BR112021011366A2 - Produção de polihidroxialcanoatos a partir de correntes de resíduos de polpa e papel - Google Patents

Abstract

produção de polihidroxialcanoatos a partir de correntes de resíduos de polpa e papel. é fornecido um processo para produzir polihidroxialcanoatos (pha). o processo compreende: fornecer uma corrente de resíduos compreendendo materiais lignocelulósicos; adicionar um mineral contendo cálcio à corrente de resíduos; tratar termicamente a corrente de resíduos na presença do mineral contendo cálcio, para obter uma corrente de resíduos tratada; fermentar pelo menos uma cepa de microrganismo produtor de pha em um meio de cultura compreendendo a corrente de resíduos tratada como uma fonte de carbono, para produzir os pha; e extrair os pha do microrganismo produtor de pha.

Description

PRODUÇÃO DE POLIHIDROXIALCANOATOS A PARTIR DE CORRENTES DE RESÍDUOS DE POLPA E PAPEL CAMPO

[001] O campo técnico geralmente se refere ao campo dos bioplásticos. Mais particularmente, o campo técnico se refere à produção de polihidroxialcanoatos a partir de resíduos, tais como correntes de resíduos a partir da produção de polpa e papel.

ANTECEDENTES

[002] Os polihidroxialcanoatos (PHA) são uma família de termoplásticos biodegradáveis e biocompatíveis que podem ser produzidos por microrganismos. Normalmente, a eficiência de custo na produção de biopolímero, e particularmente na produção de PHA, é determinada pelo preço das matérias-primas necessárias. Por exemplo, o preço das matérias-primas pode representar até 50% dos custos. Portanto, a fim de alcançar a viabilidade econômica da produção de PHA, há uma necessidade de desenvolver processos de fermentação eficientes usando fontes de carbono de baixo custo a partir de materiais residuais.

SUMÁRIO

[003] Em um aspecto, é fornecido um processo para produção de polihidroxialcanoatos (PHA), compreendendo: fornecer uma corrente de resíduos compreendendo materiais lignocelulósicos; adicionar um mineral contendo cálcio à corrente de resíduos; tratar termicamente a corrente de resíduos na presença do mineral contendo cálcio, para esterilizar a corrente de resíduos e obter uma corrente de resíduos tratada; fermentar pelo menos uma cepa de microrganismo produtor de PHA em um meio de cultura compreendendo a corrente de resíduos tratada como uma fonte de carbono, para produzir os PHA; e extrair os PHA a partir do microrganismo produtor de

PHA.

[004] Em outro aspecto, é fornecido um processo para preparar uma fonte de carbono para a produção de polihidroxialcanoatos (PHA), o processo compreendendo: fornecer uma corrente de resíduos compreendendo materiais lignocelulósicos; adicionar um mineral contendo cálcio à corrente de resíduos; tratar termicamente a corrente de resíduos na presença do mineral contendo cálcio, para esterilizar a corrente de resíduos e obter uma corrente de resíduos tratada como a fonte de carbono para a produção de PHA.

[005] Em algumas implementações, a corrente de resíduos é uma corrente de lama ativada por papel e polpa.

[006] Em algumas implementações, o mineral contendo cálcio compreende pelo menos um dentre carbonato de cálcio, hidróxido de cálcio e óxido de cálcio.

[007] Em algumas implementações, o mineral contendo cálcio compreende hidróxido de cálcio.

[008] Em algumas implementações, o mineral contendo cálcio compreende cal (lime).

[009] Em algumas implementações, a adição do mineral contendo cálcio à corrente de resíduos é realizada antes de tratar termicamente a corrente de resíduos.

[010] Em algumas implementações, a adição do mineral contendo cálcio à corrente de resíduos é realizada durante tratar termicamente a corrente de resíduos.

[011] Em algumas implementações, o tratamento térmico da corrente de resíduos é realizado a uma temperatura de pelo menos 120°C.

[012] Em algumas implementações, o processo compreende, adicionalmente, filtrar a corrente de resíduos para remover fibras grossas, antes de adicionar o mineral contendo cálcio à corrente de resíduos, obtendo, desse modo, um filtrado de corrente de resíduos.

[013] Em algumas implementações, o processo compreende, adicionalmente, assentar o filtrado da corrente de resíduos para decantar os sólidos não filtrados, antes de adicionar o mineral contendo cálcio à corrente de resíduos, obtendo, desse modo, uma corrente de resíduos decantada.

[014] Em algumas implementações, o processo compreende adicionalmente, antes de adicionar o mineral contendo cálcio à corrente de resíduos, lavar a corrente de resíduos decantada para obter sólidos lavados.

[015] Em algumas implementações, lavar a corrente de resíduos decantada compreende: centrifugar a corrente de resíduos decantada para obter sólidos centrifugados.

[016] Em algumas implementações, o processo compreende adicionalmente: ressuspender os sólidos centrifugados em um meio aquoso, para obter uma suspensão; e re-centrifugar a suspensão para obter os sólidos centrifugados.

[017] Em algumas implementações, o processo compreende adicionalmente, antes de adicionar o mineral contendo cálcio à corrente de resíduos: ajustar uma concentração de sólidos suspensos (SS) na corrente de resíduos para uma concentração predeterminada, para obter uma corrente de resíduos condicionada; e adicionar o mineral contendo cálcio à corrente de resíduos condicionada, em que tratar termicamente a corrente de resíduos compreende tratar termicamente a corrente de resíduos condicionada.

[018] Em algumas implementações, o ajuste da concentração de SS é realizado nos sólidos lavados.

[019] Em algumas implementações, a concentração pré-determinada está entre 5 g/L e 50 g/L.

[020] Em algumas implementações, a concentração pré-determinada está entre 10 g/L e 20 g/L.

[021] Em algumas implementações, o processo compreende, adicionalmente, adicionar uma fonte de carbono secundária ao meio de cultura antes e/ou durante a etapa de fermentação.

[022] Em algumas implementações, a fonte de carbono secundária compreende um ácido carboxílico, um sacarídeo, um óleo, um álcool ou uma combinação dos mesmos.

[023] Em algumas implementações, o ácido carboxílico compreende ácido acético, ácido propiônico, ácido butírico, ácido valérico, um sal dos mesmos ou uma combinação dos mesmos.

[024] Em algumas implementações, o sacarídeo compreende glicose, manitol, sacarose ou uma combinação dos mesmos.

[025] Em algumas implementações, o óleo compreende azeite, óleo de milho, óleo de palma ou uma combinação dos mesmos.

[026] Em algumas implementações, o álcool compreende glicerol.

[027] Em algumas implementações, a etapa de fermentação compreende manter o pH da corrente de resíduos entre 6,5 e 7,5 e/ou manter a temperatura entre 25°C e 35°C.

[028] Em algumas implementações, o processo compreende, adicionalmente, adicionar uma fonte de minerais ao meio de cultura, antes e/ou durante a etapa de fermentação.

[029] Em algumas implementações, a pelo menos uma cepa de microrganismo produtor de PHA é uma cepa única de microrganismo produtor de PHA.

[030] Em algumas implementações, a pelo menos uma cepa de microrganismo produtor de PHA é selecionada a partir do grupo em Bacillus megaterium, Comamonas testosteroni, Cupriavidus necator 11599, Cupriavidus necator H16, Pseudomonas guezennei biovar. Tikehau, R. eutropha, E. coli, E. coli modificada, Alcaligenes latus, Sphingobacterium sp. ATM, Plasticicumulans acidivorans, Bacillus tequilensis, Haloferax mediterranei, H. mediterranei, Pseudomonas fluorescens A2a5 e Ralstonia eutropha H16.

[031] Em algumas implementações, extrair os PHA dos microrganismos produtores de PHA compreende tratar termicamente a mistura de fermentação de modo a lisar pelo menos uma porção dos microrganismos produtores de PHA, liberando desse modo os PHA.

[032] Em algumas implementações, o tratamento térmico da mistura de fermentação é realizado a uma temperatura entre 80°C e 125°C.

[033] Em algumas implementações, o processo compreende, adicionalmente, a secagem da mistura de extração compreendendo os PHA.

[034] Em algumas implementações, o processo mantém, adicionalmente, uma concentração de carbono no meio de cultura em uma concentração de carbono ideal com base em um consumo de carbono do microrganismo produtor de PHA.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[035] A Figura 1 é um diagrama do fluxo de processo de um processo para a síntese de PHA usando uma corrente de resíduos como fonte de carbono; A Figura 2 é um diagrama do fluxo de processo da Figura 1, em que a corrente de resíduos é condicionada antes de adicionar o mineral contendo cálcio; A Figura 3 é um diagrama do fluxo de processo que mostra várias etapas do processo de condicionamento; A Figura 4 é um quadro do fluxo que mostra várias etapas e condições para sintetizar PHA usando uma corrente de resíduos como fonte de carbono; A Figura 5 é um gráfico que mostra uma comparação entre o crescimento de microrganismos produtores de PHA em um meio sintético vs. um meio de lama fortificada com glicose; A Figura 6 é um gráfico que mostra vários parâmetros observados durante a produção de PHA como uma função do tempo durante a fermentação em lote alimentado, usando uma fonte de carbono compreendendo uma corrente de resíduos condicionada tratada com Ca(OH)2 e glicose; A Figura 7 é um gráfico que mostra vários parâmetros observados durante a produção de PHA em função do tempo durante a fermentação em lote alimentado, usando uma fonte de carbono compreendendo uma corrente de resíduos condicionada (lavada) tratada com Ca(OH)2 e glicerol bruto; A Figura 8 é um gráfico que mostra vários parâmetros observados durante a produção de PHA em função do tempo durante a fermentação em lote alimentado, usando uma fonte de carbono compreendendo uma corrente de resíduos não condicionada (não lavada) tratada com Ca(OH)2 e glicerol bruto; A Figura 9 é um gráfico que mostra vários parâmetros observados durante a produção de PHA em função do tempo durante a fermentação em lote alimentado, usando uma fonte de carbono compreendendo uma corrente de resíduos condicionada com alta concentração de sólidos suspensos tratada com Ca(OH)2 e glicerol bruto; A Figura 10 é um gráfico que mostra vários parâmetros observados durante a produção de PHA em função do tempo durante a fermentação em lote alimentado, usando uma fonte de carbono compreendendo uma corrente de resíduos condicionada com alta concentração de sólidos suspensos tratada com Ca(OH)2 e ácido acético.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[036] Conforme discutido acima, há uma necessidade de técnicas aprimoradas na produção de PHA a partir de fontes de corrente de resíduos

(municipais ou industriais, como lama ativada da indústria de papel e polpa). Essas fontes de corrente de resíduos podem ser levadas em consideração devido a i) seu alto teor em nutrientes e fontes de carbono complexas e ii) a possibilidade de resolver problemas de descarte de lama na indústria de papel e polpa, que pode representar até 60% de custos totais de tratamento de águas residuais.

[037] Espera-se que o custo do descarte secundário da lama aumente, particularmente na América do Norte e na Europa, em resposta aos padrões mais elevados de tratamento de águas residuais, redução da capacidade dos aterros e aumento dos custos de combustível.

[038] Os pesquisadores estão continuamente tentando resolver a questão do descarte de lama secundária e do alto custo de produção de PHA, utilizando polpa não estéril e lama ativada de fábrica de papel (PPMAS) diretamente para a produção de PHA. Os processos de produção de PHA com base em culturas microbianas mistas (isto é, lama ativada) foram investigados como uma possível tecnologia para resolver as questões associadas ao custo de manutenção de condições estéreis, preparação de meio sintético e manutenção de culturas puras (Singh et al., 2014). Nesse processo, o principal problema é a variação de lote para lote da concentração de PHA. Assim, a produção (acúmulo) de PHAs não é reproduzível (para a lama coletada em momentos diferentes a partir da mesma estação de tratamento de águas residuais, bem como para a lama coletada a partir de diferentes estações de tratamento de águas residuais). A variação no acúmulo de PHA pode ser atribuída à mudança na composição da comunidade microbiana na lama e na composição química da lama ativado, que, adicionalmente, depende da natureza do processo usado para a produção de celulose e papel dentro da fábrica de celulose e papel. Além disso, as comunidades microbianas da lama são sensíveis a mudanças nos parâmetros do processo de tratamento de águas residuais, como carga de alimentação orgânica, adição de produtos químicos, mudança no SRT, HRT, temperaturas, pH de operação, etc.

[039] Várias técnicas que são descritas na presente invenção permitem a síntese de PHA usando fontes de corrente de resíduos como uma fonte de nutrientes e de carbono. Um exemplo não limitativo de uma fonte de corrente de resíduos é a lama ativada de polpa e papel. Visão geral do processo

[040] Com referência à Figura 1, é fornecido um processo 100 para a síntese de PHA usando a fonte de corrente de resíduos 11. A corrente de resíduos 11 pode, por exemplo, incluir uma corrente de lama ativada de polpa e papel, ou uma corrente derivado de uma corrente de lama ativada de polpa e papel. Deve ser entendido que a expressão "corrente derivada de uma corrente de lama ativada de polpa e papel" refere-se a uma corrente de lama que é pré-tratada ou condicionada usando uma ou várias etapas selecionadas de filtração, sedimentação, decantação, centrifugação, lavagem, suspensão em um meio aquoso (por exemplo, água) e ajustando uma concentração de sólidos suspensos. Por exemplo, a corrente de resíduos 11 pode ser uma corrente de lama ativada de polpa e papel originada de uma fábrica de polpa e papel.

[041] A corrente de resíduos 11 inclui vários compostos contendo carbono que podem ser usados como uma fonte de carbono e outros nutrientes para a produção de PHA. Um mineral contendo cálcio 12 pode ser adicionado à corrente de resíduos 11 para mitigar o efeito inibitório de certos materiais, tais como materiais lignocelulósicos hidrolisados que podem estar presentes na corrente de resíduos 11 ou ser formados durante o processamento da corrente de resíduos 11. A corrente de resíduos 11 pode ser tratada termicamente na etapa de tratamento térmico 13 (também referida na presente invenção como uma etapa de esterilização ou uma etapa de desintoxicação) na presença do mineral contendo cálcio 12, para esterilizar a corrente de resíduos e obter uma corrente de resíduos tratada 14.

[042] Foi surpreendentemente descoberto que adicionar o mineral contendo cálcio 12 à corrente de resíduos 11 antes ou durante a etapa de tratamento térmico 13 pode ajudar a solubilizar sólidos suspensos de lama e tornar os nutrientes mais prontamente disponíveis para microorganismos produtores de PHA. Mais ainda, foi surpreendentemente descoberto que adicionar o mineral contendo cálcio 12 à corrente de resíduos 11 antes ou durante a etapa de tratamento térmico 13 pode ajudar a diminuir os materiais inibidores tipicamente gerados durante o tratamento térmico como resultado da hidrólise dos materiais lignocelulósicos inicialmente presentes na corrente de resíduos.

[043] A corrente de resíduos tratada 14 pode então ser fermentada em uma etapa de fermentação 15 para obter uma mistura de fermentação 16 e extraída em uma etapa de extração 18 para obter uma mistura de extração 20 compreendendo os PHA 24. Opcionalmente, uma etapa de secagem 22 pode ser realizada para secar os PHA 24.

[044] A corrente de resíduos 11 pode ser submetida à etapa de tratamento térmico 13 diretamente, como mostrado no processo 100 da Figura 1. Alternativamente, a corrente de resíduos 11 pode ser condicionada em um processo de condicionamento 300 antes da etapa de tratamento térmico 13, como mostrado no processo 200 da Figura 2. Nesse caso, é a corrente de resíduos condicionada 114 que é submetido à etapa de tratamento térmico 13. O processo de condicionamento 300 será discutido em detalhes adicionais na presente invenção.

[045] As etapas do processo e outros aspectos das técnicas de produção de

PHA são descritos em detalhes adicionais abaixo. Polihidroxialcanoatos (PHA)

[046] Deve ser entendido que os termos "polihidroxialcanoatos" ou "PHA" se referem a polímeros que podem ser representados pela seguinte unidade de repetição de Fórmula I, ou a copolímeros compreendendo monômeros de pelo menos duas unidades de repetição diferentes de Fórmula I, em que R é H, alquila ou alquenila, e m e n são inteiros.

Fórmula I

[047] Alguns PHAs encontraram aplicação industrial, com representantes não limitantes sendo o PHB (poli-3-hidroxibutirato), PHBV (poli (hidroxibutirato- co-hidroxivalerato)), P4HB (poli (4-hidroxibutirato), P3HB4HB (poli (3- hidroxibutirato-co-4-hidroxibutirato)), PHV (polihidroxivalerato) e PHHx (polihidroxihexanoato).

[048] Opcionalmente, n pode ser um número inteiro entre 100 e 30.000. Opcionalmente, m pode ser um número inteiro entre 1 e 4. Opcionalmente, R pode ser H, alquila, alquila substituída, alquenila ou alquenila substituído. Por exemplo, R pode ser H, metil, etil, propil ou butil. Fontes de corrente de resíduos

[049] Deve ser entendido que a corrente de resíduos 11 pode ter origem a partir de várias fontes. Em algumas implementações, a corrente de resíduos 11 é obtido a partir de águas residuais municipais, águas residuais de fabricação de amido, águas residuais de fabricação de queijo, uma corrente de resíduos de produção de polpa e papel ou uma combinação dos mesmos. Além disso, qualquer uma das correntes de resíduos referidas na presente invenção pode ser obtida a partir de lama primária, lama secundária ou uma combinação das mesmas. Entende-se que “lama primária” é o resultado da captura de sólidos em suspensão e orgânicos em um processo de tratamento primário, principalmente por meio de separação gravitacional, o que pode ser feito, por exemplo, em um clarificador primário. Entende-se também que a “lama secundária” é obtida ao tratar águas residuais em um processo de tratamento secundário que usa microrganismos para consumir matéria orgânica presente nas águas residuais. Os microrganismos normalmente se alimentam de material biodegradável presente nas águas residuais, por exemplo, em um tanque de aeração e, em seguida, fluem para um clarificador secundário onde a biomassa pode se depositar e ser removida coma lama secundária. Como resultado do processo a partir do qual a corrente de resíduos se origina, bem como a atividade de microrganismos, a corrente de resíduos 11 contém tipicamente material orgânico que pode ser usado como fonte de carbono para microrganismos produtores de PHA para produzir PHA.

[050] Em algumas implementações, a corrente de resíduos é uma corrente de resíduos da produção de polpa e papel. Opcionalmente, a corrente de resíduos da produção de polpa e papel inclui uma corrente de resíduos secundária. Opcionalmente, a corrente de resíduos da produção de polpa e papel consiste essencialmente em uma corrente de resíduos secundária. Lama secundária ou ativada descarregada da estação de tratamento de águas residuais pode ser usada como material residual para a produção de PHA. Em alguns cenários, a lama ativada pode ser combinada com outras fontes de carbono (como glicerol bruto - um produto residual da indústria de biodiesel, glicose, ácido acético, óleo de cozinha residual ou resíduos municipais ou industriais semelhantes, etc.). Condicionamento da corrente de resíduos

[051] Agora com referência à Figura 3, é mostrado um processo 300 para condicionar a corrente de resíduos 11 para a produção subsequente de PHA. A corrente de resíduos 11 pode ser condicionada antes da adição do mineral contendo cálcio e antes da etapa de tratamento térmico 13 e da etapa de fermentação 15.

[052] Em algumas implementações, a corrente de resíduos 11 é submetida a uma etapa de filtração 103 antes de adicionar o mineral contendo cálcio 12, para obter um filtrado da corrente de resíduos 104. A etapa de filtração 103 pode permitir a remoção de material grosseiro, como resíduos de madeira e/ou fibras grosseiras que podem estar inicialmente presentes na corrente de resíduos 11. Por exemplo, a etapa de filtração 103 pode ser realizada usando um filtro de 100 mm a 1500 mm, ou um filtro de 500 mm a 1000 mm, ou um filtro de 700 mm a 900 mm, ou um filtro de 800 mm.

[053] Em algumas implementações, o filtrado da corrente de resíduos 104 pode ser submetido a uma etapa de sedimentação ou etapa de decantação 105 antes de adicionar o mineral contendo cálcio 12 à corrente de resíduos, para obter uma corrente de resíduos decantada 106. A etapa de sedimentação ou etapa de decantação 105 pode incluir a decantação do filtrado da corrente de resíduos 104 por várias horas, tal como entre 2 horas e 12 horas, ou entre 5 horas e 7 horas, ou por cerca de 6 horas. A decantação do filtrado da corrente de resíduos 104 permite a decantação de sólidos não filtrados. Em algumas implementações, a porção de lama líquida pode ser descartada e a corrente de resíduos decantada 106 pode incluir principalmente sólidos de lama sedimentada concentrada. Em alguns cenários, os sólidos de lama sedimentada concentrada são obtidos ao descartar a porção de lama líquida sem secagem ou processamento adicional dos sólidos restantes.

[054] Em algumas implementações, a corrente de resíduos decantada 106 pode ser lavada. Lavar a corrente de resíduos decantada 106 pode incluir uma etapa de centrifugação 107 antes de adicionar o mineral contendo cálcio 12 à corrente de resíduos, para obter sólidos centrifugados 108. Em algumas implementações, lavar a corrente de resíduos decantada 106 inclui, adicionalmente, ressuspender os sólidos centrifugados em um meio aquoso (por exemplo, água) em uma etapa de suspensão 109, para obter sólidos ressuspensos 110. Em algumas implementações, lavar a corrente de resíduos decantada 106 inclui, adicionalmente, a centrifugação dos sólidos ressuspensos 110 em uma segunda etapa de centrifugação 111 para obter sólidos centrifugados 112.

[055] Em algumas implementações, a porção líquida (ou sobrenadante) obtida após a etapa de decantação 105, primeira etapa de centrifugação 107 e/ou segunda etapa de centrifugação 111 pode ser descartada. A fração de sólidos obtida após a etapa de decantação 105, primeira etapa de centrifugação 107 e/ou segunda etapa de centrifugação 111 pode ser opcionalmente ressuspensa em um meio aquoso (por exemplo, água) antes de uma etapa subsequente.

[056] Também deve ser entendido que cada uma das etapas de condicionamento descritas na presente invenção é opcional e não necessariamente precisa ser realizada a fim de obter a corrente de resíduos tratada 14 após a etapa de desintoxicação 13. Por exemplo, em alguns cenários, a etapa de assentamento ou decantação 105 pode ser omitida e a primeira etapa de centrifugação 107 pode ser realizada diretamente no filtrado da corrente de resíduos 104. Em alguns cenários, a corrente de resíduos 11 pode não exigir uma etapa de filtração 103 (por exemplo, em casos onde há nenhum ou poucos materiais grosseiros a serem filtrados). Em outro exemplo, a etapa de suspensão 109 pode ser realizada diretamente na corrente de resíduos decantada 106 e a etapa de centrifugação 107 pode ser omitida. Também deve ser entendido que, em alguns cenários, a segunda etapa de centrifugação 111 também pode ser omitida. Em alguns cenários, apenas uma única etapa de centrifugação pode ser realizada. Em outros cenários, duas ou mais etapas de centrifugação podem ser realizadas.

[057] Em algumas implementações, a primeira e/ou segunda etapas de centrifugação são realizadas entre 8.000 xg e 10.000 xg. Em algumas implementações, a primeira e/ou segunda etapas de centrifugação são realizadas à temperatura ambiente (20-25 °C). Em algumas implementações, a primeira e/ou segunda etapa de centrifugação são realizadas por entre 5 minutos e 20 minutos.

[058] Em algumas implementações, o condicionamento da corrente de resíduos 11 compreende, adicionalmente, ajustar uma concentração de sólidos suspensos (SS) a uma concentração predeterminada. Em algumas implementações, a concentração pré-determinada está entre 5 g/L e 50 g/L, ou entre 10 g/L e 20 g/L, ou ainda em cerca de 15 g/L. Em algumas implementações, a concentração de sólidos suspensos é ajustada pela adição de um meio aquoso (por exemplo, água). O ajuste da concentração de SS pode ser realizado diretamente na corrente de resíduos 11 ou após a última etapa realizada no processo de condicionamento. Em outras palavras, o ajuste da concentração de SS pode ser realizado em uma das correntes de resíduos 11, filtrado da corrente de resíduos 104, corrente de resíduos decantada 106, sólidos centrifugados 108, sólidos ressuspensos 110 ou sólidos centrifugados 112, dependendo de qual fluxo é o último fluxo obtido no processo de condicionamento 300. Mineral contendo cálcio e etapa de tratamento térmico

[059] Quando a corrente de resíduos 11 é uma corrente de lama ativada de polpa e papel, ou uma corrente derivada do tratamento de vários materiais naturais originários de várias fontes de madeira ou plantas (por exemplo, madeira, trigo, arroz etc.), os materiais orgânicos incluem materiais lignocelulósicos. Quando os materiais lignocelulósicos são hidrolisados, vários produtos de hidrólise são liberados e podem ser inibidores da produção de PHA. Foi surpreendentemente descoberto que adicionar o mineral contendo cálcio 12 à corrente de resíduos 11 ou à corrente de resíduos condicionada 114 antes ou durante a etapa de tratamento térmico 13 pode ajudar a solubilizar sólidos suspensos de lamas e aumentar a disponibilidade de nutrientes para os microorganismos produtores de PHA. Além disso, foi surpreendentemente descoberto que adicionar o mineral contendo cálcio 12 à corrente de resíduos 11 ou à corrente de resíduos condicionada 114 antes ou durante a etapa de tratamento térmico 13 pode ajudar a diminuir os materiais inibidores tipicamente gerados durante o tratamento térmico como resultado da hidrólise dos materiais lignocelulósicos inicialmente presentes na corrente de resíduos 11.

[060] Exemplos não limitantes de mineral contendo cálcio 12 incluem carbonato de cálcio, hidróxido de cálcio, óxido de cálcio, cal ou uma mistura dos mesmos. Preferencialmente, o mineral contendo cálcio inclui hidróxido de cálcio.

[061] Deve ser entendido que a etapa de tratamento térmico 13 é tipicamente uma etapa de esterilização (isto é, aquecimento em temperaturas altas o suficiente e por um tempo longo o suficiente para matar ou inativar microorganismos (por exemplo, bactérias) presentes na corrente de resíduos 11 ou nas correntes de resíduos condicionadas 114). Em algumas implementações, o tratamento térmico da corrente de resíduos 11 ou da corrente de resíduos condicionada 114 é realizado a uma temperatura de pelo menos 120°C.

[062] Em algumas implementações, a quantidade de mineral contendo Ca que é adicionada com base na concentração de SS. Por exemplo, entre 0,05 g e

0,5 g, ou entre 0,05 g e 0,2 g, ou entre 0,1 g e 0,2 g, ou cerca de 0,1 g de mineral contendo Ca podem ser adicionados para cada g de sólidos SS presentes na corrente de resíduos 11 ou a corrente de resíduos condicionada 114, dependendo de quando o mineral contendo Ca é adicionado. Mais particularmente, entre cerca de 0,05 g e 0,5 g, ou entre 0,05 g e 0,2 g, ou entre 0,1 g e 0,2 g, ou cerca de 0,1 g de hidróxido de cálcio, carbonato de cálcio, óxido de cálcio ou cal podem ser adicionados à corrente de resíduos 11 ou a corrente de resíduos condicionada 114. Deve ser entendido que a concentração de sólidos SS pode ser medida usando protocolos padronizados, como ASTM-D 5907, EPA

180.1 e/ou ISO 7027. Etapa de fermentação

[063] Após a corrente de resíduos 11 ou a corrente de resíduos condicionada 114 ser esterilizado na presença do mineral contendo Ca, a corrente de resíduos tratada 14 é fermentado em uma etapa de fermentação

15.

[064] Em algumas implementações, a etapa de fermentação 15 pode incluir uma fermentação por lote, uma fermentação por lote alimentado, uma fermentação aberta e/ou uma fermentação contínua. Preferencialmente, a etapa de fermentação 15 inclui uma fermentação por lote alimentado. Em alguns cenários, a etapa de fermentação 15 consiste em uma fermentação por lote alimentado. Deve ser entendido que o termo "fermentação por lote alimentado", como utilizado na presente invenção, refere-se a uma variação da fermentação por lote, onde alguns dos ingredientes são adicionados durante a fermentação. Isso normalmente permite um maior controle sobre as etapas do processo de fermentação. Em particular, a produção de metabólitos secundários pode ser aumentada pela adição de uma quantidade limitada de certos nutrientes durante a fase de crescimento não exponencial. Em algumas implementações, a etapa de fermentação 15 inclui operações de lote alimentado ensanduichadas entre as operações de lote.

[065] Em algumas implementações, a etapa de fermentação 15 é realizada a uma temperatura entre 20°C e 40°C. Também deve ser entendido que a temperatura pode ser selecionada com base na cepa ou cepas bacterianas usadas como microrganismos produtores de PHA. Em algumas implementações, tratar termicamente a corrente de resíduos 11 ou da corrente de resíduos condicionada 114 pode ser realizado em um fermentador na presença do mineral contendo Ca. Nesse caso, o fermentador pode ser aquecido à temperatura desejada para tratamento térmico e, em seguida, resfriado até a temperatura de fermentação.

[066] Em algumas implementações, a etapa de fermentação compreende manter o pH da corrente de resíduos entre 6,5 e 7,5 e/ou manter a temperatura entre 25°C e 35°C.

[067] Em algumas implementações, uma fonte de carbono secundária pode ser adicionada ao meio de cultura, antes e/ou durante a etapa de fermentação

15. De maneira similar, uma fonte de minerais pode ser adicionada ao meio de cultura, antes e/ou durante a etapa de fermentação 15. Os microrganismos produtores de PHA também são tipicamente adicionados ao meio de cultura antes e/ou durante a etapa de fermentação 15. Microrganismos produtores de PHA

[068] O microrganismo produtor de PHA pode ser qualquer cepa bacteriana conhecida por produzir PHA. Exemplos não limitantes de microrganismos produtores de PHA estão listados na Tabela 1 abaixo. Tabela 1: Lista de microrganismos produtores de PHA Cepa Conteúdo de PHA (% p/p)

Bacillus megaterium 50 Comamonas testosteroni 79 Cupriavidus necator 11599 90 Cupriavidus necator H16 80 Pseudomonas guezennei biovar. 63 tikehau R. eutropha 76 E. coli (manipulado) 75 Alcaligenes latus 77,6 Sphingobacterium sp. ATM 64 Plasticicumulans acidivorans 70 Bacillus tequilensis 79,2 Haloferax mediterranei 65 H. mediterranei 75 Pseudomonas fluorescens A2a5 70 Ralstonia eutropha H16 76

[069] Em algumas implementações, a contagem de células no pré-inóculo para cepas bacterianas pode estar entre 108 a 109 cultivado por 24h. No entanto, deve ser entendido que uma contagem de células mais baixa ou mais alta no pré- inóculo é possível e geralmente não afeta o processo de produção de PHA em maior extensão.

[070] Em algumas implementações, os microrganismos produtores de PHA são cultivados antes de serem introduzidos no meio de cultura. Por exemplo, os microrganismos produtores de PHA podem ser cultivados durante 12 horas a 48 horas, ou entre 12 horas e 24 horas, ou cerca de 24 horas, antes de serem introduzidos no meio de cultura. O pré-inóculo obtido pode, desse modo, ser adicionado ao meio de cultura antes e/ou durante a etapa de fermentação 15.

[071] Em algumas implementações, o microrganismo produtor de PHA é uma cepa única de microrganismo produtor de PHA. Em outras implementações, o microrganismo produtor de PHA pode incluir mais de uma cepa de microrganismo produtor de PHA. Fonte de minerais

[072] Em algumas implementações, uma fonte de minerais pode ser adicionada ao meio para ajudar na produção de PHA durante o processo de fermentação. Exemplos não limitantes de minerais que podem ser adicionados são NH4Cl (por exemplo, 0,2-1,0 g/L), Na2HPO4 (por exemplo, 0,5-6,0 g/L), KH2PO4 (por exemplo, 0,2-2,4 g/L), MgSO4 7h2O (por exemplo, 0,04-0,5 g/L) e combinações dos mesmos. Os componentes a seguir podem ser adicionados ao meio para promover a produção de PHA durante o processo de fermentação. Deve ser entendido que outros minerais podem ser usados e que as concentrações indicadas acima são dadas como um exemplo e não devem ser interpretadas como limitantes. Fonte adicional de carbono

[073] Em algumas implementações, o processo inclui, adicionalmente, adicionar uma fonte de carbono secundária ao meio de cultura, antes e/ou durante a etapa de fermentação 15. Por exemplo, a fonte de carbono secundária pode incluir um ácido carboxílico, um sacarídeo, um óleo, um álcool ou uma combinação dos mesmos. O ácido carboxílico pode incluir ácido acético, ácido propiônico, ácido butírico, ácido valérico, um sal ou uma combinação dos mesmos. O sacarídeo pode incluir glicose, manitol, sacarose ou uma combinação dos mesmos. O óleo pode incluir um óleo vegetal, como azeite, óleo de milho, óleo de palma ou uma combinação dos mesmos. O álcool pode incluir glicerol, tal como glicerol puro ou bruto. Etapa de extração

[074] A mistura de fermentação 16 que é obtida após a etapa de fermentação 15 contém células microbianas que incluem PHA 24 que deve ser extraído em uma etapa de extração 18. A etapa de fermentação 16 é, portanto, interrompida e a mistura de fermentação 16 é adicionalmente processada de modo a recuperar os PHA 24. Em algumas implementações, a etapa de extração 18 pode incluir pelo menos uma dentre uma etapa de tratamento térmico, uma etapa de sonicação e uma etapa de tratamento oxidativo.

[075] A etapa de extração 18 pode incluir tratamento térmico da mistura de fermentação 16 a fim de lisar pelo menos uma porção das células microbianas que incluem PHA. Em alguns cenários, os PHA contido na mistura de fermentação 16 é degradado pelas células microbianas. Nesse caso, o tratamento térmico aplicado pode ajudar a minimizar a degradação.

[076] Em algumas implementações, quando a concentração de PHA atinge um máximo (que é, por exemplo, determinado quando a taxa de consumo da fonte de carbono, tal como ácido acético/acetato torna-se constante e atingiu um valor mínimo), a mistura de fermentação 16 pode ser aquecida (por exemplo entre 80°C e 125°C, e por exemplo entre cerca de 10 minutos a 45 minutos, ou entre cerca de 15 minutos a 30 minutos). Opcionalmente, durante a etapa de aquecimento, uma concentração positiva de ácido acético pode ser mantida no fermentador. Este passo de aquecimento tipicamente lisa pelo menos uma porção das células microbianas, liberando, portanto, os PHA nelas contido. Entende-se que os PHA normalmente não se degrada a essas temperaturas. Entende-se que a expressão "os PHA é liberado a partir das células" significa que os PHA que é inicialmente PHA intracelular, é conduzido para fora das células devido à lise das células/ruptura celular causada pelo tratamento térmico (isto é, os PHA extracelular é obtido). Mais ainda, a concentração de PHA pode ser aumentada devido à solubilização do conteúdo celular, como a solubilização de componentes das paredes celulares.

[077] Em algumas implementações, tratar termicamente a mistura de fermentação 16 inclui um composto de aprimoramento de tratamento térmico. Entende-se que o composto de aprimoramento do tratamento térmico pode permitir que o tratamento térmico seja realizado a temperaturas mais baixas. Em alguma implementação, o composto de aprimoramento do tratamento térmico inclui detergente. Em algumas implementações, o detergente inclui um surfactante, um agente quelante ou uma combinação dos mesmos. Em algumas implementações, o detergente inclui Tween™ 20, Tween™ 40, Tween™ 60, 2- dodecil sulfato de sódio, Triton X-100, etileno diamina tetra-acético (EDTA) ou uma combinação dos mesmos. Quando um detergente é adicionado durante o tratamento térmico da mistura de fermentação 16, o tratamento térmico pode ser realizado a temperaturas entre 80°C e 95°C.

[078] A etapa de extração 18 para separar PHAs da biomassa pode ser realizada usando solventes clorados, tais como clorofórmio, cloretos de metileno e/ou 1,2-dicloroetano. Uma combinação desses solventes clorados com outros solventes também pode ser usada para extração. O PHA extraído pode então ser separado do solvente por evaporação do solvente ou por precipitação do polímero pela adição de um solvente polar como acetona ou um álcool (por exemplo metanol ou etanol). Alternativamente, o material celular nãos PHA pode ser digerido usando diferentes produtos químicos, como compostos alcalinos e os detergentes citados acima. Um método à base de detergente para recuperar os PHA difere da extração à base de solvente porque o detergente pode romper os componentes da célula, deixando os PHA substancialmente intacto.

[079] Outro método para iniciar a interrupção da célula é o uso de sonicação, por exemplo, usando dispositivos operando entre as frequências de

20 e 40 kHz, que estão disponíveis comercialmente. Em algumas implementações, a mistura de fermentação 16 pode ser sonicada antes do tratamento térmico, durante o tratamento térmico ou após o tratamento térmico. Em algumas implementações, a mistura de fermentação tratada termicamente é sonicada para quebrar, adicionalmente, as células e liberar PHA no meio. A sonicação pode ser realizada por vários minutos, por exemplo, entre 1 minuto e 30 minutos. Em algumas implementações, a sonicação é realizada por 2 a 5 minutos ou por 3 minutos.

[080] Em algumas implementações, a etapa de extração 18 pode incluir adicionar um agente de oxidação à mistura de fermentação. Por exemplo, o agente de oxidação pode incluir um peróxido, um hipoclorito ou uma combinação dos mesmos. Em algumas implementações, o hipoclorito inclui hipoclorito de sódio, que pode ser usado em concentrações entre 1 e 5% p/v. Em algumas implementações, o peróxido inclui peróxidos de hidrogênio, que podem ser usados em concentrações entre 1 e 5% v/v. Em algumas implementações, o hipoclorito de sódio é usado antes do peróxido de hidrogênio. Entende-se que o uso de um agente de oxidação pode facilitar a descoloração da mistura de fermentação, o que por sua vez pode levar a um PHA descolorado. Em algumas implementações, o tratamento oxidativo é realizado após a etapa de tratamento térmico. Em algumas implementações, a etapa de oxidação é realizada após a etapa de sonicação.

[081] Em algumas implementações, a etapa de extração 18 pode incluir centrifugação. Por exemplo, a centrifugação pode ser realizada após o tratamento térmico, após a etapa de sonicação e/ou após um dos tratamentos oxidativos. Em algumas implementações, o processo de extração inclui várias etapas de centrifugação. Por exemplo, uma etapa de centrifugação pode ser realizada entre a etapa de tratamento térmico e a etapa de sonicação, entre a etapa de sonicação e a etapa de tratamento com hipoclorito de sódio e/ou entre a etapa de tratamento com hipoclorito de sódio e/ou a etapa de tratamento com peróxido de hidrogênio. Etapa de secagem

[082] A mistura de extração compreendendo os PHA pode ser seca, por exemplo, por secagem por pulverização.

EXEMPLOS Exemplo 1

[083] Os experimentos foram conduzidos para comparar o crescimento de microrganismos produtores de PHA usando um meio sintético (glicose), por um lado, e uma polpa esterilizada e lama ativada de fábrica de papel (PPMAS) que foi fortificada com glicose, por outro lado.

[084] Os experimentos foram iniciados com a preparação do primeiro e segundo pré-inóculos. O primeiro pré-inóculo foi preparado inoculando microrganismos produtores de PHA das placas de ágar de meio mineral no meio mineral (MM) ou meio sintético (SM) caldo contendo (por litro de água destilada) 20g de glicose, 6,0 g de hidrogenofosfato dissódico dodecahidratado (Na2HPO4.12H2O), 2,4g de dihidrogenofosfato de potássio (KH2P04), 1,0 g de cloreto de amônio (NH4Cl), 0,50 g de sulfato de magnésio heptahidratado (MgSO4· 7H2O). Os fosfatos (Na2HPO4.12H2O, KH2P04) e cloreto de amônio foram esterilizados juntamente com glicose, enquanto MgSO4· 7H2O foi autoclavado separadamente a 121oC por 15 min e essas soluções foram misturadas assepticamente após o resfriamento. O pH do meio foi mantido em 6,8 e o pré- inóculo foi mantido com agitação de 150 rpm por 24h a 30°C. A mesma composição e condições de cultivo são seguidas para o pré-inóculo 1 em todos os exemplos dados.

[085] Após este tempo, 2 - 10% (v/v) do pré-inóculo foi transferido para cada um de a) meio sintético (glicose, 10g/L) e b) lama (10g/L SS (sólidos suspensos) meio fortificado com 10g/L de glicose (segundo pré-inóculo). A outra composição mineral foi a mesma do primeiro meio pré-inóculo. O segundo pré- inóculo também foi mantido a 30°C, 150 rpm por 24h e depois disso, 2 -10% (v/v) do segundo pré-inóculo foi transferido para 200mL de meio de produção em frascos de agitação Erlenmeyer de 1L. A composição do meio de produção foi a mesma do segundo meio pré-inóculo, exceto que 15g/L de SS foi usado no meio de produção de lama e a concentração de glicose usada em ambos os casos da lama e do meio de produção sintético foi de 20g/L. A incubação dos meios de produção para a produção de PHA foi conduzida por 96h a 30°C e 150rpm. As amostras a partir da fermentação bacteriana foram retiradas a cada 24h para medir a CFU (unidade formadora de colônia).

[086] O crescimento microbiano foi um ciclo logarítmico maior usando PPMAS esterilizado (lama ativada de fábrica de papel e polpa) como um substrato em comparação com o meio sintético sem adição de lama (Os resultados estão resumidos na Figura 5). Exemplo 2

[087] Diferentes experimentos foram conduzidos em frascos de agitação para variação de diferentes parâmetros, e uma comparação de crescimento microbiano e produção de PHA para lama lavada e não lavada foi realizada. Uma variação adicional da dosagem de hidróxido de sódio (NaOH) foi feita para a solubilização máxima dos sólidos da lama. A dosagem de NaOH selecionada foi adicionalmente aplicada para examinar o efeito da concentração de SS no crescimento e na produção de PHA.

[088] Produção de PHA usando lama lavada (condicionada) e não lavada (sem fortificação de fonte extra de carbono e minerais): Os componentes não identificados da matriz de lama podem representar uma inibição razoável para o crescimento de biomassa e acúmulo de PHA. Com uma suposição de que durante o acúmulo de PHA, uma quantidade muito limitada de nutrientes é necessária e os nutrientes são incorporados nos sólidos da lama ativada, a lama foi centrifugada e o sobrenadante assim obtido foi descartado e a biomassa da lama (ou o pellet centrifugado) foi ressuspensa em água da torneira para ser usado como substrato (fonte parcial de carbono e nutrientes) para o acúmulo de PHA (lama condicionada). Portanto, o meio de produção de lama foi preparado usando diferentes concentrações de sólidos suspensos de lama não lavada (10, 15, 20, 25, 30 g/L) e lama lavada (15, 20, 25, 30 e 35g/L) para estudar seu efeito sobre o crescimento microbiano e acúmulo de PHA. Os sólidos suspensos de lama foram esterilizados a 121oC por 30 min. Após a esterilização, os sólidos suspensos foram deixados esfriar até a temperatura ambiente, depois disso, sob condições estéreis, o pH foi ajustado para 6,8 usando NaOH 4 N (hidróxido de sódio) ou H2SO4 (Ácido sulfúrico). Todos os frascos de agitação foram inoculados com 2 - 10% (v/v) de inóculo de pré-cultura-2, que foi preparado da mesma forma que o meio de produção (várias concentrações de SS de lama lavada e não lavada, sem fortificação de fonte extra de carbono e minerais) e mantidos para incubação a 30oC, 150 rpm por 96h.

[089] O crescimento celular máximo e o teor de PHA foram obtidos usando lama lavada com 15 g/L de SS (Tabela 2). Outros valores de SS também permitem obter um teor de PHA comparável. Tabela 2: Comparação entre lama lavada e não lavada usada para crescimento e produção de PHA (os resultados são fornecidos às 48h de fermentação, sem fortificação de fonte extra de carbono e minerais) Concentração Lama não lavada Lama lavada Concentração inicial de Conteúdo Concentração Conteúdo final de CFU/mL CFU/mL SS (g/L) de final de SS de PHA SS (g/L)

PHA (% (% (g/L) p/p) p/p) 10 6,9 4,90E+09 4,23 5,9 5,40E+10 4,6 15 11,3 4,40E+09 7,75 12,1 5,80E+10 11,46 20 15,66 5,10E+09 9,92 15,8 7,90E+10 10,92 25 22,27 5,60E+09 9 18,1 6,90E+10 7,31

[090] Dose de álcali (hidróxido de sódio) para pré-tratamento de lama: O objetivo do processo de pré-tratamento é fracionar os principais componentes dos materiais lignocelulósicos, para dissolver o máximo de sólidos da lama e lise celular, o que leva à liberação de nutrientes que podem ser utilizados pelo microrganismo em crescimento. Portanto, neste experimento, foram utilizadas concentrações de sólidos suspensos de 10 e 30g/L e tratadas com diferentes doses de hidróxido de sódio (0,05, 0,07, 0,09, 0,11, 0,13 g de NaOH/g de sólidos suspensos). Posteriormente, a lama foi esterilizada a 121oC por 30 min. A concentração de sólidos suspensos foi medida para cada frasco tomando 10mL de amostras. A dose de hidróxido de sódio, na qual o máximo de sólidos da lama foi dissolvido, foi selecionada para experimentos adicionais.

[091] A hidrólise máxima da lama para 10 g/L (após o tratamento, conc. final de SS-4,1g/L) e 30g/L (após o tratamento conc. final de SS -11,3g/L) de SS foi obtida em 0,13 g de NaOH/g de SS.

[092] Concentração de sólidos suspensos para produção de PHA: Vários inibidores, como ácidos alifáticos, fenólicos e derivados de furano, podem ser liberados durante o tratamento com hidróxido de sódio, o que pode inibir o crescimento de microrganismos e o acúmulo de PHA. Os inibidores podem ser aumentados com o aumento da concentração de sólidos suspensos, pois em SS maiores, maior quantidade de inibidores será liberada durante o pré-tratamento com hidróxido de sódio, o que pode afetar diretamente o crescimento e o acúmulo de PHA. Portanto, o pré-tratamento de várias concentrações de SS (10, 15, 20, 25, 30 g/L) foi realizado com uma concentração de NaOH de 0,133 g NaOH/g de SS. Após a esterilização da lama a 121oC por 30 min., sólidos suspensos pré-tratados foram deixados vir à temperatura ambiente e sob condições estéreis, o pH foi ajustado para 6,8 usando H2SO4 4 N. Todos os frascos de agitação foram inoculados com 2 - 10% (v/v) de pré-cultura-2, que foi preparada da mesma forma que o meio de produção (várias concentrações de SS, sem suplementação de carbono e minerais extras). Os frascos foram mantidos para incubação a 30oC, 150 rpm por 96h e as amostras foram analisadas para a concentração de sólidos suspensos, CFU (unidade formadora de colônia) e concentração de PHA.

[093] Após o tratamento alcalino (0,133g NaOH/g de SS) da lama lavada com concentração variável de SS, a concentração de sólidos suspensos diminuiu de 15, 20, 25 e 30g/L para 4,7, 5,0, 8,0 e 13g/L, respectivamente. O teor de PHA de biomassa (9,67% p/p) foi máximo usando a concentração de SS de 15g/L em 24h. No entanto, o teor de PHA obtido (9,67% p/p) foi menor quando comparado àquele obtido usando apenas lama lavada tratada termicamente (11,46% p/p) na mesma concentração de SS. O menor acúmulo de PHA usando o tratamento alcalino pode ser devido à formação de componentes tóxicos durante a hidrólise. Exemplo 3

[094] Os materiais tóxicos liberados durante a hidrólise da lama usando hidróxido de sódio inibem o acúmulo de PHA. O tratamento com cal ou hidróxido de cálcio foi utilizado para reduzir os componentes inibitórios gerados durante a hidrólise da lama.

[095] Doses diferentes de hidróxido de cálcio (0,05, 0,07, 0,09, 0,11, 0,13g de Ca (OH)2/g de sólidos suspensos) foram adicionadas a uma concentração de

SS de 15 g/L de lama lavada em diferentes frascos. Após esterilização da lama, glicose (20g/L), cloreto de amônio (1g/L) e minerais foram suplementados (composição igual à do Exemplo 1) em cada frasco. O pH foi ajustado para 6,8 usando ácido sulfúrico 4N e a inoculação foi feita usando 2 - 10% (v/v) de pré- cultura-2 (composição igual à do meio de produção e a pré-cultura será cultivada por 24h), após incubação foi feito aos 30oC, 150 rpm por 96h. As amostras foram retiradas a cada 24h para concentração de biomassa (g/L), reduzindo o consumo de açúcares (g/L), CFU e concentração de PHA (g/L).

[096] Verificou-se que 0,11 g de hidróxido de cálcio/g de SS permitia o crescimento máximo das células e o acúmulo de PHA. A concentração de PHA foi aumentada de 1,10 g/L (usando lama tratada com NaOH) para 4,45 g/L usando desintoxicação de hidróxido de cálcio em frascos de agitação. Outras concentrações de hidróxido de cálcio também produziram alto crescimento celular e acúmulo de PHA, como pode ser visto na Tabela 3 abaixo, em comparação com o controle de NaOH. Tabela 3: Pré-tratamento de lama lavada (condicionada) com diferentes doses de hidróxido de cálcio (para desintoxicação) e produção de PHA na lama pré- tratada (com fortificação de fonte extra de carbono e minerais)

CFU SS PHA PHA Lama lavada SS-15g/L /mL) (g/L) (%) (g/L) Controle (sem lama, meio sintético usando 9,10E+11 2,95 46,72 1,38 glicose) Controle - lama lavada tratada com NaOH 9,60E+12 10,9 8,91 0,97 (0,133 g/g de SS) Ca(OH)2 (0,09g/g de SS) lama lavada tratada 8,00E+12 15,32 17,42 2,67 Ca(OH)2 (0,11g/g de SS) lama lavada tratada 7,80E+12 15,45 30,82 4,76 Ca(OH)2 (0,13g/g de SS) lama lavada tratada 7,40E+12 14,99 20,44 3,06 Ca(OH)2 (0,15g/g de SS) lama lavada tratada 5,80E+11 14,56 15,91 2,32 Exemplo 4

[097] Os experimentos foram conduzidos para produzir PHA usando lama fortificada com glicose como uma fonte extra de carbono e tratada com hidróxido de cálcio antes da esterilização (fermentação em lote alimentado).

[098] A fermentação em lote alimentado foi realizada em fermentadores de 5L ou 7L para verificar a estabilidade e consistência do acúmulo de PHA usando lama ativada de polpa e papel (PPAS) com uma cultura bacteriana pura. A glicose (substrato de carbono puro) foi usada como um substrato de carbono adicional para aumentar o acúmulo de PHA.

[099] Uma concentração de sólidos suspensos de 15g/L do experimento em frascos de agitação foi usada neste estudo e uma concentração de hidróxido de cálcio de 0,11g Ca(OH)2/g de SS foi adicionado à lama lavada antes da esterilização. Após a esterilização da lama, o meio foi suplementado com glicose esterilizada e minerais sob condições assépticas. A temperatura foi mantida a 30oC circulando água pela jaqueta. O pH da fermentação foi controlado automaticamente a 6,8 ± 0,1 através de bombas peristálticas controladas por computador usando ácido sulfúrico 4N e NaOH 4N. Ambos DO e pH foram monitorados continuamente por meio de sonda polarográfica de oxigênio dissolvido e sensor de pH (Mettler-Toledo, EUA), respectivamente.

[0100] Pré-cultura-2 (foi usada composição igual aos meios de produção, exceto baixa SS (10g/L) e concentração de glicose (10g/L)) cultivada a 30oC, 150 rpm por 24h foi transferida para o meio de produção de lama. A mesma concentração de nitrogênio e minerais foi suplementada por 0,12 e 24h, enquanto após 24h, baixa concentração de minerais e nitrogênio foi suplementada ao longo da fermentação (cinco alimentações às 36, 42, 60, 72 e 84h). A composição do meio de produção de lama e da solução de alimentação é dada na Tabela 4. A alimentação de glicose foi feita com base no consumo ao longo da fermentação. Tabela 4: Composição dos meios de produção e solução de alimentação para o fermentador Concentração (g/L) Alimentação Alimentação Meios de solução 1 solução 2 Componente produção (Alimentado às (Alimentado às 24, (0h) 12 e 24h) 36, 48, 60, 72, 84h) Lama condicionada e tratada com Ca(OH)2 15 - - (g/L) Glicose ou Solução de glicerol bruto 20,0 10,0 10,0 (equivalente de carbono)-g/L NH4Cl (g/L) 1,00 1,00 0,20 Na2HPO4. 12h2O (g/L) 6,00 6,00 0,50 KH2PO4 (g/L) 2,40 2,40 0,20 MgSO4·7H2O (g/L) 0,50 0,50 0,04

[0101] Lama esterilizada condicionada e tratada com Ca(OH)2 (concentração de SS -15 g/L) deu um teor máximo de PHA de 86,5% (p/p), concentração de biomassa de 51,97 g/L e concentração de PHA de 44,97 g/L (como visto na Figura 6). A mesma experiência foi repetida usando PPMAS coletados em diferentes períodos de tempo e os resultados foram reproduzíveis, o que aborda um problema típico de inconsistência ou variabilidade no acúmulo de PHA em técnicas do estado da técnica.

[0102] Mais ainda, um alto rendimento de PHA de 0,60g de PHA/g de glicose consumida (1,5g de PHA/g de carbono consumido) foi alcançado usando lama fortificada com glicose. No entanto, o baixo rendimento de PHA de 0,36g/g de glicose consumida (0,9g de PHA/g de carbono consumido) foi alcançado usando apenas glicose como substrato sem adição de lama (Tabela 5). Tabela 5: Comparação do rendimento de PHA para lama fortificada com glicose e apenas glicose como substrato Rendimento Rendimento % global de global de de Glicose Carbono PHA (g PHA (g SS PHA total total Substrato PHA de PHA/g de PHA/g Referência (g/L) (g/L) consumida consumido (p/p (g/L) (g/L) de de ) glicose carbono consumida) consumido)

O 28,0 Glicose 31,5 89,1 77 30,8 0,36 0,91 presente 7 pedido Glicose + lama O 44,9 (SS 51,9 86,5 75 30 0,60 1,50 presente 7 inicial- pedido 15 g/L) Nonato et al. 2001; Glicose 0,32 0,8 Mozumd er et al., 2014 Exemplo 5

[0103] Os experimentos foram conduzidos para produzir PHA usando lama fortificada com alto teor de sabão contendo glicerol bruto (composição na Tabela 6) como uma fonte extra de carbono e tratada com hidróxido de cálcio antes da esterilização. Tabela 6: Caracterização da solução de glicerol bruto Ensaio Solução de glicerol bruto pH 9,36 Densidade 5,2 g/5 mL ou 1,04 g/mL Conteúdo de metanol 30% p/v

Conteúdo de água 30,43% p/v Catalisador 0,66% p/v Concentração de glicerol 160 g/L ou (16% p/v) Conteúdo de sabão 280 g/L (ou) (28% p/v)

[0104] Lama não condicionada (não lavada) e condicionada (lavada) com concentração de SS de 15 g/L foi usada em dois fermentadores diferentes. Uma concentração de 0,11g Ca(OH)2/g de SS foi adicionado à lama (coletada da indústria de polpa e papel de bétula branca, cidade de Quebec, Canadá) antes da esterilização. Após a esterilização da lama, o meio foi suplementado com solução esterilizada de glicerol bruto (8 g de carbono/L) e minerais sob condições assépticas.

[0105] Pré-cultura-2 (composição igual aos meios de produção, exceto SS baixo (10g/L) e concentração de glicerol bruto (4 g de carbono/L) foram usadas) cultivada a 30oC, 150 rpm por 24h foi transferida para o meio de produção de lama. A mesma concentração de nitrogênio e minerais foi suplementada por 0,12 e 24h, enquanto após 24h, baixa concentração de minerais e nitrogênio foi suplementada ao longo da fermentação (cinco alimentações às 36, 42, 60, 72 e 84h). A composição do meio de produção de lama e da solução de alimentação é dada na Tabela 4. A alimentação da solução de glicerol bruto foi feita com base no consumo de glicerol e sabão ao longo da fermentação.

[0106] A concentração máxima de biomassa de 41,2 g/L foi alcançada com teor de PHA de 72,1% (p/p) e concentração de PHA de 29,7 g/L usando lama condicionada com SS inicial de 15 g/L (como visto na Figura 7). No entanto, a concentração de biomassa de 38,9 g/L foi alcançada com teor de PHA de 55,7% (p/p) e concentração de PHA de 21,9 g/L usando lama não condicionada com SS inicial de 15 g/L (como visto na Figura 8). Estes resultados mostram que lavagem da lama tem um efeito sobre a acúmulo de PHA, visto que o teor de PHA e a concentração de PHA aumentaram 17% e 8g/L, respectivamente, após a eliminação de compostos tóxicos durante o lavar da lama.

[0107] O alto rendimento de PHA de 0,98g de PHA/g de carbono consumido (ambos sabão e glicerol) foi alcançado no experimento usando lama condicionada fortificado com glicerol bruto. No entanto, o baixo rendimento de PHA de 0,73g de PHA/g de carbono consumido (ambos sabão e glicerol) foi alcançado no experimento usando apenas glicerol bruto como substrato sem adição de lama (Tabela 7). Tabela 7: Comparação do rendimento de PHA para lama fortificada com glicerol bruto e apenas glicerol bruto como substrato Substrato Rendimento total Carbono global de % de SS PHA consumido total PHA (g de Substrato PHA Referência (g/L) (g/L) (glicerol + consumido PHA/g de (p/p) sabonete (g/L) carbono g/L) consumido)

O Glicerol 23,2 30,7 75,7 58,3 31,99 0,73 presente bruto 4 pedido Glicerol bruto +

O Lama 29,7 41,2 72,1 55,5 30,44 0,98 presente (SS 1 pedido inicial- 15 g/L) Paula Glicerol 0,56 et al., bruto 2017

Exemplo 6

[0108] Os experimentos foram conduzidas para a produção de PHA usando uma lama com uma concentração de SS maior e tratada com hidróxido de cálcio antes da esterilização.

[0109] Uma lama condicionada com alta concentração de SS de 25g/L foi usada e uma concentração de hidróxido de cálcio de 0,11g Ca(OH) 2/g de SS foi adicionada à lama antes da esterilização. Após a esterilização da lama, o meio foi suplementado com solução esterilizada de glicerol bruto (8 g de carbono/L, composição na Tabela 6) e minerais sob condições assépticas.

[0110] A pré-cultura-2 (composição igual ao meio de produção, exceto SS baixo (10g/L) e concentração de glicerol bruto (4 g de carbono/L) foram usadas) cultivada a 30oC, 150 rpm por 24h foi transferida para o meio de produção de lama. A mesma concentração de nitrogênio e minerais foi suplementada por 0,12 e 24h, enquanto após 24h, baixa concentração de minerais e nitrogênio foi suplementada ao longo da fermentação (cinco alimentações às 36, 42, 60, 72 e 84h). A composição do meio de produção de lama e da solução de alimentação é dada na Tabela 4. A alimentação da solução de glicerol bruto foi feita com base no consumo ao longo da fermentação.

[0111] A lama condicionada com alta concentração de sólidos deu uma concentração de biomassa de 48,7g/L, um teor de PHA de 68% (p/p) e concentração de PHA de 33,2g/L com um rendimento de PHA de 0,86g de PHA/g de carbono consumido (sabão e glicerol) foi obtido (como visto na Figura 9).

[0112] A biomassa e a concentração de PHA foram maiores usando a concentração inicial de SS de 25g/L em comparação com a obtida com o uso de menor concentração de SS (15g/L). O uso de alta concentração de sólidos no processo de fermentação pode, em última análise, diminuir o volume do fermentador necessário para processar uma determinada quantidade de lama gerada por uma estação específica. Isso, por sua vez, reduz o custo de estabelecimento de um PHA. Exemplo 7

[0113] Os experimentos foram conduzidos para a produção de PHA usando lama condicionada fortificada com ácido acético como uma fonte extra de carbono e tratada com hidróxido de cálcio antes da esterilização.

[0114] O ácido acético também foi estudado como um substrato de carbono adicional junto com a lama usando uma estratégia de lote alimentado com pH stat. Sempre que o pH do caldo dentro do fermentador aumentava de 6,8 para 6,85 (variação de pH 0,05), o ácido acético era alimentado automaticamente no fermentador por bomba de ácido. A pré-cultura 2 para todos os experimentos com ácido acético foi preparada usando solução de glicerol bruto. Utilizou-se a polpa condicionada e lama de papel com concentração de SS de 25g/L e concentração de hidróxido de cálcio de 0,11g Ca(OH)2/g de SS foi adicionado à lama antes da esterilização. Após a esterilização da lama, o meio foi suplementado com minerais sob condições assépticas. Pré- cultura-2 (composição igual à do meio de produção, exceto SS baixo (10g/L) e concentração de glicerol bruto (4 g de carbono/L) (Composição dada na Tabela 6) foram utilizadas) cultivada a 30oC, 150 rpm por 24h foi transferida para o meio de produção de lama. A mesma concentração de nitrogênio e minerais foi suplementada às 0, 12 e 24h, enquanto após 24h, baixa concentração de minerais e nitrogênio foi suplementada ao longo da fermentação (cinco alimentações às 36, 42, 60, 72 e 84h). O ácido acético foi adicionado automaticamente ao fermentador com base na estratégia de lote alimentado com base no pH.

[0115] A concentração máxima de biomassa de 44,7g/L foi alcançada com teor de PHA de 68% (p/p) e concentração de PHA de 30,5g/L usando lama condicionada de SS inicial de 25g/L (como visto na Figura 10). O alto rendimento de PHA de 0,60 g de PHA/g de ácido acético consumido (1,5 g de PHA/g de carbono consumido) foi alcançado usando lama condicionada e ácido acético como um substrato de carbono adicional.

[0116] O rendimento comparativamente baixo de PHA de 0,2g de PHA/g de mistura de substrato de carbono (ácido acético, ácido butírico, ácido succínico e ácidos propiônicos) consumido foi relatado por Chakraborty et al., 2012. No outro estudo de Yu et al., (2002), foi relatado o rendimento médio de PHA de 0,39g de PHA/g de mistura de substrato de carbono (ácido acético, ácido butírico e ácidos propiônicos) consumido. Exemplo 8

[0117] Os experimentos foram conduzidos usando lama não condicionada coletada de diferentes indústrias de polpa e papel.

[0118] A composição da lama muda de uma estação para outra. Nesta série de experimentos, a lama de polpa e papel foi coletada de diferentes indústrias de polpa e papel, como Alma e Dolbeau. Considera-se que a lama varia com o tempo e a natureza do processo usado dentro da indústria. Mais ainda, nas águas de resíduos, as comunidades microbianas da lama são sensíveis às mudanças no fluxo do processo, como carga de alimentação orgânica, adição de produtos químicos, mudança no SRT, HRT, temperaturas, pH de operação, etc., alterando, desse modo, o teor de PHA. Também pode-se hipotetizar que a composição da lama será variada de uma indústria para outra. Portanto, nesta seção, o método estabelecido foi utilizado para a produção de PHA utilizando polpa e lama de papel coletados a partir de diferentes indústrias, a fim de verificar a sustentabilidade do processo.

[0119] Uma concentração de hidróxido de cálcio de 0,11g de Ca(OH) 2/g de SS foi adicionado à lama não lavada de Alma e Dolbeau antes da esterilização em diferentes experimentos. Após a esterilização da lama, o meio foi suplementado com solução esterilizada de glicerol bruto (8 g de carbono/L) (composição dada na Tabela 6) e minerais em condições assépticas.

[0120] Pré-cultura-2 (composição igual à do meio de produção, exceto SS baixo (10g/L) e concentração de glicerol bruto (4 g de carbono/L) (composição dada na Tabela 6) foi usada) cultivada a 30oC, 150 rpm por 24h foi transferida para o meio de produção de lama. A mesma concentração de nitrogênio e minerais foi suplementada por 0, 12 e 24h, enquanto após 24h, baixa concentração de minerais e nitrogênio foi suplementada ao longo da fermentação (cinco alimentações de glicerol bruto às 36, 42, 60, 72 e 84h). A composição do meio de produção de lama e da solução de alimentação é dada na Tabela 4. A alimentação da solução de glicerol bruto foi feita com base no consumo de sabão e glicerol ao longo da fermentação.

[0121] Lama não lavada de Alma com concentração inicial de SS de 15g/L e solução de glicerol bruto como um substrato de carbono adicional deu concentração máxima de biomassa de 40,12g/L e teor de PHA de biomassa de 53,45% (p/p) e concentração de PHA de 21,44g/L. Em um estudo experimental similar em condições similares do processo de fermentação da lama não lavada de Dolbeau, a concentração máxima de biomassa de 41,32g/L foi alcançada com teor de PHA de 55,2% (p/p) e concentração de PHA de 22,8g/L. Esses resultados foram similares aos obtidos usando lama não lavada da indústria de polpa e papel de bétula branca em condições similares de fermentação. É evidente a partir dos resultados obtidos com o uso de lama coletado a partir de três estações de tratamento de águas de resíduos de indústrias de poupa e papel diferentes que a composição da lama não afeta a produção de PHA usando o processo de cultura pura, que foi o maior gargalo com a produção de PHA usando cultura mista.

Exemplo 9

[0122] Os experimentos foram conduzidos para produzir PHA usando um fermentador de 150L de larga escala.

[0123] A produção de PHA também foi realizada em fermentador de 150L (volume total) com lama não condicionada (sem decantação) obtida da Dolbeau e glicerol bruto como substrato de carbono adicional para confirmar a consistência do processo desenvolvido.

[0124] Pré-cultura-2 (composição igual aos meios de produção, exceto SS baixo (10g/L) e concentração de glicerol bruto (4 g de carbono/L) foram utilizadas) cultivada a 30oC, 150 rpm por 24h foi transferida para a pré-cultura 3 (composição igual aos meios de produção, exceto SS baixo (10 g/L) e glicerol bruto (4 g de concentração de carbono/L foi usada, composição dada na Tabela 6) e condições de cultivo eram as mesmas da pré-cultura 2. Após 24h, a pré- cultura 3 foi transferida para um fermentador de 150L com volume de trabalho de 100L. O nitrogênio e os minerais foram suplementados por 0, 12 e 24h, enquanto após 24h, baixa concentração de minerais e nitrogênio foi suplementado ao longo da fermentação (cinco alimentações às 36, 42, 60, 72 e 84h). A composição do meio de produção de lama e da solução de alimentação é dada na tabela 4. A alimentação da solução de glicerol bruto foi feita com base no consumo de sabão e glicerol ao longo da fermentação.

[0125] A concentração máxima de biomassa de 40g/L foi alcançada com teor de PHA de 54% (p/p) e concentração de PHA de 21,5g/L usando lama não condicionada com SS inicial de 15g/L. Esses resultados foram semelhantes ao experimento realizado usando fermentador de 5L com lama não condicionada de 15g/L, o que mostra a consistência do novo processo de produção de PHA em diferentes escalas.

[0126] Foi demonstrado que a lama é um substrato que pode ser usado para cultura pura, sozinho ou em combinação com outros substratos residuais (como glicerol bruto, etc.). O processo pode abordar, pelo menos em parte, a questão da inconsistência da concentração de PHA, menor teor de PHA e menor rendimento de PHA obtido durante a produção de PHA usando cultura microbiana mista. Mais ainda, menos tratamento químico é necessário para extração e purificação adicional de PHA devido à alta concentração de PHA na biomassa produzida durante a fermentação. Exemplo 10

[0127] Os experimentos foram conduzidos no fermentador de 5 L para aumentar, adicionalmente, a concentração de biomassa, concentração de PHA e rendimento de PHA usando lama condicionada fortificada com alto teor de sabão contendo glicerol bruto (composição na Tabela 6) como uma fonte extra de carbono e tratada com hidróxido de cálcio antes da esterilização. A estratégia de batelada alimentada com carbono contínuo foi usada para manter a concentração ideal de carbono (8 ± 1 g de carbono de solução de glicerol bruto/L de meio) para o microrganismo ao longo da fermentação.

[0128] Para fermentador de 5 L, Pré-cultura-2 (composição igual aos meios de produção, exceto SS baixo (10g/L) e concentração de glicerol bruto (4 g de carbono/L) foram usadas) cultivada a 30oC, 150 rpm por 24h foi transferida para o meio de produção de lama.

[0129] A mesma concentração de nitrogênio e minerais foi suplementada por 0, 12 e 24h, enquanto após 24h, baixa concentração de minerais e nitrogênio foi suplementada ao longo da fermentação (cinco alimentações às 36, 42, 60, 72 e 84h). A composição do meio de produção de lama e da solução de alimentação é dada na Tabela 8. Tabela 8: Composição dos meios de produção e solução de alimentação para fermentador com estratégia de fermentação em batelada alimentada contínua

Concentração (g/L) Solução de Solução de Meios de alimentação 1 alimentação 2 Componente produção (Alimentado às (Alimentado às 24, (0h) 12 e 24h) 36, 48, 60, 72, 84h) Lama condicionada e tratada com Ca(OH)2 15 - - (g/L) Solução de glicerol bruto Modo contínuo para manter a (equivalente de 20,0 concentração ideal de carbono de 8 g carbono) -g/L de carbono /L no fermentador NH4Cl (g/L) 1,00 1,00 0,20 Na2HPO4. 12h2O (g/L) 6,00 6,00 0,50 KH2PO4 (g/L) 2,40 2,40 0,20 MgSO4·7H2O (g/L) 0,50 0,50 0,04

[0130] Durante a fermentação em lote alimentado, a solução de glicerol bruto foi adicionada intermitentemente, com base no consumo de glicerol e sabão. No entanto, a estratégia de lote de alimentação contínua pode, alternativamente, ser usada para fornecer uma concentração ótima de carbono (8 g de carbono/L) para o microrganismo, que é mantida no meio ao longo da fermentação. A estratégia de lote de alimentação contínua também pode ajudar a manter a razão C/N ao longo da fermentação.

[0131] Portanto, em 0 h, a solução de glicerol bruto (carbono equivalente a 20 g carbono/L de glicerol ou 8 g carbono/L) foi adicionada ao meio. Depois disso, a solução de glicerol bruto foi adicionada automaticamente (ajustando a taxa de fluxo da bomba peristáltica para adicionar a quantidade necessária de solução de glicerol bruto conforme otimizado durante a estratégia de lote alimentado intermitente). Durante a estratégia de lote alimentado intermitente, o carbono foi adicionado com base no consumo e as bactérias exigiram 4 g C de solução de glicerol bruto/L de meio a cada 12 h. Portanto, na estratégia de lote de alimentação contínua, a mesma quantidade de carbono foi adicionada lentamente ao fermentador ao ajustar a taxa de fluxo da bomba peristáltica durante um período de tempo de 12 h. Assim, observou-se que a mesma concentração de carbono foi mantida ao longo da fermentação.

[0132] Assim, o uso de uma estratégia de fermentação em batelada alimentada com carbono contínuo com PPMAS tratada com Ca(OH)2 como um substrato e glicerol bruto como um substrato de carbono adicional levou a uma concentração de biomassa de 58 g/L com 42 g/L de concentração de PHA, em comparação com 41,2 g/L de concentração de biomassa e 29,7 g/L de concentração de PHA obtido com estratégia de batelada alimentada com carbono intermitente. Além disso, o uso de uma estratégia de fermentação de batelada alimentada com carbono contínuo levou a um rendimento de PHA de 1,17 g de PHA/g de carbono consumido, em comparação com um rendimento de PHA de 0,98 g de PHA/g de carbono consumido obtido com estratégia de batelada alimentada com carbono intermitente (Tabela 9). Tabela 9: Comparação do rendimento de PHA para estratégia de fermentação em batelada alimentada com carbono intermitente e batelada alimentada com carbono contínuo Substrato Rendimento PHA PH Carbono SS total global de PHA % A total Substrato (g/ consumido (g de PHA/g Referência (p/p (g/ consumi L) (glicerol+soap de carbono ) L) do (g/L) g/L) consumido) Glicerol 30, 75,7 23, 58,3 31,99 0,73 O bruto 7 24 presente pedido Estratégia de lote alimentado intermitente O (Glicerol 41, 29, 72,1 55,5 30,44 0,98 presente bruto + 2 71 pedido Lama (SS inicial- 15 g/L) Estratégia de batelada alimentada

O contínua 58 72,4 42 60,6 35,80 1,17 presente (Glicerol pedido bruto + Lama (SS inicial- 15 g/L) Exemplo 11

[0133] Os experimentos foram conduzidos para a produção de PHA usando um fermentador de 150L de larga escala. A produção de PHA também foi realizada em fermentador de 150L (volume total) para estratégia de batelada alimentada contínua com lama condicionada obtida de Dolbeau e glicerol bruto como um substrato de carbono adicional (fonte de carbono secundária) para confirmar a consistência do processo desenvolvido.

[0134] Pré-cultura-2 (cuja composição é a mesma do meio de produção, exceto SS baixo (10g/L) e concentração de glicerol bruto (4 g de carbono/L) cultivada a 30oC, 150 rpm por 24h, foi transferida para a pré-cultura 3 (cuja composição é a mesma que o meio de produção, exceto SS baixo (10g/L) e glicerol bruto (foi utilizado 4 g de concentração de carbono/L, composição apresentada na Tabela 6) e as condições de cultivo foram iguais às da pré-cultura

2. Após 24h, a pré-cultura 3 foi transferida para um fermentador de 150L com um volume de trabalho de 100L. O nitrogênio e os minerais foram suplementados por 0, 12 e 24h, enquanto após 24h, baixa concentração de minerais e nitrogênio foi suplementado ao longo da fermentação (cinco alimentações às 36, 42, 60, 72 e 84h). A composição do meio de produção de lama e da solução de alimentação é dada na Tabela 8.

[0135] Na estratégia de fermentação em batelada alimentada com carbono contínuo, conforme discutido no exemplo 10, a mesma concentração de carbono foi adicionada lentamente ao fermentador. A solução de glicerol bruto foi esterilizada a 121oC por 15 min em autoclave e resfriado à temperatura ambiente. Sob condições estéreis, a solução de glicerol bruto foi transferida para um tanque de plástico de alimentação estéril em fluxo de ar laminar. Depois disso, o tanque de plástico de alimentação estéril (tanque de alimentação de carbono) foi conectado a um fermentador. Devido ao fato da solução bruta de glicerol consistir em sabão e glicerol, que são imiscíveis juntos, o tanque de alimentação de carbono foi colocado em um agitador magnético para misturar a solução bruta de glicerol continuamente. A taxa de fluxo de alimentação da solução de glicerol bruto para o fermentador foi configurada manualmente, definindo a frequência de rotação de uma bomba peristáltica para 5 rpm (ligada a cada 17 segundos e desligada por 60 segundos). Consequentemente, a concentração ótima de carbono (8 ± 1 g de carbono/L) foi mantida no meio de fermentação (meio de cultura) com base no consumo (a amostra foi analisada quanto à concentração de glicerol e sabão, a cada 6 h) e considerando o aumento do volume do caldo de fermentação dentro do fermentador com o tempo. O volume da solução de glicerol bruto adicionado dentro do fermentador foi, desse modo, aumentado (o tempo de intervalo (ligado) foi aumentado até 20 segundos).

[0136] A concentração máxima de biomassa de 58,4 g/L foi alcançada com teor de PHA da biomassa de 70% (p/p) e concentração de PHA de 40 g/L usando lama condicionada com SS inicial de 15 g/L com estratégia de fermentação em batelada alimentada contínua em fermentador de 150 L. Esses resultados foram similares ao experimento realizado utilizando fermentador de 5L com lama condicionada de 15 g/L, o que mostra a consistência do processo de produção dos PHA em diferentes escalas.

Claims (79)

REIVINDICAÇÕES

1. Processo para produzir polihidroxialcanoatos (PHA), caracterizado pelo fato de que compreende: fornecer uma corrente de resíduos compreendendo materiais lignocelulósicos; adicionar um mineral contendo cálcio à corrente de resíduos; tratar termicamente a corrente de resíduos na presença do mineral contendo cálcio, para esterilizar a corrente de resíduos e obter uma corrente de resíduos tratada; fermentar pelo menos uma cepa de microrganismo produtor de PHA em um meio de cultura compreendendo a corrente de resíduos tratada como uma fonte de carbono, para produzir os PHA; e extrair os PHA do microrganismo produtor de PHA.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a corrente de resíduos é uma corrente de lama ativada de polpa e papel.

3. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o mineral contendo cálcio compreende pelo menos um dentre carbonato de cálcio, hidróxido de cálcio e óxido de cálcio.

4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o mineral contendo cálcio compreende hidróxido de cálcio.

5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o mineral contendo cálcio compreende cal (lime).

6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a adição do mineral contendo cálcio à corrente de resíduos é realizada antes do tratamento térmico da corrente de resíduos.

7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5,

caracterizado pelo fato de que a adição do mineral contendo cálcio à corrente de resíduos é realizada durante o tratamento térmico da corrente de resíduos.

8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o tratamento térmico da corrente de resíduos é realizado a uma temperatura de pelo menos 120°C.

9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que compreende, adicionalmente, filtrar a corrente de resíduos para remover fibras grossas, antes de adicionar o mineral contendo cálcio à corrente de resíduos, obtendo, desse modo, um filtrado da corrente de resíduos.

10. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que compreende, adicionalmente, assentar o filtrado da corrente de resíduos para decantar sólidos não filtrados, antes de adicionar o mineral contendo cálcio à corrente de resíduos, obtendo, desse modo, uma corrente de resíduos decantada.

11. Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que compreende, adicionalmente, antes de adicionar o mineral contendo cálcio à corrente de resíduos, lavar a corrente de resíduos decantada para obter sólidos lavados.

12. Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que lavar a corrente de resíduos decantada compreende: centrifugar a corrente de resíduos decantada para obter sólidos centrifugados.

13. Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que compreende, adicionalmente: ressuspender os sólidos centrifugados em um meio aquoso, para obter uma suspensão; e re-centrifugar a suspensão para obter os sólidos centrifugados.

14. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que compreende, adicionalmente, antes de adicionar o mineral contendo cálcio à corrente de resíduos: ajustar uma concentração de sólidos suspensos (SS) na corrente de resíduos para uma concentração predeterminada, para obter uma corrente de resíduos condicionada; e adicionar o mineral contendo cálcio à corrente de resíduos condicionada, em que tratar termicamente a corrente de resíduos compreende tratar termicamente a corrente de resíduos condicionada.

15. Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o ajuste da concentração de SS é realizado nos sólidos lavados.

16. Processo de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que a concentração predeterminada está entre 5 g/L e 50 g/L.

17. Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a concentração predeterminada está entre 10 g/L e 20 g/L.

18. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que compreende, adicionalmente, adicionar uma fonte de carbono secundária ao meio de cultura, antes e/ou durante a etapa de fermentação.

19. Processo de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a fonte de carbono secundária compreende um ácido carboxílico, um sacarídeo, um óleo, um álcool ou uma combinação dos mesmos.

20. Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o ácido carboxílico compreende ácido acético, ácido propiônico, ácido butírico, ácido valérico, um sal dos mesmos ou uma combinação dos mesmos.

21. Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o sacarídeo compreende glicose, manitol, sacarose ou uma combinação dos mesmos.

22. Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o óleo compreende azeite de oliva, óleo de milho, óleo de palma ou uma combinação dos mesmos.

23. Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o álcool compreende glicerol.

24. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pelo fato de que a etapa de fermentação compreende manter o pH da corrente de resíduos entre 6,5 e 7,5 e/ou manter a temperatura entre 25°C e 35°C.

25. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de que compreende, adicionalmente, adicionar uma fonte de minerais ao meio de cultura, antes e/ou durante a etapa de fermentação.

26. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma cepa de microrganismo produtor de PHA é uma cepa única de microrganismo produtor de PHA.

27. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma cepa de microrganismo produtor de PHA é selecionada a partir do grupo que consiste em Bacillus megaterium, Comamonas testosteroni, Cupriavidus necator 11599, Cupriavidus necator H16, Pseudomonas guezennei biovar. Tikehau, R. eutropha, E. coli, E. coli modificada, Alcaligenes latus, Sphingobacterium sp. ATM, Plasticicumulans acidivorans, Bacillus tequilensis, Haloferax mediterranei, H. mediterranei, Pseudomonas fluorescens A2a5 e Ralstonia eutropha H16.

28. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27,

caracterizado pelo fato de que a extração dos PHA dos microrganismos produtores de PHA compreende o tratamento térmico da mistura de fermentação de modo a lisar pelo menos uma porção dos microrganismos produtores de PHA, liberando, desse modo, os PHA.

29. Processo de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o tratamento térmico da mistura de fermentação é realizado a uma temperatura entre 80°C e 125°C.

30. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 29, caracterizado pelo fato de que compreende, adicionalmente, a secagem da mistura de extração compreendendo os PHA.

31. Processo para preparar uma fonte de carbono para a produção de polihidroxialcanoatos (PHA), caracterizado pelo fato de que compreende: fornecer uma corrente de resíduos compreendendo materiais lignocelulósicos; adicionar um mineral contendo cálcio à corrente de resíduos; tratar termicamente a corrente de resíduos na presença do mineral contendo cálcio, para esterilizar a corrente de resíduos e obter uma corrente de resíduos tratada como a fonte de carbono para a produção de PHA.

32. Processo de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a corrente de resíduos é uma corrente de lama ativada de polpa e papel.

33. Processo de acordo com a reivindicação 31 ou 32, caracterizado pelo fato de que o mineral contendo cálcio compreende pelo menos um dentre carbonato de cálcio, hidróxido de cálcio e óxido de cálcio.

34. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 33, caracterizado pelo fato de que o mineral contendo cálcio compreende hidróxido de cálcio.

35. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 33,

caracterizado pelo fato de que o mineral contendo cálcio compreende cal.

36. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 35, caracterizado pelo fato de que a adição do mineral contendo cálcio à corrente de resíduos é realizada antes do tratamento térmico da corrente de resíduos.

37. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 35, caracterizado pelo fato de que a adição do mineral contendo cálcio à corrente de resíduos é realizada durante o tratamento térmico da corrente de resíduos.

38. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 37, caracterizado pelo fato de que o tratamento térmico da corrente de resíduos é realizado a uma temperatura de pelo menos 120°C.

39. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 38, caracterizado pelo fato de que compreende, adicionalmente, filtrar a corrente de resíduos para remover fibras grossas, antes de adicionar o mineral contendo cálcio à corrente de resíduos, obtendo, desse modo, um filtrado da corrente de resíduos.

40. Processo de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que compreende, adicionalmente, assentar o filtrado da corrente de resíduos para decantar sólidos não filtrados, antes de adicionar o mineral contendo cálcio à corrente de resíduos, obtendo, desse modo, uma corrente de resíduos decantada.

41. Processo de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que compreende, adicionalmente, antes de adicionar o mineral contendo cálcio à corrente de resíduos, lavar a corrente de resíduos decantada para obter sólidos lavados.

42. Processo de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que lavar a corrente de resíduos decantada compreende: centrifugar a corrente de resíduos decantada para obter sólidos centrifugados.

43. Processo de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que compreende, adicionalmente: ressuspender os sólidos centrifugados em um meio aquoso, para obter uma suspensão; e re-centrifugar a suspensão para obter os sólidos centrifugados.

44. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 43, caracterizado pelo fato de que compreende, adicionalmente, antes de adicionar o mineral contendo cálcio à corrente de resíduos: ajustar uma concentração de sólidos suspensos (SS) na corrente de resíduos para uma concentração predeterminada, para obter uma corrente de resíduos condicionado; e adicionar o mineral contendo cálcio à corrente de resíduos condicionado, em que tratar termicamente a corrente de resíduos compreende o tratar termicamente a corrente de resíduos condicionado.

45. Processo de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que o ajuste da concentração de SS é realizado nos sólidos lavados.

46. Processo de acordo com a reivindicação 44 ou 45, caracterizado pelo fato de que a concentração predeterminada está entre 5 g/L e 50 g/L.

47. Processo de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que a concentração predeterminada está entre 10 g/L e 20 g/L.

48. Processo para produzir polihidroxialcanoatos (PHA), caracterizado pelo fato de que compreende: fornecer uma corrente de resíduos tratado, em que a corrente de resíduos tratada é obtida por um processo compreendendo: adicionar um mineral contendo cálcio a uma corrente de resíduos; e tratar termicamente a corrente de resíduos na presença do mineral contendo cálcio, para esterilizar a corrente de resíduos; fermentar pelo menos uma cepa de microrganismo produtor de PHA em um meio de cultura compreendendo a corrente de resíduos tratada como uma fonte de carbono, para produzir os PHA; e extrair os PHA do microrganismo produtor de PHA.

49. Processo de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que a corrente de resíduos é uma corrente de lama ativada de polpa e papel.

50. Processo de acordo com a reivindicação 48 ou 49, caracterizado pelo fato de que o mineral contendo cálcio compreende pelo menos um dentre carbonato de cálcio, hidróxido de cálcio e óxido de cálcio.

51. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 50, caracterizado pelo fato de que o mineral contendo cálcio compreende hidróxido de cálcio.

52. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 50, caracterizado pelo fato de que o mineral contendo cálcio compreende cal.

53. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 52, caracterizado pelo fato de que a adição do mineral contendo cálcio à corrente de resíduos é realizada antes do tratamento térmico da corrente de resíduos.

54. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 52, caracterizado pelo fato de que a adição do mineral contendo cálcio à corrente de resíduos é realizada durante o tratamento térmico da corrente de resíduos.

55. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 54, caracterizado pelo fato de que o tratamento térmico da corrente de resíduos é realizado a uma temperatura de pelo menos 120°C.

56. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 55, caracterizado pelo fato de que compreende, adicionalmente, filtrar a corrente de resíduos para remover fibras grossas, antes de adicionar o mineral contendo cálcio à corrente de resíduos, obtendo, desse modo, um filtrado da corrente de resíduos.

57. Processo de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo fato de que compreende, adicionalmente, assentar o filtrado da corrente de resíduos para decantar os sólidos não filtrados, antes de adicionar o mineral contendo cálcio à corrente de resíduos, obtendo, desse modo, uma corrente de resíduos decantada.

58. Processo de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que compreende, adicionalmente, antes de adicionar o mineral contendo cálcio à corrente de resíduos, lavar a corrente de resíduos decantada para obter sólidos lavados.

59. Processo de acordo com a reivindicação 58, caracterizado pelo fato de que lavar a corrente de resíduos decantada compreende: centrifugar a corrente de resíduos decantada para obter sólidos centrifugados.

60. Processo de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato de que compreende, adicionalmente: ressuspender os sólidos centrifugados em um meio aquoso, para obter uma suspensão; e re-centrifugar a suspensão para obter os sólidos centrifugados.

61. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 60, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente, antes de adicionar o mineral contendo cálcio à corrente de resíduos: ajustar uma concentração de sólidos suspensos (SS) na corrente de resíduos para uma concentração predeterminada, para obter uma corrente de resíduos condicionada; e adicionar o mineral contendo cálcio à corrente de resíduos condicionado,

em que tratar termicamente a corrente de resíduos compreende tratar termicamente a corrente de resíduos condicionada.

62. Processo de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo fato de que o ajuste da concentração de SS é realizado nos sólidos lavados.

63. Processo de acordo com a reivindicação 61 ou 62, caracterizado pelo fato de que a concentração predeterminada está entre 5 g/L e 50 g/L.

64. Processo de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelo fato de que a concentração predeterminada está entre 10 g/L e 20 g/L.

65. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 64, caracterizado pelo fato de que compreende, adicionalmente, adicionar uma fonte de carbono secundária ao meio de cultura, antes e/ou durante a etapa de fermentação.

66. Processo de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelo fato de que a fonte de carbono secundária compreende um ácido carboxílico, um sacarídeo, um óleo, um álcool ou uma combinação dos mesmos.

67. Processo de acordo com a reivindicação 66, caracterizado pelo fato de que o ácido carboxílico compreende ácido acético, ácido propiônico, ácido butírico, ácido valérico, um sal dos mesmos ou uma combinação dos mesmos.

68. Processo de acordo com a reivindicação 66, caracterizado pelo fato de que o sacarídeo compreende glicose, manitol, sacarose ou uma combinação dos mesmos.

69. Processo de acordo com a reivindicação 66, caracterizado pelo fato de que o óleo compreende azeite de oliva, óleo de milho, óleo de palma ou uma combinação dos mesmos.

70. Processo de acordo com a reivindicação 66, caracterizado pelo fato de que o álcool compreende glicerol.

71. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 70,

caracterizado pelo fato de que a etapa de fermentação compreende manter o pH da corrente de resíduos entre 6,5 e 7,5 e/ou manter a temperatura entre 25°C e 35°C.

72. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 71, caracterizado pelo fato de que compreende, adicionalmente, adicionar uma fonte de minerais ao meio de cultura, antes e/ou durante a etapa de fermentação.

73. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 72, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma cepa de microrganismo produtor de PHA é uma cepa única de microrganismo produtor de PHA.

74. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 73, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma cepa de microrganismo produtor de PHA é selecionada a partir do grupo que consiste em Bacillus megaterium, Comamonas testosteroni, Cupriavidus necator 11599, Cupriavidus necator H16, Pseudomonas guezennei biovar. Tikehau, R. eutropha, E. coli, E. coli modificada, Alcaligenes latus, Sphingobacterium sp. ATM, Plasticicumulans acidivorans, Bacillus tequilensis, Haloferax mediterranei, H. mediterranei, Pseudomonas fluorescens A2a5 e Ralstonia eutropha H16.

75. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 74, caracterizado pelo fato de que a extração dos PHA a partir dos microrganismos produtores de PHA compreende o tratamento térmico da mistura de fermentação de modo a lisar pelo menos uma porção dos microrganismos produtores de PHA, liberando, desse modo, os PHA.

76. Processo de acordo com a reivindicação 75, caracterizado pelo fato de que o tratamento térmico da mistura de fermentação é realizado a uma temperatura entre 80°C e 125°C.

77. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 76,

caracterizado pelo fato de que compreende, adicionalmente, secar a mistura de extração compreendendo os PHA.

78. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 30 e 48 a 77, caracterizado pelo fato de que compreende manter uma concentração de carbono no meio de cultura a uma concentração de carbono ótima com base no consumo de carbono do microrganismo produtor de PHA.

79. Invenção de produto, processo, sistema, kit ou uso, caracterizada pelo fato de que compreende um ou mais elementos descritos no presente pedido de patente.

Petição 870210071732, de 06/08/2021, pág. 56/65 Mineral Contendo Ca 12

Detoxificação- Fermentação Extração Secagem Esterilização 15 18 22 13 1/10

Corrente de Corrente de Resíduos Mistura de Mistura de resíduos Fermentação Extração 11 Tratada 16 20 14

Petição 870210071732, de 06/08/2021, pág. 57/65 Fonte de Carbono Mineral Adicional Fonte de Minerais Contendo Ca 12

Condicionamento Detoxificação- Fermentação Extração Secagem 300 Esterilização 15 18 22 13 2/10

Corrente de Corrente de resíduos Corrente de resíduos Mistura de Mistura de PHA Resíduos Condicionada Tratada Fermentação Extração 24 11 114 14 16 20 Microrganismo Produtor de PHA

Petição 870210071732, de 06/08/2021, pág. 58/65 Sobrenadante Sobrenadante

Deposição- Centrifugação Nova suspensão Filtração 109 103 Decantação 107 105

Corrente de Resíduos Filtrado da Corrente Corrente de resíduos Sólidos 11 de Decantada Centrifugados 108 Sólidos suspensos Resíduos 104 106 Novamente 110 3/10

Ajuste de Centrifugação conc. de SS 111 113

Corrente de resíduos Sólidos Sobrenadante Condicionada Centrifugados 112 114

Filtração para remover material grosseiro Adição de Mineral contendo Ca e esterilização Após a fermentação (Exemplo 9) - Conteúdo de PHA - 54% (p/p) - Conc. de biomassa - 40 g/L - Rendimento de PHA (g/g de Uso de lama (sem decantação) substrato como meio para produção de PHA consumido) - 0,36

Petição 870210071732, de 06/08/2021, pág. 59/65 Lama ativada de polpa e papel Decantação por 6h Porção líquida da lama - descartada

Sólidos de lama Lama lavada concentrados Lama não lavada sedimentados

Sólidos de lama centrifugados a 8000 rpm por 10 min Concentração de sólidos de lama ajustada para 15 4/10 g/L em água da torneira e usada como meio para Sobrenadante produção de PHA de descarte Pellets de sólidos de lama Adição de Mineral contendo Ca e esterilização Após fermentação com lama não lavada (Exemplo 5, Figura 8) - Conteúdo de PHA - 55,7% (p/p) Pellets de sólidos de lama suspensos novamente - Conc. de biomassa - 38,9 g/L em água e centrifugados a 8000 rpm por 10 min - Rendimento de PHA (g/g de Sobrenadante substrato de descarte consumido) - 0,34 Após fermentação com lama não lavada Concentração de sólidos de lama ajustada para 15 g/L em (Exemplo 5, Figura 7) água da torneira e usada como meio para produção de PHA - Conteúdo de PHA - 72% (p/p) Adição de Mineral - Conc. de biomassa - 41,2 g/L contendo Ca - Rendimento de PHA (g/g de Recuperação de PHA e esterilização substrato consumido) - 0,54

Petição 870210071732, de 06/08/2021, pág. 60/65 Log(CFU/mL) 5/10

Tempo(h) Meio sintético (Glicose somente) Meio de lama com glicose

FIGURA 5. Comparação da tendência de crescimento de microrganismo produtor de PHA usando meio sintético e meio sintético incorporado com lama (fortificado com glicose)

Petição 870210071732, de 06/08/2021, pág. 61/65 Conc. de RS e NPCM (g/L) 6/10

Tempo(h) conc.

PHA.. conc. de SS.

Consumo de RS(g/L) e % de PHA (p/p)

Conc. de RS (g/L) Conc. de NPCM (g/L) Conc. de SS (g/L) % de PHA (p/p) Conc. de PHA (g/L) Consumo de RS (g/L)

FIGURA 6. Perfil de SS, concentração de RS, consumo de RS, NPCM, concentração de PHA e teor de PHA durante a fermentação por batelada alimentada para lama lavada de polpa e papel e tratada com Ca(OH)2 (15g/L) fortificada com glicose (A seta na figura representa os pontos quando a alimentação de glicose e sais foi adicionada)

Petição 870210071732, de 06/08/2021, pág. 62/65 sabão(g/L) Conc. de SS.NPCM.glicerol e 7/10

% de pha (p/p) e conc. de PHA(g/L)

Tempo(h)

Conc. de SS (g/L) Conc. de glicerol (g/L) Conc. de sabão (g/L)

Conc. de NPCM (g/L) % de PHA (p/p) Conc. de PHA (g/L)

FIGURA 7. Perfil de SS, concentração de Glicerol e sabão, NPCM, concentração de PHA e teor de PHA durante fermentação por batelada alimentada e lama lavada de polpa e papel tratada com Ca(OH)2 (15g/L) fortificada com solução de glicerol bruto

Petição 870210071732, de 06/08/2021, pág. 63/65 % DE PHA (P/P) E CONC.

DE SS(g/L) 8/10

PHA.

CONC.

DE GLICEROL.SABÃO E NPCM (g/L) TEMPO(H)

Conc. de PHA (g/L) Conc. de NPCM (g/L) Conc. de glicerol (g/L) Conc. de sabão (g/L) SS(g/L) PHA (%p/p)

FIGURA 8. Perfil de SS, concentração de Glicerol e sabão, NPCM, concentração de PHA e teor de PHA durante fermentação por batelada alimentada para lama não lavada de polpa e papel tratada com Ca(OH)2 (15g/L) fortificada com solução de glicerol bruto

Petição 870210071732, de 06/08/2021, pág. 64/65 Conc. de NPCM. glicerol e sabão(g/L) 9/10

% de PHA (p/p) e conc. de PHA e de SS(g/L)

tempo(h)

NPCM(g/L) Conc. de glicerol (g/L) Conc. de sabão (g/L) SS(g/L) % de PHA (p/p) PHA(g/L)

FIGURA 9. Perfil de SS, concentração de Glicerol e sabão, NPCM, concentração de PHA e teor de PHA durante fermentação por batelada alimentada para lama não lavada de polpa e papel tratada com Ca(OH)2 (25g/L) fortificada com solução de glicerol bruto

Petição 870210071732, de 06/08/2021, pág. 65/65 Conc. de SS.NPCM e PHA(g/L) 10/10

% de teor de PHA e conc. de ácido acético(gC/L)

tempo(h)

Conc. de PHA (g/L) Conc. de NPCM (g/L) Conc. de ácido acético (g carbono/L) Conc. de SS (g/L) % de PHA (p/p)

FIGURA 10. Perfil de teor de PHA de biomassa e concentração de SS, PHA, NPCM e ácido acético durante a fermentação por batelada alimentada de lama lavada de polpa e papel tratada com Ca(OH)2 (25g/L) fortificada com ácido acético (6N)