JP2001340095A

JP2001340095A - 生体細胞からのポリヒドロキシアルカン酸の分離方法

Info

Publication number: JP2001340095A
Application number: JP2001067254A
Authority: JP
Inventors: Takeshi Imamura; 剛士今村; Takashi Kenmoku; 敬見目; Tomohiro Suzuki; 智博鈴木; Tsutomu Honma; 務本間; Takeshi Nomoto; 毅野本; Etsuko Sugawa; 悦子須川; Tetsuya Yano; 哲哉矢野
Original assignee: Canon Inc
Current assignee: Canon Inc
Priority date: 2000-03-28
Filing date: 2001-03-09
Publication date: 2001-12-11

Abstract

(57)【要約】【課題】微生物生産ポリエステルであるポリヒドロキ
シアルカン酸(ＰＨＡ)を、ラージスケールにおいて有機
溶剤の使用を最小限の量にとどめることができ、かつ効
率的に分離可能な方法を提供する。【解決手段】ポリヒドロキシアルカン酸を含有する生
体細胞から、ポリヒドロキシアルカン酸を回収する方法
であって、該生体細胞にマイクロ波を照射する工程を含
むことを特徴とする生体細胞からのポリヒドロキシアル
カン酸の分離方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、微生物により生産
・蓄積されたポリヒドロキシアルカン酸の、生体細胞か
らの分離方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ポリ３-ヒドロキシ酪酸(ＰＨＢ)に代表
される微生物産生ポリエステル(ポリヒドロキシアルカ
ン酸；以下ＰＨＡと記載)は、石油由来の合成高分子と
は異なり、生物により分解されうるという特性を有して
いる。人類は長年にわたって合成高分子をプラスチック
等として使用してきたが、それらのプラスチックが廃棄
物となった場合、その分解されにくいという性質が災い
し、廃棄物処理場に蓄積される。また、焼却処理を行な
うことにより、ダイオキシンや環境ホルモン等の有害物
質の原因となり、環境汚染を引き起こすことが問題とな
っている。一方、微生物産生ＰＨＡは生分解されること
により自然の物質循環に取り込まれるので、環境保全を
可能とするプラスチックとして利用することができる。
また、医療用軟質部材としても今後有用視される可能性
を有している(特開平５-１５９号公報)。

【０００３】これまで、多くの細菌がＰＨＢ或いはその
他のヒドロキシアルカン酸とのコポリマーを菌体内に生
成・蓄積することが報告されてきた(「生分解性プラス
チックハンドブック」(生分解性プラスチック研究会
編；(株)エヌ・テイー・エス)、p178-197)。特に、アル
カリゲネス・ユウトロファスＨ16株(Ａlcaligenes eutr
ophus Ｈ16、ＡＴＣＣＮo.17699)及びその変異株はこ
れらポリマーの生産に関し詳細に研究されてきており、
基質となる炭素源を変化させることによって、３-ヒド
ロキシ酪酸(３ＨＢ)と３-ヒドロキシ吉草酸(３ＨＶ)の
共重合体または両者の各単位を共に含有成分とする共重
合体を様々な割合で生成することが開示されている(特
公平６-１５６０４号公報、特公平７-１４３５２号公
報、特公平８-１９２２７号公報等)。

【０００４】特許公報第２６４２９３７号には、シュー
ドモナス・オレオボランス(Ｐseudoｍonas oleovorans)
ＡＴＣＣ 29347株に、炭素源として非環状脂肪族炭化水
素を与えることにより、炭素数が６から１２までの３-
ヒドロキシアルカン酸(３ＨＡ)をモノマーユニットとす
るポリエステルを生産することが開示されている。

【０００５】特開平５-７４４９２号公報には、メチロ
バクテリウム(Ｍethylobacteriuｍ)属、パラコッカス(P
aracoccus)属、アルカリゲネス属、シュードモナス属の
バクテリアを、炭素数３から７の第一アルコールに接触
させることにより３ＨＢと３ＨＶの共重合ポリエステル
を生産せしめる方法が開示されている。

【０００６】特開平５-９３０４９号公報、及び特開平
７-２６５０６５号公報には、アエロモナス・キャビエ
(Ａeroｍonas Ｃaviae)がオレイン酸やオリーブオイル
を炭素源として培養することにより３ＨＢと３-ヒドロ
キシヘキサン酸(３ＨＨx)の２成分共重合ポリエステル
を生産することが開示されている。

【０００７】特開平９-１９１８９３号公報には、コマ
モナス・アシドボランス(Ｃoｍaｍonas acidovorans)I
ＦＯ 13852株が、炭素源としてグルコン酸及び１,４ブ
タンジオールを用いた培養により、３ＨＢと４-ヒドロ
キシ酪酸(４ＨＢ)をモノマーユニットに持つポリエステ
ルを生産することが開示されている。

【０００８】この様な、微生物により生産・蓄積された
ＰＨＡは、通常ＰＨＡが溶解する有機溶剤、具体的には
クロロホルムやジクロロメタン等の塩素系有機溶剤で菌
体から抽出する方法が一般的である。しかし、大規模生
産を考えた場合、微生物菌体よりＰＨＡを分離するため
には、上記の方法では大量に塩素系有機溶剤を使用する
こととなり、現実的ではない。

【０００９】この様な観点から、微生物菌体等の生体細
胞からＰＨＡを分離する際に、有機溶剤を使用しない方
法が様々に研究されてきている。

【００１０】特開昭５７-１７４０９４号公報には、Ｐ
ＨＡ蓄積菌体を加温加圧し、圧力を開放することにより
菌体を破砕して微生物菌体からＰＨＡを分離する方法が
開示されている。

【００１１】米国特許４５６２２４５号公報及び特開昭
５９-２０５９９２号公報には、ＰＨＢ含有菌体をタン
パク質分解酵素組成物で細胞を消化し、ＰＨＢを分離す
る方法が開示されている。

【００１２】米国特許４９１０１４５号公報及び特開昭
６０-１４５０９７号公報には、タンパク質分解酵素や
界面活性剤等の細胞成分可溶化剤をもちいてＰＨＢを菌
体から分離する方法が開示されている。

【００１３】特開昭６３-２２６２９１号公報には、菌
体をスフェロプラストヘ変換し、音波振動処理によって
これらを破砕し、そして遠心分離したのちに形成される
最上層のＰＨＡを分離する方法が記載されている。

【００１４】特開平５-３３６９８２号公報には、ＰＨ
Ａ蓄積微生物の細胞質をプロテアーゼで溶解させ、界面
活性剤を用いて当該重合体及び/又は共重合体を精製す
る方法が開示されている。

【００１５】特開平７-３１４８７号公報、特開平７-３
１４８８号公報、特開平７-３１４８９号公報には、Ｐ
ＨＢ含有菌体をアルカリで処理し、ＰＨＢを分離する方
法、高温高圧処理し、ＰＨＢを分離する方法、両者を組
み合わせてＰＨＢを分離する方法が開示されている。

【００１６】特表平８-５０８８８１号公報には、ＰＨ
Ａ蓄積菌体をタンパク質分解酵素処理した後、適当なキ
レート剤で処理し、更に過酸化水素処理を行なうことで
ＰＨＡを菌体から分離する方法が開示されている。

【００１７】

【発明が解決しようとする課題】このように、微生物生
産ポリエステルであるポリヒドロキシアルカン酸(ＰＨ
Ａ)を、溶媒を使用せずに分離する方法は様々開示され
てきているが、回収率が上がらない、純度が高くない、
分子量が低下するなど、様々な問題点が少なからず存在
し、実用上必ずしも十分であるとは言えない。一方ＰＨ
Ａの利用は今後ますます拡がっていくことが予想され、
ＰＨＡをラージスケールで効率的に、かつ高純度・高品
質で分離する必要性はますます高まっている。従来分離
プロセスではかかる理想的分離には多量の有機溶剤とり
わけ塩素系有機溶剤が大量に必要とされていたが、これ
を最小限の使用量で分離効率・品質を保つことを可能に
すること、あるいは全く使用しない場合でも従来よりも
分離効率・品質にかなりの改善が認められるような方法
の開発が強く望まれていた。

【００１８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、この様な
課題を解決すべく鋭意研究の結果以下のような、微生物
菌体等の生体細胞からのポリヒドロキシアルカン酸(Ｐ
ＨＡ)の分離方法を発明するに至った。即ち本発明は、
ポリヒドロキシアルカン酸を含有する生体細胞から、ポ
リヒドロキシアルカン酸を回収する方法であって、該生
体細胞にマイクロ波を照射する工程を含むことを特徴と
する生体細胞からのポリヒドロキシアルカン酸の分離方
法に関するものである。

【００１９】

【発明の実施の形態】マイクロ波を照射した後の処理方
法の一つは、マイクロ波を照射した該微生物菌体等の生
体細胞をポリヒドロキシアルカン酸が溶解しうる溶媒に
より回収し、次いでＰＨＡが溶解しない溶媒によりポリ
ヒドロキシアルカン酸を洗浄する方法がある。この場
合、ＰＨＡが溶解しうる溶媒として、従来から抽出に用
いられているクロロホルムを用いた場合はいかなるヒド
ロキシアルカン酸ユニットを含んでいるＰＨＡでも非常
に良好な結果が得られる。溶媒の使用量はＰＨＡの溶解
に必要なだけでよく、例えばマイクロ波を照射した該微
生物菌体１g(乾燥重量)当たり 0.1ｍLから 15ｍL、好ま
しくは１ｍLから 10ｍLあればよい。すなわち従来の抽
出のみのプロセスのように問題となる大量使用の必要が
ない。

【００２０】炭素数が６以上のヒドロキシアルカン酸ユ
ニットが組成の大部分をなすＰＨＡであればより害の少
ないアセトンでも良好に溶解する。更にユニットの構造
によってはジオキサン、テトラヒドロフラン、アセトニ
トリルも用いることができる。

【００２１】また、ＰＨＡが溶解しない溶媒としては、
メタノール、エタノールを用いることができる。

【００２２】マイクロ波を照射した後の処理方法のもう
一つは、マイクロ波を照射した該水性懸濁液を、ＰＨＡ
以外の微生物菌体等の生体細胞成分の可溶化剤処理を行
なう工程を含む方法がある。この場合、可溶化剤として
は、菌体成分加水分解酵素或いは界面活性剤、或いはそ
の両方が使用される。用いる菌体成分加水分解酵素とし
てはプロテアーゼ、リパーゼ、リゾチーム、パパイン
等、通常菌体成分加水分解酵素として用いられているも
のならいかなるものでも使用可能である。用いる界面活
性剤としては、硫酸ドデシルナトリウム塩(ＳＤＳ)やト
リトンＸ等、通常菌体成分を変成・可溶化させうるよう
なものならいかなる物でも用いることができる。

【００２３】更に、マイクロ波照射と併せて、菌体の水
性懸濁液のpＨを 10以上に調整する方法もとりうる。具
体的には水酸化ナトリウムや水酸化カリウムを 0.01ｍo
l/Lから 0.5ｍol/L(0.01規定から 0.5規定)程度の濃度
で加え、よく攪拌した後にマイクロ波照射を行なうと良
いが、水酸化ナトリウムや水酸化カリウムの濃度は用い
る微生物によって異なり、ＰＨＡの分子量低下や変成を
防ぐために最小限にとどめることが望ましい。

【００２４】逆に、菌体の水性懸濁液のpＨを２以下に
調整する方法もとりうる。具体的には硫酸を 10％から
50％(v／v)程度の濃度で加え、よく攪拌した後にマイク
ロ波照射を行なうと良いが、硫酸の濃度は用いる微生物
によって異なり、ＰＨＡの分子量低下や変成を防ぐため
に最小限にとどめることが望ましい。

【００２５】これらのようにpＨを調整した後マイクロ
波を照射した場合には、中和操作が必要となるが、処理
後の溶液を直接中和した場合は不溶成分が多量に発生す
るので、反応後一旦遠心分離等で分離した後、再懸濁液
を中和することが望ましい。

【００２６】更に、マイクロ波照射と併せて、菌体の水
性懸濁液に予め界面活性剤処理を行なう方法もとりう
る。用いる界面活性剤としては、硫酸ドデシルナトリウ
ム塩(ＳＤＳ)やトリトンＸ等、通常菌体成分を変成・可
溶化させうるようなものならいかなる物でも用いること
ができる。

【００２７】マイクロ波処理方法では、菌体質量の５か
ら 50倍量、好ましくは 10から 30倍量の水性媒体を用
いて、100ｍL当り出力 0.5から２kＷ、好ましくは 0.8
から1.7kＷの高周波(周波数 900から 2500ＭＨz程度)を
照射する方法が用いられる。実験室レベルでは市販の電
子レンジで十分であるが、大規模な抽出操作の場合には
特開平８-２０００９号公報に開示されているような大
型の装置が必要となる。

【００２８】本発明の方法を用いることができる生体細
胞は、体内にＰＨＡを蓄積する等の生体細胞であればい
かなる等の生体細胞でもよく、主には微生物菌体、更に
はＰＨＡ生産遺伝子を組み換えた植物細胞にも応用する
ことができる。

【００２９】以下実施例により本発明をさらに詳細に説
明する。

【００３０】各実施例で用いたＭ９培地は下記の組成を
有するものである。Ｍ９培地組成(１リットル中): Ｎa₂ＨＰＯ₄ ６.２g ＫＨ₂ＰＯ₄ ３.０g ＮaＣl ０.５g ＮＨ₄Ｃl １.０g 水残部 (pＨ７.０) 本実施例で用いた微生物はラルストニアユウトロファ
ＴＢ64株(Ｒalstoniaeutropha ＴＢ64、特開２０００-
１６６５８７号公報に開示；経済産業省産業技術総合研
究所生命工学工業技術研究所に寄託(寄託番号:ＦＥＲＭ
ＢＰ-6933))、及びシュードモナスオレオボランス(Ps
eudoｍonas oleovorans)ＡＴＣＣ 29347(Ａmerican Ｔy
pe Ｃulture Ｃollection より分譲)である。

【００３１】

【実施例】[実施例１]ピルビン酸ナトリウム 0.1％を含
有するＭ９寒天培地上のＴＢ64株のコロニーを、500ｍL
容振とうフラスコ中の、ピルビン酸ナトリウム 0.5％を
含有するＭ９培地 200ｍLに植菌し、30℃で振とう培養
した。24時間後、菌体を遠心分離によって収穫し、窒素
源であるＮＨ₄Ｃlを含まない、ピルビン酸ナトリウム
0.5％を含有するＭ９培地 200ｍLに再懸濁し、同様に振
とうして菌体にＰＨＢを蓄積させた。24時間後、ＰＨＢ
蓄積菌体を遠心分離によって収穫し、蒸留水 40ｍLに再
懸濁して４等分した。これらを１から４まで番号をつ
け、以下の処理を行なった。

【００３２】１：対照:メタノールで洗浄し、凍結乾燥
して秤量した後クロロホルムで 60℃、24時間抽出操作
を行なった。

【００３３】２：５ｍol/L(５規定)の水酸化ナトリウム
を、最終濃度 0.1ｍol/L(0.1規定)になるように加え、
室温で 10分間攪拌した。

【００３４】３：１の操作を行なった後、家庭用電子レ
ンジ(0.8kＷ、2450ＭＨz)で５分間処理した。

【００３５】４：家庭用電子レンジ(0.8kＷ、2450ＭＨ
z)で８分間処理した。

【００３６】番号２から４は、処理後蒸留水 30ｍLを加
え良く攪拌した後遠心分離(8000rpｍ、10分間)し、更に
再度後蒸留水 40ｍLを加え良く攪拌した後遠心分離し
(２に関しては希塩酸によりpＨ７程度まで中和し)、沈
殿物を凍結乾燥し、秤量した。

【００３７】以下に示す「回収率」及び「純度」を評価
する為、次の操作を行なった。

【００３８】凍結乾燥した１から４までの試料にクロロ
ホルム 30ｍLを加え、60℃で 24時間攪拌抽出操作を行
なった。ＰＨＢが抽出されたクロロホルム溶液を 0.45
μｍのＰＴＦＥフィルターでろ過し、ロータリーエバポ
レーターで濃縮して 10倍量のメタノールに注加しＰＨ
Ｂを沈殿、回収した。これらを減圧乾燥して秤量した。

【００３９】対照である１における、クロロホルム抽出
によって得られたＰＨＢに対する、対から、のクロロホ
ルム抽出によって得られたＰＨＢの質量比を回収率、各
試料の、クロロホルム抽出前の試料に対するクロロホル
ム抽出によって得られたＰＨＢの質量比を純度とし、表
１に示す。

【００４０】

【表１】回収率、純度とも、マイクロ波(電子レンジ)処理のみを
行なった試料(４)が最も良好であった。

【００４１】得られたＰＨＢは、ゲルパーミエーション
クロマトグラフイー(ＧＰＣ；東ソーＨＬＣ-8020、カラ
ム:ポリマーラボラトリーＰＬgelＭIＸＥＤ-Ｃ(５μ
ｍ)、溶媒:クロロホルム、ポリスチレン換算)により分
子量を測定した。結果を表２に示す。なお、「試料２」
はピークが２つに分離したため両方を示す。

【００４２】

【表２】対照に対する分子量の低下は、マイクロ波(電子レンジ)
処理のみを行なった試料(４)では全く見られなかった。

【００４３】[実施例２]実施例１と同様にして得られた
ＴＢ64株のＰＨＢ蓄積菌体(各培養液 50ｍL分)を 10ｍL
の蒸留水に再懸濁した試料を２サンプル用意し、試料５
及び６として、以下の処理を行なった。

【００４４】５:家庭用電子レンジ(0.8kＷ、2450ＭＨz)
で５分間処理した。

【００４５】６:５の処理を行なった後、最終濃度 0.2
％となるようにＳＤＳ水溶液を加え、１分間激しく攪拌
した。

【００４６】各サンプルは、実施例１と同様に、処理後
蒸留水 30ｍLを加え良く攪拌した後遠心分離(8000rp
ｍ、10分間)し、更に再度後蒸留水 40ｍLを加え良く攪
拌した後遠心分離し、沈殿物を凍結乾燥し、秤量した。

【００４７】これらの試料を実施例１と同様にクロロホ
ルム抽出し、回収率及び純度を求めた。結果を表３に示
す。なお、回収率の対照は実施例１における試料１のデ
ータを用いた。

【００４８】

【表３】実施例１に比べ温和な条件でマイクロ波処理し、更に界
面活性剤であるＳＤＳ処理を行なうことにより、高い回
収率及び純度でＰＨＢを回収することが可能であった。

【００４９】得られたＰＨＢは実施例１と同様にＧＰＣ
で分子量を測定した。結果を表４に示す。

【００５０】

【表４】分子量の低下は全く見られなかった。

【００５１】[実施例３]n-ノナン酸 0.1％を含有するＭ
９寒天培地上のシュードモナス・オレオボランスのコロ
ニーを、500ｍL容振とうフラスコ中の、n-ノナン酸 0.2
％を含有するＭ９培地 200ｍLに植菌し、30℃で振とう
培養した。24時間後、菌体を遠心分離によって収穫し、
窒素源であるＮＨ₄Ｃlを含まず、n-ノナン酸 0.1％及び
５-フェニル吉草酸 0.1％を含有するＭ９培地 200ｍLに
再懸濁し、同様に振とうして菌体に３-ヒドロキシノナ
ン酸、３-ヒドロキシヘプタン酸、３-ヒドロキシ吉草
酸、及び３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸をユニッ
トとして含むＰＨＡを蓄積させた。24時間後、ＰＨＡ蓄
積菌体を遠心分離によって収穫し、以下の処理を行なっ
た。

【００５２】７：対照:メタノールで洗浄し、凍結乾燥
して秤量した後クロロホルムで 60℃、24時間抽出操作
を行なった。

【００５３】８：30％硫酸水溶液 50ｍLに懸濁し、室温
で 24時間攪拌した。

【００５４】９：30％硫酸水溶液 50ｍLに懸濁した後、
家庭用電子レンジ(0.8kＷ、2450ＭＨz)で１分間処理を
３回繰り返した。

【００５５】これらの試料を実施例１と同様にクロロホ
ルム抽出し、回収率及び純度を求めた。結果を表５に示
す。

【００５６】

【表５】得られたＰＨＡは実施例１と同様にＧＰＣで分子量を測
定した。結果を表６に示す。

【００５７】

【表６】硫酸を加え、マイクロ波処理することにより、幾つかの
ユニットを含んだＰＨＡ成分が、高純度、高回収率で分
子量低下もそれ程なしに回収することが可能であった。

【００５８】

【発明の効果】本発明の方法により、微生物等の生体細
胞内に蓄積されたポリヒドロキシアルカン酸を、簡便な
方法で、且つ本来の分子量をほぼ保ったままで、高い回
収率で回収することが可能となった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｒ 1:38）Ｃ１２Ｒ 1:38） (72)発明者鈴木智博東京都大田区下丸子３丁目30番２号キヤノン株式会社内 (72)発明者本間務東京都大田区下丸子３丁目30番２号キヤノン株式会社内 (72)発明者野本毅東京都大田区下丸子３丁目30番２号キヤノン株式会社内 (72)発明者須川悦子東京都大田区下丸子３丁目30番２号キヤノン株式会社内 (72)発明者矢野哲哉東京都大田区下丸子３丁目30番２号キヤノン株式会社内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ポリヒドロキシアルカン酸を含有する生
体細胞から、ポリヒドロキシアルカン酸を回収する方法
であって、該生体細胞にマイクロ波を照射する工程を含
むことを特徴とする生体細胞からのポリヒドロキシアル
カン酸の分離方法。
【請求項２】マイクロ波を照射した該生体細胞をポリ
ヒドロキシアルカン酸が溶解しうる溶媒で処理すること
によりポリヒドロキシアルカン酸を回収し、次いでポリ
ヒドロキシアルカン酸が溶解しない溶媒により該回収さ
れたポリヒドロキシアルカン酸を洗浄する工程を含む請
求項１に記載の方法。
【請求項３】該ポリヒドロキシアルカン酸が溶解しう
る溶媒がクロロホルム、アセトン、ジオキサン、テトラ
ヒドロフラン、アセトニトリルのいずれか一つである請
求項２に記載の方法。
【請求項４】該ポリヒドロキシアルカン酸が溶解しう
る溶媒の使用量がマイクロ波を照射した該生体細胞１g
(乾燥重量)当たり１ｍLから１０ｍLである請求項２に記
載の方法。
【請求項５】該ポリヒドロキシアルカン酸が溶解しな
い溶媒がメタノール、エタノールのいずれか一つである
請求項２に記載の方法。
【請求項６】マイクロ波を照射した該生体細胞を、ポ
リヒドロキシアルカン酸以外の生体細胞成分を可溶化剤
を用いて溶解処理を行なう工程を含む請求項１に記載の
方法。
【請求項７】該可溶化剤がタンパク質分解酵素及び/
或いは界面活性剤である請求項６に記載の方法。
【請求項８】該生体細胞のpＨを１０以上に調整する
請求項１に記載の方法。
【請求項９】該生体細胞のpＨを２以下に調整する請
求項１に記載の方法。
【請求項１０】該生体細胞に硫酸を加えることを特徴
とする請求項９に記載の方法。