JP3748537B2 - ポリヒドロキシアルカノエート及びその製造方法、並びにω−（２−チエニルスルファニル）アルカン酸及びその製造方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は新規なポリエステルの一種であるポリヒドロキシアルカノエート(ＰＨＡ)に関する。また当該ＰＨＡを生産し体内に蓄積する微生物を用いた当該ＰＨＡの生産方法に関する。また当該微生物の培養に供せられる化合物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
これまで、多くの微生物がポリ-３-ヒドロキシ酪酸(ＰＨＢ)あるいはその他のＰＨＡを生産し、菌体内に蓄積することが報告されてきた(「生分解性プラスチックハンドブック」,生分解性プラスチック研究会編,(株)エヌ・ティー・エス,Ｐ178-197(1995))。これらのポリマーは従来のプラスチックと同様に、溶融加工等により各種製品の生産に利用することができる。さらに、生分解性であるがゆえに、自然界で微生物により完全分解されるという利点を有しており、従来の多くの合成高分子化合物のように自然環境に残留して汚染を引き起こすことがない。また、生体適合性にも優れており、医療用軟質部材等としての応用も期待されている。
【０００３】
このような微生物産生ＰＨＡは、その生産に用いる微生物の種類や培地組成、培養条件等により、様々な組成や構造のものとなり得ることが知られており、これまで主に、ＰＨＡの物性の改良という観点から、このような組成や構造の制御に関する研究がなされてきた。
【０００４】
《１》まず、３-ヒドロキシ酪酸(以下、３ＨＢと略す)をはじめとする比較的簡単な構造のモノマーユニットを重合させたＰＨＡの生合成としては、次のものが挙げられる。
【０００５】
(a)３ＨＢと３-ヒドロキシ吉草酸(以下３ＨＶ)を含むもの
特公平６-15604号公報、特公平７-14352号公報、特公平８-19227号公報等；特開平５-7492号公報
(b)３ＨＢと３-ヒドロキシヘキサン酸(以下３ＨＨx)を含むもの
特開平５-93049号公報、及び特開平７-265065号公報
(c)３ＨＢと４-ヒドロキシ酪酸(以下４ＨＢ)を含むもの
特開平９-191893号公報
(d)炭素数６から 12 までの３-ヒドロキシアルカノエートを含むもの
特許公報第2642937号
(e)単一の脂肪酸を炭素源とした生合成。生産物は(d)とほぼ同様
Ａppl.Ｅnviron.Ｍicrobiol,58(２),746(1992)
等が挙げられる。これらはいずれも微生物による炭化水素等のβ酸化や糖からの脂肪酸合成により合成された、いずれも側鎖にアルキル基を有するモノマーユニットからなるＰＨＡ、即ち、「usual ＰＨＡ」である。
【０００６】
《２》しかし、このような微生物産生ＰＨＡのより広範囲な応用、例えば機能性ポリマーとしての応用を考慮した場合、アルキル基以外の置換基を側鎖に導入したＰＨＡ「unusual ＰＨＡ」が極めて有用であることが期待される。置換基の例としては、芳香環を含むもの(フェニル基、フェノキシ基など)や、不飽和炭化水素、エステル基、アリル基、シアノ基、ハロゲン化炭化水素、エポキシドなどが挙げられる。これらの中でも、特に、芳香環を有するＰＨＡの研究が盛んになされている。
【０００７】
(a)フェニル基もしくはその部分置換体を含むもの
Ｍakroｍol.Ｃheｍ.,191，1957-1965(1990)及びＭacroｍolecules,24，5256-5260(1991)には、５-フェニル吉草酸を基質として、シュードモナス オレオボランス(Ｐseudoｍonas oleovorans)が３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸をユニットとして含むＰＨＡを生産することが報告されている。
【０００８】
Ｍacroｍolecules,29，1762-1766(1996)には、５-(４'-トリル)吉草酸を基質として、シュードモナス オレオボランス(Ｐseudoｍonas oleovorans)が３-ヒドロキシ-５-(４'-トリル)吉草酸をユニットとして含むＰＨＡを生産することが報告されている。
【０００９】
Ｍacroｍolecules,32，2889-2895(1999)には、５-(２',４'-ジニトロフェニル)吉草酸を基質として、シュードモナス オレオボランス(Ｐseudoｍonas oleovorans)が３-ヒドロキシ-５-(２',４'-ジニトロフェニル)吉草酸及び３-ヒドロキシ-５-(４'-ニトロフェニル)吉草酸をユニットとして含むＰＨＡを生産することが報告されている。
【００１０】
(b)フェノキシ基もしくはその部分置換体を含むもの
Ｍacroｍol.Ｃheｍ.Ｐhys.,195，1665-1672(1994)には、11-フェノキシウンデカン酸を基質として、シュードモナス オレオボランス(Ｐseudoｍonas oleovorans)が３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸と３-ヒドロキシ-９-フェノキシノナン酸のＰＨＡコポリマーを生産することが報告されている。
【００１１】
特許公報第2989175号には、３-ヒドロキシ-５-(モノフルオロフェノキシ)ペンタノエート(３Ｈ５(ＭＦＰ)Ｐ)ユニットあるいは３-ヒドロキシ-５-(ジフルオロフェノキシ)ペンタノエート(３Ｈ５(ＤＦＰ)Ｐ)ユニットからなるホモポリマー、少なくとも３Ｈ５(ＭＦＰ)Ｐユニットあるいは３Ｈ５(ＤＦＰ)Ｐユニットを含有するコポリマー；これらのポリマーを合成するシュードモナス・プチダ；シュードモナス属を用いた前記のポリマーの製造法に関する発明が開示されており、その効果として、置換基をもつ長鎖脂肪酸を資化して、側鎖末端が１から２個のフッ素原子が置換したフェノキシ基をもつポリマーを合成することができ、融点が高く良い加工性を保持しながら、立体規則性、撥水性を与えることができるとしている。
【００１２】
この様なフッ素基置換体以外に、シアノ基やニトロ基の置換体の研究もなされている。
【００１３】
Ｃan.Ｊ.Ｍicrobiol.,41，32-43(1995)及び Ｐolyｍer International,39，205-213(1996)には、シュードモナス オレオボランス(Ｐseudoｍonas oleovorans)ＡＴＣＣ 29347株及びシュードモナス プチダ(Ｐseudoｍonas putida)ＫＴ2442株を用いて、オクタン酸とp-シアノフェノキシヘキサン酸或いはp-ニトロフェノキシヘキサン酸を基質として、３-ヒドロキシ-p-シアノフェノキシヘキサン酸或いは３-ヒドロキシ-p-ニトロフェノキシヘキサン酸をモノマーユニットとして含むＰＨＡの生産が報告されている。
【００１４】
これらの報告は側鎖がアルキル基である一般的なＰＨＡとは異なり、いずれもＰＨＡの側鎖に芳香環を有しており、それに由来する物性を有するポリマーを得る上で有益である。
【００１５】
《３》また新たなカテゴリーとして、単に物性の変化に留まらず、側鎖に適当な官能基を有するＰＨＡを生産し、その官能基を利用して新たな機能を生み出そうとする研究も行なわれている。
【００１６】
例えばＭacroｍolecules,31，1480-1486(1996)及び、Journal of Ｐolyｍer Ｓcience:Ｐart Ａ:Ｐolyｍer Ｃheｍistry,36，2381-2387(1998)などでは、側鎖の末端にビニル基を持つユニットを含むＰＨＡを合成した後、酸化剤によりエポキシ化し、側鎖末端に反応性の高いエポキシ基を含むＰＨＡを合成出来たと報告されている。
【００１７】
またビニル基以外にも、高い反応性が期待されるチオエーテルを持つユニットを含むＰＨＡの合成例として、Ｍacroｍolecules,32，8315-8318(1999)においては、シュードモナス プチダ(Ｐseudoｍonas putida)27Ｎ01株が 11-(フェニルスルファニル)吉草酸を基質とし、３-ヒドロキシ-５-(フェニルスルファニル)吉草酸及び３-ヒドロキシ-７-(フェニルスルファニル)ヘプタン酸のＰＨＡコポリマーを生産することが報告されている。
【００１８】
【発明が解決しようとする課題】
これらのＰＨＡのうち、側鎖にＳ原子を有する３-ヒドロキシ-(フェニルスルファニル)アルカン酸ユニットを含むＰＨＡに関しては、その反応性の高さから、機能性ＰＨＡを開発していく上で今後益々研究がなされていくものと予想される。しかし、この様な種類のＰＨＡに関する研究は多くはなされてはおらず、それに関連する報告例は上記のみである。また得られたＰＨＡの側鎖に化学的な修飾を行なうことによって機能性ＰＨＡを開発していくためには、フェニル基よりも反応性の高い、たとえばチエニル基のような側鎖を有していることが望まれるが、これまでそれに関連したＰＨＡを生産したという報告例はない。
【００１９】
本発明の目的は、そのような問題に鑑み、新規なＰＨＡと、その生産方法を提供することにある。
【００２０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究の結果、以下のような発明に至った。即ち、本発明の第一は、化学式[１]に示されるユニットを有することを特徴とするポリヒドロキシアルカノエートそのものである。
【００２１】
【化１０】
【００２２】
また本発明のポリヒドロキシアルカノエートは、化学式[１]に示されるユニット以外のユニットが、化学式[２]で示される３-ヒドロキシアルカン酸ユニット及び化学式[１２]で示される３-ヒドロキシアルケン酸ユニットのうち、少なくとも一つを含むことを特徴とするポリヒドロキシアルカノエートである。
【００２３】
【化１１】
【００２４】
本発明により得られるポリヒドロキシアルカノエートは、数平均分子量が 10000 から 1000000 の範囲であるポリヒドロキシアルカノエートである。
【００２５】
また本発明により得られるポリヒドロキシアルカノエートは、化学式[１]、[２]及び[12]に示されるように不斉炭素を有しており多くの立体異性体が存在しうる。しかし本発明による生産方法では、微生物を用いてポリヒドロキシアルカノエートを生産していることから、ポリヒドロキシアルカノエートのモノマーユニットである３-ヒドロキシアルカン酸ユニットは、すべてＲ体となる特徴を有している。
【００２６】
また本発明の第二は、化学式[３]で示される化合物を含む培地中で微生物を培養することを特徴とする上記ポリヒドロキシアルカノエートの製造方法である。
【００２７】
【化１２】
【００２８】
またさらに詳しくは化学式[４]で示される５-(２-チエニルスルファニル)吉草酸、あるいは[５]で示される６-(２-チエニルスルファニル)ヘキサン酸を含む培地中で微生物を培養することを特徴とするポリヒドロキシアルカノエートの製造方法である。
【００２９】
【化１３】
【００３０】
【化１４】
【００３４】
本発明で用いられる化学式[11]に示すω-(２-チエニルスルファニル)アルカン酸の製造方法は、ブロモアルカン酸、ブロモアルカン酸エステル誘導体、ブロモアルカノール、ジブロモアルカン及びラクトンのいずれかと、チオフェン-２-チオールとを反応させる工程を有することを特徴とする。
【００３５】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明において利用される微生物、培養工程等について説明する。
【００３６】
(微生物)
本発明の方法で用いる微生物は、化学式[３]で示されるω-(２-チエニルスルファニル)アルカン酸を含む培地中で培養することにより化学式[１]に示されるユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを生産しうる微生物であれば如何なる微生物であってもよいが、その一例としては、シュードモナス(Ｐseudoｍonas)属に属する微生物が挙げられる。さらに詳しくは、微生物がシュードモナス・チコリアイ ＹＮ２株(Ｐseudoｍonas cichorii ＹＮ２；ＦＥＲＭ ＢＰ-7375)、シュードモナス・チコリアイ Ｈ45株(Ｐseudoｍonas cichorii Ｈ45、ＦＥＲＭ ＢＰ-7374)、シュードモナス・ジェッセニイ Ｐ161株(Ｐseudoｍonas jessenii Ｐ161、ＦＥＲＭ ＢＰ-7376)が挙げられる。これら３種の微生物は独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託されており、特願平11-371863号(特開2001-178484号公報)に記載されている微生物である。
【００３７】
以下にＹＮ２株、Ｈ45株及びＰ161株についての詳細を示す。
＜ＹＮ２株の菌学的性質＞
(１)形態学的性質
細胞の形と大きさ :桿菌、0.8μｍ×1.5〜2.0μｍ
細胞の多形性 :なし
運動性 :あり
胞子形成 :なし
グラム染色性 :陰性
コロニー形状 :円形、全縁なめらか、低凸状、
表層なめらか、光沢、半透明
(２)生理学的性質
カタラーゼ :陽性
オキシダーゼ :陽性
Ｏ/Ｆ試験 :酸化型(非発酵性)
硝酸塩の還元 :陰性
インドールの生成 :陽性
ブドウ糖酸性化 :陰性
アルギニンジヒドロラーゼ :陰性
ウレアーゼ :陰性
エスクリン加水分解 :陰性
ゼラチン加水分解 :陰性
β-ガラクトシダーゼ :陰性
Ｋing'sＢ寒天での蛍光色素産生:陽性
４％ＮaＣlでの生育 :陽性(弱い生育)
ポリ-β-ヒドロキシ酪酸の蓄積 :陰性(＊)
Ｔｗeen 80 の加水分解 :陽性
＊nutrient agar培養コロニーをズダンブラックで染色することで判定。
(３)基質資化能
ブドウ糖 :陽性
Ｌ-アラビノース :陽性
Ｄ-マンノース :陰性
Ｄ-マンニトール :陰性
Ｎ-アセチル-Ｄ-グルコサミン :陰性
マルトース :陰性
グルコン酸カリウム :陽性
n-カプリン酸 :陽性
アジピン酸 :陰性
dl-リンゴ酸 :陽性
クエン酸ナトリウム :陽性
酢酸フェニル :陽性
【００３８】
＜Ｈ45株の菌学的性質＞
(１)形態学的性質
細胞の形と大きさ :桿菌、0.8μｍ×1.0〜1.2μｍ
細胞の多形性 :なし
運動性 :あり
胞子形成 :なし
グラム染色性 :陰性
コロニー形状 :円形、全縁なめらか、低凸状、
表層なめらか、光沢、クリーム色
(２)生理学的性質
カタラーゼ :陽性
オキシダーゼ :陽性
Ｏ/Ｆ試験 :酸化型
硝酸塩の還元 :陰性
インドールの生成 :陰性
ブドウ糖酸性化 :陰性
アルギニンジヒドロラーゼ :陰性
ウレアーゼ :陰性
エスクリン加水分解 :陰性
ゼラチン加水分解 :陰性
β-ガラクトシダーゼ :陰性
Ｋing'sＢ寒天での蛍光色素産生:陽性
４％ＮaＣlでの生育 :陰性
ポリ-β-ヒドロキシ酪酸の蓄積 :陰性
(３)基質資化能
ブドウ糖 :陽性
Ｌ-アラビノース :陰性
Ｄ-マンノース :陽性
Ｄ-マンニトール :陽性
Ｎ-アセチル-Ｄ-グルコサミン :陽性
マルトース :陰性
グルコン酸カリウム :陽性
n-カプリン酸 :陽性
アジピン酸 :陰性
dl-リンゴ酸 :陽性
クエン酸ナトリウム :陽性
酢酸フェニル :陽性
【００３９】
＜Ｐ161株の菌学的性質＞
(２)生理学的性質
カタラーゼ :陽性
オキシダーゼ :陽性
Ｏ/Ｆ試験 :酸化型
硝酸塩の還元 :陽性
インドールの生成 :陰性
ブドウ糖酸性化 :陰性
アルギニンジヒドロラーゼ :陽性
ウレアーゼ :陰性
エスクリン加水分解 :陰性
ゼラチン加水分解 :陰性
β-ガラクトシダーゼ :陰性
Ｋing'sＢ寒天での蛍光色素産生:陽性
(３)基質資化能
ブドウ糖 :陽性
Ｌ-アラビノース :陽性
Ｄ-マンノース :陽性
Ｄ-マンニトール :陽性
Ｎ-アセチル-Ｄ-グルコサミン :陽性
マルトース :陰性
グルコン酸カリウム :陽性
n-カプリン酸 :陽性
アジピン酸 :陰性
dl-リンゴ酸 :陽性
クエン酸ナトリウム :陽性
酢酸フェニル :陽性
【００４０】
(培養工程)
本発明にかかるＰＨＡの製造方法に用いる微生物の通常の培養、例えば、保存菌株の作成、ＰＨＡの生産に必要とされる菌数や活性状態を確保するための増殖などには、用いる微生物の増殖に必要な成分を含有する培地を適宜選択して用いる。例えば、微生物の生育や生存に悪影響を及ぼすものでない限り、一般的な天然培地(肉汁培地、酵母エキスなど)や、栄養源を添加した合成培地など、いかなる種類の培地をも用いることができる。温度、通気、攪拌などの培養条件は、用いる微生物に応じて適宜選択する。
【００４１】
前記したようなＰＨＡ生産微生物を用いて、目的とするポリヒドロキシアルカノエートを製造するためには、ＰＨＡ生産用の原料として、該モノマーユニットに対応する、上記化学式[３]で示されるω-(２-チエニルスルファニル)アルカン酸と微生物の増殖用炭素源とを少なくとも含んだ無機培地などを用いることができる。ω-(２-チエニルスルファニル)アルカン酸は、培地あたり 0.01％から１％(ｗ/v)、更に好ましくは 0.02％から 0.2％の割合で含有していることが望ましい。
【００４２】
水溶性は必ずしも良好ではないが、本発明に示す微生物を用いれば、懸濁された状態であっても何ら問題は無い。また、場合によっては１-ヘキサデセンや n-ヘキサデカンのような溶媒に溶解或いは懸濁された形で培地中に含有されることも可能である。この場合、該溶媒の濃度は培地溶液に対して３％以下にすることが必要である。
【００４３】
増殖用炭素源としては、ポリペプトン、酵母エキスや肉エキスといった栄養素を用いることが可能であり、更に、糖類、ＴＣＡ回路中の中間体として生じる有機酸及びＴＣＡ回路から一段階ないしは二段階の生化学反応を経て生じる有機酸或いはその塩、アミノ酸或いはその塩、炭素数４から 12 の直鎖アルカン酸或いはその塩等から用いる菌株に対する基質としての有用性で適宜選択することができる。
【００４４】
これらのうち、糖類としては、グリセロアルデヒド、エリスロース、アラビノース、キシロース、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトースといったアルドース、
グリセロール、エリスリトール、キシリトール等のアルジトール、
グルコン酸等のアルドン酸、
グルクロン酸、ガラクツロン酸等のウロン酸、
マルトース、スクロース、ラクトース、セロビオースといった二糖等
から選ばれる１つ以上の化合物が好適に利用できる。
【００４５】
また、有機酸或いはその塩としては、ピルビン酸、オキサロ酢酸、クエン酸、イソクエン酸、ケトグルタル酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、乳酸などがその例であり、或いはその塩から選ばれる１つ以上の化合物が好適に利用できる。
【００４６】
また、アミノ酸或いはその塩としては、グルタミン酸、アスパラギン酸或いはその塩から選ばれる１つ以上の化合物が好適に利用できる。
【００４７】
これらの中では、ポリペプトンや糖類を用いるのが好ましく、また糖類の中ではグルコース、フルクトース、マンノースからなる群から選択される少なくとも一つであることがより好ましい。これらの基質は通常培地あたり 0.1％から５％(ｗ/v)、更に好ましくは 0.2％から２％の割合で含有していることが望ましい。
【００４８】
一例を挙げれば、Ｄ-グルコースを 0.1％から 5.0％程度、および、化学式[３]で示されるω-(２-チエニルスルファニル)アルカン酸を 0.01％から 1.0％程度含んだ無機培地等で培養し、対数増殖後期から定常期の時点で菌体を回収して所望のＰＨＡを抽出することができる。Ｄ-グルコースの代わりに同量の酵母エキスを与えても良い。
【００４９】
微生物にＰＨＡを生産・蓄積させる方法としては、一旦十分に増殖させて後に、塩化アンモニウムのような窒素源を制限した培地へ菌体を移し、目的ユニットの基質となる化合物を加えた状態で更に培養すると生産性が向上する場合がある。具体的には、前記の工程を複数段接続した多段方式の採用が挙げられる。例えば、Ｄ-グルコースを 0.1％から 5.0％程度、および、化学式[３]で示されるω-(２-チエニルスルファニル)アルカン酸を 0.01％から 1.0％程度含んだ無機培地等で対数増殖後期から定常期の時点まで培養し、菌体を遠心分離等で回収したのち化学式[３]で示されるω-(２-チエニルスルファニル)アルカン酸を 0.01％から 1.0％程度含んだ、窒素源を制限した、あるいはほとんど存在しない無機培地で更に培養する方法がある。
【００５０】
培養温度としては上記の菌株が良好に増殖可能な温度であれば良く、例えば 15〜40℃、好ましくは 20〜35℃、更に好ましくは 20℃から 30℃程度が適当である。
【００５１】
培養は液体培養、固体培養等該微生物が増殖し、ＰＨＡを生産する培養方法ならいかなる培養方法でも用いることができる。さらに、バッチ培養、フェドバッチ培養、半連続培養、連続培養等の種類も問わない。液体バッチ培養の形態としては、振とうフラスコによって振とうさせて酸素を供給する方法、ジャーファーメンターによる攪拌通気方式の酸素供給方法がある。
【００５２】
(培地)
上記の培養方法に用いる無機培地としては、リン源(例えば、リン酸塩など)、窒素源(例えば、アンモニウム塩、硝酸塩など)等、当該微生物の増殖に必要な成分を含んでいるものであればいかなるものでも良く、例えば、ＭＳＢ培地、Ｍ９培地等を挙げることができる。
【００５３】
本発明の一方法に用いた無機塩培地(Ｍ９培地)の組成を以下に示す。
【００５４】
[Ｍ９培地]
Ｎa2ＨＰＯ4 6.2g
ＫＨ2ＰＯ4 3.0g
ＮaＣl 0.5g
ＮＨ4Ｃl 1.0g
(培地１リットル中、pＨ7.0)
【００５５】
更に、良好な増殖及びＰＨＡの生産のためには、上記の無機塩培地に以下に示す微量成分溶液を 0.3％(v/v)程度添加する必要がある。
【００５６】
[微量成分溶液]
ニトリロ三酢酸:1.5g ；ＭgＳＯ4:3.0g ；
ＭnＳＯ4:0.5g ；ＮaＣl:1.0g ；ＦeＳＯ4:0.1g ；
ＣaＣl2:0.1g ；ＣoＣl2:0.1g ；ＺnＳＯ4:0.1g ；
ＣuＳＯ4:0.1g ；ＡlＫ(ＳＯ4)2:0.1g ；
Ｈ3ＢＯ3:0.1g ；Ｎa2ＭoＯ4:0.1g ；ＮiＣl2:0.1g
(溶液１リットル中、pＨ7.0)
【００５７】
(ＰＨＡの取得)
本発明にかかる培養液からのＰＨＡの取得には、通常行なわれている方法を適用することができる。ＰＨＡが培養液中に分泌される場合は、培養液からの抽出精製方法が、また、菌体に蓄積される場合は、菌体からの抽出精製方法が用いられる。例えば、微生物の培養菌体からのＰＨＡの回収には、通常行なわれているクロロホルムなどの有機溶媒による抽出が最も簡便ではあるが、クロロホルム以外にジオキサン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、アセトンが用いられる場合もある。また、有機溶媒が使用しにくい環境中においては、ＳＤＳ等の界面活性剤による処理、リゾチーム等の酵素による処理、ＥＤＴＡ等の薬剤による処理によってＰＨＡ以外の菌体成分を除去して、菌体内成分を除去することによってＰＨＡのみを回収する方法を採ることもできる。
【００５８】
(カルボン酸誘導体)
本発明で用いるカルボン酸誘導体は、化学式[３]で示されるω-(２-チエニルスルファニル)アルカン酸を用いる。この中で、化学式[11]で示されるω-(２-チエニルスルファニル)アルカン酸は、新規物質である。
【００５９】
【化１６】
【００６０】
【化１７】
【００６１】
(kは４から11の整数)
【００６２】
また、化学式[11]において、k＝ω(ωは４から 11 の整数)であるω-(２-チエニルスルファニル)アルカン酸の製造方法は、以下の製造方法がある。
【００６３】
1-1． チオフェン-２-チオールとω-ブロモアルカン酸を反応させて、化学式[11]に示すω-(２-チエニルスルファニル)アルカン酸を得る製造方法
1-2． チオフェン-２-チオールとω-ブロモアルカン酸エステルを反応させ、ω-(２-チエニルスルファニル)アルカン酸エステルを合成した後、エステルを加水分解することにより化学式[１１]に示すω-(２-チエニルスルファニル)アルカン酸を得る製造方法
1-3．チオフェン-２-チオールとω-ブロモ-１-アルカノールを反応させ、ω-(２-チエニルスルファニル)-１-アルカノールを合成した後、酸化することにより、化学式[11]に示すω-(２-チエニルスルファニル)アルカン酸を得る製造方法
1-4．チオフェン-２-チオールと１,ω-ジブロモアルカンを反応させ、２-[(ω-ブロモアルキル)スルファニル]チオフェンを合成した後、金属マグネシウムを用いグリニヤール試薬を調整し、更に炭酸ガスを加えることにより、化学式[11]に示すω-(２-チエニルスルファニル)アルカン酸を得る製造方法
1-5．チオフェン-２-チオールとラクトン類を反応させ、化学式[11]に示すω-(２-チエニルスルファニル)アルカン酸を得る製造方法
【００６４】
上記製造方法をさらに具体的に示す。
【００６５】
まず、化学式[４]に示す５-(２-チエニルスルファニル)吉草酸の製造方法を以下に示す。
【００６６】
【化１８】
【００６７】
2-1．チオフェン-２-チオールと５-ブロモ吉草酸を反応させ、化学式[４]に示す５-(２-チエニルスルファニル)吉草酸を得る製造方法
2-2．チオフェン-２-チオールと５-ブロモ吉草酸エステルを反応させ、５-(２-チエニルスルファニル)吉草酸エステルを合成した後、エステルを加水分解することにより化学式[４]に示す５-(２-チエニルスルファニル)吉草酸を得る製造方法
2-3．チオフェン-２-チオールと５-ブロモ-１-ペンタノールを反応させ、５-(２-チエニルスルファニル)-１-ペンタノールを合成した後、酸化することにより、化学式[４]に示す５-(２-チエニルスルファニル)吉草酸を得る製造方法
2-4．チオフェン-２-チオールと１,４-ジブロモブタンを反応させ、２-[(４-ブロモブチル)スルファニル]チオフェンを合成した後、金属マグネシウムを用いグリニヤール試薬を調整し、更に炭酸ガスを加えることにより、化学式[４]に示す５-(２-チエニルスルファニル)吉草酸を得る製造方法
2-5．チオフェン-２-チオールとδ-バレロラクトンを反応させ、化学式[４]に示す５-(２-チエニルスルファニル)吉草酸を得る製造方法
【００６８】
次に、化学式[５]に示す６-(２-チエニルスルファニル)ヘキサン酸の製造方法を以下に示す。
【００６９】
【化１９】
【００７０】
3-1. チオフェン-２-チオールと６-ブロモヘキサン酸を反応させ、化学式[５]に示す６-(２-チエニルスルファニル)ヘキサン酸を得る製造方法
3-2. チオフェン-２-チオールと６-ブロモヘキサン酸エステルを反応させ、６-(２-チエニルスルファニル)ヘキサン酸エステルを合成した後、エステルを加水分解することにより化学式[５]に示す６-(２-チエニルスルファニル)ヘキサン酸を得る製造方法
3-3. チオフェン-２-チオールと６-ブロモ-１-ヘキサノールを反応させ、６-(２-チエニルスルファニル)-１-ヘキサノールを合成した後、酸化することにより、化学式[５]に示す６-(２-チエニルスルファニル)ヘキサン酸を得る製造方法
3-4. チオフェン-２-チオールと１,５-ジブロモペンタンを反応させ、２-[(５-ブロモペンチル)スルファニル]チオフェンを合成した後、金属マグネシウムを用いグリニヤール試薬を調整し、更に炭酸ガスを加えることにより、化学式[５]に示す６-(２-チエニルスルファニル)ヘキサン酸を得る製造方法
3-5. チオフェン-２-チオールとε-カプロラクトンを反応させ、化学式[５]に示す６-(２-チエニルスルファニル)ヘキサン酸を得る製造方法
【００７１】
なお、本発明の微生物の培養、本発明の微生物によるＰＨＡの生産と菌体への蓄積、本発明における菌体からのＰＨＡの回収、並びに、化学式[11]に示すカルボン酸誘導体の製造は、上記の方法に限定されるものではない。
【００７２】
以下に実施例を示す。なお、以下における「％」は特に標記した以外は重量基準である。
【００７３】
【実施例】
(実施例１)５-(２-チエニルスルファニル)吉草酸の合成
５-(２-チエニルスルファニル)吉草酸の合成は、チオフェン-２-チオールと５-ブロモ吉草酸エチルを反応させ、５-(２-チエニルスルファニル)吉草酸エチルを合成した後、末端のエチルエステルを加水分解する事によって得た。反応の詳細は図１及び図２に示す合成フローシートに従って行なった。チオフェン-２-チオール 24.3gから５-(２-チエニルスルファニル)吉草酸 39gを回収し、収率は 83％であった。得られた５-(２-チエニルスルファニル)吉草酸の構造決定は、1Ｈ-ＮＭＲによって行なった(ＦＴ-ＮＭＲ:Ｂruker ＤＰＸ 400；1Ｈ共鳴周波数: 400ＭＨz；測定核種:1Ｈ;使用溶媒:ＣＤＣl3；reference:キャピラリ封入ＴＭＳ/ＣＤＣl3；測定温度:室温)。1Ｈ-ＮＭＲスペクトルチャートを図３に示す。また、下記[６]に示す各Ｈ原子の帰属を、表１(1Ｈ-ＮＭＲ)に示す。
【００７４】
【化２０】
【００７５】
【表１】
(実施例２)６-(２-チエニルスルファニル)ヘキサン酸の合成
四つ口丸底フラスコに、240ｍLの脱水アセトンを入れ、炭酸カリウム 15.21g(0.11ｍol)を加え、窒素雰囲気下で攪拌した。この溶液にヨウ化ナトリウム 9.00g(0.06ｍol)、チオフェン-２-チオール 8.14g(0.07ｍol)を加えて、室温、窒素雰囲気下で十分攪拌した。更に、６-ブロモヘキサン酸エチル 13.39g(0.06 ｍol)を加え、65℃、19時間加熱還流した。
【００７６】
反応終了後、アセトンをロータリーエバポレーターにより留去し、クロロホルムにより抽出し、水を加えて分液し、有機相を無水硫酸マグネシウムにて脱水した後、クロロホルムをロータリーエバポレーターにより留去し、真空ポンプにより乾燥して、粗製の６-(２-チエニルスルファニル)ヘキサン酸エチルを 17.56gを得た。
【００７７】
ここで得られた粗製の６-(２-チエニルスルファニル)ヘキサン酸エチルは、精製せず次の加水分解反応を行なった。
【００７８】
得られたエステル粗製物 17.56gをエタノール-水(１:９(Ｖ/Ｖ))混合液 300ｍLに溶解し、10倍ｍol量の水酸化カリウムを加えて、氷浴下で４時間反応した。
【００７９】
この反応液を 0.1Ｍ塩酸水溶液約２L中に注いで酸性化させた。トルエンにより抽出を行ない、有機相を無水硫酸マグネシウムにより脱水した後、トルエンをロータリーエバポレーターにより留去した。ここで得られた粗製の６-(２-チエニルチオ)ヘキサン酸は、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒:クロロホルム:メタノール＝20：１)により精製を行ない、６-(２-チエニルスルファニル)ヘキサン酸を 7.21g得た。
【００８０】
また、全収率は、６-ブロモヘキサン酸エチル基準で 52.2％であった。
【００８１】
得られた６-(２-チエニルスルファニル)ヘキサン酸の構造決定は、1Ｈ-ＮＭＲによって行なった(ＦＴ-ＮＭＲ:Ｂruker ＤＰＸ 400；1Ｈ共鳴周波数: 400ＭＨz；測定核種:1Ｈ；使用溶媒:ＣＤＣl3；reference:キャピラリ封入ＴＭＳ/ＣＤＣl3；測定温度:室温)。1Ｈ-ＮＭＲスペクトルチャートを図４に示す。また、下記[７]に示す各Ｈ原子の帰属を、表２(1Ｈ-ＮＭＲ)に示す。
【００８２】
【化２１】
【００８３】
【表２】
【００８４】
(実施例３)
ポリペプトン(和光純薬)0.5％及び実施例１で得られた５-(２-チエニルスルファニル)吉草酸 0.1％を含むＭ９培地 200ｍLに、寒天プレート状のＹＮ２株のコロニーを植菌し、500ｍL容振とうフラスコで 30℃、30時間培養した。培養後、遠心分離により菌体を収穫し、メタノールで洗浄した後、凍結乾燥した。乾燥菌体を秤量後、クロロホルムを加え、室温(約23℃)で 72時間攪拌することによりポリマーを抽出した。ポリマーが抽出されたクロロホルムをろ過し、エバポレーターにより濃縮した後、冷メタノールで沈殿固化した部分を集め、減圧乾燥して、目的とするポリマーを得た。乾燥菌体の重量は 153ｍg、得られたポリマーの重量は 92ｍgであった。
【００８５】
得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ)により測定した(東ソー ＨＬＣ-8220 ＧＰＣ、カラム:東ソー ＴＳＫ-ＧＥＬ ＳuperＨＭ-Ｈ、溶媒:クロロホルム、ポリスチレン換算)。その結果、得られたポリマーはＭn＝196000，Ｍｗ＝570000 であった。
【００８６】
得られたポリマーの構造決定は、1Ｈ-ＮＭＲによって行なった(ＦＴ-ＮＭＲ:Ｂruker ＤＰＸ 400；1Ｈ共鳴周波数: 400ＭＨz；測定核種:1Ｈ；使用溶媒:ＣＤＣl3；reference:キャピラリ封入ＴＭＳ/ＣＤＣl3；測定温度:室温)。1Ｈ-ＮＭＲスペクトルチャートを図５に示す。また、下記[８]に示す各Ｈ及びＣ原子の帰属を、表３(1Ｈ-ＮＭＲ)に示す。
【００８７】
【化２２】
【００８８】
【表３】
【００８９】
1Ｈ-ＮＭＲの帰属の結果、３-ヒドロキシ-５-(２-チエニルスルファニル)吉草酸ユニットは全体の少なくとも 80％以上導入されていることが示された。
【００９０】
(実施例４)
グルコース 0.5％及び５-(２-チエニルスルファニル)吉草酸 0.05％を含むＭ９培地 200ｍLに、寒天プレート状のＹＮ２株のコロニーを植菌し、500ｍL容振とうフラスコで 30℃、45時間培養した。培養後、遠心分離により菌体を収穫し、ＮＨ4Ｃl成分を含まないＭ９培地に、グルコース 0.5％及び５-(２-チエニルスルファニル)吉草酸 0.05％を加えて調製した培地に菌体を移し、30℃、48時間培養した。培養後、遠心分離により菌体を収穫し、メタノールで洗浄した後、凍結乾燥した。乾燥菌体を秤量後、クロロホルムを加え、60℃で 24時間ポリマーを抽出した。ポリマーが抽出されたクロロホルムをろ過し、エバポレーターにより濃縮した後、冷メタノールで沈殿固化した部分を集め、減圧乾燥して、目的とするポリマーを得た。乾燥菌体の重量は 332ｍg、得られたポリマーの重量は 202ｍgであった。
【００９１】
得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ)により測定した(東ソー ＨＬＣ-8220 ＧＰＣ、カラム:東ソー ＴＳＫ-ＧＥＬ ＳuperＨＭ-Ｈ、溶媒:クロロホルム、ポリスチレン換算)。その結果、Ｍn＝212000,Ｍｗ＝564000であった。
【００９２】
得られたポリマーの構造決定は、1Ｈ-ＮＭＲによって行なった(ＦＴ-ＮＭＲ:Ｂruker ＤＰＸ 400；1Ｈ共鳴周波数: 400ＭＨz；測定核種:1Ｈ；使用溶媒:ＣＤＣl3；reference:キャピラリ封入ＴＭＳ/ＣＤＣl3；測定温度:室温)。その結果、３-ヒドロキシ-５-(２-チエニルスルファニル)吉草酸ユニットは全体の少なくとも 89％以上導入されていることが示された。
【００９３】
(実施例５)
グルコースの代わりにピルビン酸ナトリウムを用いた以外は実施例４と同様の方法でポリマーを得た。乾燥菌体の重量は 325ｍg、得られたポリマーの重量は 210ｍgであった。得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ)により測定した(東ソー ＨＬＣ-8220 ＧＰＣ、カラム:東ソー ＴＳＫ-ＧＥＬ ＳuperＨＭ-Ｈ、溶媒:クロロホルム、ポリスチレン換算)。その結果、Ｍn＝260000，Ｍｗ＝763000 であった。
【００９４】
得られたポリマーの構造決定は、1Ｈ-ＮＭＲによって行なった(ＦＴ-ＮＭＲ:Ｂruker ＤＰＸ 400；1Ｈ共鳴周波数: 400ＭＨz；測定核種:1Ｈ；使用溶媒:ＣＤＣl3；reference:キャピラリ封入ＴＭＳ/ＣＤＣl3；測定温度:室温)。その結果、３-ヒドロキシ-５-(２-チエニルスルファニル)吉草酸ユニットは全体の少なくとも 91％以上導入されていることが示された。
【００９５】
(実施例６)
菌株をＨ45株とした以外は実施例３と同様の方法でポリマーを得た。乾燥菌体の重量は 111ｍg、得られたポリマーの重量は 52ｍgであった。得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ)により測定した(東ソー ＨＬＣ-8220 ＧＰＣ、カラム:東ソー ＴＳＫ-ＧＥＬ ＳuperＨＭ-Ｈ、溶媒:クロロホルム、ポリスチレン換算)。その結果、Ｍn＝203000，Ｍｗ＝518000 であった。
【００９６】
得られたポリマーの構造決定は、1Ｈ-ＮＭＲによって行なった(ＦＴ-ＮＭＲ:Ｂruker ＤＰＸ 400；1Ｈ共鳴周波数: 400ＭＨz；測定核種:1Ｈ；使用溶媒:ＣＤＣl3；reference:キャピラリ封入ＴＭＳ/ＣＤＣl3；測定温度:室温)。その結果、３-ヒドロキシ-５-(２-チエニルスルファニル)吉草酸ユニットは全体の少なくとも 93％以上導入されていることが示された。
【００９７】
(実施例７)
菌株をＰ161株とした以外は実施例３と同様の方法でポリマーを得た。乾燥菌体の重量は 98ｍg、得られたポリマーの重量は 46ｍgであった。得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ)により測定した(東ソー ＨＬＣ-8220 ＧＰＣ、カラム:東ソー ＴＳＫ-ＧＥＬ ＳuperＨＭ-Ｈ、溶媒:クロロホルム、ポリスチレン換算)。その結果、Ｍn＝187000，Ｍｗ＝539000 であった。
【００９８】
得られたポリマーの構造決定は、1Ｈ-ＮＭＲによって行なった(ＦＴ-ＮＭＲ:Ｂruker ＤＰＸ 400；1Ｈ共鳴周波数: 400ＭＨz；測定核種:1Ｈ；使用溶媒:ＣＤＣl3；reference:キャピラリ封入ＴＭＳ/ＣＤＣl3；測定温度:室温)。その結果、３-ヒドロキシ-５-(２-チエニルスルファニル)吉草酸ユニットは全体の少なくとも 93％以上導入されていることが示された。
【００９９】
(実施例８)
５-(２-チエニルスルファニル)吉草酸のかわりに６-(２-チエニルスルファニル)ヘキサン酸を用いた以外は、実施例３と同様の方法でポリマーを得た。乾燥菌体の重量は 199ｍg、得られたポリマーの重量は 94ｍgであった。得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ)により測定した(東ソー ＨＬＣ-8220 ＧＰＣ、カラム:東ソー ＴＳＫ-ＧＥＬ ＳuperＨＭ-Ｈ、溶媒:クロロホルム、ポリスチレン換算)。その結果、Ｍn＝32000，Ｍｗ＝101000 であった。
【０１００】
続いて得られたポリマーの1Ｈ-ＮＭＲ測定を行なった(ＦＴ-ＮＭＲ:Ｂruker ＤＰＸ 400；1Ｈ共鳴周波数: 400ＭＨz；測定核種:1Ｈ；使用溶媒:ＣＤＣl3；reference:キャピラリ封入ＴＭＳ/ＣＤＣl3；測定温度:室温)。1Ｈ-ＮＭＲスペクトルチャートを図６に示す。また、下記[９][10]に示す各Ｈ原子の帰属を、表４(1Ｈ-ＮＭＲ)に示す。
【０１０１】
【化２３】
【０１０２】
【表４】
【０１０３】
※:ポリマーを構成する上記ユニットの比率に応じて積分値は増減する。
【０１０４】
その結果、３-ヒドロキシ-６-(２-チエニルスルファニル)ヘキサン酸ユニットは全体の 46％以上、３-ヒドロキシ-４-(２-チエニルスルファニル)酪酸ユニットは全体の 36％以上導入されていることが示された。
【０１０５】
(実施例９)
５-(２-チエニルスルファニル)吉草酸のかわりに６-(２-チエニルスルファニル)ヘキサン酸を用いた以外は、実施例４と同様の方法でポリマーを得た。乾燥菌体の重量は 235ｍg、得られたポリマーの重量は 119ｍgであった。得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ)により測定した(東ソー ＨＬＣ-8220 ＧＰＣ、カラム:東ソー ＴＳＫ-ＧＥＬ ＳuperＨＭ-Ｈ、溶媒:クロロホルム、ポリスチレン換算)。その結果、Ｍn＝29000，Ｍｗ＝82000 であった。
【０１０６】
得られたポリマーの構造決定は、1Ｈ-ＮＭＲによって行なった(ＦＴ-ＮＭＲ:Ｂruker ＤＰＸ 400；1Ｈ共鳴周波数: 400ＭＨz；測定核種:1Ｈ；使用溶媒:ＣＤＣl3；reference:キャピラリ封入ＴＭＳ/ＣＤＣl3；測定温度:室温)。その結果、３-ヒドロキシ-６-(２-チエニルスルファニル)ヘキサン酸ユニットは全体の 29％以上、３-ヒドロキシ-４-(２-チエニルスルファニル)酪酸ユニットは全体の 62％以上導入されていることが示された。
【０１０７】
(実施例10)
５-(２-チエニルスルファニル)吉草酸のかわりに６-(２-チエニルスルファニル)ヘキサン酸を用いた以外は、実施例５と同様の方法でポリマーを得た。乾燥菌体の重量は 215ｍg、得られたポリマーの重量は 114ｍgであった。得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ)により測定した(東ソー ＨＬＣ-8220 ＧＰＣ、カラム:東ソー ＴＳＫ-ＧＥＬ ＳuperＨＭ-Ｈ、溶媒:クロロホルム、ポリスチレン換算)。その結果、Ｍn＝37000，Ｍｗ＝109000 であった。
【０１０８】
得られたポリマーの構造決定は、1Ｈ-ＮＭＲによって行なった(ＦＴ-ＮＭＲ:Ｂruker ＤＰＸ 400；1Ｈ共鳴周波数: 400ＭＨz；測定核種:1Ｈ；使用溶媒:ＣＤＣl3；reference:キャピラリ封入ＴＭＳ/ＣＤＣl3；測定温度:室温)。その結果、３-ヒドロキシ-６-(２-チエニルスルファニル)ヘキサン酸ユニットは全体の 40％以上、３-ヒドロキシ-４-(２-チエニルスルファニル)酪酸ユニットは全体の 49％以上導入されていることが示された。
【０１０９】
(実施例11)
５-(２-チエニルスルファニル)吉草酸のかわりに６-(２-チエニルスルファニル)ヘキサン酸を用いた以外は、実施例６と同様の方法でポリマーを得た。乾燥菌体の重量は 118ｍg、得られたポリマーの重量は 33ｍgであった。得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ)により測定した(東ソー ＨＬＣ-8220 ＧＰＣ、カラム:東ソー ＴＳＫ-ＧＥＬ ＳuperＨＭ-Ｈ、溶媒:クロロホルム、ポリスチレン換算)。その結果、Ｍn＝26000，Ｍｗ＝59000 であった。
【０１１０】
得られたポリマーは、常法に従ってメタノリシスを行なったのち、ガスクロマトグラフィー質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法)で質量分析を行なった。その結果、３-ヒドロキシ-６-(２-チエニルスルファニル)ヘキサン酸ユニットと３-ヒドロキシ-４-(２-チエニルスルファニル)酪酸ユニットに加え、直鎖状アルキル鎖を側鎖に有する３-ヒドロキシアルカン酸ユニットのそれぞれのメチルエステル化物を同定した。ＧＣ-ＭＳにより同定したモノマーユニットの種類とエリア比(％)を表５に示す。
【０１１１】
【表５】
【０１１２】
続いて、得られたポリマーの構造決定を、1Ｈ-ＮＭＲによって行なった(ＦＴ-ＮＭＲ:Ｂruker ＤＰＸ 400；1Ｈ共鳴周波数: 400ＭＨz；測定核種:1Ｈ；使用溶媒:ＣＤＣl3；reference:キャピラリ封入ＴＭＳ/ＣＤＣl3；測定温度:室温)。その結果、３-ヒドロキシ-６-(２-チエニルスルファニル)ヘキサン酸ユニットは全体の 28％以上、３-ヒドロキシ-４-(２-チエニルスルファニル)酪酸ユニットは全体の 63％以上導入されていることが示された。
【０１１３】
(実施例12)
５-(２-チエニルスルファニル)吉草酸のかわりに６-(２-チエニルスルファニル)ヘキサン酸を用いた以外は、実施例７と同様の方法でポリマーを得た。乾燥菌体の重量は 93ｍg、得られたポリマーの重量は 21ｍgであった。得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ)により測定した(東ソー ＨＬＣ-8220 ＧＰＣ、カラム:東ソー ＴＳＫ-ＧＥＬ ＳuperＨＭ-Ｈ、溶媒:クロロホルム、ポリスチレン換算)。その結果、Ｍn＝23000，Ｍｗ＝46000 であった。
【０１１４】
得られたポリマーの構造決定は、1Ｈ-ＮＭＲによって行なった(ＦＴ-ＮＭＲ:Ｂruker ＤＰＸ 400；1Ｈ共鳴周波数: 400ＭＨz；測定核種:1Ｈ；使用溶媒:ＣＤＣl3；reference:キャピラリ封入ＴＭＳ/ＣＤＣl3；測定温度:室温)。その結果、３-ヒドロキシ-６-(２-チエニルスルファニル)ヘキサン酸ユニットは全体の 21％以上、３-ヒドロキシ-４-(２-チエニルスルファニル)酪酸ユニットは全体の 67％以上導入されていることが示された。
【０１１５】
【発明の効果】
本発明の方法により、新規物質５-(２-チエニルスルファニル)吉草酸、新規物質６-(２-チエニルスルファニル)ヘキサン酸、側鎖にチエニル基を含むポリヒドロキシアルカノエートおよびその製造方法が提供された。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１における５-(２-チエニルスルファニル)吉草酸の合成フローチャートの詳細を示す(１/２)。
【図２】実施例１における５-(２-チエニルスルファニル)吉草酸の合成フローチャートの詳細を示す(２/２)。
【図３】実施例１で得られた５-(２-チエニルスルファニル)吉草酸の1Ｈ-ＮＭＲスペクトルを示す。
【図４】実施例２で得られた６-(２-チエニルスルファニル)ヘキサン酸の1Ｈ-ＮＭＲスペクトルを示す。
【図５】実施例３で得られたポリマーの1Ｈ-ＮＭＲスペクトルを示す。
【図６】実施例８で得られたポリマーの1Ｈ-ＮＭＲスペクトルを示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は新規なポリエステルの一種であるポリヒドロキシアルカノエート(ＰＨＡ)に関する。また当該ＰＨＡを生産し体内に蓄積する微生物を用いた当該ＰＨＡの生産方法に関する。また当該微生物の培養に供せられる化合物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
これまで、多くの微生物がポリ-３-ヒドロキシ酪酸(ＰＨＢ)あるいはその他のＰＨＡを生産し、菌体内に蓄積することが報告されてきた(「生分解性プラスチックハンドブック」,生分解性プラスチック研究会編,(株)エヌ・ティー・エス,Ｐ178-197(1995))。これらのポリマーは従来のプラスチックと同様に、溶融加工等により各種製品の生産に利用することができる。さらに、生分解性であるがゆえに、自然界で微生物により完全分解されるという利点を有しており、従来の多くの合成高分子化合物のように自然環境に残留して汚染を引き起こすことがない。また、生体適合性にも優れており、医療用軟質部材等としての応用も期待されている。
【０００３】
このような微生物産生ＰＨＡは、その生産に用いる微生物の種類や培地組成、培養条件等により、様々な組成や構造のものとなり得ることが知られており、これまで主に、ＰＨＡの物性の改良という観点から、このような組成や構造の制御に関する研究がなされてきた。
【０００４】
《１》まず、３-ヒドロキシ酪酸(以下、３ＨＢと略す)をはじめとする比較的簡単な構造のモノマーユニットを重合させたＰＨＡの生合成としては、次のものが挙げられる。
【０００５】
(a)３ＨＢと３-ヒドロキシ吉草酸(以下３ＨＶ)を含むもの
特公平６-15604号公報、特公平７-14352号公報、特公平８-19227号公報等；特開平５-7492号公報
(b)３ＨＢと３-ヒドロキシヘキサン酸(以下３ＨＨx)を含むもの
特開平５-93049号公報、及び特開平７-265065号公報
(c)３ＨＢと４-ヒドロキシ酪酸(以下４ＨＢ)を含むもの
特開平９-191893号公報
(d)炭素数６から 12 までの３-ヒドロキシアルカノエートを含むもの
特許公報第2642937号
(e)単一の脂肪酸を炭素源とした生合成。生産物は(d)とほぼ同様
Ａppl.Ｅnviron.Ｍicrobiol,58(２),746(1992)
等が挙げられる。これらはいずれも微生物による炭化水素等のβ酸化や糖からの脂肪酸合成により合成された、いずれも側鎖にアルキル基を有するモノマーユニットからなるＰＨＡ、即ち、「usual ＰＨＡ」である。
【０００６】
《２》しかし、このような微生物産生ＰＨＡのより広範囲な応用、例えば機能性ポリマーとしての応用を考慮した場合、アルキル基以外の置換基を側鎖に導入したＰＨＡ「unusual ＰＨＡ」が極めて有用であることが期待される。置換基の例としては、芳香環を含むもの(フェニル基、フェノキシ基など)や、不飽和炭化水素、エステル基、アリル基、シアノ基、ハロゲン化炭化水素、エポキシドなどが挙げられる。これらの中でも、特に、芳香環を有するＰＨＡの研究が盛んになされている。
【０００７】
(a)フェニル基もしくはその部分置換体を含むもの
Ｍakroｍol.Ｃheｍ.,191，1957-1965(1990)及びＭacroｍolecules,24，5256-5260(1991)には、５-フェニル吉草酸を基質として、シュードモナス オレオボランス(Ｐseudoｍonas oleovorans)が３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸をユニットとして含むＰＨＡを生産することが報告されている。
【０００８】
Ｍacroｍolecules,29，1762-1766(1996)には、５-(４'-トリル)吉草酸を基質として、シュードモナス オレオボランス(Ｐseudoｍonas oleovorans)が３-ヒドロキシ-５-(４'-トリル)吉草酸をユニットとして含むＰＨＡを生産することが報告されている。
【０００９】
Ｍacroｍolecules,32，2889-2895(1999)には、５-(２',４'-ジニトロフェニル)吉草酸を基質として、シュードモナス オレオボランス(Ｐseudoｍonas oleovorans)が３-ヒドロキシ-５-(２',４'-ジニトロフェニル)吉草酸及び３-ヒドロキシ-５-(４'-ニトロフェニル)吉草酸をユニットとして含むＰＨＡを生産することが報告されている。
【００１０】
(b)フェノキシ基もしくはその部分置換体を含むもの
Ｍacroｍol.Ｃheｍ.Ｐhys.,195，1665-1672(1994)には、11-フェノキシウンデカン酸を基質として、シュードモナス オレオボランス(Ｐseudoｍonas oleovorans)が３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸と３-ヒドロキシ-９-フェノキシノナン酸のＰＨＡコポリマーを生産することが報告されている。
【００１１】
特許公報第2989175号には、３-ヒドロキシ-５-(モノフルオロフェノキシ)ペンタノエート(３Ｈ５(ＭＦＰ)Ｐ)ユニットあるいは３-ヒドロキシ-５-(ジフルオロフェノキシ)ペンタノエート(３Ｈ５(ＤＦＰ)Ｐ)ユニットからなるホモポリマー、少なくとも３Ｈ５(ＭＦＰ)Ｐユニットあるいは３Ｈ５(ＤＦＰ)Ｐユニットを含有するコポリマー；これらのポリマーを合成するシュードモナス・プチダ；シュードモナス属を用いた前記のポリマーの製造法に関する発明が開示されており、その効果として、置換基をもつ長鎖脂肪酸を資化して、側鎖末端が１から２個のフッ素原子が置換したフェノキシ基をもつポリマーを合成することができ、融点が高く良い加工性を保持しながら、立体規則性、撥水性を与えることができるとしている。
【００１２】
この様なフッ素基置換体以外に、シアノ基やニトロ基の置換体の研究もなされている。
【００１３】
Ｃan.Ｊ.Ｍicrobiol.,41，32-43(1995)及び Ｐolyｍer International,39，205-213(1996)には、シュードモナス オレオボランス(Ｐseudoｍonas oleovorans)ＡＴＣＣ 29347株及びシュードモナス プチダ(Ｐseudoｍonas putida)ＫＴ2442株を用いて、オクタン酸とp-シアノフェノキシヘキサン酸或いはp-ニトロフェノキシヘキサン酸を基質として、３-ヒドロキシ-p-シアノフェノキシヘキサン酸或いは３-ヒドロキシ-p-ニトロフェノキシヘキサン酸をモノマーユニットとして含むＰＨＡの生産が報告されている。
【００１４】
これらの報告は側鎖がアルキル基である一般的なＰＨＡとは異なり、いずれもＰＨＡの側鎖に芳香環を有しており、それに由来する物性を有するポリマーを得る上で有益である。
【００１５】
《３》また新たなカテゴリーとして、単に物性の変化に留まらず、側鎖に適当な官能基を有するＰＨＡを生産し、その官能基を利用して新たな機能を生み出そうとする研究も行なわれている。
【００１６】
例えばＭacroｍolecules,31，1480-1486(1996)及び、Journal of Ｐolyｍer Ｓcience:Ｐart Ａ:Ｐolyｍer Ｃheｍistry,36，2381-2387(1998)などでは、側鎖の末端にビニル基を持つユニットを含むＰＨＡを合成した後、酸化剤によりエポキシ化し、側鎖末端に反応性の高いエポキシ基を含むＰＨＡを合成出来たと報告されている。
【００１７】
またビニル基以外にも、高い反応性が期待されるチオエーテルを持つユニットを含むＰＨＡの合成例として、Ｍacroｍolecules,32，8315-8318(1999)においては、シュードモナス プチダ(Ｐseudoｍonas putida)27Ｎ01株が 11-(フェニルスルファニル)吉草酸を基質とし、３-ヒドロキシ-５-(フェニルスルファニル)吉草酸及び３-ヒドロキシ-７-(フェニルスルファニル)ヘプタン酸のＰＨＡコポリマーを生産することが報告されている。
【００１８】
【発明が解決しようとする課題】
これらのＰＨＡのうち、側鎖にＳ原子を有する３-ヒドロキシ-(フェニルスルファニル)アルカン酸ユニットを含むＰＨＡに関しては、その反応性の高さから、機能性ＰＨＡを開発していく上で今後益々研究がなされていくものと予想される。しかし、この様な種類のＰＨＡに関する研究は多くはなされてはおらず、それに関連する報告例は上記のみである。また得られたＰＨＡの側鎖に化学的な修飾を行なうことによって機能性ＰＨＡを開発していくためには、フェニル基よりも反応性の高い、たとえばチエニル基のような側鎖を有していることが望まれるが、これまでそれに関連したＰＨＡを生産したという報告例はない。
【００１９】
本発明の目的は、そのような問題に鑑み、新規なＰＨＡと、その生産方法を提供することにある。
【００２０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究の結果、以下のような発明に至った。即ち、本発明の第一は、化学式[１]に示されるユニットを有することを特徴とするポリヒドロキシアルカノエートそのものである。
【００２１】
【化１０】
また本発明のポリヒドロキシアルカノエートは、化学式[１]に示されるユニット以外のユニットが、化学式[２]で示される３-ヒドロキシアルカン酸ユニット及び化学式[１２]で示される３-ヒドロキシアルケン酸ユニットのうち、少なくとも一つを含むことを特徴とするポリヒドロキシアルカノエートである。
【００２３】
【化１１】
本発明により得られるポリヒドロキシアルカノエートは、数平均分子量が 10000 から 1000000 の範囲であるポリヒドロキシアルカノエートである。
【００２５】
また本発明により得られるポリヒドロキシアルカノエートは、化学式[１]、[２]及び[12]に示されるように不斉炭素を有しており多くの立体異性体が存在しうる。しかし本発明による生産方法では、微生物を用いてポリヒドロキシアルカノエートを生産していることから、ポリヒドロキシアルカノエートのモノマーユニットである３-ヒドロキシアルカン酸ユニットは、すべてＲ体となる特徴を有している。
【００２６】
また本発明の第二は、化学式[３]で示される化合物を含む培地中で微生物を培養することを特徴とする上記ポリヒドロキシアルカノエートの製造方法である。
【００２７】
【化１２】
またさらに詳しくは化学式[４]で示される５-(２-チエニルスルファニル)吉草酸、あるいは[５]で示される６-(２-チエニルスルファニル)ヘキサン酸を含む培地中で微生物を培養することを特徴とするポリヒドロキシアルカノエートの製造方法である。
【００２９】
【化１３】
【化１４】
本発明で用いられる化学式[11]に示すω-(２-チエニルスルファニル)アルカン酸の製造方法は、ブロモアルカン酸、ブロモアルカン酸エステル誘導体、ブロモアルカノール、ジブロモアルカン及びラクトンのいずれかと、チオフェン-２-チオールとを反応させる工程を有することを特徴とする。
【００３５】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明において利用される微生物、培養工程等について説明する。
【００３６】
(微生物)
本発明の方法で用いる微生物は、化学式[３]で示されるω-(２-チエニルスルファニル)アルカン酸を含む培地中で培養することにより化学式[１]に示されるユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを生産しうる微生物であれば如何なる微生物であってもよいが、その一例としては、シュードモナス(Ｐseudoｍonas)属に属する微生物が挙げられる。さらに詳しくは、微生物がシュードモナス・チコリアイ ＹＮ２株(Ｐseudoｍonas cichorii ＹＮ２；ＦＥＲＭ ＢＰ-7375)、シュードモナス・チコリアイ Ｈ45株(Ｐseudoｍonas cichorii Ｈ45、ＦＥＲＭ ＢＰ-7374)、シュードモナス・ジェッセニイ Ｐ161株(Ｐseudoｍonas jessenii Ｐ161、ＦＥＲＭ ＢＰ-7376)が挙げられる。これら３種の微生物は独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託されており、特願平11-371863号(特開2001-178484号公報)に記載されている微生物である。
【００３７】
以下にＹＮ２株、Ｈ45株及びＰ161株についての詳細を示す。
＜ＹＮ２株の菌学的性質＞
(１)形態学的性質
細胞の形と大きさ :桿菌、0.8μｍ×1.5〜2.0μｍ
細胞の多形性 :なし
運動性 :あり
胞子形成 :なし
グラム染色性 :陰性
コロニー形状 :円形、全縁なめらか、低凸状、
表層なめらか、光沢、半透明
(２)生理学的性質
カタラーゼ :陽性
オキシダーゼ :陽性
Ｏ/Ｆ試験 :酸化型(非発酵性)
硝酸塩の還元 :陰性
インドールの生成 :陽性
ブドウ糖酸性化 :陰性
アルギニンジヒドロラーゼ :陰性
ウレアーゼ :陰性
エスクリン加水分解 :陰性
ゼラチン加水分解 :陰性
β-ガラクトシダーゼ :陰性
Ｋing'sＢ寒天での蛍光色素産生:陽性
４％ＮaＣlでの生育 :陽性(弱い生育)
ポリ-β-ヒドロキシ酪酸の蓄積 :陰性(＊)
Ｔｗeen 80 の加水分解 :陽性
＊nutrient agar培養コロニーをズダンブラックで染色することで判定。
(３)基質資化能
ブドウ糖 :陽性
Ｌ-アラビノース :陽性
Ｄ-マンノース :陰性
Ｄ-マンニトール :陰性
Ｎ-アセチル-Ｄ-グルコサミン :陰性
マルトース :陰性
グルコン酸カリウム :陽性
n-カプリン酸 :陽性
アジピン酸 :陰性
dl-リンゴ酸 :陽性
クエン酸ナトリウム :陽性
酢酸フェニル :陽性
【００３８】
＜Ｈ45株の菌学的性質＞
(１)形態学的性質
細胞の形と大きさ :桿菌、0.8μｍ×1.0〜1.2μｍ
細胞の多形性 :なし
運動性 :あり
胞子形成 :なし
グラム染色性 :陰性
コロニー形状 :円形、全縁なめらか、低凸状、
表層なめらか、光沢、クリーム色
(２)生理学的性質
カタラーゼ :陽性
オキシダーゼ :陽性
Ｏ/Ｆ試験 :酸化型
硝酸塩の還元 :陰性
インドールの生成 :陰性
ブドウ糖酸性化 :陰性
アルギニンジヒドロラーゼ :陰性
ウレアーゼ :陰性
エスクリン加水分解 :陰性
ゼラチン加水分解 :陰性
β-ガラクトシダーゼ :陰性
Ｋing'sＢ寒天での蛍光色素産生:陽性
４％ＮaＣlでの生育 :陰性
ポリ-β-ヒドロキシ酪酸の蓄積 :陰性
(３)基質資化能
ブドウ糖 :陽性
Ｌ-アラビノース :陰性
Ｄ-マンノース :陽性
Ｄ-マンニトール :陽性
Ｎ-アセチル-Ｄ-グルコサミン :陽性
マルトース :陰性
グルコン酸カリウム :陽性
n-カプリン酸 :陽性
アジピン酸 :陰性
dl-リンゴ酸 :陽性
クエン酸ナトリウム :陽性
酢酸フェニル :陽性
【００３９】
＜Ｐ161株の菌学的性質＞
カタラーゼ :陽性
オキシダーゼ :陽性
Ｏ/Ｆ試験 :酸化型
硝酸塩の還元 :陽性
インドールの生成 :陰性
ブドウ糖酸性化 :陰性
アルギニンジヒドロラーゼ :陽性
ウレアーゼ :陰性
エスクリン加水分解 :陰性
ゼラチン加水分解 :陰性
β-ガラクトシダーゼ :陰性
Ｋing'sＢ寒天での蛍光色素産生:陽性
(３)基質資化能
ブドウ糖 :陽性
Ｌ-アラビノース :陽性
Ｄ-マンノース :陽性
Ｄ-マンニトール :陽性
Ｎ-アセチル-Ｄ-グルコサミン :陽性
マルトース :陰性
グルコン酸カリウム :陽性
n-カプリン酸 :陽性
アジピン酸 :陰性
dl-リンゴ酸 :陽性
クエン酸ナトリウム :陽性
酢酸フェニル :陽性
【００４０】
(培養工程)
本発明にかかるＰＨＡの製造方法に用いる微生物の通常の培養、例えば、保存菌株の作成、ＰＨＡの生産に必要とされる菌数や活性状態を確保するための増殖などには、用いる微生物の増殖に必要な成分を含有する培地を適宜選択して用いる。例えば、微生物の生育や生存に悪影響を及ぼすものでない限り、一般的な天然培地(肉汁培地、酵母エキスなど)や、栄養源を添加した合成培地など、いかなる種類の培地をも用いることができる。温度、通気、攪拌などの培養条件は、用いる微生物に応じて適宜選択する。
【００４１】
前記したようなＰＨＡ生産微生物を用いて、目的とするポリヒドロキシアルカノエートを製造するためには、ＰＨＡ生産用の原料として、該モノマーユニットに対応する、上記化学式[３]で示されるω-(２-チエニルスルファニル)アルカン酸と微生物の増殖用炭素源とを少なくとも含んだ無機培地などを用いることができる。ω-(２-チエニルスルファニル)アルカン酸は、培地あたり 0.01％から１％(ｗ/v)、更に好ましくは 0.02％から 0.2％の割合で含有していることが望ましい。
【００４２】
水溶性は必ずしも良好ではないが、本発明に示す微生物を用いれば、懸濁された状態であっても何ら問題は無い。また、場合によっては１-ヘキサデセンや n-ヘキサデカンのような溶媒に溶解或いは懸濁された形で培地中に含有されることも可能である。この場合、該溶媒の濃度は培地溶液に対して３％以下にすることが必要である。
【００４３】
増殖用炭素源としては、ポリペプトン、酵母エキスや肉エキスといった栄養素を用いることが可能であり、更に、糖類、ＴＣＡ回路中の中間体として生じる有機酸及びＴＣＡ回路から一段階ないしは二段階の生化学反応を経て生じる有機酸或いはその塩、アミノ酸或いはその塩、炭素数４から 12 の直鎖アルカン酸或いはその塩等から用いる菌株に対する基質としての有用性で適宜選択することができる。
【００４４】
これらのうち、糖類としては、グリセロアルデヒド、エリスロース、アラビノース、キシロース、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトースといったアルドース、
グリセロール、エリスリトール、キシリトール等のアルジトール、
グルコン酸等のアルドン酸、
グルクロン酸、ガラクツロン酸等のウロン酸、
マルトース、スクロース、ラクトース、セロビオースといった二糖等
から選ばれる１つ以上の化合物が好適に利用できる。
【００４５】
また、有機酸或いはその塩としては、ピルビン酸、オキサロ酢酸、クエン酸、イソクエン酸、ケトグルタル酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、乳酸などがその例であり、或いはその塩から選ばれる１つ以上の化合物が好適に利用できる。
【００４６】
また、アミノ酸或いはその塩としては、グルタミン酸、アスパラギン酸或いはその塩から選ばれる１つ以上の化合物が好適に利用できる。
【００４７】
これらの中では、ポリペプトンや糖類を用いるのが好ましく、また糖類の中ではグルコース、フルクトース、マンノースからなる群から選択される少なくとも一つであることがより好ましい。これらの基質は通常培地あたり 0.1％から５％(ｗ/v)、更に好ましくは 0.2％から２％の割合で含有していることが望ましい。
【００４８】
一例を挙げれば、Ｄ-グルコースを 0.1％から 5.0％程度、および、化学式[３]で示されるω-(２-チエニルスルファニル)アルカン酸を 0.01％から 1.0％程度含んだ無機培地等で培養し、対数増殖後期から定常期の時点で菌体を回収して所望のＰＨＡを抽出することができる。Ｄ-グルコースの代わりに同量の酵母エキスを与えても良い。
【００４９】
微生物にＰＨＡを生産・蓄積させる方法としては、一旦十分に増殖させて後に、塩化アンモニウムのような窒素源を制限した培地へ菌体を移し、目的ユニットの基質となる化合物を加えた状態で更に培養すると生産性が向上する場合がある。具体的には、前記の工程を複数段接続した多段方式の採用が挙げられる。例えば、Ｄ-グルコースを 0.1％から 5.0％程度、および、化学式[３]で示されるω-(２-チエニルスルファニル)アルカン酸を 0.01％から 1.0％程度含んだ無機培地等で対数増殖後期から定常期の時点まで培養し、菌体を遠心分離等で回収したのち化学式[３]で示されるω-(２-チエニルスルファニル)アルカン酸を 0.01％から 1.0％程度含んだ、窒素源を制限した、あるいはほとんど存在しない無機培地で更に培養する方法がある。
【００５０】
培養温度としては上記の菌株が良好に増殖可能な温度であれば良く、例えば 15〜40℃、好ましくは 20〜35℃、更に好ましくは 20℃から 30℃程度が適当である。
【００５１】
培養は液体培養、固体培養等該微生物が増殖し、ＰＨＡを生産する培養方法ならいかなる培養方法でも用いることができる。さらに、バッチ培養、フェドバッチ培養、半連続培養、連続培養等の種類も問わない。液体バッチ培養の形態としては、振とうフラスコによって振とうさせて酸素を供給する方法、ジャーファーメンターによる攪拌通気方式の酸素供給方法がある。
【００５２】
(培地)
上記の培養方法に用いる無機培地としては、リン源(例えば、リン酸塩など)、窒素源(例えば、アンモニウム塩、硝酸塩など)等、当該微生物の増殖に必要な成分を含んでいるものであればいかなるものでも良く、例えば、ＭＳＢ培地、Ｍ９培地等を挙げることができる。
【００５３】
本発明の一方法に用いた無機塩培地(Ｍ９培地)の組成を以下に示す。
【００５４】
[Ｍ９培地]
Ｎa2ＨＰＯ4 6.2g
ＫＨ2ＰＯ4 3.0g
ＮaＣl 0.5g
ＮＨ4Ｃl 1.0g
(培地１リットル中、pＨ7.0)
【００５５】
更に、良好な増殖及びＰＨＡの生産のためには、上記の無機塩培地に以下に示す微量成分溶液を 0.3％(v/v)程度添加する必要がある。
【００５６】
[微量成分溶液]
ニトリロ三酢酸:1.5g ；ＭgＳＯ4:3.0g ；
ＭnＳＯ4:0.5g ；ＮaＣl:1.0g ；ＦeＳＯ4:0.1g ；
ＣaＣl2:0.1g ；ＣoＣl2:0.1g ；ＺnＳＯ4:0.1g ；
ＣuＳＯ4:0.1g ；ＡlＫ(ＳＯ4)2:0.1g ；
Ｈ3ＢＯ3:0.1g ；Ｎa2ＭoＯ4:0.1g ；ＮiＣl2:0.1g
(溶液１リットル中、pＨ7.0)
【００５７】
(ＰＨＡの取得)
本発明にかかる培養液からのＰＨＡの取得には、通常行なわれている方法を適用することができる。ＰＨＡが培養液中に分泌される場合は、培養液からの抽出精製方法が、また、菌体に蓄積される場合は、菌体からの抽出精製方法が用いられる。例えば、微生物の培養菌体からのＰＨＡの回収には、通常行なわれているクロロホルムなどの有機溶媒による抽出が最も簡便ではあるが、クロロホルム以外にジオキサン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、アセトンが用いられる場合もある。また、有機溶媒が使用しにくい環境中においては、ＳＤＳ等の界面活性剤による処理、リゾチーム等の酵素による処理、ＥＤＴＡ等の薬剤による処理によってＰＨＡ以外の菌体成分を除去して、菌体内成分を除去することによってＰＨＡのみを回収する方法を採ることもできる。
【００５８】
(カルボン酸誘導体)
本発明で用いるカルボン酸誘導体は、化学式[３]で示されるω-(２-チエニルスルファニル)アルカン酸を用いる。この中で、化学式[11]で示されるω-(２-チエニルスルファニル)アルカン酸は、新規物質である。
【００５９】
【化１６】
【化１７】
(kは４から11の整数)
【００６２】
また、化学式[11]において、k＝ω(ωは４から 11 の整数)であるω-(２-チエニルスルファニル)アルカン酸の製造方法は、以下の製造方法がある。
【００６３】
1-1． チオフェン-２-チオールとω-ブロモアルカン酸を反応させて、化学式[11]に示すω-(２-チエニルスルファニル)アルカン酸を得る製造方法
1-2． チオフェン-２-チオールとω-ブロモアルカン酸エステルを反応させ、ω-(２-チエニルスルファニル)アルカン酸エステルを合成した後、エステルを加水分解することにより化学式[１１]に示すω-(２-チエニルスルファニル)アルカン酸を得る製造方法
1-3．チオフェン-２-チオールとω-ブロモ-１-アルカノールを反応させ、ω-(２-チエニルスルファニル)-１-アルカノールを合成した後、酸化することにより、化学式[11]に示すω-(２-チエニルスルファニル)アルカン酸を得る製造方法
1-4．チオフェン-２-チオールと１,ω-ジブロモアルカンを反応させ、２-[(ω-ブロモアルキル)スルファニル]チオフェンを合成した後、金属マグネシウムを用いグリニヤール試薬を調整し、更に炭酸ガスを加えることにより、化学式[11]に示すω-(２-チエニルスルファニル)アルカン酸を得る製造方法
1-5．チオフェン-２-チオールとラクトン類を反応させ、化学式[11]に示すω-(２-チエニルスルファニル)アルカン酸を得る製造方法
【００６４】
上記製造方法をさらに具体的に示す。
【００６５】
まず、化学式[４]に示す５-(２-チエニルスルファニル)吉草酸の製造方法を以下に示す。
【００６６】
【化１８】
2-1．チオフェン-２-チオールと５-ブロモ吉草酸を反応させ、化学式[４]に示す５-(２-チエニルスルファニル)吉草酸を得る製造方法
2-2．チオフェン-２-チオールと５-ブロモ吉草酸エステルを反応させ、５-(２-チエニルスルファニル)吉草酸エステルを合成した後、エステルを加水分解することにより化学式[４]に示す５-(２-チエニルスルファニル)吉草酸を得る製造方法
2-3．チオフェン-２-チオールと５-ブロモ-１-ペンタノールを反応させ、５-(２-チエニルスルファニル)-１-ペンタノールを合成した後、酸化することにより、化学式[４]に示す５-(２-チエニルスルファニル)吉草酸を得る製造方法
2-4．チオフェン-２-チオールと１,４-ジブロモブタンを反応させ、２-[(４-ブロモブチル)スルファニル]チオフェンを合成した後、金属マグネシウムを用いグリニヤール試薬を調整し、更に炭酸ガスを加えることにより、化学式[４]に示す５-(２-チエニルスルファニル)吉草酸を得る製造方法
2-5．チオフェン-２-チオールとδ-バレロラクトンを反応させ、化学式[４]に示す５-(２-チエニルスルファニル)吉草酸を得る製造方法
【００６８】
次に、化学式[５]に示す６-(２-チエニルスルファニル)ヘキサン酸の製造方法を以下に示す。
【００６９】
【化１９】
3-1. チオフェン-２-チオールと６-ブロモヘキサン酸を反応させ、化学式[５]に示す６-(２-チエニルスルファニル)ヘキサン酸を得る製造方法
3-2. チオフェン-２-チオールと６-ブロモヘキサン酸エステルを反応させ、６-(２-チエニルスルファニル)ヘキサン酸エステルを合成した後、エステルを加水分解することにより化学式[５]に示す６-(２-チエニルスルファニル)ヘキサン酸を得る製造方法
3-3. チオフェン-２-チオールと６-ブロモ-１-ヘキサノールを反応させ、６-(２-チエニルスルファニル)-１-ヘキサノールを合成した後、酸化することにより、化学式[５]に示す６-(２-チエニルスルファニル)ヘキサン酸を得る製造方法
3-4. チオフェン-２-チオールと１,５-ジブロモペンタンを反応させ、２-[(５-ブロモペンチル)スルファニル]チオフェンを合成した後、金属マグネシウムを用いグリニヤール試薬を調整し、更に炭酸ガスを加えることにより、化学式[５]に示す６-(２-チエニルスルファニル)ヘキサン酸を得る製造方法
3-5. チオフェン-２-チオールとε-カプロラクトンを反応させ、化学式[５]に示す６-(２-チエニルスルファニル)ヘキサン酸を得る製造方法
【００７１】
なお、本発明の微生物の培養、本発明の微生物によるＰＨＡの生産と菌体への蓄積、本発明における菌体からのＰＨＡの回収、並びに、化学式[11]に示すカルボン酸誘導体の製造は、上記の方法に限定されるものではない。
【００７２】
以下に実施例を示す。なお、以下における「％」は特に標記した以外は重量基準である。
【００７３】
【実施例】
(実施例１)５-(２-チエニルスルファニル)吉草酸の合成
５-(２-チエニルスルファニル)吉草酸の合成は、チオフェン-２-チオールと５-ブロモ吉草酸エチルを反応させ、５-(２-チエニルスルファニル)吉草酸エチルを合成した後、末端のエチルエステルを加水分解する事によって得た。反応の詳細は図１及び図２に示す合成フローシートに従って行なった。チオフェン-２-チオール 24.3gから５-(２-チエニルスルファニル)吉草酸 39gを回収し、収率は 83％であった。得られた５-(２-チエニルスルファニル)吉草酸の構造決定は、1Ｈ-ＮＭＲによって行なった(ＦＴ-ＮＭＲ:Ｂruker ＤＰＸ 400；1Ｈ共鳴周波数: 400ＭＨz；測定核種:1Ｈ;使用溶媒:ＣＤＣl3；reference:キャピラリ封入ＴＭＳ/ＣＤＣl3；測定温度:室温)。1Ｈ-ＮＭＲスペクトルチャートを図３に示す。また、下記[６]に示す各Ｈ原子の帰属を、表１(1Ｈ-ＮＭＲ)に示す。
【００７４】
【化２０】
【表１】
四つ口丸底フラスコに、240ｍLの脱水アセトンを入れ、炭酸カリウム 15.21g(0.11ｍol)を加え、窒素雰囲気下で攪拌した。この溶液にヨウ化ナトリウム 9.00g(0.06ｍol)、チオフェン-２-チオール 8.14g(0.07ｍol)を加えて、室温、窒素雰囲気下で十分攪拌した。更に、６-ブロモヘキサン酸エチル 13.39g(0.06 ｍol)を加え、65℃、19時間加熱還流した。
【００７６】
反応終了後、アセトンをロータリーエバポレーターにより留去し、クロロホルムにより抽出し、水を加えて分液し、有機相を無水硫酸マグネシウムにて脱水した後、クロロホルムをロータリーエバポレーターにより留去し、真空ポンプにより乾燥して、粗製の６-(２-チエニルスルファニル)ヘキサン酸エチルを 17.56gを得た。
【００７７】
ここで得られた粗製の６-(２-チエニルスルファニル)ヘキサン酸エチルは、精製せず次の加水分解反応を行なった。
【００７８】
得られたエステル粗製物 17.56gをエタノール-水(１:９(Ｖ/Ｖ))混合液 300ｍLに溶解し、10倍ｍol量の水酸化カリウムを加えて、氷浴下で４時間反応した。
【００７９】
この反応液を 0.1Ｍ塩酸水溶液約２L中に注いで酸性化させた。トルエンにより抽出を行ない、有機相を無水硫酸マグネシウムにより脱水した後、トルエンをロータリーエバポレーターにより留去した。ここで得られた粗製の６-(２-チエニルチオ)ヘキサン酸は、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒:クロロホルム:メタノール＝20：１)により精製を行ない、６-(２-チエニルスルファニル)ヘキサン酸を 7.21g得た。
【００８０】
また、全収率は、６-ブロモヘキサン酸エチル基準で 52.2％であった。
【００８１】
得られた６-(２-チエニルスルファニル)ヘキサン酸の構造決定は、1Ｈ-ＮＭＲによって行なった(ＦＴ-ＮＭＲ:Ｂruker ＤＰＸ 400；1Ｈ共鳴周波数: 400ＭＨz；測定核種:1Ｈ；使用溶媒:ＣＤＣl3；reference:キャピラリ封入ＴＭＳ/ＣＤＣl3；測定温度:室温)。1Ｈ-ＮＭＲスペクトルチャートを図４に示す。また、下記[７]に示す各Ｈ原子の帰属を、表２(1Ｈ-ＮＭＲ)に示す。
【００８２】
【化２１】
【表２】
(実施例３)
ポリペプトン(和光純薬)0.5％及び実施例１で得られた５-(２-チエニルスルファニル)吉草酸 0.1％を含むＭ９培地 200ｍLに、寒天プレート状のＹＮ２株のコロニーを植菌し、500ｍL容振とうフラスコで 30℃、30時間培養した。培養後、遠心分離により菌体を収穫し、メタノールで洗浄した後、凍結乾燥した。乾燥菌体を秤量後、クロロホルムを加え、室温(約23℃)で 72時間攪拌することによりポリマーを抽出した。ポリマーが抽出されたクロロホルムをろ過し、エバポレーターにより濃縮した後、冷メタノールで沈殿固化した部分を集め、減圧乾燥して、目的とするポリマーを得た。乾燥菌体の重量は 153ｍg、得られたポリマーの重量は 92ｍgであった。
【００８５】
得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ)により測定した(東ソー ＨＬＣ-8220 ＧＰＣ、カラム:東ソー ＴＳＫ-ＧＥＬ ＳuperＨＭ-Ｈ、溶媒:クロロホルム、ポリスチレン換算)。その結果、得られたポリマーはＭn＝196000，Ｍｗ＝570000 であった。
【００８６】
得られたポリマーの構造決定は、1Ｈ-ＮＭＲによって行なった(ＦＴ-ＮＭＲ:Ｂruker ＤＰＸ 400；1Ｈ共鳴周波数: 400ＭＨz；測定核種:1Ｈ；使用溶媒:ＣＤＣl3；reference:キャピラリ封入ＴＭＳ/ＣＤＣl3；測定温度:室温)。1Ｈ-ＮＭＲスペクトルチャートを図５に示す。また、下記[８]に示す各Ｈ及びＣ原子の帰属を、表３(1Ｈ-ＮＭＲ)に示す。
【００８７】
【化２２】
【表３】
1Ｈ-ＮＭＲの帰属の結果、３-ヒドロキシ-５-(２-チエニルスルファニル)吉草酸ユニットは全体の少なくとも 80％以上導入されていることが示された。
【００９０】
(実施例４)
グルコース 0.5％及び５-(２-チエニルスルファニル)吉草酸 0.05％を含むＭ９培地 200ｍLに、寒天プレート状のＹＮ２株のコロニーを植菌し、500ｍL容振とうフラスコで 30℃、45時間培養した。培養後、遠心分離により菌体を収穫し、ＮＨ4Ｃl成分を含まないＭ９培地に、グルコース 0.5％及び５-(２-チエニルスルファニル)吉草酸 0.05％を加えて調製した培地に菌体を移し、30℃、48時間培養した。培養後、遠心分離により菌体を収穫し、メタノールで洗浄した後、凍結乾燥した。乾燥菌体を秤量後、クロロホルムを加え、60℃で 24時間ポリマーを抽出した。ポリマーが抽出されたクロロホルムをろ過し、エバポレーターにより濃縮した後、冷メタノールで沈殿固化した部分を集め、減圧乾燥して、目的とするポリマーを得た。乾燥菌体の重量は 332ｍg、得られたポリマーの重量は 202ｍgであった。
【００９１】
得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ)により測定した(東ソー ＨＬＣ-8220 ＧＰＣ、カラム:東ソー ＴＳＫ-ＧＥＬ ＳuperＨＭ-Ｈ、溶媒:クロロホルム、ポリスチレン換算)。その結果、Ｍn＝212000,Ｍｗ＝564000であった。
【００９２】
得られたポリマーの構造決定は、1Ｈ-ＮＭＲによって行なった(ＦＴ-ＮＭＲ:Ｂruker ＤＰＸ 400；1Ｈ共鳴周波数: 400ＭＨz；測定核種:1Ｈ；使用溶媒:ＣＤＣl3；reference:キャピラリ封入ＴＭＳ/ＣＤＣl3；測定温度:室温)。その結果、３-ヒドロキシ-５-(２-チエニルスルファニル)吉草酸ユニットは全体の少なくとも 89％以上導入されていることが示された。
【００９３】
(実施例５)
グルコースの代わりにピルビン酸ナトリウムを用いた以外は実施例４と同様の方法でポリマーを得た。乾燥菌体の重量は 325ｍg、得られたポリマーの重量は 210ｍgであった。得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ)により測定した(東ソー ＨＬＣ-8220 ＧＰＣ、カラム:東ソー ＴＳＫ-ＧＥＬ ＳuperＨＭ-Ｈ、溶媒:クロロホルム、ポリスチレン換算)。その結果、Ｍn＝260000，Ｍｗ＝763000 であった。
【００９４】
得られたポリマーの構造決定は、1Ｈ-ＮＭＲによって行なった(ＦＴ-ＮＭＲ:Ｂruker ＤＰＸ 400；1Ｈ共鳴周波数: 400ＭＨz；測定核種:1Ｈ；使用溶媒:ＣＤＣl3；reference:キャピラリ封入ＴＭＳ/ＣＤＣl3；測定温度:室温)。その結果、３-ヒドロキシ-５-(２-チエニルスルファニル)吉草酸ユニットは全体の少なくとも 91％以上導入されていることが示された。
【００９５】
(実施例６)
菌株をＨ45株とした以外は実施例３と同様の方法でポリマーを得た。乾燥菌体の重量は 111ｍg、得られたポリマーの重量は 52ｍgであった。得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ)により測定した(東ソー ＨＬＣ-8220 ＧＰＣ、カラム:東ソー ＴＳＫ-ＧＥＬ ＳuperＨＭ-Ｈ、溶媒:クロロホルム、ポリスチレン換算)。その結果、Ｍn＝203000，Ｍｗ＝518000 であった。
【００９６】
得られたポリマーの構造決定は、1Ｈ-ＮＭＲによって行なった(ＦＴ-ＮＭＲ:Ｂruker ＤＰＸ 400；1Ｈ共鳴周波数: 400ＭＨz；測定核種:1Ｈ；使用溶媒:ＣＤＣl3；reference:キャピラリ封入ＴＭＳ/ＣＤＣl3；測定温度:室温)。その結果、３-ヒドロキシ-５-(２-チエニルスルファニル)吉草酸ユニットは全体の少なくとも 93％以上導入されていることが示された。
【００９７】
(実施例７)
菌株をＰ161株とした以外は実施例３と同様の方法でポリマーを得た。乾燥菌体の重量は 98ｍg、得られたポリマーの重量は 46ｍgであった。得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ)により測定した(東ソー ＨＬＣ-8220 ＧＰＣ、カラム:東ソー ＴＳＫ-ＧＥＬ ＳuperＨＭ-Ｈ、溶媒:クロロホルム、ポリスチレン換算)。その結果、Ｍn＝187000，Ｍｗ＝539000 であった。
【００９８】
得られたポリマーの構造決定は、1Ｈ-ＮＭＲによって行なった(ＦＴ-ＮＭＲ:Ｂruker ＤＰＸ 400；1Ｈ共鳴周波数: 400ＭＨz；測定核種:1Ｈ；使用溶媒:ＣＤＣl3；reference:キャピラリ封入ＴＭＳ/ＣＤＣl3；測定温度:室温)。その結果、３-ヒドロキシ-５-(２-チエニルスルファニル)吉草酸ユニットは全体の少なくとも 93％以上導入されていることが示された。
【００９９】
(実施例８)
５-(２-チエニルスルファニル)吉草酸のかわりに６-(２-チエニルスルファニル)ヘキサン酸を用いた以外は、実施例３と同様の方法でポリマーを得た。乾燥菌体の重量は 199ｍg、得られたポリマーの重量は 94ｍgであった。得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ)により測定した(東ソー ＨＬＣ-8220 ＧＰＣ、カラム:東ソー ＴＳＫ-ＧＥＬ ＳuperＨＭ-Ｈ、溶媒:クロロホルム、ポリスチレン換算)。その結果、Ｍn＝32000，Ｍｗ＝101000 であった。
【０１００】
続いて得られたポリマーの1Ｈ-ＮＭＲ測定を行なった(ＦＴ-ＮＭＲ:Ｂruker ＤＰＸ 400；1Ｈ共鳴周波数: 400ＭＨz；測定核種:1Ｈ；使用溶媒:ＣＤＣl3；reference:キャピラリ封入ＴＭＳ/ＣＤＣl3；測定温度:室温)。1Ｈ-ＮＭＲスペクトルチャートを図６に示す。また、下記[９][10]に示す各Ｈ原子の帰属を、表４(1Ｈ-ＮＭＲ)に示す。
【０１０１】
【化２３】
【表４】
※:ポリマーを構成する上記ユニットの比率に応じて積分値は増減する。
【０１０４】
その結果、３-ヒドロキシ-６-(２-チエニルスルファニル)ヘキサン酸ユニットは全体の 46％以上、３-ヒドロキシ-４-(２-チエニルスルファニル)酪酸ユニットは全体の 36％以上導入されていることが示された。
【０１０５】
(実施例９)
５-(２-チエニルスルファニル)吉草酸のかわりに６-(２-チエニルスルファニル)ヘキサン酸を用いた以外は、実施例４と同様の方法でポリマーを得た。乾燥菌体の重量は 235ｍg、得られたポリマーの重量は 119ｍgであった。得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ)により測定した(東ソー ＨＬＣ-8220 ＧＰＣ、カラム:東ソー ＴＳＫ-ＧＥＬ ＳuperＨＭ-Ｈ、溶媒:クロロホルム、ポリスチレン換算)。その結果、Ｍn＝29000，Ｍｗ＝82000 であった。
【０１０６】
得られたポリマーの構造決定は、1Ｈ-ＮＭＲによって行なった(ＦＴ-ＮＭＲ:Ｂruker ＤＰＸ 400；1Ｈ共鳴周波数: 400ＭＨz；測定核種:1Ｈ；使用溶媒:ＣＤＣl3；reference:キャピラリ封入ＴＭＳ/ＣＤＣl3；測定温度:室温)。その結果、３-ヒドロキシ-６-(２-チエニルスルファニル)ヘキサン酸ユニットは全体の 29％以上、３-ヒドロキシ-４-(２-チエニルスルファニル)酪酸ユニットは全体の 62％以上導入されていることが示された。
【０１０７】
(実施例10)
５-(２-チエニルスルファニル)吉草酸のかわりに６-(２-チエニルスルファニル)ヘキサン酸を用いた以外は、実施例５と同様の方法でポリマーを得た。乾燥菌体の重量は 215ｍg、得られたポリマーの重量は 114ｍgであった。得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ)により測定した(東ソー ＨＬＣ-8220 ＧＰＣ、カラム:東ソー ＴＳＫ-ＧＥＬ ＳuperＨＭ-Ｈ、溶媒:クロロホルム、ポリスチレン換算)。その結果、Ｍn＝37000，Ｍｗ＝109000 であった。
【０１０８】
得られたポリマーの構造決定は、1Ｈ-ＮＭＲによって行なった(ＦＴ-ＮＭＲ:Ｂruker ＤＰＸ 400；1Ｈ共鳴周波数: 400ＭＨz；測定核種:1Ｈ；使用溶媒:ＣＤＣl3；reference:キャピラリ封入ＴＭＳ/ＣＤＣl3；測定温度:室温)。その結果、３-ヒドロキシ-６-(２-チエニルスルファニル)ヘキサン酸ユニットは全体の 40％以上、３-ヒドロキシ-４-(２-チエニルスルファニル)酪酸ユニットは全体の 49％以上導入されていることが示された。
【０１０９】
(実施例11)
５-(２-チエニルスルファニル)吉草酸のかわりに６-(２-チエニルスルファニル)ヘキサン酸を用いた以外は、実施例６と同様の方法でポリマーを得た。乾燥菌体の重量は 118ｍg、得られたポリマーの重量は 33ｍgであった。得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ)により測定した(東ソー ＨＬＣ-8220 ＧＰＣ、カラム:東ソー ＴＳＫ-ＧＥＬ ＳuperＨＭ-Ｈ、溶媒:クロロホルム、ポリスチレン換算)。その結果、Ｍn＝26000，Ｍｗ＝59000 であった。
【０１１０】
得られたポリマーは、常法に従ってメタノリシスを行なったのち、ガスクロマトグラフィー質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ、島津ＱＰ-5050、ＥI法)で質量分析を行なった。その結果、３-ヒドロキシ-６-(２-チエニルスルファニル)ヘキサン酸ユニットと３-ヒドロキシ-４-(２-チエニルスルファニル)酪酸ユニットに加え、直鎖状アルキル鎖を側鎖に有する３-ヒドロキシアルカン酸ユニットのそれぞれのメチルエステル化物を同定した。ＧＣ-ＭＳにより同定したモノマーユニットの種類とエリア比(％)を表５に示す。
【０１１１】
【表５】
続いて、得られたポリマーの構造決定を、1Ｈ-ＮＭＲによって行なった(ＦＴ-ＮＭＲ:Ｂruker ＤＰＸ 400；1Ｈ共鳴周波数: 400ＭＨz；測定核種:1Ｈ；使用溶媒:ＣＤＣl3；reference:キャピラリ封入ＴＭＳ/ＣＤＣl3；測定温度:室温)。その結果、３-ヒドロキシ-６-(２-チエニルスルファニル)ヘキサン酸ユニットは全体の 28％以上、３-ヒドロキシ-４-(２-チエニルスルファニル)酪酸ユニットは全体の 63％以上導入されていることが示された。
【０１１３】
(実施例12)
５-(２-チエニルスルファニル)吉草酸のかわりに６-(２-チエニルスルファニル)ヘキサン酸を用いた以外は、実施例７と同様の方法でポリマーを得た。乾燥菌体の重量は 93ｍg、得られたポリマーの重量は 21ｍgであった。得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ)により測定した(東ソー ＨＬＣ-8220 ＧＰＣ、カラム:東ソー ＴＳＫ-ＧＥＬ ＳuperＨＭ-Ｈ、溶媒:クロロホルム、ポリスチレン換算)。その結果、Ｍn＝23000，Ｍｗ＝46000 であった。
【０１１４】
得られたポリマーの構造決定は、1Ｈ-ＮＭＲによって行なった(ＦＴ-ＮＭＲ:Ｂruker ＤＰＸ 400；1Ｈ共鳴周波数: 400ＭＨz；測定核種:1Ｈ；使用溶媒:ＣＤＣl3；reference:キャピラリ封入ＴＭＳ/ＣＤＣl3；測定温度:室温)。その結果、３-ヒドロキシ-６-(２-チエニルスルファニル)ヘキサン酸ユニットは全体の 21％以上、３-ヒドロキシ-４-(２-チエニルスルファニル)酪酸ユニットは全体の 67％以上導入されていることが示された。
【０１１５】
【発明の効果】
本発明の方法により、新規物質５-(２-チエニルスルファニル)吉草酸、新規物質６-(２-チエニルスルファニル)ヘキサン酸、側鎖にチエニル基を含むポリヒドロキシアルカノエートおよびその製造方法が提供された。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１における５-(２-チエニルスルファニル)吉草酸の合成フローチャートの詳細を示す(１/２)。
【図２】実施例１における５-(２-チエニルスルファニル)吉草酸の合成フローチャートの詳細を示す(２/２)。
【図３】実施例１で得られた５-(２-チエニルスルファニル)吉草酸の1Ｈ-ＮＭＲスペクトルを示す。
【図４】実施例２で得られた６-(２-チエニルスルファニル)ヘキサン酸の1Ｈ-ＮＭＲスペクトルを示す。
【図５】実施例３で得られたポリマーの1Ｈ-ＮＭＲスペクトルを示す。
【図６】実施例８で得られたポリマーの1Ｈ-ＮＭＲスペクトルを示す。
Claims (7)
- 化学式［１］に示されるユニットを有することを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート。
- 化学式［１］に示されるユニット以外のユニットが、化学式［２］及び化学式［１２］に示されるユニットの少なくとも一つを含む請求項１に記載のポリヒドロキシアルカノエート。
- 前記ポリヒドロキシアルカノエートのモノマーユニットは、すべてＲ体であることを特徴とする請求項１または２に記載のポリヒドロキシアルカノエート。
- 化学式［３］で示される化合物を含む培地中で微生物を培養することにより、化学式［１］に示されるユニットを有するポリヒドロキシアルカノエートを得る工程と、
培地中で培養した前記微生物から前記ポリヒドロキシアルカノエートを回収する工程を有することを特徴とするポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
- 前記培地は、ペプチド類、有機酸、アミノ酸、糖類のうち少なくとも１種類を含む請求項４に記載のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
- 前記微生物がシュードモナス(Pseudomonas)属に属する微生物である請求項４または５に記載のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
- 前記微生物がシュードモナス・チコリアイ ＹＮ２株(Pseudomonas cichorii ＹＮ２；ＦＥＲＭ ＢＰ−７３７５)、シュードモナス・チコリアイ Ｈ４５株(Pseudomonas cichorii Ｈ４５；ＦＥＲＭ ＢＰ−７３７４）、及び、シュードモナス・ジェッセニイ Ｐ１６１株(Pseudomonas jessenii Ｐ１６１、ＦＥＲＭ ＢＰ−７３７６)から選ばれた何れか１つ以上の株である請求項６に記載のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
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