), 폐기물 스트림 여과액(104), 디캔팅된 폐기물 스트림(106), 원심 분리된 고형물(108), 재현탁된 고형물(110) 또는 원심 분리된 고형물(112) 중 하나에 대해 실시할 수 있다.

칼슘 함유 광물 및 열처리 단계

폐기물 스트림(11)이 펄프 및 제지 활성 슬러지 스트림이거나, 다양한 목재 공급원 또는 식물(예를 들어, 나무, 밀, 쌀등)에서 기원하는 다양한 천연 물질의 처리에서 유래하는 스트림인 경우, 유기 물질은 리그노셀룰로오스계 물질을 포함한다. 리그노셀룰로오스계 물질이 가수분해되는 경우, 몇몇 가수분해 생성물이 방출되며, PHA 생산에 대해 억제될 수 있다. 놀랍게도, 열처리 단계(13) 이전 또는 동안에 폐기물 스트림(11) 또는 컨디셔닝된 폐기물 스트림(114)에 칼슘 함유 광물(12)을 첨가하면 슬러지 현탁된 고형물을 가용화할 수 있고, PHA 생산 미생물에 대한 영양분 이용 가능성을 높일 수 있다는 것이 밝혀져 있다. 게다가, 놀랍게도 열처리 단계(13) 이전 또는 동안에 폐기물 스트림(11) 또는 컨디셔닝된 폐기물 스트림(114)에 칼슘 함유 광물(12)을 첨가하면 초기에 폐기물 스트림(11)에 존재하는 리그노셀룰로오스계 물질의 가수분해의 결과로서 열처리 동안에 전형적으로 생성되는 억제 물질을 감소시키는데 도움이 될 수 있다는 것이 밝혀져 있다.

칼슘 함유 광물(12)의 비제한적인 예로는 탄산칼슘, 수산화칼슘, 산화칼슘, 석회 또는 이들의 혼합물을 들 수 있다. 바람직하게는, 칼슘 함유 광물은 수산화칼슘을 포함한다.

열처리 단계(13)는 전형적으로 멸균 단계(즉, 폐기물 스트림(11) 또는 컨디셔닝된 폐기물 스트림(114)에 존재하는 미생물(예를 들어, 박테리아)을 살해 또는 불활성화하기에 충분히 높은 온도에서 충분히 긴 시간 동안의 가열)인 것으로 이해되어야 한다. 일부 구현예에서, 폐기물 스트림(11) 또는 컨디셔닝된 폐기물 스트림(114)의 열처리를 적어도 120℃의 온도에서 실시한다.

일부 구현예에서, Ca 함유 광물의 양은 SS 농도를 기준으로 첨가된다. 예를 들어, Ca 함유 광물은 Ca 함유 광물이 첨가되는 시기에 따라 폐기물 스트림(11) 또는 컨디셔닝된 폐기물 스트림(114)에 존재하는 SS 고형물 1 g에 대해 0.05 g과 0.5 g 사이, 또는 0.05 g과 0.2 g 사이, 또는 0.1 g과 0.2 g 사이, 또는 약 0.1 g으로 첨가될 수 있다. 보다 구체적으로는 수산화칼슘, 탄산칼슘, 산화칼슘 또는 석회는 폐기물 스트림(11) 또는 컨디셔닝된 폐기물 스트림(114)에 약 0.05 g과 0.5 g 사이, 또는 0.05 g과 0.2 g 사이, 또는 0.1 g과 0.2 g 사이, 또는 약 0.1 g으로 첨가될 수 있다. SS 고형물 농도는 ASTM-D 5907, EPA 180.1 및/또는 ISO 7027과 같은 표준화된 프로토콜을 이용하여 측정될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.

발효 단계

폐기물 스트림(11) 또는 컨디셔닝된 폐기물 스트림(114)을 Ca 함유 광물 존재 하에 멸균한 이후, 발효 단계(15)에서 처리된 폐기물 스트림(14)을 발효한다.

일부 구현예에서, 발효 단계(15)는 배치식 발효, 유가식 발효, 개방식 발효 및/또는 연속 발효를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 발효 단계(15)는 유가식 발효를 포함한다. 일부 시나리오에서, 발효 단계(15)는 유가식 발효로 이루어져 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "유가식 발효"란 용어는 성분들 중 일부가 발효 동안에 첨가되는 배치식 발효의 변형을 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 이는 전형적으로 발효 공정의 단계에 대해 보다 높은 제어를 가능케 한다. 특히, 이차 대사산물의 생산은 비지수적 성장 단계 동안에 특정 영양분을 제한된 양으로 첨가함으로써 증가될 수 있다. 일부 구현예에서, 발효 단계(15)는 배치식 작동(batch operation)들 사이에 있는 유가식 작동을 포함한다.

일부 구현예에서, 발효 단계(15)를 20℃와 40℃ 사이의 온도에서 수행한다. 또한, 온도는 박테리아 균주, 또는 PHA 생산 미생물로서 사용되는 균주를 기준으로 선택될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 일부 구현예에서, 폐기물 스트림(11) 또는 컨디셔닝된 폐기물 스트림(114)의 열처리를 Ca 함유 광물의 존재 하에 발효기 내에서 실시할 수 있다. 이 같은 경우, 발효기를 열처리를 위해 요구되는 온도에서 가열할 수 있으며, 이어서 발효 온도까지 냉각할 수 있다.

일부 구현예에서, 발효 단계는 폐기물 스트림의 pH를 pH 6.5과 pH 7.5 사이로 유지하고/하거나, 온도를 25℃와 35℃ 사이로 유지하는 단계를 포함한다.

일부 구현예에서, 발효 단계(15) 이전 및/또는 동안에 배양 배지에 2차 탄소 공급원을 첨가할 수 있다. 유사하게, 발효 단계(15) 이전 및/또는 동안에 배양 배지에 광물 공급원을 첨가할 수 있다. 또한, 전형적으로는 발효 단계(15) 이전 및/또는 동안에 배양 배지에 PHA 생산 미생물을 첨가한다.

PHA 생산 미생물

PHA 생산 미생물은 PHA를 생산하는 것으로 알려져 있는 임의의 박테리아 균주일 수 있다. PHA 생산 미생물의 비제한적인 예는 하기 표 1에 나열되어 있다.

PHA 생산 미생물의 목록

균주	PHA 함량(%(w/w))
바실러스 메가테리움	50
코마모나스 테스토스테로니	79
쿠프리아비두스 네카토르 11599	90
쿠프리아비두스 네카토르 H16	80
슈도모나스 게제네이 비오라브. 티케하우	63
R. 유트로파	76
대장균(유전자 조작)	75
알칼리게네스 라투스	77.6
스핑고박테리움 종 ATM	64
플라스티시쿠물란스 아시디보란스	70
바실러스 테퀼렌시스	79.2
할로페락스 메디테라네이	65
H. 메디테라네이	75
슈도모나스 플루오레센스 A2a5	70
랄스토니아 유트로파 H16	76

일부 구현예에서, 박테리아 균주에 대한 사전 접종물(pre-inoculum) 내의 세포수는 24시간 동안 성장하면 10⁸개 내지 10⁹개 사이일 수 있다. 그러나, 사전 접종물 내 보다 작거나 보다 많은 세포수가 가능하며, 일반적으로 PHA 생산 공정에 보다 높은 정도로는 영향을 미치지 않는 것으로 이해되어야 한다.

일부 구현예에서, PHA 생산 미생물을 배양 배지에 도입하기 전에 배양한다. 예를 들어, PHA 생산 미생물을 배양 배지에 도입하기 전에 12시간 내지 48시간 동안, 또는 12시간과 24시간 사이 동안, 또는 약 24시간 동안 배양할 수 있다. 이어서, 이렇게 수득된 사전 접종물을 발효 단계(15) 이전 및/또는 동안에 배양 배지에 첨가할 수 있다.

일부 구현예에서, PHA 생산 미생물은 단일 PHA 생산 미생물 균주이다. 기타 구현예에서, PHA 생산 미생물은 하나 초과의 PHA 생산 미생물 균주를 포함할 수 있다.

광물 공급원

일부 구현예에서, 광물 공급원을 배지에 첨가하여 발효 공정 동안에 PHA 생산에 도움을 줄 수 있다. 첨가될 수 있는 광물의 비제한적인 예로는 NH₄Cl(예를 들어, 0.2 내지 1.0 g/ℓ), Na₂HPO₄(예를 들어, 0.5 내지 6.0 g/ℓ), KH₂PO₄(예를 들어, 0.2 내지 2.4 g/ℓ), MgSO₄ㅇ7H₂O(예를 들어, 0.04 내지 0.5 g/ℓ) 및 이들의 조합이 있다. 하기에 있는 성분들을 배지에 첨가하여 발효 공정 동안 PHA 생산을 조장할 수 있다. 기타 광물이 사용될 수 있으며, 상기에 나타나 있는 농도는 일례로서 제공되는 것으로 이해되어야 하며, 제한의 의미로 해석되어서는 안 된다.

추가의 탄소 공급원

일부 구현예에서, 공정은 발효 단계(15) 이전 및/또는 동안에 배양 배지에 2차 탄소 공급원을 첨가하는 단계를 더 포함한다. 예를 들어, 2차 탄소 공급원은 카르복실산, 당류, 오일, 알코올 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 카르복실산은 아세트산, 프로피온산, 부티르산, 발레르산, 이들의 염 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 당류는 글루코오스, 만니톨, 수크로오스 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 오일은 올리브 오일, 옥수수 오일, 야자수 오일 또는 이들의 조합과 같은 식물성 오일을 포함할 수 있다. 알코올은 순수 또는 조질의 글리세롤과 같은 글리세롤을 포함할 수 있다.

추출 단계

발효 단계(15) 이후에 수득되는 발효 혼합물(16)은 추출 단계(18)에서 추출되어야 하는 PHA(24)를 포함하는 미생물 세포를 함유한다. 따라서, 발효 단계(15)를 중단하고, PHA(24)를 회수하기 위해 발효 혼합물(16)을 추가로 가공한다. 일부 구현예에서, 추출 단계(18)는 열처리 단계, 초음파 처리 단계 및 산화적 처리 단계 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.

추출 단계(18)는 PHA를 포함하는 미생물 세포 중 적어도 일부를 용균하기 위해 발효 혼합물(16)을 열처리하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 시나리오에서, 발효 혼합물(16)에 함유된 PHA를 미생물 세포에 의해 분해한다. 이 같은 경우, 열처리가 인가되며, 분해를 최소화하는 것을 도울 수 있다.

일부 구현예에서, PHA 농도가 최대치(예를 들어, 아세트산/아세테이트와 같은 탄소 공급원의 소비율이 일정하게 되며, 최소 값에 도달한 경우에 측정됨)에 도달한 경우, 발효 혼합물(16)을 (예를 들어 80℃와 125℃ 사이까지, 그리고 예를 들어 약 10분과 45분 사이 동안, 또는 약 15분과 30분 사이 동안) 가열할 수 있다. 선택적으로, 가열 단계 동안에 아세트산의 양의 농도가 발효기 내에서 유지될 수 있다. 이러한 가열 단계에 의해 전형적으로 미생물 세포의 적어도 일부가 용균되며, 따라서 그 내부에 함유된 PHA를 방출한다. PHA는 전형적으로 이들 온도에서 분해되지 않는 것으로 이해되어야 한다. "PHA가 세포로부터 방출된다"는 표현은 초기에는 세포 내 PHA인 PHA가 열처리에 의한 세포 용균/세포 파쇄로 인해 세포 밖으로 축출된다(즉, 세포 외 PHA가 수득된다)는 것을 의미하는 것을 이해된다. 또한, PHA 농도는 세포 함량의 가용화(예를 들어, 세포벽 성분의 가용화)로 인해 증가할 수 있다.

일부 구현예에서, 발효 혼합물(16)의 열처리에는 열처리 증강 화합물이 포함된다. 열처리 증강 화합물은 보다 낮은 온도에서 열처리가 실시되도록 할 수 있는 것으로 이해된다. 일부 구현예에서, 열처리 증강 화합물은 세정제를 포함한다. 일부 구현예에서, 세정제는 계면 활성제, 킬레이트제(chelating agent) 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 세정제로는 트윈^TM 20, 트윈^TM 40, 트윈^TM 60, 소듐 2-도데실설페이트, 트리톤 X-100, 에틸렌디아민 테트라-아세테이트(EDTA) 또는 이들의 조합을 들 수 있다. 발효 혼합물(16)의 열처리 동안에 세정제를 첨가하는 경우, 열처리를 80℃와 95℃ 사이의 온도에서 실시할 수 있다.

바이오매스로부터 PHA를 분리하기 위한 추출 단계(18)를 클로로포름, 염화메틸렌 및/또는 1,2-디클로로에탄과 같은 염소화 용매를 사용하여 실시할 수 있다. 이들 염소화 용매와 기타 용매의 조합을 또한 추출용으로 사용할 수 있다. 이어서, 용매의 증발에 의해, 또는 아세톤 또는 알코올(예를 들어 메탄올 또는 에탄올)과 같은 극성 용매를 첨가함으로써 중합체의 침전에 의해 추출된 PHA를 용매로부터 분리할 수 있다. 대안적으로, 비-PHA 세포성 물질을 알칼리 화합물과 같은 상이한 화합물질 및 상기에 인용된 세정제를 사용하여 분해할 수 있다. PHA를 회수하기 위한 세정제 기반 방법은, 세정제가 실질적으로 PHA를 온전하게 유지하면서 세포 성분을 파쇄할 수 있다는 점에서 용매 기반 추출과는 상이하다.

세포 파쇄를 개시하는 다른 방법은, 예를 들어 상업적으로 이용 가능한 20 kHz와 40 kHz 주파수 사이에서 작동하는 장치를 사용함으로써 초음파 처리를 사용하는 것이다. 일부 구현예에서, 발효 혼합물(16)에는 열처리 이전 열처리 동안 또는 열처리 이후에 초음파 처리를 할 수 있다. 일부 구현예에서, 열처리된 발효 혼합물에 초음파 처리를 하여 세포를 추가로 분쇄하고, PHA를 배지 내로 방출한다. 초음파 처리를 수분 동안, 예를 들어 1분과 30분 사이 동안 실시할 수 있다. 일부 구현예에서, 초음파 처리를 2분 내지 5분 동안 또는 3분 동안 실시할 수 있다.

일부 구현예에서, 추출 단계(18)는 발효 혼합물에 산화제를 첨가하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 산화제는 과산화물, 차아염소산염 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 차아염소산염은 1%와 5%(w/v) 사이의 농도로 사용될 수 있는 차아염소산나트륨을 포함한다. 일부 구현예에서, 과산화물은 1%와 5%(v/v) 사이의 농도로 사용될 수 있는 과산화수소를 포함한다. 일부 구현예에서, 과산화수소 이전에 차아염소산나트륨을 사용한다. 산화제의 사용으로 인해 발효 혼합물의 탈색이 용이하게 될 수 있으며, 이는 이어서 PHA의 탈색을 초래할 수 있는 것으로 이해된다. 일부 구현예에서, 산화적 처리를 열처리 단계 이후에 실시한다. 일부 구현예에서, 산화 단계를 초음파 처리 단계 이후에 실시한다.

일부 구현예에서, 추출 단계(18)는 원심 분리를 포함할 수 있다. 예를 들어, 원심 분리를 열처리 이후, 초음파 처리 단계 이후 및/또는 산화적 처리들 중 1회 이후에 실시할 수 있다. 일부 구현예에서, 추출 공정은 수회의 원심 분리 단계를 포함한다. 예를 들어, 원심 분리 단계를 열처리 단계와 초음파 처리 단계 사이, 초음파 처리 단계와 차아염소산나트륨 처리 단계 사이, 및/또는 차아염소산나트륨 처리 단계와 과산화수소 처리 단계 사이에 실시할 수 있다.

건조 단계

PHA를 포함하는 추출 혼합물은, 예를 들어 분무 건조에 의해 건조할 수 있다.

실시예

실시예 1

한편으로는 합성 배지(글루코오스)를 사용하고 다른 한편으로는 글루코오스로 강화된 멸균된 펄프 및 제지 공장 활성 슬러지(PPMAS)를 사용하여 PHA 생산 미생물의 성장을 비교하기 위해 실험을 실시하였다.

제1 및 제2 사전 접종물을 제조함으로써 실험을 시작하였다. 광물 배지 한천 플레이트로부터 얻어진 PHA 생산 미생물을 (증류수 1 ℓ 당) 20 g의 글루코오스, 6.0 g의 인산수소나트륨 12수화물(Na₂HPO₄ㅇ12H₂O), 2.4 g의 인산이수소칼륨(KH₂PO₄), 1.0 g의 염화암모늄(NH₄Cl) 및 0.50 g의 황산마그네슘 7수화물(MgSO₄ㅇ7H₂O)을 함유하는 광물 배지(MM) 또는 합성 배지(SM) 브로스(broth)에 접종함으로써 제1 사전 접종물을 제조하였다. 인산염(Na₂HPO₄ㅇ12H₂O, KH₂PO₄) 및 염화암모늄을 글루코오스와 함께 멸균하였으며, 그 동안에 MgSO₄ㅇ7H₂O를 121℃에서 15분 동안 별도로 고압 멸균(autoclaving)하고, 이들 용액을 냉각 이후에 무균 상태로 혼합하였다. 배지의 pH를 pH 6.8로 유지하였으며, 사전 접종물을 30℃에서 24시간 동안 150 rpm으로 진탕하면서 유지하였다. 주어진 모든 실시예에서는 사전 접종물 1에 대해 동일한 조성 및 배양 조건을 따랐다.

이 시간 이후, 2% 내지 10%(v/v)의 사전 접종물을 a) 합성 배지(글루코오스; 10 g/ℓ) 및 b) 슬러지(10 g/ℓ의 글루코오스로 보강된 SS(현탁된 고형물) 배지(제2 사전 접종물; 10 g/ℓ) 각각으로 전달하였다. 기타 광물 조성은 제1 사전 접종물 배지와 동일하였다. 또한, 제2 사전 접종물을 30℃에서 24시간 동안 150 rpm으로 유지하였으며, 그 이후에 2% 내지 10%(v/v)의 제2 사전 접종물을 1 ℓ 삼각 진탕 플라스크 내의 200 ㎖의 생산 배지 내로 전달하였다. 생산 배지의 조성은 15 g/ℓ의 SS가 슬러지 생산 배지에서 사용되고, 슬러지 및 합성 생산 배지 둘 모두의 경우에 사용되는 글루코오스 농도가 20 g/ℓ라는 것을 제외하고는 제2 사전 접종물 배지와 동일하였다. PHA 생산을 위한 생산 배지의 배양은 30℃에서 96시간 동안 150 rpm으로 수행하였다. 박테리아 발효로부터 얻어진 샘플을 24시간 마다 취하여 CFU(콜로니 형성 단위)를 측정하였다.

미생물 성장은 슬러리의 첨가가 없는 합성 배지와 비교할 때 멸균된 PPMAS(펄프 및 제지 공장 활성 슬러지)를 기질로서 사용한 로그 주기는 1회 이상이었다(결과는 도 5에 요약되어 있음).

실시예 2

다양한 파라미터를 변경하기 위해 진탕 플라스크에서 다양한 실험을 수행하였으며, 세척된 슬러지 및 세척되지 않은 슬러지에 대한 미생물 성장과 PHA 생산의 비교를 실시하였다. 수산화나트륨(NaOH)의 투여량의 추가적인 변경은 슬러지 고형물의 최대 가용화를 위해 이루어졌다. SS 농도가 성장 및 PHA 생산에 미치는 효과를 조사하기 위해 선택된 NaOH 투여량을 추가로 적용하였다.

세척(컨디셔닝)된 슬러지 및 세척되지 않은 슬러지(추가의 탄소 공급원 및 광물의 보강이 없음)를 사용한 PHA 생산: 슬러지 매트릭스의 미확인 성분은 PHA의 바이오매스 성장 및 축적을 합리적으로 억제할 수 있다. PHA 축적 동안에 매우 제한된 양의 영양분이 요구되고, 영양분이 활성 슬러지 고형물 내에 함침되어 있다는 가정 하에, 슬러지를 원심 분리하고, 이렇게 얻어진 상층액을 폐기하였으며, 슬러지 바이오매스(또는 원심 분리된 펠릿)를 수돗물에 재현탁하여 PHA 축적을 위한 기질(부분 탄소 및 영양분 공급원)로서 사용하였다(컨디셔닝된 슬러지). 따라서, 미생물 성장 및 PHA 축적에 미치는 이들의 효과를 연구하기 위해 다양한 현탁된 고형물 농도의 세척되지 않은 슬러지(10 g/ℓ, 15 g/ℓ, 20 g/ℓ, 25 g/ℓ 및 30 g/ℓ) 및 세척된 슬러지(15 g/ℓ, 20 g/ℓ, 25 g/ℓ, 30 g/ℓ 및 35 g/ℓ)를 사용하여 슬러지 생산 배지를 제조하였다. 슬러지 현탁된 고형물을 121℃에서 30분 동안 멸균하였다. 멸균 이후, 현탁된 고형물을 실온까지 냉각하도록 하였으며, 그 이후에 멸균 조건 하에 pH를 4 N NaOH(수산화나트륨) 또는 H₂SO₄(황산)을 사용하여 pH 6.8로 조절하였다. 모든 진탕 플라스크에는 생산 배지(추가의 탄소 공급원 및 광물의 보강 없이 다양한 SS 농도의 세척된 슬러지 및 세척되지 않은 슬러지)와 동일한 방식으로 제조되고 30℃에서 96시간 동안 150 rpm으로 배양하기 위해 유지된 예비 배양액-2의 2% 내지 10%(v/v) 접종물과 함께 배양하였다.

15 g/ℓ의 SS을 갖는 세척된 슬러지를 사용하여 최대 세포 성장 및 PHA 함량을 수득하였다(표 2). 또한, 기타 SS 값에 의해 비슷한 PHA 함량이 얻어지게 된다.

성장 및 PHA 생산용으로 사용된 세척된 슬러지 및 세척되지 않은 슬러지 사이의 비교(결과는 추가의 탄소 공급원 및 광물의 보강 없이 발효 48시간에 제공됨)

초기 SS 농도(g/ℓ)	세척되지 않은 슬러지			세척된 슬러지
초기 SS 농도(g/ℓ)	최종 SS 농도(g/ℓ)	CFU/㎖	PHA 함량(%(w/w))	최종 SS 농도(g/ℓ)	CFU/㎖	PHA 함량(%(w/w))
10	6.9	4.90E+09	4.23	5.9	5.40E+10	4.6
15	11.3	4.40E+09	7.75	12.1	5.80E+10	11.46
20	15.66	5.10E+09	9.92	15.8	7.90E+10	10.92
25	22.27	5.60E+09	9	18.1	6.90E+10	7.31

슬러지의 전처리를 위한 알카리(수산화나트륨) 투여: 전처리 공정의 목적은 리그노셀룰로오스 물질의 주요 성분을 분획화하여 최대 슬러지 고형물을 용해하고 세포를 용균하는 것이며, 이는 성장하는 미생물에 의해 사용될 수 있는 영양분의 방출을 초래한다. 따라서, 이러한 실험에서 10 g/ℓ 및 30 g/ℓ의 현탁된 고형물 농도를 사용하였으며, 다양한 투여량의 수산화나트륨(현탁된 고형물 1 g 당 0.05 g, 0.07 g, 0.09 g, 0.11 g 및 0.13 g의 NaOH)으로 처리하였다. 그 이후, 슬러지를 121℃에서 30분 동안 멸균하였다. 10 ㎖의 샘플을 취하여 각각의 플라스크에 대해 현탁된 고형물 농도를 측정하였다. 추가의 실험을 위해 최대 슬러지 고형물이 용해되는 수산화나트륨의 투여량을 선택하였다.

10 g/ℓ(처리 후 최종 SS 농도: 4.1 g/ℓ) 및 30 g/ℓ(처리 후 최종 SS 농도: 11.3 g/ℓ)의 SS에 대한 최대 슬러지 가수분해는 SS 1 g 당 0.13 g의 NaOH에서 수득되었다.

PHA 생산을 위한 현탁된 고형물 농도: 지방족 산, 페놀 화합물(phenolics) 및 퓨란 유도체와 같은 다양한 억제제를 수산화나트륨 처리 동안에 방출할 수 있으며, 이는 미생물 성장 및 PHA 축적을 억제할 수 있다. SS 농도가 높을수록 수산화나트륨을 사용한 전처리 동안에 보다 많은 양의 억제제가 방출될 것이기 때문에 현탁된 고형물의 농도가 증가함에 따라 억제제도 증가할 수 있으며, 이는 성장뿐만 아니라 PHA 축적에도 직접적으로 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 다양한 농도(10 g/ℓ, 15 g/ℓ, 20 g/ℓ, 25 g/ℓ 및 30 g/ℓ)의 SS의 전처리는 NaOH를 SS 1 g 당 0.133 g의 NaOH 농도로 이용하여 실시하였다. 121℃에서 30분 동안 슬러지를 멸균한 후, 전처리된 현탁된 고형물이 실온에서 멸균 조건 하에 있게 되었으며, pH를 4 N H₂SO₄를 사용하여 pH 6.8로 조절하였다. 모든 진탕 플라스크에는 생산 배지(추가의 탄소 공급원 및 광물의 보충 없는 다양한 SS 농도)와 동일한 방식으로 제조된 예비 배양액-2의 2% 내지 10%(v/v)로 접종하였다. 플라스크를 30℃에서 96시간 동안 150 rpm으로 배양하기 위해 방치하였으며, 현탁된 고형물 농도, CFU(콜로니 형성 단위) 및 PHA 농도에 대해 샘플을 분석하였다.

세척된 슬러지를 다양한 SS 농도로 알칼리 처리(SS 1 g 당 0.133 g의 NaOH)한 이후, 현탁된 고형물 농도는 15 g/ℓ, 20 g/ℓ, 25 g/ℓ 및 30 g/ℓ에서 4.7 g/ℓ, 5.0 g/ℓ, 8.0 g/ℓ 및 13 g/ℓ로 각각 감소하였다. 바이오매스(9.67%(w/w))의 PHA 함량은 24시간 동안 15 g/ℓ의 SS 농도를 사용하는 경우 최대였다. 그러나, 수득된 PHA 함량(9.67%(w/w))은 열처리된 세척된 슬러지(11.46%(w/w))만을 동일한 SS 농도로 사용함으로써 수득된 것과 비교할 때보다 낮았다. 알칼리 처리를 사용한 PHA 축적 감소는 가수분해 동안에 독성 성분의 형성에서 기인할 수 있다.

실시예 3

수산화나트륨을 사용한 슬러지의 가수분해 동안에 방출된 독성 물질은 PHA 축적을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 슬러지 가수분해 동안에 생성된 억제 성분을 감소시키기 위해 석회 또는 수산화칼슘 처리를 사용하였다.

다양한 투여량의 수산화칼슘(현탁된 고형물 1 g 당 0.05 g, 0.07 g, 0.09 g, 0.11 g 및 0.13 g의 Ca(OH)₂)을 15 g/ℓ의 SS 농도의 세척된 슬러지에 첨가하여 상이한 플라스크에 넣었다. 슬러지의 멸균 이후, 글루코오스(20 g/ℓ), 염화암모늄(1 g/ℓ) 및 광물을 각각의 플라스크에 보충하였다(실시예 1과 동일한 조성). 4 N 황산을 사용하여 pH를 pH 6.8로 조절하고, 2% 내지 10%(v/v)의 예비 배양액-2(생산 배지와 동일한 조성 및 예비 배양액을 24시간 동안 성장시킬 것임)를 사용함으로써 접종을 수행하였으며, 그 이후에 30℃에서 96시간 동안 150 rpm으로 배양을 수행하였다. 바이오매스 농도(g/ℓ)에 대해 24시간 마다 샘플을 취하였으며, 당류 소비량(g/ℓ), CFU 및 PHA 농도(g/ℓ)는 감소하였다.

SS 1 g 당 0.11 g의 수산화칼슘이 최대 세포 성장 및 PHA 축적을 허용하는 것으로 밝혀졌다. 진탕 플라스크에서 PHA 농도는 1.10 g/ℓ(NaOH-처리된 슬러지를 사용함)에서 4.45 g/ℓ(수산화칼슘 해독을 사용함)까지 증가하였다. 하기 표 3에서 알 수 있는 바와 같이, 기타 수산화칼슘 농도로 인해 NaOH 대조군과 비교하여 높은 세포 성장 및 PHA 축적이 이루어졌다.

다양한 투여량의 수산화칼슘(해독용)을 사용한 세척(컨디셔닝)된 슬러지의 전처리 및 전처리된 슬러지(추가의 탄소 공급원 및 광물의 보강 있음)에서의 PHA의 생산

세척된 슬러지 SS(15 g/ℓ)	CFU/㎖)	SS(g/ℓ)	PHA(%)	PHA(g/ℓ)
대조군(슬러지 없음; 글루코오스를 사용한 합성 배지)	9.10E+11	2.95	46.72	1.38
대조군: NaOH(SS 1 g 당 0.133 g)-처리된 세척된 슬러지	9.60E+12	10.9	8.91	0.97
Ca(OH)₂(SS 1 g 당 0.09 g)-처리된 세척된 슬러지	8.00E+12	15.32	17.42	2.67
Ca(OH)₂(SS 1 g 당 0.11 g)-처리된 세척된 슬러지	7.80E+12	15.45	30.82	4.76
Ca(OH)₂(SS 1 g 당 0.13 g)-처리된 세척된 슬러지	7.40E+12	14.99	20.44	3.06
Ca(OH)₂(SS 1 g 당 0.15 g)-처리된 세척된 슬러지	5.80E+11	14.56	15.91	2.32

실시예 4

추가의 탄소 공급원으로서 글루코오스가 보강되고 멸균(유가식 발효) 이전에 수산화칼슘으로 처리된 슬러지를 사용하여 PHA를 생산하기 위해 실험을 수행하였다.

순수한 박테리아 배양액과 함께 펄프 및 제지 활성 슬러지(PPAS)를 사용하여 PHA 축적의 안정성 및 일관성을 확인하기 위해 5 ℓ 또는 7 ℓ 발효기에서 유가식 발효를 실시하였다. PHA 축적을 증가시키기 위해 글루코오스(순수한 탄소 기질)를 추가의 탄소 기질로서 사용하였다.

진탕 플라스크 실험으로부터 얻어진 15 g/ℓ의 현탁된 고형물 농도를 본 연구에 사용하였으며, 멸균 이전에 Ca(OH)₂를 SS 1 g 당 0.11 g의 수산화칼슘 농도로 세척된 슬러지에 첨가하였다. 슬러지의 멸균 이후, 배지에 멸균된 글루코오스 및 광물을 무균 조건 하에 보충하였다. 재킷(jacket)을 통해 물을 순환시킴으로써 온도를 30℃로 유지하였다. 4 N 황산 및 4 N NaOH를 사용함으로써 발효 pH를 컴퓨터-제어 연동 펌프를 통해 pH 6.8±0.1로 자동적으로 제어하였다. DO 및 pH 둘 모두를 폴라로그래프 용존 산소 탐침 및 pH 센서(메틀러-톨레도(Mettler-Toledo); 미국)에 의해 연속적으로 각각 모니터링하였다.

30℃에서 24시간 동안 150 rpm으로 배양한 예비 배양액-2(낮은 SS 농도(10 g/ℓ) 및 글루코오스 농도(10 g/ℓ)를 사용하였다는 것을 제외하고 생산 배지와 동일한 조성)를 슬러지 생산 배지로 옮겼다. 동일한 농도의 질소 및 광물을 0시간, 12시간 및 24시간 동안 보충하는 반면, 24시간 후에는 낮은 농도의 광물 및 질소를 발효 기간 내내 보충하였다(36시간, 42시간, 60시간, 72시간 및 84시간에 5회 공급). 슬러지 생산 배지 및 공급 용액의 조성은 표 4에 나타나 있다. 발효 기간 전체의 소비량을 기준으로 글루코오스 공급을 수행하였다.

발효기용 생산 배지 및 공급 용액의 조성

성분	농도(g/ℓ)
성분	생산 배지 (0시간)	공급 용액 1(12시간 및 24시간에 공급)	공급 용액 2(24시간, 36시간, 48시간, 60시간, 72시간, 84시간에 공급)
컨디셔닝 및 Ca(OH)₂-처리된 슬러지(g/ℓ)	15	-	-
글루코오스 또는 조질의 글리세롤 용액(탄소 당량)(g/ℓ)	20.0	10.0	10.0
NH₄Cl(g/ℓ)	1.00	1.00	0.20
Na₂HPO₄ㅇ12H₂O(g/ℓ)	6.00	6.00	0.50
KH₂PO₄(g/ℓ)	2.40	2.40	0.20
MgSO₄ㅇ7H₂O(g/ℓ)	0.50	0.50	0.04

컨디셔닝 및 Ca(OH)₂-처리된 멸균된 슬러지(SS 농도: 15 g/ℓ)는 86.5%(w/w)의 최대 PHA 함량, 51.97 g/ℓ의 바이오매스 농도 및 44.97 g/ℓ의 PHA 농도를 나타냈다(도 6에 나타나 있는 바와 같음). 상이한 기간에 수집된 PPMAS를 사용하여 동일한 실험을 반복하였으며, 결과는 재생 가능하였는데, 여기에는 선행 기술의 기법에서의 PHA 축적의 불일치 또는 가변성의 전형적인 문제점을 다루고 있다.

게다가, 글루코오스로 보강된 슬러지를 사용하여 소비된 글루코오스 1 g 당 PHA의 0.60 g의 높은 PHA 수율(소비된 탄소 1 g 당 PHA 1.5 g)을 달성하였다. 그러나, 슬러지의 첨가 없이 글루코오스만을 기질로서 사용하여 소비된 글루코오스 1 g 당 PHA의 0.36 g의 낮은 PHA 수율(소비된 탄소 1 g 당 PHA 0.9 g)을 달성하였다(표 5).

기질로서 글루코오스로 보강된 슬러지에 대한 PHA 수율과 글루코오스 단독에 대한 PHA 수율의 비교

기질	SS (g/ℓ)	PHA(%(w/w))	PHA (g/ℓ)	총 글루코오스 소비량 (g/ℓ)	총 탄소 소비량 (g/ℓ)	전체 PHA 수율(소비된 글루코오스 1 g 당 PHA의 양(g))	전체 PHA 수율(소비된 탄소 1 g 당 PHA의 양(g))	인용문헌
글루코오스	31.5	89.1	28.07	77	30.8	0.36	0.91	본 출원
글루코오스 + 슬러지(초기 SS: 15 g/ℓ)	51.9	86.5	44.97	75	30	0.60	1.50	본 출원
글루코오스						0.32	0.8	Nonato et al., 2001; Mozumder et al., 2014

실시예 5

조질의 글리세롤(표 6의 조성)을 추가의 탄소 공급원으로 함유하는 고함량 비누(high soap)로 보강되고 멸균 전에 수산화칼슘으로 처리된 슬러지를 사용하여 PHA를 생산하기 위해 실험을 수행하였다.

조질의 글리세롤 용액의 특성 분석

시험	조질의 글리세롤 용액
pH	9.36
밀도	5.2 g/5 ㎖ 또는 1.04 g/㎖
메탄올 함량	30%(w/v)
물 함량	30.43%(w/v)
촉매	0.66%(w/v)
글리세롤 농도	160 g/ℓ 또는 (16%(w/v))
비누 함량	280 g/ℓ(또는) (28%(w/v))

15 g/ℓ의 SS 농도를 갖는 컨디셔닝(세척)되지 않은 슬러지 및 컨디셔닝(세척)된 슬러지를 2개의 상이한 발효기 내에서 사용하였다. 멸균 전에 슬러지(흰자작나무 펄프 및 제지 산업으로부터 수집됨; 캐나다 퀘벡 시) 내에 SS 1 g 당 Ca(OH)₂를 0.11 g의 농도로 첨가하였다. 슬러지의 멸균 이후, 배지에는 멸균된 조질의 글리세롤 용액(8 g의 탄소/ℓ) 및 광물을 무균 조건 하에 보충하였다.

30℃에서 24시간 동안 150 rpm으로 배양한 예비 배양액-2(낮은 SS 농도(10 g/ℓ) 및 조질의 글리세롤 농도(4 g의 탄소/ℓ)를 사용하였다는 것을 제외하고 생산 배지와 동일한 조성)를 슬러지 생산 배지로 옮겼다. 동일한 농도의 질소 및 광물을 0시간, 12시간 및 24시간 동안 보충하는 반면, 24시간 후에는 낮은 농도의 광물 및 질소를 발효 기간 내내 보충하였다(36시간, 42시간, 60시간, 72시간 및 84시간에 5회 공급). 슬러지 생산 배지 및 공급 용액의 조성은 표 4에 나타나 있다. 발효 기간 전체의 글리세롤 및 비누의 소비량을 기준으로 조질의 글리세롤 용액의 공급을 수행하였다.

15 g/ℓ의 초기 SS 농도를 갖는 컨디셔닝된 슬러지를 사용하여 41.2 g/ℓ의 최대 바이오매스 농도를 72.1%(w/w)의 PHA 함량 및 29.7 g/ℓ의 PHA 농도와 함께 달성하였다(도 7에 나타나 있는 바와 같음). 그러나, 15 g/ℓ의 초기 SS 농도를 갖는 컨디셔닝되지 않은 슬러지를 사용하여 38.9 g/ℓ의 바이오매스 농도를 55.7%(w/w)의 PHA 함량 및 21.9 g/ℓ의 PHA 농도와 함께 달성하였다(도 8에 나타나 있는 바와 같음). 이들 결과에 따르면 슬러지 세척 동안에 독성 화합물을 제거한 이후에 PHA 함량 및 PHA 농도가 17% 및 8 g/ℓ로 각각 증가함에 따라 슬러지 세척이 PHA 축적에 영향을 미치는 것으로 나타난다.

조질의 글리세롤로 보강된 컨디셔닝된 슬러지를 사용한 실험에서 소비된 탄소 1 g 당 PHA의 0.98 g의 높은 PHA 수율(비누 및 글리세롤 둘 모두)을 달성하였다. 그러나, 슬러지의 첨가 없이 조질의 글리세롤만을 기질로서 사용한 실험에서 소비된 탄소 1 g 당 PHA의 0.73 g의 낮은 PHA 수율(비누 및 글리세롤 둘 모두)을 달성하였다(표 7).

기질로서 조질의 글리세롤로 보강된 슬러지에 대한 PHA 수율과 조질의 글리세롤 단독에 대한 PHA 수율의 비교

기질	SS (g/ℓ)	PHA (%(w/w))	PHA (g/ℓ)	총 기질 소비량(글리세롤 + 비누 (g/ℓ))	총 탄소 소비량 (g/ℓ)	전체 PHA 수율(소비된 탄소 1 g 당 PHA의 양(g))	인용문헌
조질의 글리세롤	30.7	75.7	23.24	58.3	31.99	0.73	본 출원
조질의 글리세롤 + 슬러지(초기 SS: 15 g/ℓ)	41.2	72.1	29.71	55.5	30.44	0.98	본 출원
조질의 글리세롤						0.56	Paula et al., 2017

실시예 6

보다 높은 SS 농도를 갖고 멸균 이전에 수산화칼슘으로 처리된 슬러지를 사용하여 PHA를 생산하기 위해 실험을 수행하였다.

25 g/ℓ의 높은 SS 농도를 갖는 컨디셔닝된 슬러지를 사용하였으며, 멸균 이전에 슬러지 내에 SS 1 g 당 수산화칼슘을 0.11 g의 농도로 첨가하였다. 슬러지의 멸균 이후, 배지에는 멸균된 조질의 글리세롤 용액(8 g의 탄소/ℓ; 표 6에서의 조성) 및 광물을 무균 조건 하에 보충하였다.

30℃에서 24시간 동안 150 rpm으로 배양한 예비 배양액-2(낮은 SS 농도(10 g/ℓ) 및 조질의 글리세롤 농도(4 g의 탄소/ℓ)를 사용하였다는 것을 제외하고 생산 배지와 동일한 조성)를 슬러지 생산 배지로 옮겼다. 동일한 농도의 질소 및 광물을 0시간, 12시간 및 24시간 동안 보충하는 반면, 24시간 후에는 낮은 농도의 광물 및 질소를 발효 기간 내내 보충하였다(36시간, 42시간, 60시간, 72시간 및 84시간에 5회 공급). 슬러지 생산 배지 및 공급 용액의 조성은 표 4에 나타나 있다. 발효 기간 전체의 소비량을 기준으로 조질의 글리세롤 용액의 공급을 수행하였다.

높은 고형물 농도를 갖는 컨디셔닝된 슬러지는 48.7 g/ℓ의 바이오매스 농도, 68%(w/w)의 PHA 함량 및 33.2 g/ℓ의 PHA 농도를 나타냈으며, 이때 소비된 탄소 1 g 당 PHA의 0.86 g의 PHA 수율(비누 및 글리세롤 둘 모두)이 얻어졌다(도 9에 나타낸 바와 같음).

바이오매스 및 PHA 농도는 보다 낮은 SS 농도(15 g/ℓ)를 사용함으로써 달성된 것과 비교할 때 25 g/ℓ의 초기 SS 농도를 사용하는 경우 보다 높았다. 발효 공정에서 높은 농도의 고형물이 사용되면 궁극적으로 특정 식물에 의해 생성되는 소정량의 슬러지를 가공하는데 요구되는 발효기의 부피가 감소할 수 있다. 이는 이어서 PHA의 구축 비용을 감소시킨다.

실시예 7

추가의 탄소 공급원으로서 아세트산으로 보강되고 멸균 이전에 수산화칼슘으로 처리된 컨디셔닝된 슬러지를 사용하여 PHA를 생산하기 위해 실험을 수행하였다.

또한, pH stat 유가식 전략을 사용하여 슬러지와 함께 추가의 탄소 기질로서 아세트산을 연구하였다. 발효기 내부의 브로스의 pH가 pH 6.8에서 pH 6.85으로 증가(pH 0.05씩 변화)할 때마다 내산 펌프(acid pump)를 사용하여 아세트산을 발효기 내로 자동적으로 공급하였다. 조질의 글리세롤 용액을 사용하여 아세트산을 사용한 모든 실험을 위한 예비 배양액 2을 제조하였다. 25 g/ℓ의 SS 농도를 갖는 컨디셔닝된 펄프 및 제지 슬러지를 사용하였으며, 멸균 이전에 슬러지 내에 Ca(OH)₂를 SS 1 g 당 0.11 g의 수산화칼슘 농도로 세척된 슬러지에 첨가하였다. 슬러지의 멸균 이후, 배지에 광물을 무균 조건 하에 보충하였다. 30℃에서 24시간 동안 150 rpm으로 배양한 예비 배양액-2(낮은 SS 농도(10 g/ℓ) 및 조질의 글리세롤 농도(4 g의 탄소/ℓ)(표 6에 나타나 있는 조성)를 사용한다는 것을 제외하고 생산 배지와 동일한 조성)를 슬러지 생산 배지로 옮겼다. 동일한 농도의 질소 및 광물을 0시간, 12시간 및 24시간 동안 보충하는 반면, 24시간 후에는 낮은 농도의 광물 및 질소를 발효 기간 내내 보충하였다(36시간, 42시간, 60시간, 72시간 및 84시간에 5회 공급). pH 기반의 유가식 전략에 기초하여 아세트산을 발효기에 자동적으로 첨가하였다.

25 g/ℓ의 초기 SS 농도를 갖는 컨디셔닝된 슬러지를 사용하여 44.7 g/ℓ의 최대 바이오매스 농도를 68%(w/w)의 PHA 함량 및 30.5 g/ℓ의 PHA 농도와 함께 달성하였다(도 10에 나타나 있는 바와 같음). 컨디셔닝된 슬러지 및 아세트산을 추가의 탄소 기질로서 사용함으로써 소비된 아세트산 1 g 당 PHA의 0.60 g의 높은 PHA 수율(소비된 탄소 1 g 당 PHA 1.5 g)을 달성하였다.

소비된 탄소 기질(아세트산, 부티르산, 숙신산 및 프로피온산)의 혼합물 1 g 당 PHA의 0.2 g의 비교적 낮은 PHA 수율이 문헌[Chakraborty et al., 2012]에 보고된 바 있었다. 유(Yu) 등(2002)에 의한 다른 연구에서, 소비된 탄소 기질(아세트산, 부티르산 및 프로피온산)의 혼합물 1 g 당 PHA의 0.39 g의 평균 PHA 수율이 보고된 바 있었다.

실시예 8

다양한 펄프 및 제지 산업으로부터 수집된 컨디셔닝되지 않은 슬러지를 사용하여 실험을 수행하였다.

슬러지의 조성을 식물마다 달라진다. 이러한 일련의 실험에서, 알마(Alma) 및 돌보(Dolbeau)와 같은 다양한 펄프 및 제지 산업으로부터 펄프 및 제지 슬러지를 수집하였다. 슬러지는 산업 내부에서 사용되는 공정의 시간 및 특성에 따라 변경되는 것으로 간주되고 있다. 게다가, 폐수 중에서 슬러지 미생물 군집은 유기 공급 부하, 화학 첨가, 작동 SRT, HRT, 온도 및 pH의 변화 등과 같은 공정 스트림에서의 변화에 민감하여 PHA 함량을 변경하다. 또한, 슬러지 조성이 산업에 따라 달라질 것이라는 가설이 있을 수 있다. 따라서, 본 단락에서는 공정의 지속 가능성을 확인하기 위해 다양한 산업으로부터 수집된 펄프 및 제지 슬러지를 사용한 PHA 생산을 위해 확립된 방법을 사용하였다.

상이한 실험에서 멸균 이전에 Ca(OH)₂를 SS 1 g 당 0.11 g의 수산화칼슘 농도로 세척되지 않은 알마 및 돌보 슬러지 내로 첨가하였다. 슬러지의 멸균 이후, 배지에는 멸균된 조질의 글리세롤 용액(8 g의 탄소/ℓ)(표 6에 나타나 있는 조성) 및 광물을 무균 조건 하에 보충하였다.

30℃에서 24시간 동안 150 rpm으로 배양한 예비 배양액-2(낮은 SS 농도(10 g/ℓ) 및 조질의 글리세롤 농도(4 g의 탄소/ℓ)(표 6에 나타나 있는 조성)를 사용한다는 것을 제외하고 생산 배지와 동일한 조성)를 슬러지 생산 배지로 옮겼다. 동일한 농도의 질소 및 광물을 0시간, 12시간 및 24시간 동안 보충하는 반면, 24시간 후에는 낮은 농도의 광물 및 질소를 발효 기간 내내 보충하였다(36시간, 42시간, 60시간, 72시간 및 84시간에 5회 공급). 슬러지 생산 배지 및 공급 용액의 조성은 표 4에 나타나 있다. 발효 기간 전체의 비누 및 글리세롤의 소비량을 기준으로 조질의 글리세롤 용액의 공급을 수행하였다.

15 g/ℓ의 초기 SS 농도를 갖고 추가의 탄소 기질로서 조질의 글리세롤 용액을 갖는 알마의 세척되지 않은 슬러지는 40.12 g/ℓ의 최대 바이오매스 농도와 53.45 %(w/w)의 바이오매스 PHA 함량 및 21.44 g/ℓ의 PHA 농도를 나타냈다. 돌보의 세척되지 않은 슬러지에 대한 발효 공정의 유사한 조건 하에서의 유사한 실험 연구에서, 41.32 g/ℓ의 최대 바이오매스 농도를 55.2 %(w/w)의 PHA 함량 및 22.8 g/ℓ의 PHA 농도와 함께 달성하였다. 이들 결과는 유사한 발효 조건 하에 흰자작나무 펄프 및 제지 산업의 세척되지 않은 슬러지를 사용함으로써 수득된 결과와 유사하였다. 3개의 상이한 펄프 및 제지 산업의 폐수 처리장으로부터 수집된 슬러지를 사용하여 수득된 결과로부터 자명한 것은, 슬러지의 조성이 순수한 배양 공정을 사용한 PHA 생산에 영향을 미치지 않는다는 것이며, 이는 혼합 배양액을 사용한 PHA 생산이 갖는 주요 장애물이다.

실시예 9

대규모 150 ℓ 발효기를 사용하여 PHA를 생산하기 위해 실험을 수행하였다.

또한 개발된 공정의 일관성을 확인하기 위해 추가의 탄소 기질로서 돌보 및 조질의 글리세롤로부터 수득된 컨디셔닝되지 않은 슬러지(디캔테이션 없음)를 이용하여 150 ℓ(총 부피) 발효기에서 PHA 생산을 실시하였다.

30℃에서 24시간 동안 150 rpm으로 배양한 예비 배양액-2(낮은 SS 농도(10 g/ℓ) 및 조질의 글리세롤 농도(4 g의 탄소/ℓ)를 사용하였다는 것을 제외하고 생산 배지와 동일한 조성)를 예비 배양액 3(낮은 SS 농도(10 g/ℓ) 및 조질의 글리세롤 농도(4 g 탄소/ℓ)를 사용하였다는 것을 제외하고 생산 배지와 동일한 조성: 표 6에 나타나 있는 조성)으로 옮겼으며, 배양 조건은 예비 배양액 2와 동일하였다. 24시간 후, 예비 배양액 3을 100 ℓ의 작업 부피를 갖는 150 ℓ 발효기로 옮겼다. 질소 및 광물을 0시간, 12시간 및 24시간 동안 보충하는 반면, 24시간 후에는 낮은 농도의 광물 및 질소를 발효 기간 내내 보충하였다(36시간, 42시간, 60시간, 72시간 및 84시간에 5회 공급). 슬러지 생산 배지 및 공급 용액의 조성은 표 4에 나타나 있다. 발효 기간 전체의 비누 및 글리세롤의 소비량을 기준으로 조질의 글리세롤 용액의 공급을 수행하였다.

15 g/ℓ의 초기 SS 농도를 갖는 컨디셔닝되지 않은 슬러지를 사용하여 40 g/ℓ의 최대 바이오매스 농도를 54%(w/w)의 PHA 함량 및 21.5 g/ℓ의 PHA 농도와 함께 달성하였다. 이들 결과는 15 g/ℓ의 초기 SS 농도를 갖는 컨디셔닝되지 않은 슬러지를 사용하여 5 ℓ 발효기를 사용함으로써 수행한 실험과 유사하였으며, 이는 새로운 PHA 생산 공정의 일관성을 상이한 규모로 보여주는 것이다.

슬러지는 순수한 배양을 위해 단독으로 또는 기타 폐기물 기질(예를 들어, 조질의 글리세롤 등)과 함께 사용될 수 있는 기질인 것으로 나타나 있다. 공정은 혼합 미생물 배양액을 사용한 PHA 생산 동안에 달성되는 PHA 농도의 불일치, 보다 낮은 PHA 함량 및 보다 낮은 PHA 수율의 문제를 적어도 부분적으로 해결할 수 있다. 게다가, 발효 동안에 생산되는 바이오매스 내의 PHA의 높은 농도로 인해 PHA에 대한 추가의 추출 및 정제를 위해 덜 화학적인 처리가 요구된다.

실시예 10

조질의 글리세롤(표 6의 조성)을 추가의 탄소 공급원으로서 함유하는 고함량 비누로 보강되고 멸균 이전에 수산화칼슘으로 처리된 컨디셔닝된 슬러지를 사용함으로써 바이오매스 농도, PHA 농도 및 PHA 수율을 추가로 향상시키기 위해 5 ℓ 발효기에서 실험을 수행하였다. 발효 기간 내내 미생물에 대한 최적의 탄소 농도(배지 1 ℓ 당 조질의 글리세롤 용액의 탄소 8 ± 1 g)를 유지하기 위해 연속 탄소 유가식 전략을 사용하였다.

5 ℓ 발효기에 있어서, 30℃에서 24시간 동안 150 rpm으로 배양한 예비 배양액-2(낮은 SS 농도(10 g/ℓ) 및 조질의 글리세롤 농도(4 g의 탄소/ℓ)를 사용하였다는 것을 제외하고 생산 배지와 동일한 조성)를 슬러지 생산 배지로 옮겼다.

동일한 농도의 질소 및 광물을 0시간, 12시간 및 24시간 동안 보충하는 반면, 24시간 후에는 낮은 농도의 광물 및 질소를 발효 기간 내내 보충하였다(36시간, 42시간, 60시간, 72시간 및 84시간에 5회 공급). 슬러지 생산 배지 및 공급 용액의 조성은 표 8에 나타나 있다.

연속 유가식 발효 전략을 이용한 발효기용 생산 배지 및 공급 용액의 조성

성분	농도(g/ℓ)
	생산 배지 (0시간)	공급 용액 1(12시간 및 24시간에 공급)	공급 용액 2(24시간, 36시간, 48시간, 60시간, 72시간, 84시간에 공급)
컨디셔닝 및 Ca(OH)₂-처리된 슬러지(g/ℓ)	15	-	-
조질의 글리세롤 용액(탄소 당량)(g/ℓ)	20.0	발효기 내에서 탄소를 1 ℓ 당 8 g 의 최적의 탄소 농도로 유지하기 위한 연속 모드
NH₄Cl(g/ℓ)	1.00	1.00	0.20
Na₂HPO₄ㅇ12H₂O(g/ℓ)	6.00	6.00	0.50
KH₂PO₄(g/ℓ)	2.40	2.40	0.20
MgSO₄ㅇ7H₂O(g/ℓ)	0.50	0.50	0.04

유가식 발효 동안, 글리세롤 및 비누의 소비량을 기준으로 조질의 글리세롤 용액을 간헐적으로 첨가하였다. 그러나, 발효 기간 내내 배지 내에서 유지되는 미생물에 대한 최적의 탄소 농도(8 g의 탄소/ℓ)를 제공하기 위해 연속 유가식 전략을 대안적으로 사용할 수 있다. 또한, 연속 유가식 전략은 발효 기간 내내 C/N 비율을 유지하는데 도움이 될 수 있다.

따라서, 0시간에 배지에 조질의 글리세롤 용액(글리세롤 1 ℓ 당 20 g의 탄소와 동일한 탄소 당량 또는 8 g의 탄소/ℓ)을 첨가하였다. 그 이후, (간헐적 유가식 전략 동안에 최적화된 바와 같이 조질의 글리세롤 용액을 요구량으로 첨가하기 위해 연동 펌프의 유량을 조절함으로써) 조질의 글리세롤 용액을 자동적으로 첨가하였다. 간헐적 유가식 전략 동안, 소비량을 기준으로 탄소를 첨가하였으며, 박테리아는 12시간 마다 배지 1 ℓ 당 조질의 글리세롤 용액 중 4 g의 C를 필요로 하였다. 따라서, 연속 유가식 전략에서는 12시간의 기간 동안에 연동 펌프의 유량을 조절함으로써 동일한 양의 탄소를 발효기 내로 천천히 첨가하였다. 이로 인해, 발효 기간 내내 동일한 탄소 농도가 유지된다는 것이 관찰되었다.

따라서, 기질로서 Ca(OH)₂-처리된 PPMAS를 사용하고 추가의 탄소 기질로서 조질의 글리세롤을 사용하는 연속 탄소 유가식 발효 전략을 사용하면 간헐적 탄소 유가식 전략을 이용하여 수득된 41.2 g/ℓ의 바이오매스 농도 및 29.7 g/ℓ의 PHA 농도와 비교할 때 58 g/ℓ의 바이오매스 농도 및 42 g/ℓ의 PHA 농도가 얻어졌다. 또한, 연속 탄소 유가식 발효 전략을 사용하면 간헐적 탄소 유가식 전략을 이용하여 수득된 소비된 탄소 1 g 당 PHA의 0.98 g의 PHA 수율과 비교할 때 소비된 탄소 1 g 당 PHA가 1.17 g의 PHA 수율로 얻어졌다(표 9).

간헐적 탄소 유가식 및 연속 탄소 유가식 발효 전략에 대한 PHA 수율의 비교

기질	SS (g/ℓ)	PHA (%(w/w))	PHA (g/ℓ)	총 기질 소비량(글리세롤 + 비누 (g/ℓ))	총 탄소 소비량 (g/ℓ)	전체 PHA 수율(소비된 탄소 1 g 당 PHA의 양(g))	인용문헌
조질의 글리세롤	30.7	75.7	23.24	58.3	31.99	0.73	본 출원
간헐적 유가식 전략(조질의 글리세롤 + 슬러지(초기 SS: 15 g/ℓ))	41.2	72.1	29.71	55.5	30.44	0.98	본 출원
연속 유가식 전략(조질의 글리세롤 + 슬러지(초기 SS: 15 g/ℓ))	58	72.4	42	60.6	35.80	1.17	본 출원

실시예 11

대규모 150 ℓ 발효기를 사용하여 PHA를 생산하기 위해 실험을 수행하였다. 또한 개발된 공정의 일관성을 확인하기 위해 추가의 탄소 기질(2차 탄소 공급원)로서 돌보 및 조질의 글리세롤로부터 수득된 컨디셔닝된 슬러지를 이용하여 연속 유가식 전략용 150 ℓ(총 부피) 발효기에서 PHA 생산을 실시하였다.

30℃에서 24시간 동안 150 rpm으로 배양한 예비 배양액-2(이의 조성은 낮은 SS 농도(10 g/ℓ) 및 조질의 글리세롤 농도(4 g 탄소/ℓ)를 사용하였다는 것을 제외하고 생산 배지와 동일함)를 예비 배양액 3(이의 조성은 낮은 SS 농도(10 g/ℓ) 및 조질의 글리세롤 농도(4 g 탄소/ℓ)를 사용하였다는 것을 제외하고 생산 배지와 동일함; 표 6에 나타나 있는 조성)으로 옮겼으며, 배양 조건은 예비 배양액 2와 동일하였다. 24시간 후, 예비 배양액 3을 100 ℓ의 작업 부피를 갖는 150 ℓ 발효기로 옮겼다. 질소 및 광물을 0시간, 12시간 및 24시간 동안 보충하는 반면, 24시간 후에는 낮은 농도의 광물 및 질소를 발효 기간 내내 보충하였다(36시간, 42시간, 60시간, 72시간 및 84시간에 5회 공급). 슬러지 생산 배지 및 공급 용액의 조성은 표 8에 나타나 있다.

실시예 10에서 논의된 바와 같은 연속 탄소 유가식 발효 전략에서, 동일한 농도의 탄소를 발효기 내로 천천히 첨가하였다. 고압 멸균기 내에서 조질의 글리세롤 용액을 121℃에서 15분 동안 멸균하고, 실온까지 냉각시켰다. 멸균 조건 하에, 조질의 글리세롤 용액을 층류 공기 흐름으로 멸균 공급 플라스틱 탱크로 전달하였다. 그 이후, 멸균 공급 플라스틱 탱크(탄소 공급 탱크)를 발효기에 연결하였다. 조질의 글리세롤 용액이 함께 혼합되지 않는 비누 및 글리세롤로 이루어져 있다는 사실로 인해, 조질의 글리세롤 용액을 연속적으로 혼합하기 위해 탄소 공급 탱크를 자석 교반기 위에 놓았다. 발효기로의 조질의 글리세롤 용액의 공급 유량은 연동 펌프의 회전 빈도를 5 rpm(17초 마다 켜짐; 60초 동안 켜고 꺼짐)으로 설정함으로써 수동으로 설정하였다. 따라서, 소비량(6시간 마다 글리세롤 및 비누 농도에 대해 샘플을 분석함)을 기준으로, 그리고 시간이 지남에 따른 발효기 내의 발효 브로스의 부피 증가를 고려하여 발효 배지(배양 배지)에서 최적의 탄소 농도(8 ± 1 g의 탄소/ℓ)를 유지하였다. 그 결과, 발효기 내부에 첨가된 조질의 글리세롤 용액의 부피가 증가하였다(간격 시간(켜짐)이 최고 20초까지 증가함).

150 ℓ 발효기에서 연속 유가식 발효 전략에 의해 15 g/ℓ의 초기 SS 농도를 갖는 컨디셔닝된 슬러지를 이용하여 58.4 g/ℓ의 최대 바이오매스 농도를 70 %(w/w)의 바이오매스 PHA 함량 및 40 g/ℓ의 PHA 농도와 함께 달성하였다. 이들 결과는 15 g/ℓ의 초기 SS 농도를 갖는 컨디셔닝된 슬러지를 이용한 5 ℓ 발효기를 사용함으로써 수행된 실험과 유사하였으며, 이는 PHA 생산 공정의 일관성을 상이한 규모로 보여주는 것이다.

Claims

폴리하이드록시알카노에이트(PHA)를 생산하기 위한 공정으로서,
리그노셀룰로오스계 물질을 포함하는 폐기물 스트림을 제공하는 단계;
폐기물 스트림에 칼슘 함유 광물을 첨가하는 단계;
칼슘 함유 광물의 존재 하에 폐기물 스트림을 열처리하여 폐기물 스트림을 멸균하고, 처리된 폐기물 스트림을 수득하는 단계;
처리된 폐기물 스트림을 탄소 공급원으로서 포함하는 배양 배지에서 적어도 하나의 PHA 생산 미생물 균주를 발효시켜 PHA를 생산하는 단계; 및
PHA 생산 미생물로부터 PHA를 추출하는 단계를 포함하는 것인, 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)를 생산하기 위한 공정.
제1항에 있어서, 폐기물 스트림은 펄프 및 제지 활성 슬러지 스트림인 것인 공정.
제1항 또는 제2항에 있어서, 칼슘 함유 광물은 탄산칼슘, 수산화칼슘 및 산화칼슘 중 적어도 하나를 포함하는 것인 공정.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 칼슘 함유 광물은 수산화칼슘을 포함하는 것인 공정.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 칼슘 함유 광물은 석회를 포함하는 것인 공정.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 폐기물 스트림에 칼슘 함유 광물을 첨가하는 단계는 폐기물 스트림을 열처리하기 전에 실시되는 것인 공정.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 폐기물 스트림에 칼슘 함유 광물을 첨가하는 단계는 폐기물 스트림을 열처리하는 동안에 실시되는 것인 공정.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 폐기물 스트림을 열처리하는 단계는 적어도 120℃의 온도에서 실시되는 것인 공정.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 폐기물 스트림에 칼슘 함유 광물을 첨가하기 전에 폐기물 스트림을 여과하여 조대 섬유(coarse fibers)를 제거함으로써 폐기물 스트림 여과액을 수득하는 단계를 더 포함하는 것인 공정.
제9항에 있어서, 폐기물 스트림에 칼슘 함유 광물을 첨가하기 전에 폐기물 스트림 여과액을 침강시켜 여과되지 않은 고형물을 디캔팅(decanting)함으로써 디캔팅된 폐기물 스트림을 수득하는 단계를 더 포함하는 것인 공정.
제10항에 있어서, 폐기물 스트림에 칼슘 함유 광물을 첨가하기 전에 디캔팅된 폐기물 스트림을 세척하여 세척된 고형물을 수득하는 단계를 더 포함하는 것인 공정.
제11항에 있어서, 디캔팅된 폐기물 스트림을 세척하는 단계는 디캔팅된 폐기물 스트림을 원심 분리하여 원심 분리된 고형물을 수득하는 단계를 포함하는 것인 공정.
제12항에 있어서,
원심 분리된 고형물을 수성 배지에 재현탁하여 현탁액을 수득하는 단계; 및
현탁액을 다시 원심 분리하여 원심 분리된 고형물을 수득하는 단계를 더 포함하는 것인 공정.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 폐기물 스트림에 칼슘 함유 광물을 첨가하기 전에,
폐기물 스트림 내의 현탁된 고형물(SS) 농도를 소정의 농도로 조절하여 컨디셔닝(conditioning)된 폐기물 스트림을 수득하는 단계; 및
컨디셔닝된 폐기물 스트림에 칼슘 함유 광물을 첨가하는 단계를 더 포함하며,
이때 폐기물 스트림을 열처리하는 단계는 컨디셔닝된 폐기물 스트림을 열처리하는 단계를 포함하는 것인 공정.
제14항에 있어서, SS 농도를 조절하는 단계는 세척된 고형물에 대해 실시되는 것인 공정.
제14항 또는 제15항에 있어서, 소정의 농도는 5 g/ℓ와 50 g/ℓ 사이인 것인 공정.
제16항에 있어서, 소정의 농도는 10 g/ℓ와 20 g/ℓ 사이인 것인 공정.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 발효 단계 이전 및/또는 동안에 배양 배지에 2차 탄소 공급원을 첨가하는 단계를 더 포함하는 것인 공정.
제18항에 있어서, 2차 탄소 공급원은 카르복실산, 당류, 오일, 알코올 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 공정.
제19항에 있어서, 카르복실산은 아세트산, 프로피온산, 부티르산, 발레르산, 이들의 염 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 공정.
제19항에 있어서, 당류는 글루코오스, 만니톨, 수크로오스 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 공정.
제19항에 있어서, 오일은 올리브 오일, 옥수수 오일, 야자수 오일 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 공정.
제19항에 있어서, 알코올은 글리세롤을 포함하는 것인 공정.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 발효 단계는 폐기물 스트림의 pH를 6.5와 7.5 사이로 유지하고/하거나, 온도를 25℃와 35℃ 사이로 유지하는 단계를 포함하는 것인 공정.
제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 발효 단계 이전 및/또는 동안에 배양 배지에 광물 공급원을 첨가하는 단계를 더 포함하는 것인 공정.
제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 PHA 생산 미생물 균주는 단일 PHA 생산 미생물 균주인 것인 공정.
제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 PHA 생산 미생물 균주는 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium), 코마모나스 테스토스테로니(Comamonas testosteroni), 쿠프리아비두스 네카토르 11599(Cupriavidus necator 11599), 쿠프리아비두스 네카토르 H16(Cupriavidus necator H16), 슈도모나스 게제네이 비오바르. 티케하우(Pseudomonas guezennei biovar. Tikehau), R. 유트로파(R. eutropha), 대장균(E. coli), 유전자 조작 대장균(engineered E. coli), 알칼리게네스 라투스(Alcaligenes latus), 스핑고박테리움 종 ATM(Sphingobacterium sp. ATM), 플라스티시쿠물란스 아시디보란스(Plasticicumulans acidivorans), 바실러스 테퀼렌시스(Bacillus tequilensis), 할로페락스 메디테라네이(Haloferax mediterranei), H. 메디테라네이(H. mediterranei), 슈도모나스 플루오레센스 A2a5(Pseudomonas fluorescens A2a5) 및 랄스토니아 유트로파 H16(Ralstonia eutropha H16)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 공정.
제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, PHA 생산 미생물로부터 PHA를 추출하는 단계는 PHA 생산 미생물의 적어도 일부를 용균하기 위해 발효 혼합물을 열처리함으로써 PHA를 방출하는 단계를 포함하는 것인 공정.
제28항에 있어서, 발효 혼합물을 열처리하는 단계는 80℃와 125℃ 사이의 온도에서 실시되는 것인 공정.
제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, PHA를 포함하는 추출 혼합물을 건조하는 단계를 더 포함하는 것인 공정.
폴리하이드록시알카노에이트(PHA)의 생산을 위한 탄소 공급원을 제조하기 위한 공정으로서,
리그노셀룰로오스계 물질을 포함하는 폐기물 스트림을 제공하는 단계;
폐기물 스트림에 칼슘 함유 광물을 첨가하는 단계;
칼슘 함유 광물의 존재 하에 폐기물 스트림을 열처리하여 폐기물 스트림을 멸균하고, 처리된 폐기물 스트림을 PHA 생산을 위한 탄소 공급원으로서 수득하는 단계를 포함하는 것인, 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)의 생산을 위한 탄소 공급원을 제조하기 위한 공정.
제31항에 있어서, 폐기물 스트림은 펄프 및 제지 활성 슬러지 스트림인 것인 공정.
제31항 또는 제32항에 있어서, 칼슘 함유 광물은 탄산칼슘, 수산화칼슘 및 산화칼슘 중 적어도 하나를 포함하는 것인 공정.
제31항 내지 제33항 중 어느 한에 있어서, 칼슘 함유 광물은 수산화칼슘을 포함하는 것인 공정.
제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 칼슘 함유 광물은 석회를 포함하는 것인 공정.
제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 폐기물 스트림에 칼슘 함유 광물을 첨가하는 단계는 폐기물 스트림을 열처리하기 전에 실시되는 것인 공정.
제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 폐기물 스트림에 칼슘 함유 광물을 첨가하는 단계는 폐기물 스트림을 열처리하는 동안에 실시되는 것인 공정.
제31항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 폐기물 스트림을 열처리하는 단계는 적어도 120℃의 온도에서 실시되는 것인 공정.
제31항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 폐기물 스트림에 칼슘 함유 광물을 첨가하기 전에 폐기물 스트림을 여과하여 조대 섬유를 제거함으로써 폐기물 스트림 여과액을 수득하는 단계를 더 포함하는 것인 공정.
제39항에 있어서, 폐기물 스트림에 칼슘 함유 광물을 첨가하기 전에 폐기물 스트림 여과액을 침강시켜 여과되지 않은 고형물을 디캔팅함으로써 디캔팅된 폐기물 스트림을 수득하는 단계를 더 포함하는 것인 공정.
제40항에 있어서, 폐기물 스트림에 칼슘 함유 광물을 첨가하기 전에 디캔팅된 폐기물 스트림을 세척하여 세척된 고형물을 수득하는 단계를 더 포함하는 것인 공정.
제41항에 있어서, 디캔팅된 폐기물 스트림을 세척하는 단계는,
디캔팅된 폐기물 스트림을 원심 분리하여 원심 분리된 고형물을 수득하는 단계를 포함하는 것인 공정.
제42항에 있어서,
원심 분리된 고형물을 수성 배지에 재현탁하여 현탁액을 수득하는 단계; 및
현탁액을 다시 원심 분리하여 원심 분리된 고형물을 수득하는 단계를 더 포함하는 것인 공정.
제31항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 폐기물 스트림에 칼슘 함유 광물을 첨가하기 전에,
폐기물 스트림 내의 현탁된 고형물(SS) 농도를 소정의 농도로 조절하여 컨디셔닝된 폐기물 스트림을 수득하는 단계; 및
컨디셔닝된 폐기물 스트림에 칼슘 함유 광물을 첨가하는 단계를 더 포함하며,
이때 폐기물 스트림을 열처리하는 단계는 컨디셔닝된 폐기물 스트림을 열처리하는 단계를 포함하는 것인 공정.
제44항에 있어서, SS 농도를 조절하는 단계는 세척된 고형물에 대해 실시되는 것인 공정.
제44항 또는 제45항에 있어서, 소정의 농도는 5 g/ℓ와 50 g/ℓ 사이인 것인 공정.
제46항에 있어서, 소정의 농도는 10 g/ℓ와 20 g/ℓ 사이인 것인 공정.
폴리하이드록시알카노에이트(PHA)를 생산하기 위한 공정으로서,
처리된 폐기물 스트림을 제공하며, 이때 처리된 폐기물 스트림은,
폐기물 스트림에 칼슘 함유 광물을 첨가하는 단계; 및
칼슘 함유 광물의 존재 하에 폐기물 스트림을 열처리하여 폐기물 스트림을 멸균하는 단계를 포함하는 공정에 의해 수득되는 단계;
처리된 폐기물 스트림을 탄소 공급원으로서 포함하는 배양 배지에서 적어도 하나의 PHA 생산 미생물 균주를 발효시켜 PHA를 생산하는 단계; 및
PHA 생산 미생물로부터 PHA를 추출하는 단계를 포함하는 것인, 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)를 생산하기 위한 공정.
제48항에 있어서, 폐기물 스트림은 펄프 및 제지 활성 슬러지 스트림인 것인 공정.
제48항 또는 제49항에 있어서, 칼슘 함유 광물은 탄산칼슘, 수산화칼슘 및 산화칼슘 중 적어도 하나를 포함하는 것인 공정.
제48항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 칼슘 함유 광물은 수산화칼슘을 포함하는 것인 공정.
제48항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 칼슘 함유 광물은 석회를 포함하는 것인 공정.
제48항 내지 제52항에 있어서, 폐기물 스트림에 칼슘 함유 광물을 첨가하는 단계는 폐기물 스트림을 열처리하기 전에 실시되는 것인 공정.
제48항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 폐기물 스트림에 칼슘 함유 광물을 첨가하는 단계는 폐기물 스트림을 열처리하는 동안에 실시되는 것인 공정.
제48항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 폐기물 스트림을 열처리하는 단계는 적어도 120℃의 온도에서 실시되는 것인 공정.
제48항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 폐기물 스트림에 칼슘 함유 광물을 첨가하기 전에 폐기물 스트림을 여과하여 조대 섬유를 제거함으로써 폐기물 스트림 여과액을 수득하는 단계를 더 포함하는 것인 공정.
제56항에 있어서, 폐기물 스트림에 칼슘 함유 광물을 첨가하기 전에 폐기물 스트림 여과액을 침강시켜 여과되지 않은 고형물을 디캔팅함으로써 디캔팅된 폐기물 스트림을 수득하는 단계를 더 포함하는 것인 공정.
제57항에 있어서, 폐기물 스트림에 칼슘 함유 광물을 첨가하기 전에 디캔팅된 폐기물 스트림을 세척하여 세척된 고형물을 수득하는 단계를 더 포함하는 것인 공정.
제58항에 있어서, 디캔팅된 폐기물 스트림을 세척하는 단계는,
디캔팅된 폐기물 스트림을 원심 분리하여 원심 분리된 고형물을 수득하는 단계를 포함하는 것인 공정.
제59항에 있어서,
원심 분리된 고형물을 수성 배지에 재현탁하여 현탁액을 수득하는 단계; 및
현탁액을 다시 원심 분리하여 원심 분리된 고형물을 수득하는 단계를 더 포함하는 것인 공정.
제48항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 폐기물 스트림에 칼슘 함유 광물을 첨가하기 전에,
폐기물 스트림 내의 현탁된 고형물(SS) 농도를 소정의 농도로 조절하여 컨디셔닝된 폐기물 스트림을 수득하는 단계; 및
컨디셔닝된 폐기물 스트림에 칼슘 함유 광물을 첨가하는 단계를 더 포함하며,
이때 폐기물 스트림을 열처리하는 단계는 컨디셔닝된 폐기물 스트림을 열처리하는 단계를 포함하는 것인 공정.
제61항에 있어서, SS 농도를 조절하는 단계는 세척된 고형물에 대해 실시되는 것인 공정.
제61항 또는 제62항에 있어서, 소정의 농도는 5 g/ℓ와 50 g/ℓ 사이인 것인 공정.
제63항에 있어서, 소정의 농도는 10 g/ℓ와 20 g/ℓ 사이인 것인 공정.
제48항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 발효 단계 이전 및/또는 동안에 배양 배지에 2차 탄소 공급원을 첨가하는 단계를 더 포함하는 것인 공정.
제65항에 있어서, 2차 탄소 공급원은 카르복실산, 당류, 오일, 알코올 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 공정.
제66항에 있어서, 카르복실산은 아세트산, 프로피온산, 부티르산, 발레르산, 이들의 염 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 공정.
제66항에 있어서, 당류는 글루코오스, 만니톨, 수크로오스 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 공정.
제66항에 있어서, 오일은 올리브 오일, 옥수수 오일, 야자수 오일 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 공정.
제66항에 있어서, 알코올은 글리세롤을 포함하는 것인 공정.
제48항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 발효 단계는 폐기물 스트림의 pH를 6.5와 7.5 사이로 유지하고/하거나, 온도를 25℃와 35℃ 사이로 유지하는 단계를 포함하는 것인 공정.
제48항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 발효 단계 이전 및/또는 동안에 배양 배지에 광물 공급원을 첨가하는 단계를 더 포함하는 것인 공정.
제48항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 PHA 생산 미생물 균주는 단일 PHA 생산 미생물 균주인 것인 공정.
제48항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 PHA 생산 미생물 균주는 바실러스 메가테리움, 코마모나스 테스토스테로니, 쿠프리아비두스 네카토르 11599, 쿠프리아비두스 네카토르 H16, 슈도모나스 게제네이 비오바르. 티케하우, R. 유트로파, 대장균, 유전자 조작 대장균, 알칼리게네스 라투스, 스핑고박테리움 종 ATM, 플라스티시쿠물란스 아시디보란스, 바실러스 테퀼렌시스, 할로페락스 메디테라네이, H. 메디테라네이, 슈도모나스 플루오레센스 A2a5 및 랄스토니아 유트로파 H16으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 공정.
제48항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, PHA 생산 미생물로부터 PHA를추출하는 단계는 PHA 생산 미생물의 적어도 일부를 용균하기 위해 발효 혼합물을 열처리함으로써 PHA를 방출하는 단계를 포함하는 것인 공정.
제75항에 있어서, 발효 혼합물을 열처리하는 단계는 80℃와 125℃ 사이의 온도에서 실시되는 것인 공정.
제48항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, PHA를 포함하는 추출 혼합물을 건조하는 단계를 더 포함하는 것인 공정.
제1항 내지 제30항 및 제48항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 배지 내의 탄소 농도를 PHA 생산 미생물의 탄소 소비량을 기준으로 최적의 탄소 농도로 유지하는 단계를 포함하는 것인 공정.