JP4777778B2 - バクテリア発酵液からポリ−β−ヒドロキシアルカノエート(PHAs)を直接分離、抽出及び精製する方法 - Google Patents
バクテリア発酵液からポリ−β−ヒドロキシアルカノエート(PHAs)を直接分離、抽出及び精製する方法 Download PDFInfo
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Description
(1)物理的方法によって、発酵液に対し、細胞壁を破る前処理を行う段階である。
(2)前処理された発酵液のpH値をアルカリ性になるように調整する段階である。
(3)アニオン性界面活性剤を添加して、撹拌しながら反応させる段階である。
(4)反応液の中から凝集沈澱物を分離及び抽出する段階である。
(5)洗浄し、乾燥させる段階である。
アルカリゲネス・エントロファス(Alcaligenes entrophus)突然変異種65−7の発酵液を1000ml取り、その中の細胞の乾燥重量が142g/l,PHBVの含有量が78.5%であった。ボールミル(530rpm回転数、0.1mmのスチールボールで)前処理を40分間行い、30%の水酸化ナトリウム溶液でpHを12までに調整し、ドデシル硫酸ナトリウムを13g加え、反応温度を32℃まで調整した。次いで、5分間撹拌しながら反応をさせ、濾紙を用いて真空吸引濾過をし、得られた凝集沈澱物を水で洗液が中性を呈するまで洗浄し、約70℃で一定重量まで加熱乾燥させた。得られた製品の純度は98.2%であり、重量平均分子量は5.2×105Daであり、抽出収率は85.2%であった。真空吸引濾過の廃水は、嫌気性および好気性処理後、そのCOD、BODはそれぞれ800mg/lと30mg/lになり、国家の放流規格(discharge standard)に達するようになる。
アルカリゲネス・エントロファス(Alcaligenes entrophus)菌発酵液を100ml取り、その中の細胞の乾燥重量が147g/l、PHBVの含有量が75.2%であった。超音波(仕事率1500W)で細胞を破る処理(細胞破壁)をし、30%のNaOH溶液でpHを8まで調整し、ドデシル硫酸ナトリウムを0.5g、ポリアクリル酸ナトリウムを5g加え、反応温度を70℃まで調整した。次いで、30分間撹拌しながら反応をさせ、濾紙を用いて真空吸引濾過をし、得られた凝集沈澱物を水で洗浄し、洗液が中性を呈するまで洗浄した後、約70℃の乾燥器の中において、一定重量まで乾燥させた。得られた製品は純度が93.2%で、分子量が4.1×105Da、抽出収率が80.3%であった。
アルカリゲネス・エントロファス菌発酵液を50ml取り、その中の細胞の乾燥重量が102g/l、PHB含有量は60%であった。ボールミル(560rpm、0.1mmのスチールボール)で細胞破壁の前処理を30分間行い、NH3・H2O溶液でpHを13までに調整し、ドデシル硫酸ナトリウムを10g、変性澱粉を10g加えて反応温度を10℃まで調整した。次いで、10分間撹拌しながら反応を行い、遠心機(分離因数(separation factor)は600)で分離させ、得られた凝集沈澱物を水で洗浄し、洗浄液が中性を呈するまで洗浄してから、約70℃の乾燥器の中におき、一定の重量まで乾燥させた。得られた製品は純度が98.2%で、分子量が4.4×105Daで抽出収率が87%であった。
アルカリゲネス・エントロファス突然変異種65−7の発酵液を500ml取り、細胞の乾燥重量は135g/l、PHB含有量は75.5%であった。これを特製の容器に置き、60MPaまで昇圧し、10分間経過した後、圧力を急速に開放し、液体を収集してから、2回繰り返した。処理された後の発酵液を30%水酸化ナトリウム溶液によってpHを10までに調整し、ドデシルアルコール・ポリオキシエチレン・エーテル硫酸ナトリウム9gを加え、反応温度を38℃まで調整した。次いで、撹拌しながら反応を8分間行い、濾紙を用いて真空吸引濾過をし、得られた沈澱物を洗浄液が中性を呈するまで洗浄し、約70℃で一定の重量まで乾燥させた。得られた製品は純度が96.7%で、重量平均分子量が4.2×105Daで、抽出収率が81.5%であった。
アルカリゲネス・エントロファス菌発酵液を100Lとり、その中の細胞の乾燥重量は154g/l、PHBV含有量は80.5%であった。これを超音波(仕事率が2800Wで連続で処理する)によって40分間細胞破壁の前処理をし、30%NaOH溶液によって、pHを11までに調整した。さらに、ドデシル硫酸ナトリウム10kgと、ポリアクリル酸ナトリウム0.5kgを加え、反応温度を50℃まで調整し、撹拌しながら反応を60分間行った。次いで、圧力濾過機によって、圧力濾過を行い、得られた沈澱物を水で洗浄し、pHが中性を呈するまで洗浄した後、約70℃の乾燥器内に置き、一定の重量まで乾燥させた。得られた製品は、純度が97%で、分子量が5.3×105Daで、抽出収率が84%であった。
シュードモナス(Pseudomonas)菌の発酵液を100mlとり、その中の細胞の乾燥重量は86g/lであり、PHBV含有量は61.5%であった。これをボールミル(560rpm、0.1mmスチールボール)で前処理を50分間行い、30%水酸化ナトリウムによってpHを11まで調整した。さらに、ドデシル硫酸ナトリウム3gを加え、反応温度を24℃まで調整し、10分間撹拌しながら反応を行った。次いで、濾紙を用いて真空吸引濾過をし、得られた沈澱物を水で洗浄液が中性を呈するまで洗浄し、約70℃で一定の重量まで乾燥させた。得られた製品は、純度が94.2%で、重量平均分子量が3.2×105Daであり、抽出収率が71.2%であった。
Claims (9)
- 細菌発酵液の中から細胞内のポリ−β−ヒドロキシアルカノエートを分離及び精製する方法であって、
(1)物理的方法によって、発酵液に対し、細胞壁を破る前処理を行う段階と;
(2)前処理された発酵液のpH値をアルカリ性になるように調整する段階と;
(3)アニオン性界面活性剤を添加して、撹拌しながら反応させる段階と;
(4)反応液の中から凝集沈澱物を分離及び抽出する段階と;
(5)洗浄し、乾燥させる段階と;
を含み、
前記物理的方法は、機械破砕又は超音波破砕を含み、
前記機械破砕は、ボールミリング或いは高圧均質化処理を含み、
pH調整する段階と界面活性剤を添加する段階は互いに交換可能であることを特徴とする方法。 - 前記段階(3)で、更に凝集剤を添加することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記機械粉砕は、ボールミリングであることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記前処理後の発酵液のpHを8〜13に調整することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記pH調整に用いるアルカリ性物質は、NaOH、Na2CO3、NaHCO3の固体もしくは水溶液、またはアンモニア水であることを特徴とする、請求項1または4に記載の方法。
- 前記アニオン性界面活性剤は、アルキレンスルホン酸塩、脂肪族アルコール硫酸塩、脂肪族アルコールポリオキシエチレンエーテル硫酸塩、脂肪族アルコールポリオキシエチレンエーテルまたはアルキルフェノールポリオキシエチレンエーテルであり、その添加量は、発酵液の量の0.5%〜20%(W/V)であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記凝集剤は、ポリアクリル酸ナトリウム、変性澱粉またはポリアミンより選択され、その添加量は、発酵液の量の0.5%〜20%(W/V)であることを特徴とする、請求項2に記載の方法。
- 前記撹拌反応の温度は、10℃〜70℃であり、反応時間は、5〜60分間であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記反応液中の凝集沈澱物を分離及び抽出する方法は、遠心分離、圧力濾過または真空吸引濾過より選択されることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
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