JP2008054521A - 細胞培養処理装置及び細胞培養処理方法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明の目的は細胞を簡便かつ短時間で効率よく分離回収するための装置、およびその製造方法を提供する。
【解決手段】細胞の培養処理と細胞の回収を行なうための細胞培養処理装置であって、流路と細胞保持部と溶液用入口と溶液用出口と細胞回収口と蓋材とを備えていることを特徴とする細胞培養処理装置。
【選択図】図２−１

Description

本発明は、流路内において細胞の培養及び薬剤等による処理の少なくとも一方の工程を施した後に細胞を回収することが可能な多孔質材料から成る細胞保持部を備える細胞培養処理装置に関する。また、この装置を用いた細胞培養処理方法に関する。より詳しくは、流路内に細胞の保持部および細胞回収のための専用の出口を有する細胞培養処理装置に関し、細胞の保持部に対して溶液の流通方向を変化させることを特徴とする細胞培養処理方法に関する。

近年、生命工学とマイクロマシニング技術を融合することで核酸，酵素，抗体，細胞等の生体物質を機能素子として用いたバイオマイクロチップ（バイオチップ）の開発が盛んに検討されている。バイオチップを作製するに当たっては、半導体製造プロセスで培われたマイクロマシニング技術を用いることにより、微小領域への測定対象の集積化や微小量での測定が可能となる。この結果、スケールによる有意な効果を得ることができる。

非特許文献１〜２では、種々のバイオチップおよびマイクロチップについて詳細に論じられている。そして、上記の生体物質の中でもより高度な生命現象を内包している細胞をターゲットとした技術分野に対して特に注目が集まっている。そこで、マイクロチップ内において細胞培養、計測等を行なうことを目的とした各種の装置が提案されている。

特許文献１では、マイクロチップ内に細胞培養部及び細胞応答の検出部を設けて生細胞の機能解析を行なうことが可能な装置が報告されている。また、特許文献２では、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）のマイクロウェル構造体及びウェルの底部にｐＨ官能性蛍光色素を含有するセンサ部を有する細胞の活性評価が可能なマイクロウェルアレイチップが提案されている。

一方、流路内に多孔質材料を備えたマイクロチップに関しては、現在までのところ以下のようなものが提案されている。非特許文献３、非特許文献４では、マイクロマシニング技術により、流路内にシリコンを基材とするフィルターを形成し微粒子を処理するための装置が提案されている。これらの装置では、微粒子を流路内に配置したフィルターに保持した状態で微粒子に対して試薬等による化学的なコーティングやエッチング等を行なうことを目的としている。これらの装置では、処理を行なった微粒子を回収する工程では送液を逆流させることで入口側より所望の微粒子を回収している。

また、特許文献３は微細チャネル内に多孔質材料を形成する方法を開示するものである。具体的には、光照射にともなうゾルゲル反応、架橋反応等による光硬化を行なわせることにより、微細チャネル内の水平方向を横切るようなポリマーの多孔質材料を形成する。この技術は多孔質材料表面に親水化処理、疎水化処理を行なったり、触媒成分、酵素、抗体または抗原等の固定化を行なったりして、多孔質材料に細胞を接着固定化させることを目的としている。つまり、前記装置においては所望の細胞等の対象物をフィルター部分に捕捉して測定を行なうことを目的としたものである。
マイクロ化学チップの技術と応用：丸善株式会社 Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ： Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｐｒｅｓｓ ＬＴＤ． Ｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ａｃｔｕａｔｏｒｓ Ａ： Ｐｈｙｓｉｃａｌ， ｖｏｌ．７３， ｐ． １８４−１９１ （１９９９） Ｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ａｃｔｕａｔｏｒｓ Ｂ： Ｃｈｅｍｉｃａｌ， ｖｏｌ．６７， ｐ． ２０３−２０８ （２０００） 特開２００３−２９４７４１号公報 特開２００５−２５３４１２号公報 特開２００４−３１７１２８号公報

しかしながら、上記特許文献１〜３に記載の装置では、細胞の培養又は検出を目的としているものであり、細胞の培養又は検出後に細胞を回収するようには構成されていなかった。このため、一度、装置内に取り込まれた細胞は装置に固定されたままとなってしまい、細胞及び装置の再使用が困難であった。特に、この傾向は、浮遊性細胞の培養や細胞凝集塊（スフェロイド）の流通培養および接着性に富む細胞群に対する培養を行なった際に顕著であった。つまり、これらの装置では細胞等の対象物に対して薬剤等の処理をした後に回収することを目的とされてはいないため、装置の構成が本発明とは異なっていた。

また、上記非特許文献３、４に記載の装置は微粒子の処理、回収を目的としたものであり、細胞の培養処理及び回収を目的とした装置ではなかった。更に、これらの装置では、微粒子を回収する際には溶液の流れを逆流させて入口側から回収していた。このため、これらの装置を生細胞に適用した場合、回収時に処理溶液等に再接触してしまい、細胞の活性が変化してしまったり、死滅したりすることで回収後の細胞の再使用が不可能となる場合があった。

そこで、このような再接触による汚染（コンタミネーション）の可能性をより小さくし得る装置の開発が望まれていた。本発明はこのような課題を解決するためになされたものであり、その目的は細胞の培養、処理および回収のための細胞培養処理装置、及びこの装置を用いた細胞培養処理方法に関する。より詳しくは、流路内に細胞を留め置くことを目的とした細胞保持部を備えた細胞培養処理装置に関するものである。

この装置では、所望時間、培養した細胞又は種々の処理を施した細胞を簡便かつ短時間で効率よく回収することができる。また、流路内に多孔質材料などの細胞保持部を配置することで細胞を流路内にトラップすることが可能となる。更に、多孔質材料の構造体が溶液の流れ方向に対して所定の角度、好ましくは流れ方向に対して垂直な方向に流路を横切るように配置されていることにより、トラップされた細胞の重力による積層を低減することができる。この結果、効率の良い細胞処理や培養液の交換が可能となり、酸素や栄養分の欠乏による細胞死（ネグローシス）を低減できることができる。

前記の課題を解決する本発明は以下の通りである。
１．細胞の培養、処理及び回収を行なうための細胞培養処理装置であって、
細胞懸濁液、薬液または緩衝溶液を流すための流路と、
前記流路内に設けられた細胞を保持可能な細胞保持部と、
前記流路の第１の端部に接続された溶液用入口と、
前記流路の第２の端部に接続された溶液用出口と、
前記流路内の細胞保持部と第１の端部との間の位置で、前記流路に接続された細胞回収口と、
前記細胞回収口を開閉可能な蓋材と、
を備えていることを特徴とする細胞培養処理装置。

２．前記細胞保持部が、多孔質材料からなることを特徴とする上記１に記載の細胞培養処理装置。
３．前記流路は、鉛直方向に延在する鉛直流路を有し、
前記多孔質材料は、前記鉛直流路内において、その面方向が流路底部と平行となるように配置されていることを特徴とする上記２に記載の細胞培養処理装置。

４．前記多孔質材料は、単一細胞径よりも小さい平均細孔径を有することを特徴とする上記２又は３に記載の細胞培養処理装置。
５．前記多孔質材料の平均細孔径が、１μｍ以下であることを特徴とする上記２から４の何れか１項に記載の細胞培養処理装置。

６．前記流路内の、第１の端部と前記細胞回収口が流路に接続する部分との間に、更に流路の開閉が可能な流路開閉部を備えることを特徴とする上記１から５の何れか１項に記載の細胞培養処理装置。
７．前記溶液用入口及び溶液用出口の少なくとも一方に、更に溶液の送液が可能な送液手段が接続されていることを特徴とする上記１から６の何れか１項に記載の細胞培養処理装置。

８．上記１に記載の細胞培養処理装置を用いた細胞培養処理方法であって、
前記蓋材により細胞回収口を閉状態にして、前記溶液用入口から溶液用出口に向かって細胞を含有する細胞懸濁液を流すことにより前記細胞保持部に細胞を保持させる保持工程と、
前記保持工程の後、細胞保持部に細胞を保持させた状態で、前記溶液用入口から溶液用出口に向かって細胞培養液、細胞を処理する為の薬液及び緩衝液からなる群から選択された少なくとも一種の溶液を流すことにより、細胞の培養及び処理の少なくとも一方を行なう培養処理工程と、
前記培養処理工程の後、前記蓋材により細胞回収口を開状態にして、前記溶液用出口から細胞回収口に向かって溶液を流すことにより前記細胞保持部に保持された細胞を遊離させて細胞回収口で回収する回収工程と、
を有することを特徴とする細胞培養処理方法。

９．上記６に記載の細胞培養処理装置を用いた細胞培養処理方法であって、
前記蓋材により細胞回収口を閉状態にし前記流路開閉部を開状態にして、前記溶液用入口から溶液用出口に向かって細胞を含有する細胞懸濁液を流すことにより前記細胞保持部に細胞を保持させる保持工程と、
前記保持工程の後、細胞保持部に細胞を保持させた状態で、前記溶液用入口から溶液用出口に向かって細胞培養液、細胞を処理する為の薬液及び緩衝液からなる群から選択された少なくとも一種の溶液を流すことにより、細胞の培養及び処理の少なくとも一方を行なう培養処理工程と、
前記培養処理工程の後、前記蓋材により細胞回収口を開状態にし前記流路開閉部を閉状態にして、前記溶液用出口から細胞回収口に向かって溶液を流すことにより前記細胞保持部に保持された細胞を遊離させて細胞回収口で回収する回収工程と、
を有することを特徴とする細胞培養処理方法。

ここで、流路は少なくとも２つの端部を有する。流路はこれらの端部のうち、「第１の端部」において溶液用入口と接続し、「第２の端部」において溶液用出口に接続している。これら第１及び第２の端部は、同じ又は異なる高さの位置でそれぞれ溶液用入口及び溶液用出口に接続されている。例えば、図２−２では、２２が第１の端部を構成し、２３が第２の端部を構成する。
また、本明細書において「溶液」とは、細胞懸濁液、薬液または緩衝溶液を表す。

本発明は、細胞培養、処理および回収のための細胞培養処理装置、並びに細胞培養処理方法に関するものである。この装置では所望時間、培養した細胞または種々の処理を施した細胞のみを、簡便かつ短時間に効率よく回収することができる。

また、本発明の細胞培養処理装置では、流路内に多孔質材料などの細胞保持部が配置されており、細胞は流路内に備えられたこの多孔質材料などの細胞保持部により捕捉される。このため、細胞保持部に保持された細胞同士の積層による影響を低減できる。また、効率の良い細胞培養処理を行なうことができると共に、簡便に培養液の交換等を実現できる。

本発明の細胞培養処理装置は、細胞を留め置く（保持する）ことを目的としたトラップ（細胞保持部）を流路内に備えていることを特徴としている。このように、本発明の装置では細胞を流路内の所望の領域に留め置くことで、個数を制御した状態で再現性の良い効率的な細胞培養・処理工程を実現し得る。本発明の細胞培養処理装置は、所望時間、細胞を培養または薬剤等による処理をした後に、細胞保持部において留め置かれた細胞を再び回収できることが特徴となっている。また、細胞培養液を流通させた状態での培養にも適用可能である。

１．細胞培養処理
本明細書及び請求項に記載の「細胞の培養、処理」とは細胞の培養及び処理（薬剤等による細胞）の少なくとも一方の工程を行なうことを表す。従って、本明細書及び請求項に記載の「細胞の培養、処理及び回収」とは、細胞の培養工程と回収工程、細胞の処理工程と回収工程、又は細胞の培養と処理工程と回収工程を行う場合を表す。

（細胞処理工程）
細胞に対する処理工程としては、例えば、薬剤等による化学的な刺激等によって細胞機能に影響を与える工程を挙げることができる。なお、上記の「薬剤等による化学的な刺激」を行なう為の薬剤とは、生物学的に活性な化合物であれば良い。この薬剤としては例えば、抗生物質，防腐剤，酵素阻害剤，解熱剤，消炎剤，増殖因子，抗増殖因子，トランキライザー，サイトカイン，ホルモン，ステロイド，エストロゲン，酵素等の中から選択することができる。

また、本発明の細胞培養処理装置は、生体外（インビトロ）で細胞処理に使用することもできる。例えば、細胞機能評価をはじめとする細胞機能評価試験や機能性細胞の創出、有用細胞の濃縮、遺伝子の導入による機能改変細胞の獲得を行なうための装置等として使用することができる。

ここで言う、「機能性細胞」とは例えば、肝細胞や神経細胞等の生体を構成する体性細胞のことを指す。細胞機能評価試験を行なう場合、多孔質材料などの細胞保持部表面に細胞群をトラップして流れや薬剤等による刺激処理を行なう。刺激に対する細胞応答の計測は任意の公知の手法を用いて行なわれる。具体的には細胞機能に起因して変化するシグナル量から細胞の活性状態を測定する方法を適用できる。また、蛍光物質を細胞に取り込ませて刺激を与えた後や刺激の前後で変化する蛍光強度を測定することによる手法（蛍光法）または化学発光法，電気化学法等の方法が適用できる。

また、所望時間、所望の処理を行なった細胞を回収する段階において、溶液用入口とは異なる細胞回収口から細胞回収を行なうことで、処理溶液等に細胞が再接触してしまうことによる汚染（コンタミネーション）を回避することができる。

（細胞培養工程）
また、細胞に対する培養工程としては、細胞を細胞保持部に保持した状態で細胞の培養に好適な培養液を流すことにより、細胞を常に新鮮な培養液に接触させて細胞の培養を効果的に行なうものである。細胞培養液の種類及び組成は、細胞の種類に応じて適宜、選択できる。

本発明において用いられる細胞種は、ヒトまたは動植物由来の細胞，ヒトまたは動植物由来の細胞群，ヒトまたは動植物由来組織，ヒトまたは動植物由来の凝集体，細菌，原生動物，酵母およびこれらのものに対して遺伝的な改変を加えたものの中から任意に選ばれる。好ましくは、培養フラスコ等を用いた通常の静置培養においては実現が困難な細胞の培養や処理に対して適応され得る。

具体的には、以下のような特殊な培養に対しても適用することができる。
（１）浮遊性細胞群の培養
（２）実質細胞群の細胞凝集塊（スフェロイド）培養
（３）各種リンフォカイン等の有用性産物を得るための連続還流培養
（４）走化性が高い細胞群の培養。

（１）は浮遊性細胞群の培養を行なうものに関するものである。ここでいう、「浮遊性細胞」とは基板表面に対して弱く接着することは可能であるが、基本的な細胞増殖機能の発現において基板接着を必要としない細胞群のことである。より詳しくは、このような細胞として例えば、血球、リンパ球、ハイプリドーマ、またはプロトプラスト等が挙げられる。浮遊性細胞は、培養フラスコ等を用いて静置培養を行なうことは可能ではあるが、この培養方法では高密度培養が困難であった。そこで、本発明の細胞培養処理装置を用いることにより、細胞保持部に浮遊性細胞群を実質的に固定させることが可能となるため、マイクロスケールの効率の良い高密度の潅流培養を行なうことができる。

（２）は実質細胞を用いて細胞凝集塊（スフェロイド）培養を行なうものに関するものである。ここでいう、「実質細胞」とは例えば、肝臓においては肝細胞といった、対象となる臓器や組織における最も重要な働きを担う細胞のことである。より詳しくは、このような細胞として例えば、肝細胞、膵ベータ細胞、心筋細胞、皮膚上皮細胞、軟骨細胞、骨細胞および幹細胞からなる群が挙げられる。なお、実質細胞は機能性細胞と同義に扱われる。

例えば、肝細胞においては接着依存性が高いため、継代操作のために基材表面から剥離する際に大きく損傷しダメージを受けることが知られている。このため、このような細胞では通常の静置培養を行なうのが非常に困難であった。

また、肝細胞の代表的な機能として知られているアルブミン産生や化学物質代謝酵素系であるシトクロムＰ４５０活性能を獲得させるためには、細胞を一定数まで集団化（数百個程度）させる３次元培養が非常に有効であるという報告がなされている。ここで、３次元培養を実現する上で有用な要素は、細胞接着を制御し得る表面において効率的な栄養および酸素の供給および老廃物の除去が可能な状態で培養することである。そこで、本発明では、細胞保持部に細胞を保持し、培養液を流通させながら細胞塊の連続培養をマイクロ流路内の細胞保持部で行なうことにより、効率的な攪拌及び培養を可能にすると共に細胞にダメージを与えずに回収できる。

（３）は主に動物細胞をターゲットとして用いる物質生産に関するものである。具体的には、例えばバイオ医薬品の生産であり、各種リンフォカイン、糖蛋白質、抗体等を生産するために利用されている。例えば、エリスロポエチンやＧ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）等が挙げられる。細胞に物質生産を行なわせるための培養方法としては、静置培養と浮遊培養とに大別される。ここで、静置培養とは一般的にはシャーレや培養ビンを用いて底面に細胞を接着させながら行なう培養方法である。また、浮遊培養とは、坂口フラスコや培養器の中に投入したマグネチックスターラーや羽根車等によって実現される機械的な攪拌によって行なう培養方法である。

しかしながら、静置培養では物質の生産性から見て最適な培養条件に設定されていない場合があり、この場合には物質の生産性が著しく低くなる場合があった。また、浮遊培養では攪拌によって細胞に高いせん断応力がかかってしまい、細胞が大量に死滅して物質の生産性が低下してしまう場合があった。これに対して、本発明では、多孔質材料などの細胞保持部に細胞を保持し、培養液を流通させながら細胞に物質生産を行なわせることにより、細胞の死滅を防ぐと共に物質生産に好適な条件での培養が可能となる。この結果、高い物質生産性を達成することができる。

この際、物質生産に用いられる細胞種としては大腸菌、酵母、動物細胞群から適宜選択することができる。例えば動物細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣由来細胞（ＣＨＯ細胞）、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳＯ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ハイブリドーマ、昆虫細胞株などが挙げられる。一般に大腸菌や酵母に比べて動物細胞の生産量は少ないものになっているが、哺乳類細胞を利用することによる特徴として複雑な翻訳後修飾能を利用する手法を挙げることができる。

（４）は走化性（移動しやすさ）の高い細胞群の培養を行なうための方法に関するものである。具体的には大腸菌群が挙げられる。大腸菌は一般に走化性が極めて高いため、大腸菌に対する測定や効率的な遺伝子導入等を行なうことは非常に困難であった。よって、上記の目的で大腸菌を高密度培養するためには、例えばコラーゲン等の含水ゲルで３次元空間に大腸菌を閉じ込めた包埋培養を行なうしかなかった。そこで、本発明の細胞培養処理装置においては、多孔質材料などの細胞保持部を用いることで所望の空間に大腸菌を閉じ込めることにより効率的な遺伝子導入等の処理を行なうことができる。

２．細胞培養処理装置
以下、本発明の細胞培養処理装置の好適な形態について、添付図面を参照しながら説明する。本発明の細胞培養処理装置は溶液を流すための流路、および細胞を補足するための多孔質材料（細胞保持部）を備えている。また、この流路は第１及び第２の端部を介してそれぞれ溶液用入口及び溶液用出口に連通している。更に、流路は細胞回収口に連通しており、この細胞回収口は蓋材によって開閉が可能になっている。図１〜図２に本発明による細胞培養処理装置の概略図の一例を示している。図２は、図１に示されたＩ−Ｉ線位置での側方から見た断面図を示す。

この細胞培養処理装置は、溶液（細胞含有液、培養液、試薬等の処理液）を流路内に流す為の１つ以上の溶液用入口と、溶液を流路外に排出するための溶液用出口とが流路に接続されている。また、流路内には細胞保持部を備える空間、および細胞回収のための細胞回収口を備えている。

溶液用入口は１つ以上あれば良く，２つ以上であっても良い。例えば、一方の溶液用入口から細胞培養液を導入し、他方の溶液用入口から細胞に暴露するための試薬を導入するというように、細胞含有液と試薬を別々の溶液用入口から導入することができる。このように流路内に溶液（細胞培養液、細胞含有液、試薬）を導入することによって、細胞保持部近傍でこれらの溶液を混合して反応させるといった使い方をすることもできる。また、試薬の導入口を複数、設けることで濃度調整も一括して行なうこともできる。

また、溶液用出口及び細胞回収口も１つ以上あれば良く、２つ以上であっても良い。細胞回収口は蓋材によって開閉が可能なようになっており、必要に応じて蓋材により細胞回収口を開状態又は閉状態とすることができる。蓋材としては、蓋状のものや栓状のものを挙げることができるが、細胞回収口を閉じて所定の液圧がかかった場合にも液体が細胞回収口から漏れるのを防ぐことができる部材であれば特に限定されない。

本発明の細胞培養処理装置は、細胞の培養および処理工程と、細胞の回収工程とを行なうことができる機能を備えている。これらの工程を図１に示した例に基づいて説明する。ます、細胞の培養および処理工程においては図２−１に示すように導入口（溶液用入口）１１から容器内に、溶液用入口１１に接続されたポンプのような送液機器（送液手段）によって溶液を導入する。この溶液は装置内部の捕捉機構（多孔質材料）内の細孔を介して流れ、最終的に排出口（溶液用出口）１２から排出される。この際、細胞回収口１３は細胞のコンタミネーションを防ぐため蓋材によって１６のように閉じておく（閉状態にしておく）。

上記のようにしてまず、細胞を含有する溶液（細胞含有液）を溶液用入口１１から溶液用出口１２に向かって流すと、溶液中に含まれる細胞は細胞保持部の細孔径よりも大きいため細胞保持部内を流れることができない。また、この細胞は溶液の流れによる圧力によって実質的に細胞保持部に固定される。このように細胞を固定した状態で、溶液用入口１１から溶液用出口１２に向かって細胞培養液又は試薬等の処理液を流すことにより細胞の培養又は処理を行なうことが可能となる。

次に、細胞回収工程において図２−２に示すように、蓋材によって細胞回収口１３を開放し（開状態とし）、溶液用出口１２に接続されたポンプ等の送液手段によって溶液用出口１２から細胞回収口１３へ向かって送液を行なう。この際、細胞回収口は第１の端部と細胞保持部との間で流路に接続されている（図２−２では２１の位置）。このため、上記のようにして溶液の流れを逆向きとすることで、図２−１の状態では細胞保持部に保持されていた細胞を遊離させて、細胞回収口１３から細胞を回収することができる。
なお、溶液用入口１１から溶液用入口１２までの送液及び溶液用出口１２から細胞回収口１３までの送液は、溶液用入口１１及び溶液用入口１２に接続された送液手段のうち何れの送液手段によって行なっても良い。送液方向を逆にすることで、これら何れの送液手段も用いることができる。

本発明の細胞培養処理装置では、目的に応じて液体の流れ方向を確実に変えるために、液体の流れ方向切り替えのためのバルブ（流路開閉部）１７を流路内に設置しても良い。本発明で用いる流路切り替え用のバルブ機構は、後述するように一般的に報告されているものを適宜用いることができる。この場合には、溶液用入口１１から溶液用入口１２までの送液の際には流路開閉部１７を開状態とし、溶液用出口１２から細胞回収口１３までの送液の際には流路開閉部１７を閉状態としておく。

３．細胞培養処理装置の各部
（流路）
本発明の細胞培養処理装置では、装置を構成する流路は複数の基板を接着または接合して構成されたものとすることができ、それらの複数の基板により流路と細胞保持部を形成できる。複数の基板によって流路と細胞保持部を形成するための１つの例としては、基板の対向面の一方または両方に形成された溝および貫通孔より流路が形成されている。また、この細胞保持部は流路につながり一方の基板を貫通した貫通孔として形成されているものである。この場合、細胞保持部を構成する貫通孔を有する多孔質材料を上下の流路を構成する基板と接着または接合するだけで流路内に細胞保持部を形成でき、製作が容易である。

流路は基板の上面と下面とを貫通する微細孔を備えた基板および多孔質材料を備えた基板を重ね合わせることによって構築される。流路を構成する基板はガラス，シリコン，石英，またはケイ素をベースとする材料，プラスチック類およびポリマー類等の絶縁性の固体基板を基材として形成することが可能である。さらに望ましくは倒立顕微鏡等での観察が可能な程度の光透過性を有し、清浄化、前処理等により基板の表面改質を行なうことのできる基材であることが望ましい。

基板の洗浄はアルカリ洗浄、酸洗浄、水系溶剤洗浄、有機系溶剤洗浄、ＲＣＡ洗浄等のウエット洗浄や、紫外線照射、オゾン照射、酸素プラズマ照射等のドライ洗浄により行なう。また、基板の表面改質とは例えば、スライドガラスおよび石英基板等を固体基板として用いる場合に予め、酸、プラズマ、オゾン、有機系溶剤、水系溶剤、界面活性剤等から選択される方法等の工程，シランカップリング等の処理により所望置換基の表面への導入、表面自由エネルギーを制御する工程等のことである。

流路の形状、大きさは特に限定されないが使用する細胞や溶液量などに合わせて適当なものを選択できる。また、流路は鉛直方向に延在する鉛直流路や、水平方向（鉛直方向と垂直な方向）に延在する水平流路を含むことができる。好ましくは、流路は鉛直流路を有し、この鉛直流路内にその面方向が水平方向（流路底部；鉛直方向と垂直な方向）となる細胞保持部を有するのが良い。例えば、図２−２では、流路は鉛直方向２３に延在する流路を有し、その内部に細胞保持部１５が配置されている。この細胞保持部の面方向は水平方向２５となっている（この細胞保持部の面方向は流路の底部２８と平行な方向２５となっている）。

（細胞保持部）
本発明の細胞培養処理装置では、細胞は多孔質材料などの細胞保持部によって流路内に補足される。すなわち、培養又は処理時には流路内に備えられた多孔質材料に加え、さらに溶液の流れによる流速および重力によって細胞は流路内の所望の領域に保持される（図３−１）。また、細胞回収時には、多孔質材料などの細胞保持部に対して下側（逆方向）よりの溶液の流れによる流速によって細胞は細胞回収口まで運ばれる（図３−２）。細胞保持部は流路断面を全て覆うように流路内に配置されている。すなわち、溶液は全て細胞保持部を通って流れるようになっている。

本発明の細胞培養処理装置の一例では、細胞のトラップは流路内に溶液の流れ方向に対してその面方向が垂直となるように配置された多孔質材料によって行なわれる。多孔質材料の表面は、細胞を接着させないように構成されており、この構成により細胞の培養処理後、細胞の回収を容易に行なうことを可能としている。

この多孔質材料は、表面への細胞の付着を促進または阻害するように調製することができる。また、表面に対する細胞，接着蛋白質の非特異吸着防止等の消極的な相互作用により細胞反応を起こさせるためにも使用できる。

この多孔質材料表面への細胞付着の促進または阻害は具体的には例えば、溶液の流量を制御したり、または多孔質表面に細胞が接着しないような前処理を行なったりすることにより達成される。ここで言う、「前処理」とは具体的にはフッ素コーティングにより撥水性を高める、カゼイン等の細胞外マトリックス蛋白質のブロッキング剤により表面処理行なう等の処理の中から任意の方法が選択できる。

また、ブロッキング剤としては、ウシ血清アルブミン、カゼイン、ゼラチン、スキムミルク、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール，リン脂質およびそれらを含む化合物等の中から選択される。
界面活性剤としては、ポリオキシエチレン，オクチルフェニルエーテル，ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート，ポリオキシエチレンアルキルアリルエーテルリン酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル等が挙げられる。
糖としては、サッカロース、トレハロース，ヘパリン，低分子ヘパリン等が挙げられる。

なお、前記処理液中のブロッキング剤の含有量は、好ましくは０．１〜１０質量％である。前記処理液中の界面活性剤の含有量は、好ましくは０．０１〜１質量％である。前記処理液中の糖の含有量は、好ましくは０．１〜１０質量％である。さらに、公知の方法に従ってブロッキング剤、界面活性剤及び所望により糖を含有する溶液に浸漬し、乾燥してから用いることが好ましい。このような処理を行ったものを用いることによって、被検対象でない蛋白質の当該基材上への非特異的な吸着の防止、展開の容易性、並びに固定化した特異的結合物質の保存安定性等の点において良好な結果を得ることができる。

多孔質材料の孔径および空隙径としては細胞を留め置くことが（保持）できると共に、培養液やバッファーを流通させることができる径を有するものが選択される。つまり、流路内に配置した多孔質材料を介して液体を流すことが可能であり、細胞を留め置いた状態で培養液や処理薬剤の交換、バッファーによる細胞の洗浄および細胞の回収などを極めて容易に行なうことが出来るようになっている。このため、多孔質材料の孔径又は空隙径はこのような事が可能となるような径となっている。

本発明において用いられる多孔質材料の一形態例を図４に示す。この際、多孔質材料の孔の形状は細胞を捕捉し且つ送液を妨害しないという、本発明の目的を満足するものであれば任意に選択される。具体的には、正方形、長方形、円形、楕円形、三角形などを挙げることができるが、特にこれらの形状に制限されるものではない。

多孔質材料の平均細孔径の大きさは、孔又は空隙が円形の場合は直径、孔又は空隙がそれ以外の形状の場合には長径（最も長い部分の径）の上限が１μｍ程度のものが好ましい。また、多孔質材料に保持させるための細胞の単一細胞径よりも小さい平均細孔径を有することが好ましい。例えば、多孔質材料の平均細孔径が細胞長と同等以下のスケールである場合には、多孔質材料の細孔が細胞によって塞がれてしまう恐れがあり、本発明の効果である液交換や細胞回収の容易さが損なわれる可能性がある。

多孔質材料の細孔の具体的な大きさは、被検体細胞の大きさによって最適に決められるものである。例えば、被検体細胞の直径が２０μｍで、多孔質材料の細孔が円形であると仮定すると、多孔質材料の直径は２０μｍより十分に小さいもの、例えば０．５μｍ程度としておけばよい。この他、考えられる被検体細胞の大きさは小さいもので数μｍ、大きいもので数十μｍである。このため、多孔質材料の平均細孔径（細孔が円形状の場合は平均直径、細孔が円形以外の形状の場合は最も長い部分の径の平均値）が１μｍ以下であることが好ましく、１μｍ以下の中から最適な値とすることが望ましい。

多孔質材料の基材は成形性の良いもの、滅菌処理が適用できるものおよび細胞毒性の低いもの等の中から選択される。更に具体的には、例えばセルロース、ポリエチレン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリエステル、ポリアクリルアミド、フッ素樹脂、等の合成ポリマー、ガラス、アルミナ、チタニア等の無機材料や金、チタン、ステンレス等の金属材料が挙げられる。

多孔質材料の形状は、フォトリソグラフィー等のマイクロマシニング加工技術により形成されうる任意のパターン、粒状、繊維状、不繊布、スポンジ状多孔質体等のものから任意に選択されて用いられる。また、様々な形状を有する多孔質材料は市販されているメンブレンフィルターを用いても良く、例えばＭｉｌｌｉｐｏｒｅ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ等から購入したものを用いることができる。

この多孔質材料は流路を横断し、かつ溶液の流れ方向に対してその面方向が垂直となるように流路内に配置されていることが好ましい。このような流路としては例えば、流路を構成する上下の基板で多孔質材料を挟み込むような構成が考えられる。

（流路開閉部）
本発明の細胞培養処理装置では、多孔質材料で留め置かれた細胞を回収する際には、多孔質材料への流体の流れ方向を逆の方向に変化させ、かつ溶液用入口とは異なる細胞回収口から回収する。上記の特徴を満足させるためには、例えば流路内にバルブ機構（流路開閉部）を備えることにより実現される。流路内にバルブ機構を設けることにより、細胞培養・処理時および細胞回収時においてタイミングを見計らって流体の流れる方向を制御することができる。
この流路開閉部は、細胞回収口の流路との接続部分（例えば、図２−２では点線部分２１）よりも溶液用入口側の流路部分（第１の端部と、細胞回収口が流路に接続する部分２１との間の部分）に配置されている。

微小流路内におけるバルブ機構については特に限定はなく、既往の手法の中から所望のものを適宜、用いることができる。現在までに報告されているバルブ機構の代表的なものとしては、マイクロアクチュエーターによるもの、刺激応答性ポリマーを用いるもの、流路内の表面自由エネルギーを用いるもの、あるいはバルブを用いるもの等が報告されている。

マイクロアクチュエーターによるものとしては、微細加工技術を利用して作製した微小機械を用いるものであり、その詳細については非特許文献１に記載されている。具体的には、周囲を固定した膜からなる隔壁構造を有するダイヤフラム構造、ダイヤフラムと係合可能な突起形状を組み合わせた構造、片持ち梁や両持ち梁等の梁を有する構造シリコン基板などに大別される。バルブを開閉するための機構としては流路内に備えたメンブレンを何らかの駆動力によって変形させたり、流路内に配置した弁を動作させたりすることによって流路を塞ぐものである。

流路開閉部に好適に用いられる基材としてはシリコーンゴム、フォトレジスト、金属等が挙げられる。前記の材料に対してマイクロマシニング技術によりダイヤフラムやピラー形状を有するものを加工する。マイクロアクチュエーターを動作させる主な駆動力としては、静電気力、電磁力、圧電素子、体積膨張、バイメタルまたは形状記憶合金を利用したもの等が用いられる。

別の例としては、刺激応答性ポリマーを用いるものがある。刺激応答性ポリマーとしては、代表的なものとして光に応答して相分離を引き起こす光応答性ポリマーや温度変化に応答して相分離を引き起こす温度応答性ポリマーなどが知られている。

特に、温度応答性ポリマーは、その制御の容易さや細胞に与える影響の小ささから好適に用いることが出来る。本発明で用いる温度応答性ポリマーは、ホモポリマーであっても共重合体であってもよい。温度応答性ポリマーは、該ポリマーの境界温度以下まで冷却することによって高い親水性を呈して膨潤したハイドロゲルとなり体積を増加させて流路を閉状態（ｃｌｏｓｅ）とする。また、それ以上の温度では弱い疎水性を呈して体積が減少することから流路を開状態（ｏｐｅｎ）とする。

具体的な温度応答性ポリマーとしては、アクリルアミドやメタクリルアミドを含有する（メタ）アクリルアミド系化合物、モルホリン等の環状化合物を含有する（メタ）アクリルアミド誘導体、メチルビニルエーテル等のビニルエーテル誘導体等から選択され得る。

流路内の該当する壁面を刺激応答性ポリマーで被覆する方法は、壁面に刺激応答性ポリマーを塗布する方法や、壁面と刺激応答性ポリマーとを化学的な反応によって結合させる方法、物理的な相互作用を利用する方法を、単独または併用することができる。すなわち、化学的な反応によって結合させる場合は、電子線照射、γ線照射、紫外線照射、プラズマ処理、コロナ処理等を用いることができる。さらに、壁面と刺激応答性ポリマーが適当な反応性官能基を有する場合は、ラジカル反応、アニオン反応、カチオン反応等の一般に用いられる有機反応を利用することができる。

流路内の所定領域への刺激等性ポリマーの被覆は流路を組み上げてから行なうこともできるが、基板上の所定領域を反応性官能基で被覆した後に流路を組み上げれば、所望の領域に効率よく被覆することができる。物理的な相互作用による方法としては、被覆材料単独または支持体との相溶性のよいマトリックスを媒体とし、塗布、混練等の物理的吸着を用いる方法等がある。このようなマトリックスの媒体としては例えば、支持体を形成するモノマーまたは支持体と相溶性のよいモノマーと被覆材料とのグラフトポリマー、ブロックポリマー等を挙げることができる。

刺激応答性高分子として温度応答性高分子を用いる場合は、微小なヒーター等の電気信号を熱に変換する電気熱変換体が、刺激を付与する手段として好適に用いられる。係る電気熱変換体としては周囲より導電性の高い材料で作られた構造体であれば特に制限は無い。例えば、金，白金，クロム，チタニウムおよびＩＴＯ（インジウム―スズ―酸化物）等から選択される様々な金属、合金、金属化合物からなる発熱抵抗体を備えた電気熱変換体を用いることが出来る。

発熱抵抗体は公知の方法、例えばスパッタリング法、真空蒸着法、またはめっき法等によって形成することができる。このような電気熱変換体は、微細孔の内部にあっても、微細孔の外部にあってもよく、また、基板の表面にあっても、基板内部に埋め込まれていても良い。

ここで、例えば金を材料として選択した場合、金と基板間の結合力が弱いので、これらの間の結合力を向上させるために、クロム，チタニウム，タングステン等の金属薄膜を形成した後、金をスパッタ法等により成膜する。電極はフォトリソグラフィー法およびリフトオフ法等の一般的に電極を形成するのに使用される他の方法を使用して形成することができる。その他、プリント配線基板法を用いたり、温度調節のための素子としてペルチェ素子を同様に貼り合わせたりすることで、基板上の任意の場所を所定の温度に設定する電気熱変換体として用いることもできる。

また、別の例としては、流路内の表面自由エネルギーを部分的に変化させることでバルブとして利用する方法がある。表面自由エネルギーを変化させる手法とは基材自体の濡れ性を変化させることであり、基材表面を疎水化あるいは親水化させることによって実現され得る。

つまり、本発明において流体は水溶液であるために、親水性表面においてはより流れやすく、疎水性表面においてはより流れにくくすることができる。基板表面の親水化処理としては例えば、ポリエチレングリコール鎖や水酸基等を末端に有するシランカップリング剤を基板に導入することによる表面修飾や、紫外線照射、オゾンプラズマ照射、硫酸処理等によるシラノール基を露出させる処理が挙げられる。一方で基板表面の疎水化処理としては例えば、末端基にアルキル基やトリフルオロメチル基等のフッ素原子を含むシランカップリング剤を導入することにより表面修飾する方法が挙げられる。また、シリコンの陽極酸化を用いて基材表面にｎｍ〜μｍレベルの微細な凹凸パターン形状を形成させることにより表面加工において撥水性を高める方法等が挙げられる。

更に別の例としては、流路内でバブルを意図的に発生させることで液体の流通を実現する方法である。バブルを発生させる方法としては熱による気体の体積膨張を利用する手法や、電気化学的に気体を発生させる方法などが挙げられる。何れの場合にも流路内に前述した通りの方法で金属材料等を基材とした電気熱変換体および電極素子を配置することで実現することもできる。

以下、本発明の実施形態を示すが、これにより本発明を限定することを意図するものではない。

（実施例１）
本発明の細胞培養処理装置は、溶液を流すための流路および細胞を補足するための多孔質材料を備えていることを特徴とする。図５は、本発明の細胞培養処理装置の構成の一実施例であり、図６の（５１）〜（５５）は図５に例示した細胞培養処理装置を構成する５枚の基板をそれぞれ表わしている。

本実施例で用いる基材には、例えば、ガラス、シリコン、ポリスチレン等のプラスチック類およびシリコーン性のエラストマーポリマー等の絶縁性材料を用いることが可能である。流路を構成する基板の厚みは０．２〜１．０ｍｍ程度のものを用いる。

基板の加工はドリルやレーザー等の切削工具を用いることで機械的に作成しても良い。また、フォトリソグラフィー法により数十μｍ以上の膜厚を有するフォトレジストパターンおよび汎用的に用いられるメタルパターン等を鋳型としてポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）等のエラストマーで作成することもできる。

基板５１には、細胞含有液および薬剤の導入口（溶液用入口）となる貫通孔５６、排出口（溶液用出口）となる貫通孔５７、培養および処理済みの細胞を回収するための貫通孔（細胞回収口）５８が形成されている。この貫通孔５８は、多孔質材料５１１と、導入口５６が流路に接続する部分との間で流路に接続されている。また、貫通孔５８には貫通孔５８を開閉可能な蓋材が設けられている。５６〜５８の貫通孔には送液装置が配置されている。送液装置のタイプとしては特に制限はなく、例えばシリンジポンプ，ペリスタポンプ等から選択される。

基板５２には、１ｍｍ以下の幅および５００μｍ以下の深さを持つ液体試料用流路として用いる微小な流路溝５１０と排出口への流路を形成する貫通孔５９が形成されている。流路溝５１０内の、細胞回収口が流路と接続する部分よりも導入口５６側にはマイクロバルブ機構（流路開閉部）５１４が備えられている。当該装置におけるマイクロバルブとしては、前述の通り、ピエゾ素子を用いて駆動するもの、電極により駆動するもの、外部に置かれたコンプレッサーからのエアーを用いて駆動するものを使用することができる。また、加熱による流体の膨張または相変化を用いるものなどを使用することもできる。

基板５３には、細胞保持部としての多孔質材料５１１および排出口への流路を形成するための貫通孔５１２が形成されている。細胞保持部は、流路幅と同等かそれよりも広い直径が１ｍｍ程度の径を形成する。当該装置で用いられる多孔質材料は細胞を留め置くことができ、かつ培養液を含む水溶液または試薬が滞り無く通過する程度に十分大きな孔径および空隙を有していれば良い。その他請求項に記載された上記の目的を満たすものであれば市販されているものを用いることができる。

基板５４には排出口へ接続するための溝５１３が形成されている。基板５５は底面を形成するための基板であり、基板５４に形成された溝が貫通孔である場合には必要となる。基板５５は、作成を容易にするためには不要であるが、ハンドリング能を向上させる目的で使用することができる。

上記基板を重ねて接着することにより流路を形成する。本実施例では基板５２にｐｏｌｙｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ（ＰＤＭＳ：ｓｙｌｇａｒｄ１８４，Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ）を、それ以外の基板には全てスライドガラス（ｍａｔｓｕｎａｍｉ）を用いた。

スライドガラスの加工はフォトリソグラフィーおよびメタル犠牲膜によりマスクをした上で、フッ酸によるウェットエッチングにより形成した。本実施例においてスライドガラスで挟み込まれるＰＤＭＳ構造体（エラストマー）は、フォトリソグラフィーを用いてスライドガラス上にレジストパターンを形成して鋳型として転写される。本実施例では市販のネガレジスト（ＳＵ−８； ＭｉｃｒｏＣｈｅｍ Ｃｏｒｐ．）を用いて鋳型を作成した。

はじめに、ＰＤＭＳの前駆体を鋳型に流し込み、鋳型とプレポリマーをスライドガラスで挟んだ状態で９０℃で１時間、オーブンにより加熱をすることでポリマーを固化させた。放冷後、鋳型からＰＤＭＳを剥離することでＰＤＭＳエラストマーを得た。この際に、鋳型からのＰＤＭＳエラストマーの剥離を容易にするために予め３，３，４，４，５，５，６，６，６−Ｎｏｎａｆｌｕｏｒｏｈｅｘｙｌｔｒｉｃｈｌｏｒｏｓｉｌａｎｅ（信越化学）等のシランカップリング剤を用いて鋳型表面に撥水処理をしておいても良い。

なお、ＰＤＭＳエラストマーを基材として用いた場合には、基板同士の接着は自発的に行なうことができる。ＰＤＭＳエラストマーとスライドガラスとの接着には酸素プラズマ（８０Ｗ，３０秒）による融着により行なうことができる。

その他の基板の接着方法としては、例えば基材にガラスを選択した場合にはフッ酸溶液や、一般的にガラス、テフロン等の高分子材料等から選択されるスペーサ、シリコーン系の接着剤等から選択することができる。しかし、接着剤としては流通する溶液によって浸食されない物質であれば特に限定されない。基板の接着は加重等により適宜、補強することもできる。

本装置に用いた多孔質材料はセルロースアセテートを用いたもので、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ等で市販されているものを用いた。本装置に用いられる多孔質材料の孔径は、細胞体の大きさおよび送液用に十分足りるものであることを加味した上で適当なものを用いた。例えば、単一細胞径の大きな細胞については、平均細孔径が１０μｍ以下の多孔質材料、より好ましくは１〜５μｍの多孔質材料を用いることができる。

本実施例においては、前述の通りスライドガラスおよびＰＤＭＳエラストマーを基材として用いた。そして、一般的にＰＤＭＳの方がスライドガラスよりも撥水性が高いので、基板５２にＰＤＭＳエラストマーを選択することにより、撥水力を利用したバルブとして利用した。

より具体的には、通常の培養時には細胞の細胞回収口である５８の出口は蓋材によって閉じておき、溶液用入口５６から導入された液体は流路５１０、細胞保持部である５１１を通過して溶液用出口５７から排出される（図７−１）。次に、所望時間、培養または細胞に対する処理を行なった後に５８を開放する。その際に５１４の領域は周囲に比較して撥水性の高い表面となっているために液体を逆流させることで細胞回収口である５８から所望の細胞を容易に回収することができる（図７−２）。

この際に送液方向を変化させる装置としては、プッシュ・プルポンプを５７側に取り付けて切り替えるのが望ましいが、培養時と回収時とでポンプを付け替えることで方向の異なる流速を実現することができる。本実施例ではプッシュプル型のシリンジポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を用いた。

（実施例２）
薬剤の導入口を３個（５６、８１、８２）、設けた以外は、実施例１と同様にして、本実施例の細胞培養処理装置を製造した（図８）。すなわち、この細胞培養処理装置では流路に３個の溶液用入口が連通されており、使用する溶液（細胞含有液、培養液、試薬等）の種類及び量に応じて３個の溶液用入口を使い分けたり、同時に使用したりすることができる。例えば、第１の溶液用入口から細胞含有液を流して細胞を細胞保持部に保持させた後、細胞含有液の送液を停止すると同時に第２の溶液用入口から培養液を送液する。こうすることによって、連続的に細胞に流れの圧力をかけることができ、効果的に細胞を細胞保持部に保持できる。

（実施例３）
細胞回収口を２個（５８、９１）、設けた以外は、実施例１と同様にして、本実施例の細胞培養処理装置を製造した（図９）。すなわち、この細胞培養処理装置では流路に２個の細胞回収口が連通されており、回収する細胞の種類及び量に応じて２個の細胞回収口を使い分けたり、同時に使用したりすることができる。

（実施例４）
溶液用入口を３個（５６、８１、８２）、設けた以外は、実施例３と同様にして、本実施例の細胞培養処理装置を製造した（図１０）。本実施例のように溶液用入口を３個、設けた装置を用いることで、溶液用入口（５６）を介した流路への溶液の流通（図１１）や、溶液用入口（８１、８２）を介した薬液の導入（図１２）を一括して行なうことができる。また、細胞回収口（９１）を介して細胞の回収（図１３）を行なうことができる。

（実施例５）
溶液用出口の高さを異なるものとした以外は実施例１と同様にして、本実施例の細胞培養処理装置を製造した。本実施例のように溶液用入口を３個、設けた装置を用いることで、流路への液体の流通（図１４）、薬液の導入（図１５）および細胞の回収（図１６）等を行なうことができる。

（実施例６）
実施例１の方法で製造した細胞培養処理装置を用いて、動物細胞の潅流培養実験を行なった。本実施例では、多孔質材料としてポアサイズが３μｍのセルロースアセテートを用いた。細胞培養処理装置は、予めＵＶを照射するにより滅菌処理を施した。本実施例で用いた細胞は、ヒト肝癌由来細胞であるＨｅｐＧ２細胞を用いた。

ＨｅｐＧ２細胞は３７℃、５％ＣＯ₂の培養条件で、細胞培養フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ）で３−５代にわたって継代培養を行なったものを用いた。ＨｅｐＧ２細胞の細胞懸濁液はトリプシン酵素処理によって培養フラスコ底面から剥離し、血球計算盤を用いて５．０×１０⁶ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度に調整した。

細胞培養液には１０％ウシ血清を添加したハイグルコースのダルベッコ調整培地（ＤＭＥＭ； Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ， ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）を用いた。細胞培養の概略図を図７に示す。

本実施例においてはシリンジポンプを用いて送液を行なった。まず、５８を閉状態としてシリンジポンプを用いて５６から５７に向かって細胞懸濁液（細胞含有液）を５μＬ／ｍｉｎの流速で１０分間、流通させてからシリンジポンプを停止する（図７−１）。この工程により、細胞が細胞保持部に保持される（保持工程）。引き続いて導入するシリンジを切り替えて、ＤＭＥＭ培養液を流路内に導入し、５６から５７に向かって５μＬ／ｍｉｎの流速で７２時間、流通させ続けながら培養を行なった（培養工程）。

細胞培養は３７℃に保持したインキュベータ内で行ない、酸素、二酸化炭素、窒素をそれぞれ１０％、５％、８５％に調整した混合ガスを吹き込んだ培養液を流路内に導入した。所定の時間培養した後に、５８を開状態として図７−２に示すように５７から５８に向かって溶液を流すことにより、細胞保持部から細胞を遊離させて細孔回収口５８で細胞を回収した（回収工程）。

さらに回収した細胞は、顕微鏡により形態観察や、市販のキットを用いてアルブミン産生量等の細胞機能評価を行なった。細胞培養フラスコにて静置培養したＨｅｐＧ２細胞のアルブミン産生量との比較を行なったところ、静置培養と比較して同等以上のアルブミン合成能を示した。以上のことから本実施例において、ＨｅｐＧ２細胞は多孔質構造体に接着することなく培養されるため、細胞同士が凝集した肝細胞の３次元培養装置が提供され得ることが分かる。

（実施例７）
ＨｅｐＧ２細胞の代わりに大腸菌体（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２株）を用いた以外は、実施例６と同様にして走化性の激しい大腸菌の培養を行なった。Ｋ１２の培養にはトリプトソーヤ寒天培地（日水製薬株式会社）を用いた。

大腸菌は、３８℃，１２時間の条件の寒天培地で培養しているものから回収して液体培地（ＹＴ培地）による懸濁液（細胞含有液）を作成した。その際の菌数は１．０×１０⁸ｂａｃｔｅｒｉａｓ／ｍＬとした。菌体を回収後、細胞二重染色キット（同仁化学）を用いて菌体のＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ観察を行なったところ、９０％以上の菌体が生存していることが確認され、当該装置を用いて大腸菌体培養を行なうことができることが判明した。

（実施例８）
ＨｅｐＧ２細胞の代わりに血球系細胞のＨＬ６０細胞を用いた以外は、実施例６と同様にして浮遊性細胞の培養を行なった。

（実施例９）
実施例６で用いた装置を用いて、微粒子を用いたマイクロキャリア培養を行なった。本実施例で用いたマイクロキャリアビーズは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ等から入手可能な市販品（直径０．１ ｍｍ）を用いた。培養に用いた細胞はＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター子宮卵巣）、培養には、１０％牛胎児血清を含むｅ−ＲＤＦ培地（極東製薬（株）社製）を用いた。滅菌処理した５ｇ／Ｌの濃度に調整したマイクロキャリアビーズを５×１０⁶ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整した細胞懸濁液（細胞含有液）と共に２４時間、細胞培養フラスコ内で静置培養を行なうことでビーズ表面に当該細胞を接着させた。

細胞が接着したマイクロキャリアビーズをフラスコから回収し、溶液用入口から実施例６の装置内に導入し、細胞保持部でビーズを保持させながら培養液を流通させることでマイクロキャリア培養を行なった。

次に、５μＬ／ｍｉｎの流速で培養液を５日間、流通させた後に、徐々に血清添加量を減じていって、１０日目までに無血清培地へと切り替えて、無血清培地を循環させた状態でさらに２０日間培養を行なった。培養後の細胞はビーズごと送液を変えることにより回収した。

回収したビーズ表面の細胞形状および密度を、細胞二重染色キット（同仁化学）を用いて蛍光顕微鏡により測定した。遠心分離操作により底面に濃縮させ、さらに所定量の滅菌水に再懸濁させて濁度を測定した。蛍光および濁度の測定により、細胞は生存し細胞増殖性も確認されたことから、当該装置でのマイクロキャリア培養が有効であることが示された。

（実施例１０）
顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）生産能を遺伝的に付与させたＣＨＯ細胞を用いる以外は実施例７と同様にして改変ＣＨＯ細胞のマイクロキャリア培養を行なった。

本発明の細胞培養処理装置の一例を示す上面図である。 図１の細胞培養処理装置の線Ｉ−Ｉ方向に沿った断面図である。 図１の細胞培養処理装置の線Ｉ−Ｉ方向に沿った断面図である。 本発明の細胞培養処理装置の細胞保持部による細胞捕捉状態の一例を示す模式図である。 本発明の細胞培養処理装置の細胞保持部から細胞を回収する状態の一例を示す模式図である。 本発明の多孔質材料の一例を示す模式図である。 実施例１の細胞培養処理装置を示す上面図である。 実施例１の細胞培養処理装置の展開上面図である。 実施例１の細胞培養処理装置の使用方法の一例を説明する斜視図である。 実施例１の細胞培養処理装置の使用方法の一例を説明する斜視図である。 実施例２の細胞培養処理装置を示す上面図である。 実施例３の細胞培養処理装置を示す上面図である。 実施例４の細胞培養処理装置を示す上面図である。 実施例４の細胞培養処理装置の使用方法の一例を説明する斜視図である。 実施例４の細胞培養処理装置の使用方法の一例を説明する斜視図である。 実施例４の細胞培養処理装置の使用方法の一例を説明する斜視図である。 実施例５の細胞培養処理装置の使用方法の一例を説明する斜視図である。 実施例５の細胞培養処理装置の使用方法の一例を説明する斜視図である。 実施例５の細胞培養処理装置の使用方法の一例を説明する斜視図である。

符号の説明

１０ 基板
１１ 導入口
１２ 排出口
１３ 細胞回収口
１４ 流路
１５ 多孔質材料
１６ 蓋
１７ マイクロバルブ
５１ 基板
５２ 基板
５３ 基板
５４ 基板
５５ 基板
５６ 導入口
５７ 排出口
５８ 細胞回収口
５９ 貫通孔
５１０ 流路
５１１ 多孔質材料
５１２ 貫通孔
５１３ 流路
５１４ マイクロバルブ
８１ 薬剤投入口
８２ 薬剤投入口
９１ 細胞回収口

Claims (9)

1. 細胞の培養、処理及び回収を行なうための細胞培養処理装置であって、
   細胞懸濁液、薬液または緩衝溶液を流すための流路と、
   前記流路内に設けられた細胞を保持可能な細胞保持部と、
   前記流路の第１の端部に接続された溶液用入口と、
   前記流路の第２の端部に接続された溶液用出口と、
   前記流路内の細胞保持部と第１の端部との間の位置で、前記流路に接続された細胞回収口と、
   前記細胞回収口を開閉可能な蓋材と、
   を備えていることを特徴とする細胞培養処理装置。
2. 前記細胞保持部が、多孔質材料からなることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養処理装置。
3. 前記流路は、鉛直方向に延在する鉛直流路を有し、
   前記多孔質材料は、前記鉛直流路内において、その面方向が流路底部と平行となるように配置されていることを特徴とする請求項２に記載の細胞培養処理装置。
4. 前記多孔質材料は、単一細胞径よりも小さい平均細孔径を有することを特徴とする請求項２又は３に記載の細胞培養処理装置。
5. 前記多孔質材料の平均細孔径が、１μｍ以下であることを特徴とする請求項２から４の何れか１項に記載の細胞培養処理装置。
6. 前記流路内の、第１の端部と前記細胞回収口が流路に接続する部分との間に、更に流路の開閉が可能な流路開閉部を備えることを特徴とする請求項１から５の何れか１項に記載の細胞培養処理装置。
7. 前記溶液用入口及び溶液用出口の少なくとも一方に、更に溶液の送液が可能な送液手段が接続されていることを特徴とする請求項１から６の何れか１項に記載の細胞培養処理装置。
8. 請求項１に記載の細胞培養処理装置を用いた細胞培養処理方法であって、
   前記蓋材により細胞回収口を閉状態にして、前記溶液用入口から溶液用出口に向かって細胞を含有する細胞懸濁液を流すことにより前記細胞保持部に細胞を保持させる保持工程と、
   前記保持工程の後、細胞保持部に細胞を保持させた状態で、前記溶液用入口から溶液用出口に向かって細胞培養液、細胞を処理する為の薬液及び緩衝液からなる群から選択された少なくとも一種の溶液を流すことにより、細胞の培養及び処理の少なくとも一方を行なう培養処理工程と、
   前記培養処理工程の後、前記蓋材により細胞回収口を開状態にして、前記溶液用出口から細胞回収口に向かって溶液を流すことにより前記細胞保持部に保持された細胞を遊離させて細胞回収口で回収する回収工程と、
   を有することを特徴とする細胞培養処理方法。
9. 請求項６に記載の細胞培養処理装置を用いた細胞培養処理方法であって、
   前記蓋材により細胞回収口を閉状態にし前記流路開閉部を開状態にして、前記溶液用入口から溶液用出口に向かって細胞を含有する細胞懸濁液を流すことにより前記細胞保持部に細胞を保持させる保持工程と、
   前記保持工程の後、細胞保持部に細胞を保持させた状態で、前記溶液用入口から溶液用出口に向かって細胞培養液、細胞を処理する為の薬液及び緩衝液からなる群から選択された少なくとも一種の溶液を流すことにより、細胞の培養及び処理の少なくとも一方を行なう培養処理工程と、
   前記培養処理工程の後、前記蓋材により細胞回収口を開状態にし前記流路開閉部を閉状態にして、前記溶液用出口から細胞回収口に向かって溶液を流すことにより前記細胞保持部に保持された細胞を遊離させて細胞回収口で回収する回収工程と、
   を有することを特徴とする細胞培養処理方法。

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