KR100467208B1 - 원료로서의 치환된 지방산 에스테르로부터의폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
하기 화학식(2):
(식중, R은 페닐기, 페녹시기, 벤조일기, 시클로헥실기, 티에닐기 및 이들의 화학변성기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 치환기를 표시하고, x는 0 내지 8의 정수임)를 지닌 모노머유닛을 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트는, 하기 화학식(1):
(식중, R은 상기 정의한 바와 같고, R'는 임의의 치환기를 표시하고, x는 0 내지 8의 정수임)을 지닌 치환된 지방산 에스테르를 함유하는 배지중에서 미생물을 배양함으로써 생산되고, 상기 미생물은, 상기 치환된 지방산 에스테르를 그 균체내에 취해서 상기 배지에서 소망의 폴리하이드록시알카노에이트를 합성가능한 것을 특징으로 한다.
Description
발명의 분야
본 발명은 폴리하이드록시알카노에이트(이하, "PHA"라 약칭할 경우도 있음)를 미생물에 의해서 효율적으로 제조하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은, 곁사슬에 원료로부터 유래된 치환기를 지닌 PHA를 생산해서 균체내에 축적가능한 미생물을 이용해서, 원료로서의 치환된 지방산 에스테르로부터 소망의 화학 구조를 지닌 PHA를, 종래의 방법에 비해서, 효율적으로 제조하는 방법에 관한 것이다.
배경기술
이미 많은 미생물이 폴리(3-하이드록시부티르산)(이하, 간단히 "PHB"라 약칭할 경우도 있음) 혹은 기타 PHA를 생산하여 균체내에 축적하는 것이 보고되어 있다(「생분해성 플라스틱 핸드북」, 생분해성 플라스틱연구회편, (주) 엔티에스(NTS)발행, p178-197). 종래의 플라스틱의 경우와 마찬가지로, 이들 폴리머는, 용융처리 등을 통해서 각종 제품을 제조하는 데 사용될 수 있다. 또한,이들 폴리머는, 생분해성이므로, 자연계에 있어서 미생물에 의해 완전히 분해되어, 많은 종래의 합성폴리머와는 달리 자연환경에 잔류해서 오염시키는 일은 없고, 또, 소각할 필요도 없으므로, 공기오염 및 지구온난화의 방지의 점에서 유리하다. 또한, 우수한 생체적합성을 지녀, 의료용 연질재료 등으로서의 응용도 기대되고 있다.
또, 이러한 미생물에 의해 생산되는 PHA는, 생산에 사용되는 미생물의 종류나 배지조성, 배양조건 등에 따라 각종 조성이나 구조를 지니는 것으로 알려져 있고, 또, PHA물성의 개량이라고 하는 관점에서, 이들의 조성이나 구조의 제어에 관한 많은 연구가 행해져 왔다.
예를 들면, 알칼리게네스 유트로퍼스(Alcaligenes eutrophus) H16, ATCC No.17699 및 그 변이체는, 그들의 배양시의 탄소원을 변화시킴으로써, 3-하이드록시부티르산(이하, "3HB"라 약칭함) 및 3-하이드록시발레르산(이하, "3HV"라 약칭함)의 공중합체를 다양한 조성비로 생산하는 것이 보고되어 있다(일본국 공개특허 평 6-15604호 공보, 일본국 공개특허 평 7-14352호 공보, 일본국 공개특허 평 8-19227호 공보 등).
또, 일본국 공개특허 평 9-191893호 공보에는, 코마모나스 아시도보란스(Comamonas acidovorans) IFO 13852는, 탄소원으로서 글루콘산 및 1,4-부탄디올을 이용해서 배양하면, 3HB와 4-하이드록시부티르산을 모노머유닛으로서 지니는 폴리에스테르를 생산하는 것이 개시되어 있다.
또한, 이들 문헌에 개시된 PHA는, 메틸렌이나 에틸렌곁사슬이외의 다른 곁사슬은 지니지 않으므로 '보통의'(usual) PHA라 칭한다.
한편, 일본국 특허공보 제 2642937호에서는, 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovorans) ATCC 29347에, 탄소원으로서 비고리식 지방족 탄화수소를 공급할 경우, 탄소수 6 내지 12의 3-하이드록시알카노에이트(이하, "3HA"라 약칭함)의 모노머유닛을 함유하는 PHA가 생산되는 것이 개시되어 있다.
일본국 공개특허 평 5-74492호 공보에는, 메틸로박테리움속(Methylobacteriumsp.), 파라코커스속(Paracoccussp.), 알칼리게네스속(Alcaligenessp.) 또는 슈도모나스속(Pseudomonassp.)의 미생물을, 탄소수 3 내지 7개의 1급 알콜에 접촉시킴으로써, 3HB와 3HV와의 공중합체를 생산시키는 방법이 개시되어 있다.
일본국 공개특허 평 5-93049호 공보 및 일본국 공개특허 평 7-265065호 공보에는, 아에로모나스 카비에(Aeromonas caviae)를, 올레산이나 올리브유를 탄소원으로 해서 배양함으로써, 3HB와 3-하이드록시헥산산(이하, "3HHx"라 약칭함)의 2성분 공중합체를 생산하는 것이 개시되어 있다.
또, 어떤 종류의 미생물은, 예를 들면, 불포화 탄화수소, 에스테르기, 알릴기, 시아노기, 할로겐화 탄화수소, 에폭사이드 등의 각종 치환기가 도입되어 있는 PHA를 생산하는 것이 보고되어 있고, 이러한 기술을 이용해서 미생물생산 PHA의 물성을 향상시키려는 시도가 행해져 왔다.
예를 들면, Makromol. Chem., 191, 1957-1965(1990), Macromolecules, 24, 5256-5260(1991), Chirality, 3, 492-494(1991) 등에는, 슈도모나스올레오보란스(Pseudomonas oleovorans)가, 3-하이드록시-5-페닐발레르산(이하, "3HPV"라 약칭함)을 모노머유닛으로서 함유하는 PHA를 생산하고, 3HPV를 함유하는 사실에 기인해서, 폴리머물성의 일부 변화가 확인된 것이 보고되어 있다.
또한, 이들 문헌에 개시되어 있는 바와 같은 곁사슬을 지닌 PHA는, 본 명세서에 있어서 '특이한'(unusual)" PHA라 칭한다.
종래, 제조에 이용되는 미생물의 종류, 배지조성 및 배양조건을 변화시킴으로써 각종 조성과 구조를 지닌 미생물생산 PHA가 얻어지고 있었다. 또, 이 시도의 목적은, 주로, PHA에 함유된 복수의 3HA의 비율을 변화시킴으로써 플라스틱으로서의 PHA의 물성을 향상시키고자 하는 것이었다.
한편, 상기와 같이 곁사슬에 치환기가 도입된 특이한 PHA는, 도입된 치환기의 특성에 기인해서 현저하게 유용한 기능성을 지닌 기능성 폴리머로서 폭넓은 용도에 대해 개발될 것으로 기대되고 있다. 따라서, 이러한 기능성이외에도 생분해성을 구비한 혁신적인 폴리머, 이러한 폴리머를 생산해서 내부에 축적가능한 미생물 및 이러한 미생물을 이용해서 이러한 폴리머를 생산하는 효율적인 제조방법을 개방하는 것이 극히 유용하고 중요한 것으로 여겨진다.
또, 통상, 곁사슬에 각종 치환기가 도입된 이러한 특이한 PHA, 즉, 하기 화학식(2):
(식중, R은 임의로 선택된 치환기를 표시하고, x는 0 내지 8의 정수임)로 표시되는 모노머유닛을 함유하는 PHA를 미생물에 의해서 제조하는 데 이용되는 방법은, 슈도모나스 올레오보란스를 이용하는 상기 보고예와 같이, 도입하고자 하는 치환기를 지닌 하기 화학식(6):
(식중, R은 임의로 선택된 치환기를 표시하고, x는 0 내지 8의 정수임)을 지닌 치환된 지방산을 화학적으로 합성하고, 이 합성된 지방산중에서 미생물을 배양한 후, 생산된 PHA를 추출하는 공정을 구비한다.
예를 들면, Polymer Prepr., 35, 627-628(1994) 및 Can. J. Microbiol., 41,32-43(1995)에는, 하기 반응식:
(식중, x는 2 또는 4임)에 예시된 방법에 의해 PHA를 제조하는 것이 보고되어 있다.
즉, 먼저, 4-시아노페놀과 6-브로모헥산산 에틸에스테르와의 윌리암슨반응에 의해 6-(4-시아노페녹시)헥산산 에틸에스테르를 합성한 후, 이 6-(4-시아노페녹시)헥산산 에틸에스테르를 알칼리조건하에 가수분해해서 6-(4-시아노페녹시)헥산산을얻는다. 최종적으로, 얻어진 6-(4-시아노페녹시)헥산산을 PHA생산균체중의 하나인 슈도모나스 올레오보란스에 공급해서, 해당 균체를 배양하고, 생산물을 추출해서 3-하이드록시-6-(4-시아노페녹시)헥산산을 모노머유닛으로서 함유하는 PHA를 얻는다.
그러나, 상기한 바와 같이 치환된 지방산을 화학적으로 합성하여 미생물에 공급하는 공정을 포함하는 특이한 PHA의 통상의 제조방법에 있어서는, 원료, 즉, 치환된 지방산의 화학합성은 수단계의 화학반응을 필요로 하므로, 상당히 복잡한 제조공정으로 되어, 장시간이 걸리고, 비용이 높아지며, 번거로운 작업을 요하게 되는 경우가 많다. 또, 치환기의 종류, 수 및 위치에 따라, 치환된 지방산 에스테르의 합성공정에 있어서 에스테르의 가수분해반응이 원활하게 진행되지 않는 문제가 있을 수 있어, 공업적인 규모면에서 또한 제조장치의 개발면에서 특이한 PHA제조에 각종 문제를 일으키게 된다.
발명의 요약
본 발명자들은, 치환된 지방산에 비해서 비교적 용이하게 합성되거나 얻을 수 있는 원료를 이용해서 특이한 PHA를 미생물에 의해 생산하는 PHA의 제조방법을 개발하고자 예의 연구를 행한 결과, 미생물의 배양에, 종래의 원료인 치환된 지방산을 위한 화학합성법에 있어서의 중간체인 하기 화학식(1):
(식중, R은 페닐기, 페녹시기, 벤조일기, 시클로헥실기, 티에닐기 및 이들의 화학변성기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 치환기를 표시하고, R'는 임의의 치환기를 표시하고, x는 0 내지 8의 정수임)을 지닌 치환된 지방산 에스테르를 함유하는 배지를 이용함으로써 소망의 특이한 PHA를 효율적으로 얻을 수 있다는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
즉, 본 발명은, 상기 화학식(2)로 표시되는 모노머유닛을 지닌 PHA의 제조방법에 있어서, 상기 화학식(1)을 지닌 치환된 지방산 에스테르를 균체내에 취하여 PHA를 합성가능한 미생물을, 상기 치환된 지방산 에스테르를 함유하는 배지에서 배양하는 공정을 구비한 것을 특징으로 하는 PHA의 제조방법에 관한 것이다.
또, 본 발명은, 미생물에 의해 생산된 PHA를 단리하는 공정을 또 구비한 것을 특징으로 하는 상기 PHA의 제조방법에 관한 것이다.
또한, PHA를 생산해서 내부에 축적가능한 미생물은, 슈도모나스속(Pseudomonassp.)에 속하는 미생물로부터 선택하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 슈도모나스 치코리이(Pseudomonas cichorii) YN2균주, 슈도모나스 치코리이(Pseudomonas cichorii) H45균주 및 슈도모나스 젯세니이(Pseudomonas jessenii) P161균주로부터 선택된 적어도 1종의 균주를 이용하는 것이 특히 바람직하다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시형태에 대해서 상세히 설명한다.
본 발명의 방법에 이용되는 치환된 지방산 에스테르로서는, 상기 화학식(1)을 지닌 화합물이라면 어떠한 것이라도, 미생물에 의한 특이한 PHA생산용의 원료로서 사용될 수 있는 한 특히 제한없이 사용할 수 있고, 그 대표적인 예로서는, 일부 위치에서 각종 방법에 의해 화학적으로 변성되어 있어도 되는 페닐기, 페녹시기, 벤조일기, 시클로헥실기, 티에닐기 등의 작용기를 지닌 지방산을 들 수 있다. 바람직한 구체예로서는, 5-페닐발레르산 메틸에스테르,5-(4-플로오로페닐)발레르산 메틸에스테르, 6-페닐헥산산 메틸에스테르,4-페녹시-n-부티르산 메틸에스테르,4-(3-플루오로페녹시)-n-부티르산 메틸에스테르,4-(4-플루오로페녹시)-n-부티르산 메틸에스테르,4-(4-시아노페녹시)-n-부티르산 메틸에스테르,4-(4-니트로페녹시)-n-부티르산 메틸에스테르, 5-페녹시발레르산 메틸에스테르,5-(4-플루오로페녹시)발레르산 메틸에스테르, 5-벤조일발레르산 메틸에스테르,4-시클로헥실부티르산 메틸에스테르, 5-(2-티에닐)발레르산 메틸에스테르,5-페닐발레르산 에틸에스테르, 5-(4-플로오로페닐)발레르산 에틸에스테르,6-페닐헥산산 에틸에스테르, 4-페녹시-n-부티르산 에틸에스테르,4-(3-플루오로페녹시)-n-부티르산 에틸에스테르,4-(4-플루오로페녹시)-n-부티르산 에틸에스테르,4-(4-시아노페녹시)-n-부티르산 에틸에스테르,4-(4-니트로페녹시)-n-부티르산 에틸에스테르, 5-페녹시발레르산 에틸에스테르,5-(4-플루오로페녹시)발레르산 에틸에스테르, 5-벤조일발레르산 에틸에스테르,4-시클로헥실부티르산 에틸에스테르 및 5-(2-티에닐)발레르산 에틸에스테르 등의 치환된 지방산 에스테르를 들 수 있다.
이하, 본 발명에 이용되는 미생물 및 배양방법에 대해 설명한다.
(미생물)
본 발명의 방법에 사용되는 미생물로서는, 원료(기질)로서 화학식(1)을 지닌 치환된 지방산 에스테르를 이용해서 화학식(2)를 지닌 모노머유닛을 함유하는 PHA를 생산하는 능력을 지닌 것이면 되고, 그 예로서는, 일본국 특허 출원 평 11-371863호에 기재된 PHA생산미생물, 즉, 슈도모나스 치코리이(Pseudomonas cichorii) YN2, 슈도모나스 치코리이(Pseudomonas cichorii) H45, 슈도모나스 젯세니이(Pseudomonas jessenii) P161을 들 수 있다. 또한, 상기 YN2균주, H45균주 및 P161균주는, 각각, 일본국 통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소(특허미생물기탁소)에 일본국내의 기탁번호 FERM P-17411, FERM P-17410 및 FERM P-17445(이들은 각각 국제기탁의 수탁번호 FERM BP-7375, FERM BP-7374 및 FERM BP-7376에 대응함)로 기탁되어 있다.
상기 H45균주, YN2균주 및 P161균주의 균학적 성질은 다음과 같다.
<H45균주의 균학적 성질>
(1) 형태학적 성질
세포의 형상과 크기: 간상균, 0.8㎛×(1.0 내지 1.2)㎛
세포의 다형성: 없음
운동성: 있음
포자형성: 없음
그램염색: 음성
콜로니형상: 원형, 전체 가장자리가 매끄러움, 저볼록형상, 표면층이 원 활, 광택있음, 크림색
(2) 생리학적 성질
카탈라제: 양성
옥시다제: 양성
O/F시험: 산화형
질산환원: 음성
인돌생산: 음성
글루코스 산성화: 음성
아르기닌디하이드롤라제: 음성
우레아제: 음성
에스쿨린가수분해: 음성
젤라틴가수분해: 음성
β-갈락토시다제: 음성
King's B 한천에서의 형광색생산: 양성
4%NaCl에서의 생육: 음성
폴리-β-하이드록시부티르산의 축적: 음성
(3) 기질동화능
글루코스: 양성
L-아라비노스: 음성
D-만노스: 양성
D-만니톨: 양성
N-아세틸-D-글루코사민: 양성
말토스: 음성
글루콘산 칼륨: 양성
n-카프르산: 양성
아디프산: 음성
dl-말산: 양성
시트르산 나트륨: 양성
아세트산 페닐: 양성
<YN2균주의 균학적 성질>
(1) 형태학적 성질
세포의 형상과 크기: 간상균, 0.8㎛×(1.5 내지 2.0)㎛
세포의 다형성: 없음
운동성: 양성
포자형성: 없음
그램염색: 음성
콜로니형상: 원형, 전체 가장자리가 매끄러움, 저볼록형상, 표면층이 원 활, 광택있음, 반투명
(2) 생리학적 성질
카탈라제: 양성
옥시다제: 양성
O/F시험: 산화형
질산환원: 음성
인돌생산: 양성
글루코스 산성화: 음성
아르기닌디하이드롤라제: 음성
우레아제: 음성
에스쿨린가수분해: 음성
젤라틴가수분해: 음성
β-갈락토시다제: 음성
King's B 한천에서의 형광색생산: 양성
4%NaCl에서의 생육: 양성(약)
폴리-β-하이드록시부티르산의 축적: 음성
Tween 80의 가수분해: 양성
(3) 기질동화능
글루코스: 양성
L-아라비노스: 양성
D-만노스: 음성
D-만니톨: 음성
N-아세틸-D-글루코사민: 음성
말토스: 음성
글루콘산 칼륨: 양성
n-카프르산: 양성
아디프산: 음성
dl-말산: 양성
시트르산 나트륨: 양성
아세트산 페닐: 양성
<P161균주의 균학적 성질>
(1) 형태학적 성질
세포의 형상과 크기: 구형상, 직경 Φ0.6㎛,
간상 0.6㎛×(1.5 내지 2.0)㎛
세포의 다형성: 있음(신장형)
운동성: 있음
포자형성: 없음
그램염색: 음성
콜로니형상: 원형, 전체 가장자리가 매끄러움, 저볼록형상, 표면층이 원 활, 담황색
(2)생리학적 성질
카탈라제: 양성
옥시다제: 양성
O/F시험: 산화형
질산환원: 양성
인돌생산: 음성
글루코스 산성화: 음성
아르기닌디하이드롤라제: 양성
우레아제: 음성
에스쿨린가수분해: 음성
젤라틴가수분해: 음성
β-갈락토시다제: 음성
King's B 한천에서의 형광색생산: 양성
(3) 기질동화능
글루코스: 양성
L-아라비노스: 양성
D-만노스: 양성
D-만니톨: 양성
N-아세틸-D-글루코사민: 양성
말토스: 음성
글루콘산 칼륨: 양성
n-카프르산: 양성
아디프산: 음성
dl-말산: 양성
시트르산 나트륨: 양성
아세트산 페닐: 양성
또, 슈도모나스속에 속하는 미생물이외에도, 아에로모나스속(Aeromonassp.), 코마모나스속(Comamonassp.), 부르크홀데리아속(Burkholderiasp.) 등에 속하고, 원료(기질)로서 화학식(1)을 지닌 치환된 지방산 에스테르를 이용해서 화학식(2)를 지닌 모노머유닛을 함유하는 PHA를 생산가능한 미생물도 사용가능하다.
(배양법)
본 발명에 관한 PHA의 제조방법에 이용되는 미생물의 배양, 예를 들면, PHA의 생산에 필요한 보존균주의 작성, 균체의 수 및 활성상태를 확보하기 위한 증식 등에는, 이용하는 미생물의 증식에 필요한 성분을 함유하는 배지를 적절하게 선택해서 이용한다. 예를 들면, 미생물의 통상의 생육의 경우에는, 미생물의 생육이나 생존에 악영향을 미치지 않는 것인 한, 일반적인 천연배지(육즙, L-즙 등)나 영양원을 함유하는 인공배지 등의 소정 종류의 배지를 이용하는 것이 가능하다. 또, 온도, 통기, 교반 등의 배양조건은 미생물에 따라 적절하게 선택하면 된다.
상기 미생물을 이용해서 화학식(2)를 지닌 모노머유닛을 함유하는 PHA를 생산 ·축적할 경우, 화학식(1)을 지닌 치환된 지방산 에스테르와, 글루코스, 폴리펩톤, 효모엑스 등의 미생물성장기질을 함유하는 무기배지에서 미생물을 대수증식상에서부터 정상상에 이를 때까지 배양한 후, 균체를 원심분리에 의해 회수하는 제 1단계와, 화학식(1)을 지닌 치환된 지방산 에스테르와, 상기 성장기질을 함유하지만 무기질소원을 제한한 무기배지에서 더욱 배양하는 제 2단계로 이루어진 2단계배양법을 사용할 수 있다. 한편, 화학식(1)을 지닌 치환된 지방산 에스테르와 상기 성장기질을 함유하는 무기배지에서 대수증식상에서부터 정상상에 이를 때까지 배양하는 단계로 이루어진 1단계배양법을 사용하는 것도 가능하다.
상기 배양법에 사용되는 무기배지로서는, 인원(예를 들면, 인산염 등), 무기질소원(예를 들면, 암모늄염, 질산염 등) 등 대상 미생물의 증식을 허용하는 성분을 함유하고 있는 것이면 어느 것이라도 사용가능하며, 그 예로서는, MSB배지, M9배지 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 실시예에서 사용된 M9배지의 조성은 다음과 같다.
Na2HPO4: 6.2g
KH2PO4: 3.0g
NaCl: 0.5g
NH4Cl: 1.0g
(배지 1ℓ중, pH 7.0)
원료로서의 치환된 지방산 에스테르의 배지에의 첨가농도는, 미생물의 균주의 종류, 균체의 농도 또는 배양방법에 따라 적절하게 선택하면 되고, 일반적으로는, 배지중 0.01 내지 0.5%내에서 선택하는 것이 바람직하다. 또, 상기 2단계 배양법에 있어서, 제 1단계배양시 치환된 지방산 에스테르를 첨가하지 않고 배양을 행해도 된다.
또한, 글루코스, 프럭토스, 만노스, 폴리펩톤, 효모엑스 등의 미생물의 성장기질을 첨가할 경우, 그들의 농도는, 미생물의 종류, 균체의 농도 또는 배양방법에 따라 적절하게 선택하면 되나, 통상, 배지중의 함유량은 0.1% 내지 1.0%이내에서 선택하면 된다. 또, 상기 2단계 배양법에 있어서, 제 2단계배양시 성장기질을 첨가하지 않고 배양을 행해도 된다.
통상의 미생물배양에 적용가능한 방법, 예를 들면, 회분식(batch) 배양, 유동회분식 배양, 연속배양, 반응기형 배양, 고체배양 등을 이용할 수 있다. 이 때의 배양온도는, 미생물의 종류, 균체의 농도 또는 배양방법에 따라 적절하게 선택하면 되나, 통상, 사용되는 미생물이 증식될 수 있는 범위내, 예를 들면, 14℃ 내지 40℃, 바람직하게는 20℃ 내지 35%이다.
본 발명의 미생물의 균체로부터의 PHA의 회수는, 통상 행해지고 있는 클로로포름 등의 유기용매에 의한 추출이 가장 간편하지만, 유기용매를 사용하기에 적합하지 않은 환경중에 있어서는, SDS 등의 계면활성제를 이용한 처리, 리소자임 등의 효소를 이용한 처리, EDTA, 차아염소산 나트륨, 암모니아 등의 약제를 이용한 처리에 의해서 균체성분을 제거한 후, PHA를 회수하는 방법을 이용하는 것도 가능하다.
또한, 본 발명의 미생물의 배양, 본 발명의 미생물에 의한 PHA의 생산과 균체내로의 축적, 그리고, 본 발명에 있어서의 균체로부터의 PHA의 회수는, 상기 방법으로 한정되는 것은 아니다.
(실시예)
이하, PHA제조방법에 대해 실시예를 예시해서 구체적으로 설명한다. 이들실시예는 본 발명의 최량의 바람직한 실시예이지만, 본 발명은 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.
(실시예 1)
슈도모나스 치코리이 YN2, 슈도모나스 치코리이 H45 및 슈도모나스 젯세니이 P161로부터 선택된 각 1종의 균주를, D-글루코스 0.5% 및 5-페닐발레르산 메틸에스테르 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 접종하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하고, 66시간후, 균체를 원심분리에 의해서 회수하고, D-글루코스 0.5% 및 5-페닐발레르산 메틸에스테르 0.1%를 함유하나 무기질소원(NH4Cl)은 함유하지 않는 M9배지 200㎖에 재현탁시켜, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 44시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하고 나서, 동결건조하였다.
얻어진 동결건조펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 24시간 교반해서 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 해당 여과액을 회전식 증발기에서 농축하고, 얻어진 농축액을 냉메탄올중에서 재침전시키고, 또 침전물만을 회수하여 진공건조해서 PHA를 얻었다. 얻어진 PHA는 상법에 따라서 메탄올라이시스(methanolysis)를 행한 후, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마즈 QP-5050, EI법)로 분석해서, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정(同定)을 행하였다. 그 결과, 하기 표 1에 표시한 바와 같이, 3-하이드록시-5-페닐발레르산을 모노머유닛으로서 함유하는 PHA가 생산된 것으로 확인되었다.
| 균주 | YN2 | H45 | P161 |
| 균체의 건조중량(㎎/ℓ)폴리머의 건조중량(㎎/ℓ)폴리머의 건조중량/균체의 건조중량 | 2024924% | 32310432% | 2466727% |
| 모노머유닛의 조성(GC-MS: TIC피크면적비)3-하이드록시부티르산3-하이드록시옥탄산3-하이드록시데칸산3-하이드록시도데칸산3-하이드록시도데센산3-하이드록시-5-페닐발레르산 | 2%1%3%1%2%91% | 0%2%2%1%1%94% | 35%1%3%0%0%61% |
(실시예 2)
슈도모나스 치코리이 YN2, 슈도모나스 치코리이 H45 및 슈도모나스 젯세니이 P161로부터 선택된 각 1종의 균주를, D-글루코스 0.5% 및 5-페닐발레르산 메틸에스테르 0.01%를 함유하는 M9배지 200㎖에 접종하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하고, 46시간후, 균체를 원심분리에 의해서 회수하고, D-글루코스 0.5% 및 5-페닐발레르산 메틸에스테르 0.1%를 함유하나 무기질소원(NH4Cl)은 함유하지 않는 M9배지 200㎖에 재현탁시켜, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 41시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하고 나서, 동결건조하였다.
얻어진 동결건조펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 24시간 교반해서 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 해당 여과액을 회전식 증발기에서 농축하고, 얻어진 농축액을 냉메탄올중에서 재침전시키고, 또 침전물만을 회수하여 진공건조해서 PHA를 얻었다. 얻어진 PHA는 상법에 따라서 메탄올라이시스를 행한 후,가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마즈 QP-5050, EI법)로 분석해서, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 그 결과, 하기 표 2에 표시한 바와 같이, 3-하이드록시-5-페닐발레르산을 모노머유닛으로서 함유하는 PHA가 생산된 것으로 확인되었다.
| 균주 | YN2 | H45 | P161 |
| 균체의 건조중량(㎎/ℓ)폴리머의 건조중량(㎎/ℓ)폴리머의 건조중량/균체의 건조중량 | 85629635% | 81926833% | 36915943% |
| 모노머유닛의 조성(GC-MS: TIC피크면적비)3-하이드록시부티르산3-하이드록시헥산산3-하이드록시옥탄산3-하이드록시데칸산3-하이드록시도데칸산3-하이드록시도데센산3-하이드록시-5-페닐발레르산 | 1%0%2%4%2%2%89% | 0%0%2%4%2%2%90% | 6%1%5%9%4%5%70% |
(실시예 3)
슈도모나스 치코리이 YN2를, D-글루코스 0.5% 및 4-페녹시-n-부티르산 에틸에스테르 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 접종하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하고, 67시간후, 균체를 원심분리에 의해서 회수하고, D-글루코스 0.5% 및 4-페녹시-n-부티르산 에틸에스테르 0.1%를 함유하나 무기질소원(NH4Cl)은 함유하지 않는 M9배지 200㎖에 재현탁시켜, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 21시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하고 나서, 동결건조하였다.
얻어진 동결건조펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 24시간 교반해서 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한후, 해당 여과액을 회전식 증발기에서 농축하고, 얻어진 농축액을 냉메탄올중에서 재침전시키고, 또 침전물만을 회수하여 진공건조해서 PHA를 얻었다. 얻어진 PHA는 상법에 따라서 메탄올라이시스를 행한 후, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마즈 QP-5050, EI법)로 분석해서, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 그 결과, 하기 표 3에 표시한 바와 같이, 3-하이드록시-4-페녹시-n-부티르산을 모노머유닛으로서 함유하는 PHA가 생산된 것으로 확인되었다.
| 균주 | YN2 |
| 균체의 건조중량(㎎/ℓ)폴리머의 건조중량(㎎/ℓ)폴리머의 건조중량/균체의 건조중량 | 194542% |
| 모노머유닛의 조성(GC-MS: TIC피크면적비)3-하이드록시부티르산3-하이드록시헥산산3-하이드록시헵탄산3-하이드록시옥탄산3-하이드록시노난산3-하이드록시데칸산3-하이드록시도데칸산3-하이드록시도데센산3-하이드록시-4-페녹시-n-부티르산 | 13%2%3%9%7%27%9%17%13% |
(실시예 4)
슈도모나스 치코리이 H45 및 슈도모나스 젯세니이 P161의 어느 1종을, D-글루코스 0.5% 및 4-페녹시-n-부티르산 에틸에스테르 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 접종하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하고, 45시간후, 균체를 원심분리에 의해서 회수하고, D-글루코스 0.5% 및 4-페녹시-n-부티르산 에틸에스테르 0.1%를 함유하나 무기질소원(NH4Cl)은 함유하지 않는 M9배지 200㎖에 재현탁시켜, 30℃,125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 40시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하고 나서, 동결건조하였다.
얻어진 동결건조펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 24시간 교반해서 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 해당 여과액을 회전식 증발기에서 농축하고, 얻어진 농축액을 냉메탄올중에서 재침전시키고, 또 침전물만을 회수하여 진공건조해서 PHA를 얻었다. 얻어진 PHA는 상법에 따라서 메탄올라이시스를 행한 후, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마즈 QP-5050, EI법)로 분석해서, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 그 결과, 하기 표 4에 표시한 바와 같이, 3-하이드록시-4-페녹시-n-부티르산을 모노머유닛으로서 함유하는 PHA가 생산된 것으로 확인되었다.
| 균주 | H45 | P161 |
| 균체의 건조중량(㎎/ℓ)폴리머의 건조중량(㎎/ℓ)폴리머의 건조중량/균체의 건조중량 | 125543% | 2230115% |
| 모노머유닛의 조성(GC-MS: TIC피크면적비)3-하이드록시부티르산3-하이드록시옥탄산3-하이드록시데칸산3-하이드록시도데칸산3-하이드록시-4-페녹시-n-부티르산 | 0%31%45%24%0% | 81%4%5%1%9% |
(실시예 5)
슈도모나스 치코리이 YN2를, D-글루코스 0.5% 및 4-페녹시-n-부티르산 에틸에스테르 0.01%를 함유하는 M9배지 200㎖에 접종하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하고, 48시간후, 균체를 원심분리에 의해서 회수하고, D-글루코스 0.5% 및4-페녹시-n-부티르산 에틸에스테르 0.1%를 함유하나 무기질소원(NH4Cl)은 함유하지 않는 M9배지 200㎖에 재현탁시켜, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 42시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하고 나서, 동결건조하였다.
얻어진 동결건조펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 28시간 교반해서 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 해당 여과액을 회전식 증발기에서 농축하고, 얻어진 농축액을 냉메탄올중에서 재침전시키고, 또 침전물만을 회수하여 진공건조해서 PHA를 얻었다. 얻어진 PHA는 상법에 따라서 메탄올라이시스를 행한 후, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마즈 QP-5050, EI법)로 분석해서, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 그 결과, 하기 표 5에 표시한 바와 같이, 3-하이드록시-4-페녹시-n-부티르산을 모노머유닛으로서 함유하는 PHA가 생산된 것으로 확인되었다.
| 균주 | YN2 |
| 균체의 건조중량(㎎/ℓ)폴리머의 건조중량(㎎/ℓ)폴리머의 건조중량/균체의 건조중량 | 508275% |
| 모노머유닛의 조성(GC-MS: TIC피크면적비)3-하이드록시헥산산3-하이드록시옥탄산3-하이드록시노난산3-하이드록시데칸산3-하이드록시도데칸산3-하이드록시도데센산3-하이드록시-4-페녹시-n-부티르산 | 1%5%1%13%5%7%62% |
(실시예 6)
슈도모나스 치코리이 YN2를, D-글루코스 0.5%를 함유하는 M9배지 200㎖에 접종하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하고, 48시간후, 균체를 원심분리에 의해서 회수하고, D-글루코스 0.5% 및 4-페녹시-n-부티르산 에틸에스테르 0.1%를 함유하나 무기질소원(NH4Cl)은 함유하지 않는 M9배지 200㎖에 재현탁시켜, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 42시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하고 나서, 동결건조하였다.
얻어진 동결건조펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 28시간 교반해서 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 해당 여과액을 회전식 증발기에서 농축하고, 얻어진 농축액을 냉메탄올중에서 재침전시키고, 또 침전물만을 회수하여 진공건조해서 PHA를 얻었다. 얻어진 PHA는 상법에 따라서 메탄올라이시스를 행한 후, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마즈 QP-5050, EI법)로 분석해서, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 그 결과, 하기 표 6에 표시한 바와 같이, 3-하이드록시-4-페녹시-n-부티르산을 모노머유닛으로서 함유하는 PHA가 생산된 것으로 확인되었다.
| 균주 | YN2 |
| 균체의 건조중량(㎎/ℓ)폴리머의 건조중량(㎎/ℓ)폴리머의 건조중량/균체의 건조중량 | 476276% |
| 모노머유닛의 조성(GC-MS: TIC피크면적비)3-하이드록시부티르산3-하이드록시헥산산3-하이드록시옥탄산3-하이드록시데칸산3-하이드록시도데칸산3-하이드록시도데센산3-하이드록시테트라데센산3-하이드록시-5-페닐발레르산3-하이드록시-4-페녹시-n-부티르산 | 6%1%11%24%11%15%3%10%18% |
이상, 본 발명에 의하면, 곁사슬에 원료로부터 유래된 치환기를 지닌 PHA를 생산해서 균체내에 축적가능한 미생물을 이용해서, 원료로서의 치환된 지방산 에스테르로부터 소망의 화학 구조를 지닌 PHA를, 종래의 방법에 비해서, 효율적으로 제조하는 것이 가능하다.
Claims (12)
- 하기 화학식(2):(식중, R은 페닐기, 페녹시기, 벤조일기, 시클로헥실기, 티에닐기 및 이들의 화학변성기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 치환기를 표시하고, x는 0 내지 8의 정수임)를 지닌 모노머유닛을 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법에 있어서,하기 화학식(1):(식중, R은 페닐기, 페녹시기, 벤조일기, 시클로헥실기, 티에닐기 및 이들의 화학변성기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 치환기를 표시하고, R'는 임의의 치환기를 표시하고, x는 0 내지 8의 정수임)을 지닌 치환된 지방산 에스테르를 함유하는 배지중에서, 상기 치환된 지방산 에스테르를 그 균체내에 취해서 상기 배지에서 폴리하이드록시알카노에이트를 합성가능한 미생물을 배양하는 공정과;상기 미생물에 의해 생산된 폴리하이드록시알카노에이트를 단리하는 공정을 구비한 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 화학식(1)의 치환된 지방산 에스테르가, 하기 화학식(3):(식중, R은 페닐기, 페녹시기, 벤조일기, 시클로헥실기, 티에닐기 및 이들의 화학변성기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 치환기를 표시하고, x 및 y는 각각 0 내지 8의 정수임)을 지닌 치환된 지방산 에스테르인 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
- 제 2항에 있어서, 상기 화학식(1)의 치환된 지방산 에스테르가, 하기 화학식(4):(식중, R은 페닐기, 페녹시기, 벤조일기, 시클로헥실기, 티에닐기 및 이들의 화학변성기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 치환기를 표시하고, x는 0 내지 8의 정수임)를 지닌 치환된 지방산 에스테르인 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
- 제 2항에 있어서, 상기 화학식(1)의 치환된 지방산 에스테르가, 하기 화학식(5):(식중, R은 페닐기, 페녹시기, 벤조일기, 시클로헥실기, 티에닐기 및 이들의 화학변성기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 치환기를 표시하고, x는 0 내지 8의 정수임)를 지닌 치환된 지방산 에스테르인 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
- 삭제
- 제 1항에 있어서, 상기 화학식(1)로 표시되는 치환된 지방산 에스테르가,5-페닐발레르산 메틸에스테르, 5-(4-플로오로페닐)발레르산 메틸에스테르,6-페닐헥산산 메틸에스테르, 4-페녹시-n-부티르산 메틸에스테르,4-(3-플루오로페녹시)-n-부티르산 메틸에스테르,4-(4-플루오로페녹시)-n-부티르산 메틸에스테르,4-(4-시아노페녹시)-n-부티르산 메틸에스테르,4-(4-니트로페녹시)-n-부티르산 메틸에스테르, 5-페녹시발레르산 메틸에스테르,5-(4-플루오로페녹시)발레르산 메틸에스테르, 5-벤조일발레르산 메틸에스테르,4-시클로헥실부티르산 메틸에스테르, 5-(2-티에닐)발레르산 메틸에스테르,5-페닐발레르산 에틸에스테르, 5-(4-플로오로페닐)발레르산 에틸에스테르,6-페닐헥산산 에틸에스테르, 4-페녹시-n-부티르산 에틸에스테르,4-(3-플루오로페녹시)-n-부티르산 에틸에스테르,4-(4-플루오로페녹시)-n-부티르산 에틸에스테르,4-(4-시아노페녹시)-n-부티르산 에틸에스테르,4-(4-니트로페녹시)-n-부티르산 에틸에스테르, 5-페녹시발레르산 에틸에스테르,5-(4-플루오로페녹시)발레르산 에틸에스테르, 5-벤조일발레르산 에틸에스테르,4-시클로헥실부티르산 에틸에스테르 및 5-(2-티에닐)발레르산 에틸에스테르중의 적어도 1종인 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
- 삭제
- 제 1항에 있어서, 상기 미생물은, 상기 화학식(1)을 지닌 치환된 지방산 에스테르와 성장기질을 함유하는 배지에서 배양하는 단계와, 그 후, 상기 화학식(1)을 지닌 치환된 지방산 에스테르와 성장기질을 함유하지만 질소원이 제한된 배지에서 배양하는 단계의 2단계로 배양되는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 미생물은, 상기 화학식(1)을 지닌 치환된 지방산 에스테르와 성장기질을 함유하는 배지에서 배양하는 1단계만으로 배양되는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
- 제 8항에 있어서, 상기 성장기질이 글루코스인 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 미생물이 슈도모나스속(Pseudomonassp.)에 속하는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
- 제 11항에 있어서, 상기 미생물이 슈도모나스 치코리이(Pseudomonas cichorii) YN2균주(FERM BP-7375), 슈도모나스 치코리이(Pseudomonas cichorii) H45균주(FERM BP-7374) 및 슈도모나스 젯세니이(Pseudomonas jessenii) P161균주(FERM BP-7376)로부터 선택된 적어도 1종의 균주인 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
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