KR100526840B1 - 폴리하이드록시알카노에이트를 생산하는 방법 및 장치 - Google Patents
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Abstract
본 발명은, PHA를 함유하는 셀로부터 폴리하이드록시알카노에이트 PHA이외의 셀성분을 제거함으로써, 고수율을 가진 높게 정제된 PHA를 생산하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은, 차아염소산염을 함유하는 산화제에 의한 처리가 상기 설명한 바와 같이 PHA의 생산시에 행해지는 경우에, 수집된 PHA입자에 잔류된 염소를 단순하게 제거하거나 감소시키는 방법을 제공한다. 상기 설명한 방법중의 하나는, 적어도 차아염소산염을 함유하는 산화제로, 폴리하이드록시알카노에이트를 함유하는 셀을, 처리하는 단계와, 상기 처리된 셀을 수용성 부분과 불수용성 부분으로 분리하는 단계와, 불수용성 부분에 잔류된 염소를 감소시키는 단계를 포함한다. 염소를 감소시키는 단계는, 온수, 티오황산염용액, 또는 폴리하이드록시알카노에트가 용해될 수 있는 적어도 유기극성 용매를 함유하는 극성 용매용액으로 불수용성 부분을 세정하는 단계이어도 된다.
Description
본 발명은, PHA생산이 PHA합성유전자의 도입에 의해 가능한, 미생물의 셀내에 PHA를 생산하여 축적하는 능력을 가진 미생물 또는 식물세포 등의 고등생물을 사용하여 폴리하이드록시알카노에이트(폴리-3-하이드록시알칸산이라 칭하고, 또한 때때로 이하 "PHA"로서 약칭함)를 생산하는 방법에 관한 것이다.
보다 상세하게는, 본 발명은 PHA를 생산하는 방법에 관한 것으로서, 적은 공정수로 PHA이외의 셀성분을 효과적으로 제거할 수 있고, 저비용 또한 고수율로 높게 정제한 PHA를 얻을 수 있는, 산화제로 PHA를 함유하는 셀을 처리함으로써 PHA이외의 셀성분을 제거하는 단계를 포함한다. 또한, 본 발명은 PHA를 생산하는 방법에 관한 것으로서, 잔류하는 염소가 감소되거나 잔류하는 염소가 없는 PHA를 얻을 수 있다.
또한, 본 발명은 PHA를 생산하는 상기 설명한 방법이 행해질 수 있는 장치에 관한 것이다.
지금까지, 다수의 미생물이, 폴리-3-하이드록시부티르산(이하, 때때로 "PHB"로 약칭함)과 기타 PHA를 미생물의 셀내에 생산하고 축적하는 것이 보고되어 있다(문헌「"생분해성 플라스틱 핸드북" 생분해성 플라스틱 연구회편, (주) 엔 티이 에스, p. 178-197」). 이들 폴리머는, 종래의 플라스틱과 마찬가지로, 용융가공 등에 의해 각종 제품의 생산을 위해 이용할 수 있다. 또한, 이들 폴리머는 자연계에서 미생물에 의해 완전분해되는 생분해성의 이점을 가진다. 따라서, 종래의 다수의 합성고분자의 경우와는 달리, 이들 폴리머는 자연환경에 그대로 잔류하여 오염을 발생하게 하지 않고, 또한 소각처리가 필요없고, 따라서 대기오염 또는 지구온난화를 방지하는 관점에서 유용한 재료가 될 수 있다. 또한, 이들 폴리머는 우수한 생체적합성을 가지고, 따라서 의료용 연질부재 등으로서 이들의 응용도 기대되고 있다. 미생물에 의해 생산된 PHA는, PHA의 생산에 이용되는 미생물의 종류, 배지조성, 배양조건 등에 의해 다양한 조성과 구조를 가질 수 있는 것이 알려져 있고, 주로 PHA의 물리적 특성의 개량이라고 하는 관점에서 미생물의 조성과 구조의 제어에 대한 연구가 이루어지고 있다.
예를 들면, 알칼리게네스 유트로퍼스(Alcaligenes eutrophus) H16균주(ATCC No. 17699) 및 돌연변이체는, 그 배양시의 탄소원을 변화시킴으로써 3-하이드록시부티르산 및 3-하이드록시발레르산의 공중합체를 각종 조성비로 생산하는 것이 보고되어 있다(일본국 특허 공개 6-15604호 공보, 동 7-14352호 공보, 동 8-19227호 공보등). 일본국 특개평 5-74492호 공보에는, 메틸로박테리움 속(Methylobacterium sp.), 파라코쿠스 속(Paracoccus sp.), 알칼리게네스 속(Alcaligenes sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.)의 미생물이, 3 내지 7개의 탄소원자를 함유하는 1차 알콜에 접촉함으로써 3-하이드록시부티르산 및 3-하이드록시발레르산의 공중합체를 생산할 수 있는 방법이 개시되어 있다. 일본국 특개평 9-191893호 공보에는, 코마모나스 액시도보란스(Comamonas acidovorans) IFO13852가 탄소원으로서 글루콘산 및 1,4-부탄디올을 사용하여 배양을 행함으로써 3-하이드록시부티르산 유닛 및 4-하이드록시부티르산 유닛을 가진 폴리에스테르를 생산하는 것이 개시되어 있다.
일본국 특허 제 2642937호 공보에는, 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovorans) ATCC 29347이 6 내지 12개의 탄소원자를 포함하는 3-하이드록시알칸산유닛을 가진 PHA를 생산하고, 여기서 비고리식 지방족 탄화수소는 탄소원으로서 형성되어 있는 것이 개시되어 있다. 일본국 특개평 5-93049호 공보 및 동 7-265065호 공보에는, 아에로모나스 카비애(Aeromonas caviae)가 탄소원으로서 올레산 또는 올리브유를 사용하여 배양을 행함으로써, 3-하이드록시부티르산 및 3-하이드록시헥산산의 2개의 성분의 공중합체를 생산하는 것이 개시되어 있다.
상기한 PHA는, 미생물에 의한 탄화수소의 β산화 또는 당류로부터의 지방산의 합성에 의해 합성되고 측쇄에 알킬기를 각각 가진 모노머유닛으로 구성되는 모든 PHA이고, 이들 PHA의 각각은 소위 "통상의 PHA"이다.
미생물의 어떤 종류가, 그 측쇄에 도입된 알킬기 이외의 각종 치환기를 가진 PHA, 즉 소위 "통상의 PHA"를 생산하는 것이 보고 되어 있고, 이러한 수단을 사용하여 미생물에 의해 생산된 PHA의 물리적 특성을 개량하기 위한 시도가 시작되었다. 또한, 미생물에 의해 생산된 PHA의 넓은 응용, 예를 들면, 기능성 폴리머로서의 응용이 고려되는 경우, "통상의 PHA"는 매우 유용하다. 치환기의 예로서는 방향환(페닐기, 페녹시기, 벤조일기 등), 불포화 탄화수소, 에스테르기, 알릴기, 시아노기, 할로겐화 탄화수소, 에폭사이드 등을 함유하는 치환기를 포함한다. 이들 중에서, 특히 방향환을 가진 PHA가 집중적으로 연구되고 있다.
(a) 페닐기 또는 부분페닐기를 가진 PHA
슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovorans)가 5-페닐발레르산을 기질로 해서 유닛으로서 3-하이드록시-5-페닐발레르산을 함유하는 PHA를 생산하는 것에 대하여, 문헌「Makromol. Chem., 191, 1957-1965(1990)」 및 문헌 「Macromolecules, 24, 5256-5260(1991)」에 보고되어 있다. 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovorans)가 5-(4'-톨릴)발레르산을 기질로 해서 3-하이드록시-5-(4'-톨릴)발레르산을 함유하는 PHA를 생산하는 것에 대하여, 문헌 「Macromolecules, 29, 1762-1766(1996)」에 보고되어 있다. 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovorans)가 5-(2',4'-디니트로페닐)발레르산을 기질로 해서 3-하이드록시-5-(2',4'-디니트로페닐)발레르산 및 3-하이드록시-5-(4'-니트로페닐)발레르산을 함유하는 PHA를 생산하는 것에 대하여, 문헌「Macromolecules, 32, 2889-2895(1999)」에 보고되어 있다.
(b) 페녹시기 또는 부분치환페녹시기를 함유한 PHA
슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovorans)가 11-페녹시운데칸산을 기질로 해서 유닛으로서 3-하이드록시-5-페녹시발레르산 유닛 및 3-하이드록시-9-페녹시노난산유닛의 PHA공중합체를 생산하는 것에 대하여, 문헌「Macromol. Chem. Phys., 195, 1665-1672(1994)」에 보고되어 있다. 일본국 특허 제 2989175호에는, 3-하이드록시-5-(모노플루오로페녹시)펜타노에이트 (3H5(MFP)P) 유닛 또는 3-하이드록시-5-(디플루오로페녹시)펜타노에이트(3H5(DFP)P)유닛으로 구성된 단독중합체 및 3H5(MFP)P유닛 또는 3H5(DFP)P 유닛을 적어도 함유하는 공중합체와; 이들 중합체를 합성하는 슈도모나스 속(Pseudomonas oleovorans)의 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)를 사용하여 상기 설명한 중합체를 생산하는 방법에 관한 발명이 개시되어 있다. 이 공보 기재의 발명의 효과는 고융점과 양호한 처리성을 유지하면서 입체규칙성과 발수성을 제공하는 것이다. 또한, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 27N01균주가 각종 3-하이드록시플루오로페녹시발레르산 유닛을 함유하는 PHA를 생산하는 것에 대하여, 일본국 특허공개공보 제2000-72865호에 보고되어 있다.
불소기로 치환된 상기 물질이외에 시아노기와 니트로기로 치환된 물질에 관한 연구가 행해지고 있다. 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovorans) ATCC 29347 및 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) KT 2442를 사용하여, 기질로서 옥탄산과 p-시아노페녹시헥산산 또는 p-니트로페녹시헥산산으로부터 모노머유닛으로서 3-하이드록시-p-시아노페녹시헥산산 또는 3-하이드록시-p-니트로페녹시헥산산을 함유하는 PHA의 생산하는 것에 대하여, 문헌「Can. J. Microbiol., 41, 32-43(1995) and Polymer International, 39, 205-213(1996)」에 보고되어 있다.
상기 보고는, 알킬기를 측쇄에 가진 통상의 PHA와 달리 방향환을 측쇄에 가지고 또한 PHA로부터 유래하는 물리적 특성을 가진 중합체를 얻는데 있어 유용하다.
신규한 범주로서, 물리적 특성을 변경하는 것뿐만 아니라, 작용기를 사용하여 신규한 기능을 생성하기 위하여 적절한 작용기를 측쇄에 가진 PHA를 생산하는 연구가 행해지고 있다.
예를 들면, 측쇄단에 비닐기를 가진 유닛을 함유하는 PHA를 합성한 후에, 산화제로 에폭시화함으로써, 측쇄단에서 고반응성을 가진 에폭시기를 함유하는 PHA를 합성하는 것에 대하여, 문헌「Macromolecules, 31, 1480-1486(1996), Journal of Polymer Science: Part A: Polymer Chemistry, 36, 2381-2387(1998)」에 보고되어 있다. 또한, 비닐기 이외에, 고반응성을 가지는 것이 기대되는 티오에테르를 가진 유닛을 함유하는 PHA를 합성하는 예로서, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 27N01이 기질로서 11-티오페녹시발레르산으로부터 3-하이드록시-5-티오페녹시발레르산 유닛 및 3-하이드록시-7-티오페녹시헵탄산 유닛을 함유하는 PHA공중합체를 함유하는 PHA공중합체를 생산하는 것에 대하여, 문헌「Macromolecules, 32, 8315-8318 (1999)」에 보고되어 있다.
미생물이 입자의 형태로 미생물의 셀에 생산된 PHA를 축적하는 것이 알려져 있다. 미생물셀로부터 셀내에 축적된 PHA를 분리하고 정제하기 위하여, 클로로포름 또는 디클로로메탄 등의 유기용매를 함유하는 염소로 PHA의 추출을 포함하는 방법 및 PHA이외의 셀성분을 가용화시켜 제거함으로써 PHA입자를 얻는 방법의 양자가 있다. 전자의 용매추출방법은 고순도로 PHA를 용이하게 추출하고 분리하는 뛰어난 방법이지만, 산업상 생산레벨과 생산규모가 증가하고, 다량의 유기용매를 필요로 하는 문제점이 지적되고 있다(용매가 증발하거나 배출되는 경우에, 클로로포름 등이 사용된 유기용매를 포함하는 염소가 환경 또는 건강문제를 초래하는 것을 가리킴). 또한, PHA가 입자의 형태로 얻어지는 경우에, 용매추출을 포함하는 방법은 사용될 수 없다.
한편, PHA이외의 셀성분을 가용화시켜 제거하는 후자의 방법으로서, 차아염소산염 또는 과산화수소 등의 약품에 의해 처리함으로써 PHA이외의 셀성분을 용해하는 단계와, 고액분리에 의해 불용성의 PHA입자를 수집하는 단계를 포함하는 방법이 알려져 있다. 차아염소산 나트륨의 알칼리용액으로 미생물셀을 처리함으로써 폴리머를 분리하고 정제하는 방법에 대하여, 예를 들면, 문헌「J. Gen. Microbiology, 19, 198-209 (1958)」에 보고되어 있다. 펩타이드가수분해효소로 PHA축적셀을 처리함으로써 셀로부터 PHA를 분리한 후에, 적절한 킬레이트제로 처리하고 또한 과산화수소로 처리하는 방법에 대하여, 일본국 특공평 8-508881호 공보에 개시되어 있다.
다른 방법으로서, PHA축적셀을 가열하고 가압함으로써 미생물셀로부터 PHA를 분리한 후에, 셀을 분쇄하기 위하여 압력을 해제하는 방법에 대하여, 일본국 특개소 57-174094호 공보에 개시되어 있다. 셀균체를 스페로플라스트로 변환하는 단계와, 음파파쇄로 그들을 분쇄하는 단계와, 원심분리를 행하는 단계와, 원심분리후에 형성된 최상부층에서 PHA를 분리하는 단계를 포함하는 PHA의 분리방법에 대하여, 일본국 특개소 63-226291호 공보에 개시되어 있다.
이들 방법은, PHA가 입자의 형태로 얻어지는 것이 요구되는 경우에도 매우 유용하다.
그러나, 상기 처리에 있어서는, 조작이 복잡하고, 또한 효소, 산 또는 알칼리가 사용되어, 사용된 후에 잔류하기 쉬우므로, 고순도의 PHA를 보다 용이하게 수집하는 것이 소망되는 문제점이 있다.
기타 처리제를 사용하는 방법과 비교하는 경우에, 차아염소산염 또는 과산화수소 등의 산화제를 사용하는 방법은, 단순한 단계로 온화한 처리조건을 필요로 하고, 또한 셀로부터의 불순물이 좀처럼 혼합되지 않고, 따라서 고순도의 PHA는 입자의 형태로 얻을 수 있다. 따라서, 이것은 저비용 등의 많은 실용상의 이점을 가지는 뛰어난 방법이지만, 이하의 단계와 마찬가지로 해결해야 할 문제점이 있다.
예를 들면, PHA의 구조에 의존하여 분자량이 감소되고, 상당량의 염소가 수집된 PHA에 잔류하는 문제점이 있으므로, 차아염소산 나트륨 등의 차아염소산염으로 셀을 처리함으로써 입자의 형태로 셀에 축적된 PHA를 수집하는 방법은 실용상 적절하지 않은 것으로 여겨지고 있다(예를 들면, 일본국 특개평 7-177894호 공보 참조).
본 발명자의 연구에 의해, PHA가 가열되는 경우에, 이 잔류염소가 신속하게 방출되는 것이 발견되었다. 따라서, 소망의 처리된 물체가 차아염소산염처리 등을 사용함으로써 얻은 PHA입자로 이루어지는 경우에, 많은 양의 염소가 가열공정시에 방출되면, 방출된 염소가 작업환경 등의 오염요인이 되는 것이 강하게 고려된다. 또한, 본 발명자의 연구에 의하면, PHA입자에 함유된 잔류염소가 물에 의한 세정 등의 통상의 처리에 의해 충분히 제거될 수 없는 것이 또한 명백하게 되었다. 잔류염소는 PHA입자에 의해 강하게 유지되지만, 가열처리를 행할 때에 방출되고, 이에 의해 전술한 다량의 염소가 관찰된다고 하는 결론에 이르게 되었다.
따라서, 생산공정시에 차아염소산염에 의한 처리를 포함하는 PHA를 생산하는 방법에서, PHA입자에 의해 강하게 유지된 잔류염소를 감소시키는 수단의 개발은 상업상의 규모로 PHA를 개발하고 사용하는, 특히 입자의 형태로 PHA를 얻고 사용하는 매우 중요한 도전이다.
한편, 과산화수소 또는 과산화나트륨 등의 과산화화합물로 셀을 처리함으로써 셀에 축적된 PHA를 수집하는 방법에서, 수집된 PHA의 순도의 증가는 상업적 규모로 PHA를 개발하고 사용하는 매우 중요한 도전이다.
따라서, 본 발명의 목적은, PHA가 산화제로 처리함으로써 생산되는 경우에, 종래의 기술의 상기 설명한 문제점을 해결하고 고수율로 고순도의 PHA를 얻기 위하여, 적은 단계로 PHA이외의 셀성분을 효과적으로 제거하는 단계를 포함하는 PHA의 생산방법을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 기타 목적은, PHA가 차아염소산염을 함유하는 산화제로 처리함으로써 생산되는 경우에, 양호한 재현성으로 단순한 수단에 의해 수집된 PHA입자에 잔류된 염소를 제거하거나 감소시키는 단계를 포함하는 PHA의 생산방법을 제공하는 데 있다.
적은 단계, 저비용에 의한, PHA를 함유하는 셀로부터 PHA이외의 셀성분을 효과적으로 제거함으로써 고수율로 고순도의 PHA를 생산하는 방법에 대한 연구를 통한 결과로서, 본 발명자들은 다음의 발명을 성취하였다.
즉, 본 발명은, 적어도 차아염소산염을 함유하는 산화제로 셀을 처리하는 단계와, 상기 처리된 셀을 수용성 부분과 불수용성 부분으로 분리하는 단계와, 불수용성 부분에 잔류된 염소를 감소시키는 단계로 이루어진, PHA이외의 셀성분을 제거하기 위하여 산화제로 PHA를 함유하는 셀을 처리함으로써 PHA를 생산하는 방법에 관한 것이다.
보다 상세하게, 본 발명은, 적어도 차아염소산염을 함유하는 산화제로 셀을 처리하는 단계와, 상기 처리된 셀을 수용성 부분과 불수용성 부분으로 분리하는 단계와, 온수로 불수용성 부분을 세정하는 단계로 이루어진, PHA이외의 셀성분을 제거하기 위하여 산화제로 PHA를 함유하는 셀을 처리함으로써 PHA를 생산하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은, 적어도 차아염소산염을 함유하는 산화제로 셀을 처리하는 단계와 티오황산염 수용액으로 얻은 PHA를 세정하는 단계로 이루어진, PHA이외의 셀성분을 제거하기 위하여 산화제로 PHA를 함유하는 셀을 처리함으로써 PHA를 생산하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은, 적어도 차아염소산염을 함유하는 산화제로 셀을 처리하는 단계와, PHA가 불용성인 적어도 유기극성 용매를 함유하는 극성 용매용액으로 얻은 PHA를 세정하는 단계로 이루어진, PHA이외의 셀성분을 제거하기 위하여 산화제로 PHA를 함유하는 셀을 처리함으로써 PHA를 생산하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은, PHA를 함유하는 셀을 분쇄함으로써 분쇄된 생성물을 얻는 단계와, 상기 분쇄된 생성물을 수용성 부분과 불수용성 부분으로 분리하는 단계와, 산화제로 불수용성 부분을 처리하는 단계로 이루어진, PHA를 생산하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은, PHA를 생산하는 상기 설명한 방법을 행할 수 있는 장치에 관한 것이다.
본 발명의 PHA를 생산하는 방법에 의하면, 유전자 재결합기술에 의해 미생물에 PHA합성유전자를 도입함으로써 PHA생산이 가능한, PHA를 생산하기 위한 능력을 가진 미생물 또는 식물셀 등의 고등생물을 사용하여, 목적의 PHA를 셀에 생합성해서 축적할 수 있다. 따라서, 용어 "셀(또한, "바이오셀" 또는 "유기셀"로 칭함)"은 미생물셀을 의미할 뿐만 아니라, PHA생산이 PHA합성유전자의 도입에 의해 가능한, 식물셀 등의 고등생물의 셀을 의미한다.
PHA를 생산하기 위한 능력을 가진 상기 설명한 미생물로서, 소망의 PHA생산능력을 가지는 한 어떤 미생물도 사용될 수 있고, 이러한 미생물의 예는, 본 명세서의 실시예에 사용될 랄스토니아 유트로파 TB64균주(Ralstonia eutropha TB64), 슈도모나스 올레오보란스 ATCC 29347균주(Pseudomonas oleovorans ATCC 29347), 슈도모나스 치코리이 YN2균주(Pseudomonas cichorii YN2), 알칼리게네스 속 TL2균주(Alcaligenes sp. TL2) 등을 포함한다.
TB64균주는 일본국 특개평 제 2000-166587호 공보에 개시되어 있고, 이 균주는, 특허절차를 위해 미생물의 기탁의 국제인정에 관한 부다페스트조약에 의거하여 산업기술종합연구소의 국제기탁기관(통상 산업성 공업기술원 생명공학공업 기술연구소)에 수탁번호 FERM BP-6933으로 기탁되었다.
YN2균주는, 특허절차를 위해 미생물의 기탁의 국제인정에 관한 부다페스트조약에 의거하여 산업기술종합연구소의 국제기탁기관(통상 산업성 공업기술원 생명공학공업 기술연구소)에 수탁번호 FERM BP-7375로 기탁되었다. YN2균주의 균학적 성질은 다음과 같다.
〈YN2균주의 균학적 성질〉
(1) 형태학적 성질
세포의 형태 및 크기: 봉형상, 0.8㎛ × 1.5 내지 2.0㎛
세포의 다형성: 음성
운동성: 양성
포자형성: 음성
그램염색: 음성
콜로니형상: 원형; 가장자리전체가 매끄러움; 낮은 볼록형상; 매끄러운 표면; 광택; 반투명
(2) 생리학적 성질
카탈라제: 양성
옥시다제: 양성
O/F시험: 산화형(비발효성)
니트레이트 환원: 음성
인돌산생: 양성
글루코우스로부터의 산의 생산: 음성
아르기닌 디히드롤라제: 음성
요소분해요소: 음성
에스쿨린 가수분해: 음성
젤라틴 가수분해: 음성
β갈락토시다제: 음성
King's B 한천에서의 형광색소생산: 양성
4%NaCl에서의 생육: 양성(약)
폴리-p-하이드록시부티레이트의 축적: 음성(*)
Tween 80의 가수분해: 양성
(*) 영양한천 위에 배양된 콜로니를 수단블랙으로 염색하여 판정하였다.
(3) 기질자화능
글루코우스: 양성
L-아라비노스: 양성
D-만노스: 음성
D-만니톨: 음성
N-아세틸-D-글루코사민: 음성
말토우스: 음성
포타슘 글루코네이트: 양성
n-카프레이트: 양성
아디페이트: 음성
dl-말레이트: 양성
시트르산 나트륨: 양성
페닐 아세테이트: 양성
TL2균주는, 특허절차를 위해 미생물의 기탁의 국제인정에 관한 부다페스트조약에 의거하여 산업기술종합연구소의 국제기탁기관(통상 산업성 공업기술원 생명공학공업 기술연구소)에 수탁번호 FERM BP-6913으로 기탁되었다.
본 발명의 방법에 있어서, 이들 셀에서 생산된 불용성 PHA는 입자의 형태로 축적된다. 이들 PHA입자가 고액분리에 의해 수집되는 경우에, PHA이외의 셀성분으로 구성되는 혼합된 불순물은 산화제로 처리함으로써 용해되고, 따라서 물의 불용성 PHA입자만이 고체위상성분으로서 분리된다.
즉, 본 발명의 방법에 있어서는, PHA이외의 셀성분을 용해하고 제거하도록, PHA를 축적하는 셀은 배양후에 배양액으로부터 수집되고, 이들 셀은 산화제를 함유하는 처리용액에 현탁되고, 처리용액에 임의 조건하에 어떤 기간동안 반응에 의해 일어나고, 이에 의해 셀로부터 PHA입자를 분리하는 수단이 이용된다. 이 수단에 사용될 산화제의 예는 차아염소산염 및 과산화화합물을 포함한다.
본 발명의 방법에서 사용된 차아염소산염의 예는, 차아염소산 칼륨(KClO), 차아염소산 칼슘(Ca(OCl)2), 차아염소산 나트륨(NaClO)을 포함하고, 이들은 적절하게 선택되어 사용될 수 있다.
처리용액에 용해된 차아염소산염의 농도는, 용액에서 유효염소농도로서 0.5% 내지 12.0%의 범위내에서 설정되는 것이 바람직하고, 1.5% 내지 5.0%의 범위내에서 설정되는 것이 바람직하다. 예를 들면, 상업적으로 이용가능한 차아염소산 나트륨용액이 차아염소산염으로서 사용되는 경우에, 차아염소산 나트륨의 농도는 대략 4%(유효염소농도로서 약 1.7%) 내지 대략 6%(유효염소농도로서 약 2.5%)로 설정되는 것이 바람직하다. 또한, 처리용액의 양은, 처리를 행하기 위하여 셀의 g(건조중량)당 50ml 내지 300ml의 범위내에서 설정되는 것이 바람직하다. 처리온도는 처리를 행하기 위하여 0℃ 내지 10℃의 범위내에서 설정되는 것이 바람직하고, 온도가 실온(대략 20℃)보다 높으면 PHA 자체가 반응해서 부분가수분해되더라도, PHA의 분자중량의 감소를 초래한다. 어떤 경우에, 셀과 차아염소산 나트륨과의 접촉은 열을 발생시킬 수 있고, 따라서 주의가 필요하다. 차아염소산염의 농도 및 온도조건이 상기 설명한 바와 같이 선택되는 경우에, 처리기간은 1시간 내지 5시간의 범위내에서 설정되고, 충분한 용해처리를 얻기 위하여 통상 대략 2시간으로 설정된다. 처리기간이 1시간이하에서 설정되는 경우에 PHA이외의 셀성분의 용해는 불충분하고, 또한 처리가 5시간이상에서 행해지는 경우에 PHA의 분자량의 감소가 초래되고, 따라서 주의가 필요하다.
본 발명에 사용된 과산화화합물의 예는, 과산화수소, 퍼벤조산, 메타클로로퍼벤조산, 퍼포름산, 퍼아세트산, 모노퍼옥시프탈산 및 트리플루오로퍼아세트산 등의 유기과산화물과, 그의 에스테르를 포함한다. 이들중에서, 상대적으로 온화한 반응을 제공하고 용액으로서 용이하게 사용될 수 있으므로, 과산화수소 또는 과탄산 나트륨중의 하나가 사용되는 것이 바람직하다. 처리후에 잔류물이 없으므로, 과산화수소는 수집된 PHA의 순도의 개선의 관점에서 매우 유용하지만, 이 화합물은 구조가 PHA의 유닛구조에 따라 산화에 의해 변경될 가능성을 가질 수 있다. 이러한 경우에, 과탄산 나트륨이 사용되는 것이 바람직하고, 보다 완화된 반응을 제공한다.
상기 설명한 방법에서 사용된 과산화수소의 농도는 3.0% 내지 31.0%의 범위내에 있는 것이 바람직하고, 과탄산 나트륨의 농도는 5.0% 내지 20.0%의 범위내에 있는 것이 바람직하다.
이들 과산화화합물이 사용되는 경우에, 처리온도는 80℃ 내지 100℃의 범위가 바람직하다. 온도가 상기 범위보다 낮게 설정되면, 수집된 생성물의 순도는 낮아져 적은 효과를 가진다. 온도가 상기 범위를 넘어서 설정되면, 화합물의 구조는 변경되어도 된다. 반응시간은 30분 내지 2시간에서 설정되고, 보다 바람직하게는 대략 1시간으로 설정된다.
용해처리의 상기 설명한 반응의 완료후에, 공존하는 용해된 셀성분으로부터 PHA입자를 효과적으로 분리하기 위하여 가능한 한 처리용액에서 PHA입자는 어떤 고상분리수단에 의해 수집될 수 있다. 예를 들면, PHA입자는 원심분리방법에 의해 가용성 분획으로부터 분리될 수 있다. 이 때에 PHA는 수용성 용액에 현탁된 미세입자의 형태로 있다. 원심분리의 동작은, PHA미세입자의 형태를 유지하면서 행해지고, 따라서 순차의 디클로리데이션처리가 고효율로 행해진다. 즉, 원심분리는 약 0℃ 내지 약 10℃의 온도로 행해지는 것이 바람직하고, 약 0℃ 내지 약 5℃의 온도로 행해지는 것이 보다 바람직하다.
또한, 더욱 바람직하게는, 적은 양으로 함유되기 쉬운 혼합된 성분을 충분히 제거하도록, 탈이온, 증류수 또는 순수 등의 정제수로 원심분리방법에 의해 수집된 PHA입자를 세정하는 단계를 부가한다. 상기 설명한 세정단계는 2 또는 3배로 행해지는 것이 바람직하다. 특히, 과탄산 나트륨이 과산화화합물로서 사용되는 경우에, 과탄산 나트륨의 잔류물을 회피하는 주의가 필요하다.
매우 높게 정제된 PHA가 얻어지는 것이 요구된 경우에, PHA를 분리하고 세정한 후에, 예를 들면, 효소, 산화제, 계면활성제 또는 그들의 혼합물을 사용하는 화학적인 처리가 또한 행해질 수 있다.
셀을 분쇄하는 단계가 산화제로 처리하는 상기 단계전에 부가되는 경우에, PHA는 보다 효과적으로 분리될 수 있다. 이 셀의 분쇄단계에서, 초음파 파쇄법(ultrasonication method), 호모지나이저(homogenizer)방법, 고가압분쇄방법, 비드충돌방법, 밀링방법, 그라인딩방법(유리분말 또는 알루미나분말 등의 보조제가 모르타르에 첨가되고 다듬어짐) 및 동결해동방법 등으로 약품이 사용되지 않는 방법을 사용하는 것이 바람직하다. 이 재현탁에 대하여, 고체성분 및 가용성성분은 원심분리 등의 방법에 의해 분리되고, 다음에 PHA성분을 함유하는 고체성분은 과산화화합물 또는 차아염소산염에 의해 처리된다.
상기 언급한 바와 같이, 본 발명에서, 차아염소산염은 PHA이외의 셀성분을 용해시키는 산화제로서 바람직하게 사용될 수 있다. 차아염소산염에 의한 처리는 소모된 차아염소이온으로부터 생산된 바와 같은 염소를 발생시키고, 또한 불수용성 PHA입자의 표면에 부착된 부분은 분리된다. PHA입자의 표면에 약하게 부착된 부분은 고액분리 및 차아염소산염으로 처리후에 물로 세정함으로써 용출되어 제거되지만, 그위에 강하게 부착된 염소부분은 잔류염소가 되고, 또한 잔류염소는 가열처리가 행해질 때까지 제거되지 않는다. 이러한 잔류염소는 얻어진 PHA의 사용에 문제가 될 수 있다.
이러한 잔류염소를 제거하기 위하여, 본 발명에서, 차아염소산염에 의한 상기 언급한 처리와 다음의 고액분리단계후에, 후술하는 바와 같이 염소가 가용으로 되는 용액에서 세정하는 단계를 더욱 부가한다. 액체중에서 행해진 세정처리는 현탁 또는 교반 등의 단순한 단계를 가지고, 세정후의 수집은 용이하고, 수율 또는 순도는 감소되지 않고, 따라서 이 세정처리는 미세입자를 처리하는 방법으로서 적합하다. 세정액이 염소를 용해시키는 것 뿐만 아니라 PHA를 용해시키지 않는 것은 말할 필요도 없다. 잔류염소의 제거를 위한 세정처리로서, 정제수로 얻은 PHA를 현탁하는 단계와, 교반하면서 30℃ 내지 60℃의 온도로 린스하는 단계와, 수집된 PHA에 잔류하는 염소를 제거하는 단계로 이루어진 수단이 사용될 수 있다. 이 경우에, 온수의 양은 제거된 염소가 충분히 용해될 수 있는 양이고, 따라서 PHA의 g(건조중량)당 50ml이상이 바람직하고, 처리시간은 6시간 이상이 바람직하다(처리온도가 낮아짐에 따라, 처리시간이 단축되는 것이 바람직함). 또한, 사용된 온수를 신선한 온수로 대체하면서, 이 처리가 2회이상 반복되는 것이 바람직하다.
상기 설명한 세정의 완료후에, PHA입자가 예를 들면 원심분리방법이 적용될 수 있는 방법에 의해 공존하는 성분으로부터 효과적으로 분리되고 정화될 수 있는 한, 세정액에서 PHA입자를 수집하는 어떤 방법은 적용될 수 있다.
잔류염소의 제거를 위한 교호적인 세정처리로서, 염소를 감소시키기 위하여 티오황산염 수용액으로 잔류염소를 세정하는 다음의 수단이 사용될 수 있다.
여기서 사용된 티오황산염은, 티오황산칼륨(K2S2O3), 티오황산칼륨 3수화물(K2S2O3·3H2O), 티오황산칼슘 6수화물(Ca2S2O3·6H2O), 티오황산 제 1철(FeS2O3), 티오황산나트륨(Na2S2O3), 티오황산나트륨 5수화물(Na2S2O3·5H2O) 및 티오황산암모늄((NH4)2S2O3)으로 이루어진 군으로부터 적절하게 선택될 수 있다. 또한, 상기 기입된 티오황산염을 함유하는 용액 또는 혼합물이 사용될 수 있다.
이들 티오황산염중에서, 티오황산나트륨 5수화물(Na2S2O3·5H2O, 일반적으로 "차아"(hypo))로 칭함)은 수돗물로부터 "칼크 제거제(kalk removing agent)"로서 종래에 주로 사용되었다. 티오황산나트륨 5수화물은 수용성 용액에서 염소를 흡수시키는 작용을 가지고, 또한 메커니즘은 다음의 화학식(1)으로 표시된다.
Na2S2O3 + 4Cl2 + 5H2O → 2NaCl + 2H2SO
4 + 6HCl (1)
티오황산염 수용액으로 PHA를 세정함으로써, PHA에 의해 잔류하는 잔류염소는 상기 작용(1)의 결과로서 제거된다.
티오황산염에 의한 세정처리시에 온도는 PHA의 물리적 특성에 좌우하여 교호적으로 설정되지만, 0℃ 내지 100℃로 설정되는 것이 통상이고, 20℃ 내지 70℃로 설정되는 것이 바람직하다. 세정처리시의 세정시간은 5분 내지 24시간으로 설정되고, 1시간 내지 3시간으로 설정되는 것이 바람직하다.
세정처리후에, PHA입자가 공존하는 성분이 효과적으로 분리되어 정화될 수 있는 한, PHA입자를 수집하는 어떤 방법은 적용될 수 있고, 예를 들면 원심분리방법이 적용될 수 있다. 또한, 이 세정처리에 의해 세정된 PHA입자를 정제수 등으로 더 세정하는 단계가 부가되면, 보다 바람직하다.
잔류염소를 제거하는 교호적인 세정처리로서, 염소를 감소시키기 위하여 유기극성 용매로 잔류염소를 세정하는 다음의 수단이 사용될 수 있다.
극성 용매용액에 의한 이 세정처리시에, PHA입자의 표면에 부착된 잔류염소는, 전체부피에 대하여 50%이상의 농도에서 관심의 PHA에 불용성인 유기극성 용매를 함유하는 극성 용매용액으로 세정되고, 이에 의해 잔류염소는 극성 용매용액에 용출되고 감소된다.
유기극성 용매에 의한 상기 설명한 세정처리가 불용성 PHA입자의 표면에 강하게 부착된 염소부분에 행해지는 경우에, 염소의 대부분은 제거된다. 이 방법에 의해 얻은 PHA입자에서, 잔류염소의 절대량은 주목할 만하게 감소된다. 따라서, 처리된 생산물이 가공하지 않은 재료로서 PHA입자를 사용하여 제조되는 경우에, 가열에 의해 방출된 염소의 양은 염소가 작업환경 등의 오염의 요인이 되지 않는 범위로 제어될 수 있다.
극성 용매용액에 의한 세정처리에 사용된 유기극성 용매의 예는, 알콜, 케톤 등을 포함한다. 보다 상세하게는, 이러한 유기극성 용매는 사용을 위해 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 이소부탄올, 아세톤 등으로부터 적절하게 선택될 수 있다. 일반적으로, 이들 유기극성 용매는 단독으로 사용되지만, 용매의 여러 형태를 함유하는 혼합용매가 또한 사용될 수 있다. 또한, 알콜 또는 케톤 등의 상기 언급한 유기극성 용매는 물과 높은 친화력을 가지므로, 물로 균일하게 혼합됨으로써 얻은 사용될 수 있다. 유기극성 용매가 물로 균일하게 혼합된 혼합용매로서 사용되는 경우에, 유기극성 용매의 함유퍼센트(농도)가 높게 설정되는 것이 바람직하다. 예를 들면, 유기극성 용매의 함유퍼센트(농도)가 99%이상으로 설정되는 경우에, 단일의 용매의 사용과 거의 동일한 세정효과를 달성할 수 있다.
극성 용매용액에 의한 세정처리시의 온도는, 유기극성 용매, 연화점 또는 용융점에 대한 가용성 등의 관심의 PHA의 물리적 특성에 따라 적절하게 설정되지만, 통상적으로, 사용된 유기극성 용매가 액체상태인 온도범위내의, 예를 들면, 0℃ 내지 50℃의 범위내에서 약간의 벗어남만을 허용하는 온도로 설정되는 것이 바람직하다. 세정처리시의 세정시간은 사용된 유기극성 용매 또는 온도에 의존하지만, 5분 내지 24시간의 범위내로 설정되고, 충분한 세정 및 제거를 달성하기 위하여 1시간 내지 3시간의 범위내로 설정되는 것이 바람직하다.
극성 용매용액에 의한 세정처리의 완료후에, 유기극성 용매를 함유하는 용액으로부터 세정된 PHA입자를 수집하는 수단으로서, 입자가 유기극성 용매를 함유하는 극성 용매용액에 용해된 공존하는 성분으로부터 효과적으로 분리될 수 있는 한, 어떤 고액분리방법이 적용될 수 있다. 예를 들면, PHA입자는 원심분리방법에 의한 유기극성 용매를 함유하는 용액에서 용해된 성분으로부터 분리될 수 있다. 또한, 유기극성 용매에 의한 세정처리의 완료후에, 정제수 등에 의해 수집된 PHA입자를 다시 세정하는 단계가 유기극성 용매의 잔류물을 제거하기 위하여 부가되면, 보다 바람직하다.
PHA입자의 형태와는 독립적으로, 극성 용매용액에 의한 상기 설명한 세정처리시의 세정효과는 다양성을 가지고 또한 높은 재현성을 가진다. 또한, PHA입자의 양은 유기셀 자체의 벌크보다 매우 작으므로, 용매에 의한 상기 설명한 세정처리에 사용된 유기극성 용매의 양은 유기용매추출방법에 사용된 유기용매의 양과 비교가 안되게 적다. 또한, PHA자체가 용해되는 것이 아니라 표면에 부착된 염소가 용출되는 것이고, 또한 세정된 PHA입자는 고액분리방법에 의해 재수집된다. 따라서, 이 단계에서, 증발되거나 배출되는 유기용매의 양은 매우 적게 유지될 수 있다. 유기용매추출방법에서, 물의 상에서도, 잔류된 유기용매의 적은 양은 수집될 수 있고, 또한 PHA가 유기상으로부터 회수되는 경우에, 용매제거 등에 의해 제거된 유기용매의 많은 양이 회수될 수 있다. 그러나, 본 발명의 방법에 의해, 규모가 증가함에 따라 보다 어렵게 되는 유기용매의 회수는 용이하게 행해질 수 있다.
잔류염소를 제거하는 상기 단계에서 얻은 PHA입자를 건조하는 단계에서, 공기건조, 진공건조 또는 동결건조 등의 방법은 취해질 형태 등의 PHA의 물리적 특성에 좌우하여 적절하게 선택될 수 있다.
상기 설명한 방법에 의해 PHA를 생산하기 위하여 사용된 장치로서, 일반적인 미생물생산 또는 화학합성을 위해 사용된 장치는 단독 또는 조합하여 사용될 수 있다. 이하의 구성을 가진 PHA를 생산하기 위하여 사용된 장치는, 본 발명의 PHA를 생산하는 방법에 가장 적합한 생산장치의 실시예로서 예시할 수 있다.
이 장치는, 상기 설명한 산화제에 의한 PHA를 포함하는 셀을 처리함으로써 PHA이외의 셀성분을 제거하는 수단과, 상기 처리된 셀(PHA)을 수용성 부분과 불수용성 부분으로 분리하는 수단과, 세정에 의해 불수용성 부분으로부터 잔류염소를 제거하는 수단을 가진다. 잔류염소를 제거하는 수단은, 온수에 의해 불수용성 부분을 세정하는 수단과, 티오황산 수용액에 의해 불수용성 부분을 세정하는 수단과, 유기극성 용매를 함유하는 극성 용매용액에 의해 불수용성 부분을 세정하는 수단으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 수단이고, 이는 상기 설명한 PHA에 불용성이다. 또한, 이 생산장치는, 필요에 따라, 산화제로 처리하는 상기 설명한 수단전에, 분쇄된 생산물을 얻기 위하여 PHA를 함유하는 셀을 분쇄하는 수단과, 수용성 부분과 불수용성 부분으로 분쇄된 생산물을 분리하는 수단을 가지는 장치가 될 수 있다.
본 발명은, 다음의 실시예에서 보다 상세하게 설명한다. 이들은 본 발명을 행하는 최상의 모드의 실시예이다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명의 범위를 한정하는 것을 의도하지 않는다. 다음의 실시예에서 "%"는 특별히 상술하는 경우가 아니라면 중량평균을 나타낸다. 각 실시예에 사용된 M9배지(M9 medium)의 구성은 다음과 같다.
(M9 배지)
Na2HPO4 6.2g
KH2PO4
3.0g
NaCl 0.5g
NH4Cl 1.0g
(배지의 리터당 pH 7.0)
(제 1실시예)
말레산 나트륨 0.1%를 함유하는 M9한천배지 위의 TB64균주의 콜로니는 500ml의 진탕플라스크에서 말레산 나트륨 0.5%를 함유하는 M9배지의 50ml로 이동되고, 30℃에서 진탕배양한다. 24시간후에, 5ml의 배지용액이 질소로서 NH4Cl만이 1/10의 농도로 준비되고 또한 말레산 나트륨 0.5%가 함유된 1L의 M9배지용액에 첨가되고, 또한 셀균체에 PHB를 축적하도록 동일한 방법으로 혼합물이 진탕된다. 52시간후에, 셀균체에 축적되는 PHB는 30ml의 증류수에서 원심분리에 의해 수집되고 재현탁되고, 다음에 3개의 동일한 분취량(각 10ml)으로 분할된다. 이들 3개의 분취량은 1 내지 3으로 번호 붙이고, 다음의 처리가 그위에 행해진다.
1: 대조: 원심분리후에, 3개의 분취량중의 하나는 메탄올에 의한 세정, 동결건조 및 칭량을 행한다. 다음에, 클로로포름에 의한 추출은 24시간동안 60℃에서 행한다. 얻은 추출물이 여과되어 농축된 후에, 메탄올로 침전되고, 진공건조하여 대조 폴리머(샘플 1)를 얻는다.
2: 4℃로 냉각된 30ml의 탈이온수 및 4℃로 냉각된 20ml의 차아염소산 나트륨 용액(12% 차아염소산 나트륨 함유(유효염소농도: 5%이상); 키시다 화학주식회사(Kishida Chemical Co. Ltd.) 제품)은, 3개의 분취량중의 하나에 첨가되고, 다음에 2시간동안 4℃에서 반응이 일어난다. 반응이 완료된 후에, 4℃로 냉각된 140ml의 탈이온수는 반응액에 첨가되고, 원심분리는 30분동안 4℃에서 29,400m/s2(3,000×g)로 행해진다. 4℃로 냉각된 80ml의 탈이온수는 얻은 침전물에 첨가되고, 또한 입자는 원심분리(4℃, 29,400m/s2 (3,000×g), 30분)에 의해 일어난 초음파 파쇄법에 의해 완전히 분쇄된다. 이 동작은 2회 반복되고, 또한 얻은 침전물의 동결건조가 행해진다. 얻은 생성물은 샘플 2로서 정의된다.
3: 상기 2에서 설명한 바와 같이 탈이온수에 의한 세정의 동작에 의해 얻은 샘플은, 50ml의 탈이온수에서 현탁되고, 6시간동안 50℃에서 교반된다. 다음에, 상청액은 원심분리(4℃, 29,400m/s2 (3,000×g), 30분)에 의해 제거된다. 온수에 의한 이 세정처리는 다시 1회 반복된다. 4℃로 냉각된 40ml의 탈이온수는 얻은 침전물에 첨가되고, 또한 입자는 초음파 파쇄법에 의해 완전하게 분쇄되고, 원심분리(4℃, 29,400m/s2 (3,000×g), 30분)된다. 이 동작은 다시 1회 행해지고, 얻은 침전물은 동결건조가 행해진다. 얻은 생성물은 샘플 3으로서 정의된다.
(잔류염소의 측정)
샘플 2와 샘플 3의 각각의 잔류염소는 다음과 같이 측정된다.
도 1에 도시한 바와 같이, 삼각플라스크(1)(총용량: 637ml)와, 그 중심에 구멍을 가진 외부캡(2a)(스크루 캡), 그 중심에 구멍을 가진 테프론 내부캡(2b) 및 내부캡과 동일한 크기를 가진 알루미늄박(2c)을 포함하는 캡은, 미리 오븐에서 150℃로 가열된다. 다음에, 알루미늄박(3)위의 샘플(4) 0.3g이 플라스크에 놓여지고, 캡이 기밀밀봉되고, 150℃로 가열된다. 3분후에, 검출관(6)(가스텍 주식회사(GASTEC Corp.); 염소검출관, 제품 번호 8La(검출가능한 농도: 0.5ppm 내지 8ppm))은 구멍으로 삽입되고, 샘플로부터 발생된 100ml의 가스는 염소농도를 측정하기 위하여 관으로부터 배출된다.
그 결과, 온수처리가 없는 샘플 2의 염소농도는 약 50ppm인 반면에, 온수처리가 있는 샘플 3의 염소농도는 약 4ppm이었다. 샘플 2와 비교하는 경우에, 샘플 3은 염소감소의 효과가 높다.
이하 설명하는 "수율"과 "순도"를 결정하기 위하여, 다음의 동작이 행해진다.
30ml의 클로로포름이 건조된 샘플 1 내지 샘플 3에 첨가되고, 교반추출동작이 24시간동안 60℃에서 행해진다. 추출된 PHB를 함유하는 클로로포름용액은, 0.45㎛ PTFE 필터로 여과되고, 여과액은 회전증발기에 의해 농축된다. 농축액은 침전물에 메탄올의 10배의 양을 첨가하고 PHB를 수집한다. 얻은 PHB는 진공건조를 행하고, 다음에 세정한다.
대조로서 샘플 1에 대하여 클로로포름을 가진 샘플 2와 샘플 3의 추출에 의해 얻은 PHB의 중량비는 "수율"로서 결정되고, 클로로포름추출전의 샘플에 대하여 클로로포름을 가진 각 샘플의 추출에 의해 얻은 PHB의 질량비는 "순도"로서 결정된다. 결과는 표 1에 표시한다.
| 클로로포름추출전의 중량(mg/L) | 클로로포름추출후의 중량(mg/L) | 수율(%) | 순도(%) | |
| 샘플 1 | 3100 | 1880 | - | - |
| 샘플 2 | 1930 | 1820 | 96.8 | 94.8 |
| 샘플 3 | 1920 | 1810 | 95.3 | 94.3 |
샘플 3은 온수로 처리되지만, 샘플 3의 수율 및 순도는 온수로 처리되지 않은 샘플 2의 수율 및 순도와 거의 마찬가지이다. 따라서, 온수에 의한 처리는 고수율 및 고순도를 유지하면서, 잔류염소를 감소시키는 효과가 있다.
(제 2실시예)
n-노난산 0.1%를 함유하는 M9 한천배지위의 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovorans)의 콜로니는, n-노난산 0.3%를 함유하는 50ml의 M9 배지로 이동되고, 30℃에서 진탕배양된다. 40시간 후에, 5ml의 배양액은 n-노난산 0.2% 및 5-페닐발레르산 0.05%를 함유하는 1L의 M9배지에 첨가되고, 다음에 혼합물은 진탕배양이 행해진다. 36시간 후에, 셀균체는 원심분리에 의해 수집되고, 질소원으로서 NH4Cl을 함유하지 않고 n-노난산 0.05%와 5-페닐발레르산 0.2%를 함유하는 1L의 M9배지에서 재현탁되고, 다음에 진탕은 셀균체내에 3-하이드록시노난산, 3-하이드록시헵탄산, 3-하이드록시발레르산 및 3-하이드록시-5-페닐발레르산을 유닛으로서 함유하는 PHA를 축적하기 위하여 행해진다. 48시간후에, PHA를 축적하는 셀균체는 원심분리에 의해 수집되고, 수집된 셀균체에 대해 다음의 처리가 행해진다.
4: 대조: 원심분리후에, 균체는 메탄올에 의한 세정, 동결건조 및 칭량이 행해진다. 다음에, 클로로포름의 추출은 24시간동안 60℃에서 행해진다. 그 후, 추출물은 여과되어 농축되고, 다음에 대조 폴리머(샘플 4)를 얻기 위하여 메탄올에 재현탁후 진공건조된다.
5: 4℃로 냉각된 30ml의 탈이온수 및 4℃로 냉각된 20ml의 차아염소산 나트륨 용액(차아염소산 나트륨 12% 함유(유효염소농도: 5%이상); 키시다 화학주식회사)의 양자는 셀균체에 첨가되고, 2시간동안 4℃에서 반응이 일어난다. 반응이 완료된 후에, 4℃로 냉각된 140ml의 탈이온수는 반응액에 첨가되고, 원심분리는 30분동안 4℃에서 29,400m/s2(3,000×g)로 행해진다. 4℃로 냉각된 80ml의 탈이온수는 얻은 침전물에 첨가되고, 또한 입자는 초음파 파쇄법에 의해 완전히 분쇄되고, 원심분리(4℃, 29,400m/s2 (3,000×g), 30분)가 수행된다. 이 동작은 2회 반복되고, 또한 얻은 침전물 동결건조가 행해진다. 얻은 생성물은 샘플 5로서 정의된다.
6: 상기 5에서 설명한 바와 같이 탈이온수에 의한 세정 동작에 의해 얻은 샘플은, 50ml의 탈이온수에서 현탁되고, 12시간동안 30℃에서 교반된다. 상청액은 원심분리(4℃, 29,400m/s2 (3,000×g), 30분)에 의해 제거되고, 다음에, 50ml의 탈이온수에서 현탁되고, 12시간동안 30℃에서 교반된다. 처리가 완료된 후에, 상청액은 원심분리(4℃, 29,400m/s2 (3,000×g), 30분)에 의해 제거되고, 4℃로 냉각된 40ml의 탈이온수는 얻은 침전물에 첨가된다. 입자가 초음파 파쇄법에 의해 완전하게 분쇄된 후에, 원심분리(4℃, 29,400m/s2 (3,000×g), 30분)가 행해진다. 이 동작은 다시 1회 행해지고, 얻은 침전물은 동결건조가 행해지고, 샘플 6을 얻는다.
샘플 5와 샘플 6의 각각의 잔류염소는 제 1실시예에서 설명한 바와 같이 동일한 방법에 의해 측정하였다. 그 결과, 온수처리를 행하지 않은 샘플 5의 염소농도는 대략 20ppm(검출관(8La)에 의해 배출된 30ml로부터 결정)인 반면에, 온수처리를 행한 샘플 6의 염소농도는 대략 2ppm이다. 샘플 5와 비교한 경우에, 샘플 6은 염소감소의 효과가 높다.
또한, 이들 샘플은 제 1실시예와 마찬가지의 방식으로 클로로포름에 의해 추출되고, 수율 및 순도가 결정된다. 결과는 표 2에 표시한다.
| 클로로포름추출전의 중량(mg/L) | 클로로포름추출후의 중량(mg/L) | 수율(%) | 순도(%) | |
| 샘플 4 | 1890 | 980 | - | - |
| 샘플 5 | 1010 | 960 | 98.0 | 95.0 |
| 샘플 6 | 1000 | 960 | 98.0 | 96.0 |
온수처리를 행한 샘플 6의 수율 및 순도는, 온수처리를 행하지 않은 샘플 5의 수율 및 순도와 거의 동일하다. 따라서, 제 1실시예에서의 PHB의 경우와 마찬가지로, 온수처리는 고수율 및 고순도를 유지하면서 본 실시예에서 방향환을 가진 PHA에 대하여 잔류염소를 감소시키는 효과를 가진다.
(제 3실시예)
티오황산나트륨 수용액에 의한 세정(1)
YN2균주는 0.5% 이스트추출물(Oriental Yeast, Co., Ltd.)을 함유하는 200ml의 M9 배지로 식균되고, 진탕배양은 500ml의 진탕플라스크에서 30℃에서 125스트로크/분으로 행해진다. 8시간후에, 상기 배양액은 폴리펩톤(Nihon Pharmaceutical Co., Ltd.) 0.5% 및 5-티오페녹시발레르산 0.1%를 함유하는 25L의 M9 배지에 첨가되고, 다음에 혼합물을 통기하고 50L의 단지발효기(jar fermenter)에서 48시간동안 30℃에서 배양액을 교반한다.
200ml의 상기 배양액은 미생물셀을 수집하기 위하여 원심분리(78,000m/s2 (8,000×g), 4℃, 10분)를 행하고, 냉 메탄올로 세정하고, 다음에 진공건조한다. 진공건조에 의해 얻은 펠렛은 20ml의 클로로포름에서 현탁되고, 현탁액은 PHA를 추출하기 위하여 20시간동안 60℃에서 교반된다. 추출물은 0.45㎛의 구멍크기를 가진 막필터에 의해 여과되고, 다음에 회전증류기에 의해 농축된다. 농축액은 냉 메탄올에서 재현탁되고, 다음에 침전물만이 수집되고 PHA를 얻기 위하여 진공건조가 행해진다. 종래의 방법에 의하면, 얻은 PHA는 메탄올용해를 행하고, PHA모노머유닛의 에스테르화된 메틸을 확인하기 위하여 기체 크로마토그래피/질량 분광계(GC-MS, Shimadzu QP-5050, EI법)에 의해 분석된다. 그 결과, 모노머유닛구성을 가진 PHA를 함유하는 배양액에서 미생물셀이 발견된 것을 표 3에 표시하였다.
| 셀균체의 건조중량(mg/L) 1,300폴리머의 중량(mg/L) 530 |
| 모노머유닛구성 (GC-MS, TIC 피크면적비율) 3-하이드록시부탄산 8.8% 3-하이드록시-5-티오페녹시발레르산 91.2% |
미생물셀은, 원심분리에 의한 상기 분석동작에 사용된 것 이외의 배양액으로부터 수집된다. 얻은 셀은 1.6L의 정제수에 현탁되고, 다음에 0.8L의 차아염소산 나트륨 용액(유효염소농도: 5%이상)이 거기에 첨가된다. 혼합액은 PHA이외의 셀성분을 용해시키기 위하여 2시간동안 4℃에서 진탕되고, 다음에 PHA는 원심분리(29,400m/s2 (3,000×g), 4℃, 30분)에 의해 수집된다. 얻은 PHA는 200ml의 정제수에 현탁된다. 원심분리(29,400m/s2 (3,000×g), 4℃, 30분)에 의해 PHA를 수집하는 동작은, 3회 반복되고, 다음에, PHA입자(샘플 7)를 얻기 위하여 물로 세정한다.
PHA입자에 의해 잔류된 잔류염소는 다음의 방법에 의해 평가된다.
(1) 관능 평가
실온에 남겨진 PHA입자의 염소 악취는 관능적으로 검출되고, 염소적인 악취의 세기의 순으로 1 내지 5의 등급(+++(높음), ++(중간), +(낮음), ±(약함), -(없음))으로 평가된다.
(2) 농축처리
상기 PHA입자는 500ml의 캡형상의 플라스크에 놓이고, 플라스크는 완전하게 밀봉된다. 잔류염소가 150℃분위기에서 1시간동안 가열에 의해 방출된 후에, 플라스크에서 염소농도는 가스검출관에 의해 측정된다.
잔류염소의 평가결과는 표 4에 표시한다. 표는 염소가 PHA입자에 잔류하는 것을 표시한다.
| 관능 평가 | 염소농도(ppm) | ||
| 샘플 7 | PHA입자 | +++ | 20.0 |
상기 설명한 방법에 의해 얻은 1.0g건조중량의 PHA입자는 50ml의 정제수와 50ml의 10% 티오황산나트륨 5수화물 수용액에서 현탁된다. 6시간동안 50℃에서 이들 현탁액을 교반한 후에, PHA는 원심분리(29,400m/s2 (3,000×g), 4℃, 30분)에 의해 각 현탁액으로부터 수집된다. 얻은 PHA는 40ml의 정제수에 현탁되고, 다음에 원심분리(29,400m/s2 (3,000×g), 4℃, 30분)에 의해 PHA를 수집하는 동작이 3회 행해진다. 얻은 PHA는 10ml의 정제수에 현탁되고, 세정된 PHA입자를 얻기 위하여 동결건조한다. 정제수로 세정된 PHA입자는 샘플 8로서 정의되고, 10% 티오황산나트륨 5수화물 수용액에 의해 세정된 PHA입자는 샘플 9로서 정의된다.
세정된 PHA에 의해 잔류된 잔류염소는 다음의 방법에 의해 평가된다.
(1) 관능 평가
실온에 남겨진 PHA입자의 염소 악취는 관능적으로 검출되고, 염소 악취의 세기의 순으로 1 내지 5의 등급(+++(높음), ++(중간), +(낮음), ±(약함), -(없음))으로 평가된다.
(2) 농축 측정
상기 설명한 PHA입자는 500ml의 캡형상의 플라스크에 놓이고, 플라스크는 완전하게 밀봉된다. 잔류염소가 150℃분위기에서 1시간동안 가열에 의해 방출된 후에, 플라스크에서 염소농도는 가스검출관에 의해 측정된다.
잔류염소의 평가의 결과는 표 5에 표시한다. 표 4와 표 5를 비교하면, 온정제수에 의한 세정처리는 잔류염소를 감소시키는 효과가 있지만, 세정된 PHA입자에 잔류된 염소는 티오황산나트륨 용액으로 세정함으로써 보다 감소되는 것을 발견하였다.
| 관능 평가 | 염소농도(ppm) | ||
| 샘플 8 | 정제수 | ++ | 3.0 |
| 샘플 9 | 10% 티오황산나트륨 수용액 | - | 〈0.5 |
(제 4실시예)
티오황산나트륨 수용액에 의한 세정(2)
제 3실시예의 방법에 의해 얻은 샘플 7의 1.0g건조중량의 PHA입자는 50ml의 각각의 0%, 0.1%, 1.0% 및 10%의 티오황산나트륨 5수화물 수용액에서 현탁된다. 이들 4종류의 현탁액은 6시간동안 50℃에서 교반되고, 다음에 원심분리(29,400m/s2 (3,000×g), 4℃, 30분)에 의해 수집된다. 얻은 PHA는 50ml의 정제수로 현탁되고, 현탁액은 6시간동안 50℃에서 더 교반되고, 원심분리(29,400m/s2 (3,000×g), 4℃, 30분)를 행해서 PHA가 수집된다. 얻은 PHA는 40ml의 정제수에 현탁되고, 다음에 원심분리(29,400m/s2 (3,000×g), 4℃, 30분)에 의해 PHA를 수집하는 동작이 3회 행해진다. 얻은 PHA는 10ml의 정제수에 현탁되고, 또한 세정된 PHA입자를 얻기 위하여 동결건조된다. 0%, 0.1%, 1.0% 및 10%의 티오황산나트륨 수용액에 의해 세정된 PHA입자는 샘플 10, 11, 12 및 13으로서 각각 정의된다.
PHA입자에 의해 잔류된 잔류염소는 다음의 방법에 의해 평가된다.
(1) 관능 평가
실온에 남겨진 PHA입자의 염소 악취는 관능적으로 검출되고, 염소 악취의 세기의 순으로 1 내지 5의 등급(+++(높음), ++(중간), +(낮음), ±(약함), -(없음))으로 평가된다.
(2) 농축 측정
상기 세정된 입자는 500ml의 캡형상의 플라스크에 놓이고, 플라스크는 완전하게 밀봉된다. 잔류염소가 150℃분위기에서 1시간동안 가열에 의해 방출된 후에, 플라스크에서 염소농도는 가스검출관에 의해 측정된다.
잔류염소의 평가의 결과는 표 6에 표시한다. 표 4와 표 6을 비교하면, 관능 평가에 의한 희석차이가 있으나, 티오황산나트륨의 농도가 높을 수록, 더 큰 효과를 얻을 수 있고, 또, 온정제수(0% 티오황산나트륨 수용액)에 의한 세정처리는 잔류염소를 감소시키는 효과가 있지만, 세정된 PHA입자에 잔류된 염소는 티오황산나트륨 용액으로 세정함으로써 보다 감소되는 것을 발견하였다.
| 관능 평가 | 염소농도(ppm) | ||
| 샘플 10 | 0% 티오황산나트륨수용액 | + | 〈0.5 |
| 샘플 11 | 0.1% 티오황산나트륨수용액 | ± | 〈0.5 |
| 샘플 12 | 1.0% 티오황산나트륨수용액 | - | 〈0.5 |
| 샘플 13 | 10% 티오황산나트륨수용액 | - | 〈0.5 |
(제 5실시예)
알콜에 의한 세정처리
알칼리게네스 속(Alcaligenes sp.)의 TL2균주는 유산 나트륨염 0.5%를 함유하는 1.6L의 M9배지로 식균되고, 진탕배양은 30℃에서 125스트로크/분으로 행해진다. 48시간 후에, 셀은 원심분리(78,000m/s2 (8,000×g), 4℃, 10분)에 의해 배지로부터 수집된다.
상기 배양동작에 의해 얻은 셀은 80ml의 정제수에 현탁되고, 40ml의 차아염소산 나트륨 용액(유효염소농도: 5%이상)이 거기에 첨가된다. 이 현탁액은 PHA이외의 셀성분을 용해시키기 위하여 2시간동안 4℃에서 진탕되고, 다음에 PHA는 원심분리(6,000×g, 4℃, 20분)에 의해 수집된다. 수집된 PHA는 40ml의 정제수에 현탁되고, 원심분리(78,000m/s2 (8,000×g), 4℃, 10분)에 의해 PHA입자를 수집하는 동작은 2회 행해진다. 다음에, PHA는 물로 세정되어 PHA입자를 얻는다.
얻은 PHA의 분취량은 동결건조가 행해진다. 해당 분취량에 대해 종래의 방법에 의한 메탄올용해를 행한 후에, PHA를 구성하는 모노머유닛의 에스테르화된 메틸을 확인하기 위하여 기체 크로마토그래피/질량 분광계(GC-MS, Shimadzu QP-5050, EI법)에 의해 분석한다. 확인의 결과는, 얻은 PHA가 모노머유닛으로서 3-하이드록시부티르산을 가진 PHB인 것을 발견하였다.
상기 처리에 의해 얻은 0.3g 건조중량의 PHA입자는, 40ml의 각각의 정제수, 메탄올, 에탄올 및 이소부탄올에서 현탁된다. 이들 현탁액은 1시간동안 4℃에서 교반되고, 다음에 PHA입자는 원심분리(29,400m/s2 (3,000×g), 4℃, 20분)에 의해 수집된다. 수집된 PHA입자는 40ml의 정제수에 현탁되고, PHA입자는 원심분리(78,000m/s2 (8,000×g), 4℃, 10분)에 의해 수집된다. 세정처리 후에, 얻은 PHA입자는 10ml의 정제수에 현탁되고, 다음에 세정처리가 행해진 PHA입자를 얻기 위하여 동결건조된다. 각각의 정제수, 메탄올, 에탄올 및 이소부탄올에 의해 세정된 PHA입자는 샘플 14, 15, 16 및 17로서 각각 정의된다.
상기 설명한 세정된 PHA입자(샘플 14 내지 17)가 실온에 남겨진 경우 및 입자가 가열된 경우의 양자에서, 입자로부터 방출된 염소의 양은 이하 설명하는 방법에 의해 측정된다. 상기 설명한 세정된 입자는 50ml의 유리병에 놓이고, 이는 다음에 완전하게 밀봉된다. 실온에서 밤새도록 남겨둔 후에, 유리병에서 기체상으로 함유된 염소의 양은 기체검출관으로 측정된다. 다음에, 2분동안 150℃에서 열판위에 유리병을 가열한 후에, 유리병에 기체상으로 함유된 염소의 양은 기체검출관에 의해 측정된다.
측정결과는 표 7에 표시된다. 해당 표에 표시된 결과로부터, 정제수(샘플 14)로 세정된 경우와 비교할 때, 알콜(샘플 15 내지 17)로 세정된 PHA입자로부터 방출된 염소의 양은, 실온에 남겨진 경우 및 가열되는 경우의 양자의 대략 반이상만큼 감소된다.
| 방출된 염소의 양(㎍) | |||
| 실온에 남겨짐 | 2분동안 150℃에서 가열됨 | ||
| 샘플 14 | 정제수 | 〉6.3 | 160 |
| 샘플 15 | 메탄올 | 3.2 | 85 |
| 샘플 16 | 에탄올 | 1.3 | 54 |
| 샘플 17 | 이소부탄올 | Nt | 25 |
Nt: 측정불가
(제 6실시예)
케톤에 의한 세정처리
알칼리게네스 속(Alcaligenes sp.)의 TL2균주는 유산 나트륨염 0.5%를 함유하는 1.6L의 M9배지로 식균되고, 진탕배양은 30℃에서 125스트로크/분으로 행해진다. 48시간 후에, 셀은 원심분리(78,000m/s2 (8,000×g), 4℃, 10분)에 의해 배지로부터 수집된다.
상기 배양동작에 의해 얻은 셀은 80ml의 정제수에 현탁되고, 40ml의 차아염소산 나트륨 용액(유효염소농도: 5%이상)이 거기에 첨가된다. 이 현탁액은 PHA이외의 셀성분을 용해시키기 위하여 2시간동안 4℃에서 진탕되고, 다음에 PHA는 원심분리(6,000×g, 4℃, 20분)에 의해 수집된다. 수집된 PHA는 40ml의 정제수에 현탁되고, 원심분리(78,000m/s2 (8,000×g), 4℃, 10분)에 의해 PHA입자를 수집하는 동작은 2회 행해진다. 다음에, PHA는 물로 세정되어 PHA입자를 얻는다.
얻은 PHA의 분취량은 동결건조가 행해진다. 해당 분취량에 대해 종래의 방법에 의한 메탄올용해를 행한 후에, PHA를 구성하는 모노머유닛의 에스테르화된 메틸을 확인하기 위하여 기체 크로마토그래피/질량 분광계(GC-MS, Shimadzu QP-5050, EI법)에 의해 분석한다. 확인의 결과는, 얻은 PHA가 모노머유닛으로서 3-하이드록시부티르산을 가진 PHB인 것을 발견하였다.
상기 처리에 의해 얻은 0.3g 건조중량의 PHA입자는, 40ml의 정제수와 40ml의 아세톤에서 현탁된다. 이들 현탁액은 1시간동안 4℃에서 교반되고, 다음에 PHA입자는 원심분리(29,400m/s2 (3,000×g), 4℃, 20분)에 의해 수집된다. 수집된 PHA입자는 40ml의 정제수에 현탁되고, PHA입자는 원심분리(78,000m/s2 (8,000×g), 4℃, 10분)에 의해 수집된다. 세정처리 후에, 얻은 PHA입자는 10ml의 정제수에 현탁되고, 다음에 세정처리가 행해진 PHA입자를 얻기 위하여 동결건조된다. 2회 행해진 상기 세정처리의 양자에서, 정제수에 의해 세정된 PHA입자는 샘플 18로서 정의되고, 제 1세정처리에서 아세톤에 의해 세정된 PHA입자는 샘플 19로서 정의된다.
상기 설명한 세정된 PHA입자가 실온에 남겨진 경우 및 입자가 가열된 경우의 양자에서, 입자로부터 방출된 염소의 양은 이하 설명하는 방법에 의해 측정된다. 상기 설명한 세정된 입자는 50ml의 유리병에 놓이고, 이는 다음에 완전하게 밀봉된다. 실온에서 밤새도록 남겨둔 후에, 유리병에서 기체상으로 함유된 염소의 양은 기체검출관으로 측정된다. 다음에, 2분동안 150℃에서 열판위에 유리병을 가열한 후에, 유리병에 기체상으로 함유된 염소의 양은 기체검출관에 의해 측정된다.
측정결과는 표 8에 표시된다. 표 8에 표시된 결과로부터, 정제수(샘플 18)로 세정된 경우와 비교할 때, 아세톤(샘플 19)으로 세정된 PHA입자로부터 방출된 염소의 양은, 충분히 감소되고, 즉 세정처리 후에 PHA입자에 여전히 잔류된 염소의 양은 급격히 감소된다.
| 방출된 염소의 양(㎍) | |||
| 실온에 남겨짐 | 2분동안 150℃에서 가열됨 | ||
| 샘플 18 | 정제수 | 〉6.3 | 160 |
| 샘플 19 | 아세톤 | 1.6 | 32 |
(제 7실시예)
분쇄처리 (1)
말레산 나트륨 0.1%를 함유하는 M9한천배지 위의 TB64균주의 콜로니는 500ml의 진탕플라스크에서 말레산 나트륨 0.5%를 함유하는 50ml의 M9배지로 이동되고, 30℃에서 배양을 진탕한다. 24시간 후에, 5ml의 배양용액이 질소원으로서 NH4Cl만이 1/10의 농도로 준비되고 또한 말레산 나트륨 0.5%가 함유된 1L의 M9배지용액에 첨가되고, 또한 다음에 셀균체에 PHB를 축적하도록 동일한 방법으로 혼합물이 진탕된다. 48시간후에, 셀균체에 축적되는 PHB는 50ml의 증류수에서 원심분리에 의해 수집되고 재현탁되고, 다음에 5개의 분취량(각 10ml)으로 분할된다. 이들 5개의 분취량은 5종류의 처리(20 내지 24)의 각각을 행한다.
20: 대조: 5개의 동일한 분취량중의 하나는 원심분리가 행해지고, 다음에 메탄올에 의한 세정, 동결건조 및 칭량을 행한다. 다음에, 클로로포름에 의한 추출은 24시간동안 60℃에서 행한다. 얻은 추출물이 여과되고 농축된 후에, 메탄올로 재침전되고 대조 폴리머(샘플 20)를 얻기 위하여 진공건조한다.
21: 40ml의 과산화수소 용액 31%(Mitsubishi Gas Chemical Company, Inc.; JIS K-8230)는 5개의 동일한 분취량의 다른 하나에 첨가되고, 1시간동안 80℃에서 처리를 행한다.
22: 증류수는 50ml의 총량을 만들기 위하여 상기 5개의 분취량의 다른 하나에 첨가되고, 프렌치 프레스(Ohtake Works; French Press 5501)는 그위에 행해지고, 다음에 원심분리가 30분동안 4℃에서 29,400m/s2 (3,000×g)로 행해진다. 그 후, 40ml의 증류수는 거기에 더 첨가되고, 다음에 원심분리는 30분동안 4℃에서 29,400m/s2(3,000×g)로 행해지고, 세정된다.
23: 상기 5개의 분취량의 다른 하나는 상기 22에서 설명한 바와 같이 동일한 동작이 행해지고, 다음에 얻은 침전부분은 10ml의 증류수에서 현탁되고, 40ml의 과산화수소 용액 31%가 거기에 첨가되고, 다음에 1시간동안 80℃에서 처리된다.
24: 상기 5개의 분취량 중의 마지막 하나는 상기 22에서 설명한 바와 같이 동일한 동작이 행해지고, 다음에 얻은 침전부분은 10ml의 증류수로 현탁되고 5ml의 차아염소산 나트륨 용액(키시다 화학주식회사; 차아염소산 나트륨 12%함유(유효염소농도: 5%이상))이 거기에 첨가되고, 2시간동안 4℃에서 처리된다.
상기 21 내지 24에서 설명된 처리가 각각 행해진 상기 5개의 분취량은, 원심분리(4℃, 29,400m/s2 (3,000×g), 30분)를 행하고, 다시 4℃로 냉각된다. 40ml의 증류수가 거기에 첨가되고 완전히 교반된 후에, 원심분리는 동일한 조건하에서 2회 행해지고, 또한 얻은 침전물은 동결건조가 행해지고 다음에 칭량된다. 얻은 생성물은 샘플(21 내지 24)로서 각각 정의된다.
이하 설명하는 "수율" 및 "순도"를 평가하기 위하여, 다음의 동작이 행해진다.
30ml의 클로로포름이 동결건조된 샘플 20 내지 샘플 24에 첨가되고, 교반추출동작은 24시간동안 60℃에서 행해진다. 추출된 PHB를 함유하는 클로로포름용액은 0.45㎛ PTFE필터로 여과되고, 여과액은 회전증발기에 의해 농축된다. 농축액은 PHB를 수집하고 침전시키기 위하여 메탄올의 10배의 양에 첨가된다. 얻은 PHB는 진공건조를 행하고, 다음에 칭량한다.
대조로서 샘플 20에 대하여 클로로포름으로 샘플 21 내지 샘플 24를 추출함으로써 얻은 PHB의 중량비는, "수율"로서 결정되고, 또한 클로로포름추출전에 샘플에 대하여 클로로포름으로 각 샘플을 추출함으로써 얻은 PHB의 중량비는 "순도"로서 결정된다. 결과는 표 9에 표시한다.
| 클로로포름추출전의 중량(mg/L) | 클로로포름추출후의 중량(mg/L) | 수율(%) | 순도(%) | |
| 샘플 20 | 2900 | 1830 | - | - |
| 샘플 21 | 1940 | 1790 | 97.8 | 92.3 |
| 샘플 22 | 2020 | 1810 | 98.9 | 89.6 |
| 샘플 23 | 1800 | 1760 | 96.2 | 97.8 |
| 샘플 24 | 1830 | 1770 | 96.7 | 96.7 |
수율에 대하여 주목할만한 차이가 없다. 그러나, 순도에 대하여, 프렌치 프레스가 없이 처리되지만 과산화수소 용액으로 처리된 샘플 21과 프렌치 프레스로 처리되지만 과산화수소 용액으로 처리되지 않은 샘플 22와 비교하는 경우에, 프렌치프레스와 과산화수소 용액으로 처리된 샘플 23과 프렌치 프레스와 차아염소산염으로 처리된 샘플 24는 양호한 결과를 가진다. 순도는 분쇄처리와 산화제처리의 조합된 사용에 의해 개선되는 것이 명백하다.
얻은 PHB의 분자량은 겔투과 크로마토그래피(GPC; Tosoh HLC-8020, 컬럼: Polymer Laboratory PLgelMIXED-C (5㎛), 용매: 클로로포름, 폴리스티렌으로 환산)에 의해 측정된다. 결과는 표 10에 표시한다.
| Mn | Mw | Mw/Mn | ||
| 샘플 20 | 550000 | 1250000 | 2.3 | |
| 샘플 21 | 510000 | 1230000 | 2.4 | |
| 샘플 22 | 540000 | 1200000 | 2.2 | |
| 샘플 23 | 500000 | 1210000 | 2.4 | |
| 샘플 24 | 490000 | 1230000 | 2.5 | |
각 샘플의 분자량사이의 차이가 거의 없는 것이 관찰되었다. 종래의 클로로포름추출방법과 비교할 때, 분쇄처리 또는 산화제처리에 의한 분자량의 작은 변화가 있는 것이 명백하다.
(제 8실시예)
분쇄처리 (2)
n-노난산 0.1%를 함유하는 M9 한천배지위의 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovorans)의 콜로니는 n-노난산 0.3%를 함유하는 50ml의 M9 배지로 이동되어, 30℃에서 진탕배양된다. 40시간 후에, 5ml의 배양액은 n-노난산 0.1% 및 5-페닐발레르산 0.1%를 함유하는 1L의 M9배지에 첨가되고, 진탕배양된다. 40시간 후에, 셀균체는 원심분리에 의해 수집되고, 질소원으로서 NH4Cl을 함유하지 않고 n-노난산 0.1%와 5-페닐발레르산 0.1%를 함유하는 1L의 M9배지에서 재현탁된다. 현탁액은, 3-하이드록시노난산, 3-하이드록시헵탄산, 3-하이드록시발레르산 및 3-하이드록시-5-페닐발레르산을 유닛으로서 함유하는 PHA를 축적하기 위하여 셀균체를 허용하도록, 동일한 방법으로 진탕된다. 40시간 후에, PHA를 축적하는 셀균체는 원심분리에 의해 수집되고, 제 7실시예와 마찬가지의 방식으로 40ml의 증류수에서 현탁된다. 현탁액은 4개의 동일한 분취량(각 10ml)으로 분할되고, 이들 분취량은 다음의 4종류의 처리(25 내지 28)가 각각 행해진다.
25: 대조: 상기 4개의 분취량중의 하나는 원심분리를 행하고, 다음에 메탄올로 세정되고, 동결건조 및 칭량된다. 다음에, 클로로포름추출은 24시간동안 60℃에서 행해진다. 얻은 추출물이 여과되고 농축된 후에, 메탄올로 재침전되고, 대조 폴리머(샘플 25)를 얻기 위하여 진공건조된다.
26: 40ml의 31% 과산화수소 용액(Mitsubishi Gas Chemical Company, Inc.; JIS K-8230)은 상기 4개의 동일한 분취량의 다른 하나에 첨가되고, 1시간동안 80℃에서 처리된다.
27: 소량의 증류수는 50ml의 총량을 가지도록 상기 4개의 동일한 분취량의 다른 하나에 첨가되고, 프렌치 프레스(Ohtake Works; French Press 5501)가 그 위에서 행해지고, 30분동안 4℃에서 29,400m/s2 (3,000×g)으로 행해지고, 세정된다.
28: 상기 4개의 동일한 분취량중의 마지막 하나는 상기 27에서 설명한 바와 같은 동일한 동작이 행해지고, 다음에 얻은 침전부분은 10ml의 증류수에서 현탁되고, 40ml의 31% 과산화수소 용액이 거기에 첨가되고, 1시간동안 80℃에서 처리된다.
분취량(26 내지 28)은 원심분리(4℃, 29,400m/s2 (3,000×g), 30분)가 행해지고, 다음에 40ml의 증류수가 거기에 첨가되고 완전히 교반된다. 그 후, 원심분리는 동일한 조건하에서 2회 행해지고, 얻은 침전물은 동결건조가 행해지고 다음에 칭량된다. 얻은 생성물은 샘플 26 내지 샘플 28로서 정의된다.
이들 샘플은 제 7실시예와 마찬가지의 방식으로 클로로포름추출을 행하고, 또한 "수율" 및 "순도"가 결정된다. 결과는 표 11에 표시된다.
| 클로로포름추출전의 중량(mg/L) | 클로로포름추출후의 중량(mg/L) | 수율(%) | 순도(%) | |
| 샘플 25 | 1980 | 1080 | - | - |
| 샘플 26 | 1210 | 1000 | 92.6 | 83.4 |
| 샘플 27 | 1230 | 1010 | 93.5 | 82.1 |
| 샘플 28 | 1110 | 990 | 91.7 | 89.2 |
수율에 대하여 주목할만한 차이는 없다. 그러나, 순도에 대하여, 프렌치 프레스가 없이 처리되지만 과산화수소 용액으로 처리된 샘플 26과 프렌치 프레스로 처리되지만 과산화수소 용액이 없이 처리된 샘플 27과 비교할 때, 프렌치 프레스 및 과산화수소 용액의 양자로 처리된 샘플 28의 순도는 최고이다. 제 7실시예에 표시한 PHB의 경우와 마찬가지로, 본 실시예에 표시된 바와 같은 방향환을 가진 PHA의 순도는 분쇄처리 및 산화제처리의 조합된 사용에 의해 또한 개선되는 것이 명백하다.
얻은 PHB의 분자량은 겔투과 크로마토그래피(GPC; Tosoh HLC-8020, 컬럼: Ploymer Laboratory PLgelMIXED-C (5㎛), 용매: 클로로포름, 폴리스티렌으로 환산)에 의해 측정된다. 결과는 표 12에 표시한다.
| Mn | Mw | Mw/Mn | |
| 샘플 25 | 35000 | 91000 | 2.6 |
| 샘플 26 | 32000 | 89000 | 2.8 |
| 샘플 27 | 34000 | 90000 | 2.6 |
| 샘플 28 | 30000 | 89000 | 3.0 |
각 샘플의 분자량사이의 차이가 거의 없는 것이 관찰된다. 방향환을 가진 PHA에 대하여, 종래의 클로로포름추출방법과 비교할 때, 분쇄처리 또는 산화제처리에 의해 분자량의 변화가 거의 없는 것이 명백하다.
본 발명의 방법에 의하면, 원래의 분자량을 유지하면서, 미생물 등의 셀에 축적된 폴리하이드록시알카노에이트를 고수율로 용이하게 얻을 수 있는 것이 가능하다. 또한, 본 발명의 PHA를 생산하는 방법을 사용하여, 유기용매추출을 위한 수단을 사용하지 않고 감소된 잔류염소를 가진 PHA입자는 산업적인 규모로 효과적으로 생산될 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 얻은 폴리하이드록시알카노에이트의 입자는, 생분해성 재료, 생체적합성 재료, 각종 기능성 재료 등으로서 유용한 원료가 되고, 또한 소자재료 또는 의료재료 등의 각종 분야에 적용되는 것을 기대할 수 있다.
도 1은 제 1실시예 및 제 2실시예에 설명된 염소농도를 결정하는 방법을 도시하는 도면.
〈도면의 주요부분에 대한 설명〉
1 : 삼각플라스크 2a : 외부캡
2b : 내부캡 2c : 알루미늄박
6 : 검출관
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- 적어도 차아염소산염을 함유하는 산화제에 의해 폴리하이드록시알카노에이트를 함유하는 셀을 처리하는 단계와;상기 처리된 셀을 수용성 부분과 불수용성 부분으로 분리하는 단계와;불수용성 부분에 잔류된 염소를 감소시키는 단계로 이루어진 폴리하이드록시알카노에이트의 생산방법에 있어서,상기 염소를 감소시키는 단계는, 티오황산염 수용액으로 상기 불수용성 부분을 세정하는 단계인 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 생산방법.
- 제 7항에 있어서, 상기 얻은 폴리하이드록시알카노에이트를 온수로 세정하는 단계를 부가하여 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 생산방법.
- 제 7항에 있어서, 상기 티오황산염은, 티오황산칼륨, 티오황산칼륨 3수화물, 티오황산칼슘 6수화물, 티오황산 제 1철, 티오황산나트륨, 티오황산나트륨 5수화물 및 티오황산암모늄으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 생산방법.
- 적어도 차아염소산염을 함유하는 산화제에 의해 폴리하이드록시알카노에이트를 함유하는 셀을 처리하는 단계와;상기 처리된 셀을 수용성 부분과 불수용성 부분으로 분리하는 단계와;불수용성 부분에 잔류된 염소를 감소시키는 단계로 이루어진 폴리하이드록시알카노에이트의 생산방법에 있어서,상기 염소를 감소시키는 단계는, 상기 폴리하이드록시알카노에이트가 용해되지 않는 유기극성 용매를 적어도 함유하는 극성 용매용액으로 상기 불수용성 부분을 세정하는 단계인 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 생산방법.
- 제 10항에 있어서, 상기 유기극성 용매는 알콜 및 케톤으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 생산방법.
- 제 11항에 있어서, 상기 알콜은 메탄올, 에탄올, 이소프로판올 및 이소부탄올로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 생산방법.
- 제 11항에 있어서, 상기 케톤은 아세톤인 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 생산방법.
- 적어도 차아염소산염을 함유하는 산화제에 의해 폴리하이드록시알카노에이트를 함유하는 셀을 처리하는 단계와;상기 처리된 셀을 수용성 부분과 불수용성 부분으로 분리하는 단계와;불수용성 부분에 잔류된 염소를 감소시키는 단계를 구비한 폴리하이드록시알카노에이트의 생산방법에 있어서,상기 폴리하이드록시알카노에이트를 함유하는 셀을 분쇄함으로써 분쇄생성물을 얻는 단계와;상기 분쇄생성물을 수용성 부분과 불수용성 부분으로 분리하는 단계를 부가하여 포함하고,상기 불수용성 부분은 산화제로 처리하는 상기 단계에서 사용되는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 생산방법.
- 제 14항에 있어서, 상기 셀을 분쇄함으로써 분쇄생성물을 얻는 단계는, 초음파 파쇄법(ultrasonication method), 호모지나이저(homogenizer)방법, 고압분쇄방법, 비드충격방법, 밀링방법, 그라인딩방법 및 동결해동방법으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나에 의해 행해지는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 생산방법.
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