JP2002306190A

JP2002306190A - 生体細胞からのポリ−３−ヒドロキシアルカン酸の分離・回収方法

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Publication number: JP2002306190A
Application number: JP2001111273A
Authority: JP
Inventors: Takeshi Imamura; 剛士今村; Takashi Kenmoku; 敬見目; Tomohiro Suzuki; 智博鈴木; Tsutomu Honma; 務本間; Takeshi Nomoto; 毅野本; Etsuko Sugawa; 悦子須川; Tetsuya Yano; 哲哉矢野
Original assignee: Canon Inc
Current assignee: Canon Inc
Priority date: 2001-04-10
Filing date: 2001-04-10
Publication date: 2002-10-22

Abstract

(57)【要約】【課題】分離操作を簡素化し、少ない工程数で安価に
ＰＨＡ含有生体細胞からからＰＨＡ以外の細胞構成成分
を効率よく除き、かつ酵素、酸、アルカリ等の薬品の残
留のおそれがない純度の高いＰＨＡを高収率で得るため
のＰＨＡの回収方法を提供する。【解決手段】ポリ-３-ヒドロキシアルカン酸を含有す
る生体細胞を破砕して破砕物を得る工程と、該破砕物を
水溶性画分と水不溶性画分とに分離する工程と、該水不
溶性画分を酸化剤で処理する工程とを含むことを特徴と
する生体細胞からのポリ-３-ヒドロキシアルカン酸の回
収方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ポリ-３-ヒドロキ
シアルカン酸を含有する生体細胞から、ポリ-３-ヒドロ
キシアルカン酸を回収する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ポリ-３-ヒドロキシ酪酸(ＰＨＢ)に代表
される微生物産生ポリエステル(ポリ-３-ヒドロキシア
ルカン酸；以下ＰＨＡと記載)は、石油由来の合成高分
子とは異なり、生物により分解されうるという特性を有
している。人類は長年にわたって合成高分子をプラスチ
ック等として使用してきたが、それらのプラスチックが
廃棄物となった場合、その分解されにくいという性質が
災いし、廃棄物処理場に蓄積される。また、焼却処理を
行なうことにより、ダイオキシンや環境ホルモン等の有
害物質の原因となり、環境汚染を引き起こすことが問題
となっている。一方、微生物産生ＰＨＡは生分解される
ことにより自然の物質循環に取り込まれるので、環境保
全を可能とするプラスチックとして利用することができ
る。また、医療用軟質部材としても今後有用視される可
能性を有している(特開平５-１５９号公報)。

【０００３】これまで、多くの細菌がＰＨＢ或いはその
他のヒドロキシアルカン酸とのコポリマーを菌体内に生
成・蓄積することが報告されてきた(「生分解性プラス
チックハンドブック」(生分解性プラスチック研究会
編；(株)エヌ・テイー・エス)、p178-197)。特に、アル
カリゲネス・ユウトロファスＨ16株(Ａlcaligenes eutr
ophus Ｈ16、ＡＴＣＣＮo.17699)及びその変異株はこ
れらポリマーの生産に関し詳細に研究されてきており、
基質となる炭素源を変化させることによって、３-ヒド
ロキシ酪酸(３ＨＢ)と３-ヒドロキシ吉草酸(３ＨＶ)の
共重合体または両者の各単位を共に含有成分とする共重
合体を様々な割合で生成することが開示されている(特
公平６-１５６０４号公報、特公平７-１４３５２号公
報、特公平８-１９２２７号公報等)。

【０００４】特許公報第２６４２９３７号には、シュー
ドモナス・オレオボランス(Pseudoｍonas oleovorans)
ＡＴＣＣ 29347株に、炭素源として非環状脂肪族炭化水
素を与えることにより、炭素数が６から 12 までの３-
ヒドロキシアルカン酸(３ＨＡ)をモノマーユニットとす
るポリエステルを生産することが開示されている。

【０００５】特開平５-７４４９２号公報には、メチロ
バクテリウム(Ｍethylobacteriuｍ)属、パラコッカス(P
aracoccus)属、アルカリゲネス属、シュードモナス属の
バクテリアを、炭素数３から７の第一アルコールに接触
させることにより３ＨＢと３ＨＶの共重合ポリエステル
を生産せしめる方法が開示されている。

【０００６】特開平５-９３０４９号公報、及び特開平
７-２６５０６５号公報には、アエロモナス・キャビエ
(Ａeroｍonas Ｃaviae)がオレイン酸やオリーブオイル
を炭素源として培養することにより３ＨＢと３-ヒドロ
キシヘキサン酸(３ＨＨx)の２成分共重合ポリエステル
を生産することが開示されている。

【０００７】特開平９-１９１８９３号公報には、コマ
モナス・アシドボランス(Ｃoｍaｍonas acidovorans)I
ＦＯ 13852株が、炭素源としてグルコン酸及び１,４ブ
タンジオールを用いた培養により、３ＨＢと４-ヒドロ
キシ酪酸(４ＨＢ)をモノマーユニットに持つポリエステ
ルを生産することが開示されている。

【０００８】この様な、微生物により生産・蓄積された
ＰＨＡは、通常ＰＨＡが溶解する有機溶剤、具体的には
クロロホルムやジクロロメタン等の塩素系有機溶剤で菌
体から抽出する方法が一般的である。しかし、大規模生
産を考えた場合、微生物菌体よりＰＨＡを分離するため
には、上記の方法では大量に塩素系有機溶剤を使用する
こととなり、現実的ではない。

【０００９】この様な観点から、微生物菌体等の生体細
胞からＰＨＡを分離する際に、有機溶剤を使用しない方
法が様々に研究されてきている。

【００１０】特開昭５７-１７４０９４号公報には、Ｐ
ＨＡ蓄積菌体を加温加圧し、圧力を開放することにより
菌体を破砕して微生物菌体からＰＨＡを分離する方法が
開示されている。

【００１１】米国特許４５６２２４５号公報及び特開昭
５９-２０５９９２号公報には、ＰＨＢ含有菌体をタン
パク質分解酵素組成物で細胞を消化し、ＰＨＢを分離す
る方法が開示されている。

【００１２】米国特許４９１０１４５号公報及び特開昭
６０-１４５０９７号公報には、タンパク質分解酵素や
界面活性剤等の細胞成分可溶化剤をもちいてＰＨＢを菌
体から分離する方法が開示されている。

【００１３】特開昭６３-２２６２９１号公報には、菌
体をスフェロプラストヘ変換し、音波振動処理によって
これらを破砕し、そして遠心分離したのちに形成される
最上層のＰＨＡを分離する方法が記載されている。

【００１４】特開平５-３３６９８２号公報には、ＰＨ
Ａ蓄積微生物の細胞質をプロテアーゼで溶解させ、界面
活性剤を用いて当該重合体及び/又は共重合体を精製す
る方法が開示されている。

【００１５】特開平７-３１４８７号公報、特開平７-３
１４８８号公報、特開平７-３１４８９号公報には、Ｐ
ＨＢ含有菌体をアルカリで処理し、ＰＨＢを分離する方
法、高温高圧処理し、ＰＨＢを分離する方法、両者を組
み合わせてＰＨＢを分離する方法が開示されている。

【００１６】特表平８-５０８８８１号公報には、ＰＨ
Ａ蓄積菌体をタンパク質分解酵素処理した後、適当なキ
レート剤で処理し、更に過酸化水素処理を行なうことで
ＰＨＡを菌体から分離する方法が開示されている。

【００１７】

【発明が解決しようとする課題】しかし、上記の処理で
は、操作が煩雑であること、酵素や酸、アルカリを使用
し残留の恐れがあること等から、更に簡便で純度の高い
ＰＨＡを回収し得る方法が求められていた。

【００１８】本発明の目的は、従来技術における上記の
ような課題を解決し、少ない工程数で安価にＰＨＡ含有
生体細胞からからＰＨＡ以外の細胞構成成分を効率よく
除き、かつ純度の高いＰＨＡを高収率で得るためのＰＨ
Ａの回収方法を提供することにある。

【００１９】なお、本発明における「生体細胞」とは、
微生物細胞のみならず、ＰＨＡ合成遺伝子を組み込むこ
とによりＰＨＡの生産が可能となった植物細胞等の高等
生物の細胞も含んでいる。

【００２０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、少ない工
程数で安価にＰＨＡ含有生体細胞からからＰＨＡ以外の
細胞構成成分を効率よく除き、かつ純度の高いＰＨＡを
高収率で得るためのＰＨＡの回収方法に関して鋭意検討
を行った結果、以下のような発明に至った。

【００２１】即ち本発明は、生体細胞からのポリ-３-ヒ
ドロキシアルカン酸の回収方法において、ポリ-３-ヒド
ロキシアルカン酸を含有する生体細胞を破砕して破砕物
を得る工程と、該破砕物を水溶性画分と水不溶性画分と
に分離する工程と、該水不溶性画分を酸化剤で処理する
工程とを含むことを特徴とする生体細胞からのポリ-３-
ヒドロキシアルカン酸の回収方法に関するものである。

【００２２】

【発明の実施の形態】本発明における、生体細胞を破砕
する工程では、超音波破砕法、ホモジナイザー法、圧力
破砕法、ビーズ衝撃法、摩砕法、擂潰法(ガラス粉末や
アルミナ粉末等の助剤を加えて乳鉢中ですり潰す方
法)、凍結融解法等の薬剤を使用しない方法を用いるこ
とが望ましい。更に再懸濁液を遠心分離等の方法により
固体成分と可溶成分を分離し、ＰＨＡ成分が含まれてい
る固体成分を過酸化化合物で処理する。

【００２３】本発明の方法で用いられる酸化剤は、過酸
化化合物或いは次亜塩素酸ナトリウムである。

【００２４】本発明の方法で用いる過酸化化合物は、過
酸化水素、過安息香酸・メタクロロ過安息香酸・過ギ酸
・過酢酸・モノペルオキシフタル酸・トリフルオロ過酢
酸等の有機過酸類やそのエステル類が挙げられるが、水
溶液として容易に用いることができること、反応が比較
的穏やかであること等から、過酸化水素、過炭酸ナトリ
ウムのいずれかを用いることが望ましい。過酸化水素は
処理後の残留物が無く回収されたＰＨＡの純度を高める
面から非常に有効であるが、ＰＨＡのユニット構造によ
っては酸化を受け構造が変化してしまう可能性がある場
合にはより温和な反応が進行する過炭酸ナトリウムを用
いることが望ましい。

【００２５】本発明の方法で用いる過酸化水素の濃度は
3.0％から 31.0％の範囲であることが望ましく、過炭
酸ナトリウムの濃度は 5.0％から 20.0％の範囲である
ことが望ましい。

【００２６】これら過酸化化合物の処理温度は 80℃か
ら 100℃の範囲であることが望ましく、それ以下である
と効果が薄く回収物の純度が低くなり、それ以上である
と構造が変化する恐れがある。また、反応時間は 30分
から２時間、更に望ましくは１時間程度が望ましい。

【００２７】また、処理後は水によって洗浄を行い、２
度程度攪拌、遠心分離を繰り返す必要がある。残留微量
金属が望ましくない場合には水は脱イオン水、蒸留水、
純水等の精製水を用いることが望ましい。過酸化化合物
として過炭酸ナトリウムを用いた場合には過炭酸ナトリ
ウムが残留しないように注意が必要である。遠心分離を
行う場合特に注意が必要なのは温度であり、０℃から 1
0℃程度、好ましくは０℃から５℃で行うことが望まし
い。

【００２８】本発明の方法で用いる次亜塩素酸ナトリウ
ムの濃度は４％(有効塩素濃度約 1.7％)から６％(有効
塩素濃度約 2.5％)程度が望ましく、処理温度は０℃か
ら 10℃であることが望ましい。この場合も過酸化化合
物を用いた場合と同様、処理後は水によって洗浄を行
い、２度程度攪拌、遠心分離を繰り返す必要がある。

【００２９】特に高純度のＰＨＡを得る必要があるとき
には、ＰＨＡの分離および洗浄操作の後に、例えば酵
素、酸化剤、界面活性剤またはこれらを組み合わせた化
学的処理等を行うこともできる。

【００３０】本発明の方法を用いることができる生体細
胞は、体内にＰＨＡを蓄積する生体細胞であればいかな
る生体細胞でもよく、主には微生物菌体、更にはＰＨＡ
生産遺伝子を組み換えた植物細胞等にも応用することが
できる。

【００３１】次に本発明を実施例によって更に詳しく説
明する。

【００３２】各実施例で用いたＭ９培地は下記の組成を
有するものである。Ｍ９培地組成(１リットル中): Ｎa₂ＨＰＯ₄ 6.2 g ＫＨ₂ＰＯ₄ 3.0 g ＮaＣl 0.5 g ＮＨ₄Ｃl 1.0 g 水残部 (pＨ 7.0) 本実施例で用いた微生物はラルストニア・ユウトロファ
ＴＢ64株(Ｒalstoniaeutropha ＴＢ64、特開２０００-
１６６５８７号公報に開示；経済産業省産業技術総合研
究所生命工学工業技術研究所に寄託((寄託番号:ＦＥＲ
ＭＢＰ-6933))、及びシュードモナス・オレオボランス
(Pseudoｍonas oleovorans)ＡＴＣＣ 29347(Ａｍerican
Ｔype Ｃulture Ｃollectionより分譲)である。

【００３３】

【実施例】[実施例１]リンゴ酸ナトリウム 0.1％を含有
するＭ９寒天培地上のＴＢ64株のコロニーを、500ｍL容
振とうフラスコ中の、リンゴ酸ナトリウム 0.5％を含有
するＭ９培地50ｍLに植菌し、30℃で振とう培養した。2
4時間後、培養液５ｍLを、窒素源であるＮＨ₄Ｃlのみ１
/10 濃度に調製したＭ９培地にリンゴ酸ナトリウム 0.5
％を含有した培地１Lに加え、同様に振とうして菌体に
ＰＨＢを蓄積させた。48時間後、ＰＨＢ蓄積菌体を遠心
分離によって収穫し、蒸留水 40ｍLに再懸濁して４等分
した(各 10ｍL)。これらを１から４まで番号をつけ、以
下の処理を行なった。

【００３４】１:対照:更に遠心分離後メタノールで洗浄
し、凍結乾燥して秤量した後クロロホルムで 60℃、24
時間抽出操作を行ない、抽出液をろ過、濃縮後、メタノ
ールで最沈殿させ、減圧乾燥して対照ポリマーを得た。

【００３５】２: 31％過酸化水素水(三菱瓦斯化学社
製；JIＳＫ-8230)を 40ｍL添加し、80℃で１時間処理
を行った。

【００３６】３: 懸濁液を蒸留水で 50ｍLにメスアッ
プし、フレンチプレス(大岳製作所社製:フレンチプレス
5501)を行った後、４℃、29400ｍ/s²(3000Ｇ)で 30分
間遠心分離を行った。その後更に蒸留水 40ｍLを加え、
４℃、29400ｍ/s²(3000Ｇ)で 30分間遠心分離を行って
洗浄した。

【００３７】４: ３と同様の操作を行った後、沈殿
部分を 10ｍLの蒸留水に懸濁し、31％過酸化水素水を 4
0ｍL添加し、80℃で１時間処理を行った。

【００３８】５: ３と同様の操作を行った後、沈殿
部分を 10ｍLの蒸留水に懸濁し、５ｍLの次亜塩素酸ナ
トリウム溶液(キシダ化学社製；次亜塩素酸ナトリウム
12％(有効塩素濃度５％以上)含有)を加えて、４℃で２
時間処理を行った。

【００３９】番号２から４は、遠心分離(４℃、29400ｍ
/s²(3000Ｇ)で 30分間)し、更に再度４℃に冷却した後
蒸留水 40ｍLを加え良く攪拌した後同条件で２回遠心分
離し、沈殿物を凍結乾燥して秤量した。

【００４０】以下に示す「回収率」及び「純度」を評価
する為、次の操作を行なった。

【００４１】凍結乾燥した１から５までの試料にクロロ
ホルム 30ｍLを加え、60℃で 24時間攪拌抽出操作を行
なった。ＰＨＢが抽出されたクロロホルム溶液を 0.45
μｍのＰＴＦＥフィルターでろ過し、ロータリーエバポ
レーターで濃縮して 10倍量のメタノールに注加しＰＨ
Ｂを沈殿、回収した。これらを減圧乾燥して秤量した。

【００４２】対照である１に対する、２から５の試料の
クロロホルム抽出によって得られたＰＨＢの質量比を
「回収率」とし、各試料の、クロロホルム抽出前の試料
に対するクロロホルム抽出によって得られたＰＨＢの質
量比を「純度」として、表１に示す。

【００４３】

【表１】

【００４４】回収率はそれほど変わらず、純度はフレン
チプレス処理とその後の過酸化水素処理を行った試料
(４)及び次亜塩素酸処理を行った試料(５)が良好であっ
た。

【００４５】得られたＰＨＢは、ゲルパーミエーション
クロマトグラフイー(ＧＰＣ；東ソーＨＬＣ-8020、カラ
ム:ポリマーラボラトリーＰＬgelＭIＸＥＤ-Ｃ(５μ
ｍ)、溶媒:クロロホルム、ポリスチレン換算)により分
子量を測定した。結果を表２に示す。

【００４６】

【表２】

【００４７】各試料の分子量の差は殆ど見受けられなか
った。

【００４８】[実施例２]n-ノナン酸 0.1％を含有するＭ
９寒天培地上のシュードモナス・オレオボランスのコロ
ニーを、n-ノナン酸 0.3％を含有するＭ９培地 50ｍLに
植菌し、30℃で振とう培養した。40時間後、培養液５ｍ
Lをn-ノナン酸 0.1％及び５-フェニル吉草酸 0.1％を含
有するＭ９培地１Lに加え、振とう培養した。更に 40時
間後、菌体を遠心分離によって収穫し、窒素源であるＮ
Ｈ₄Ｃlを含まず、n-ノナン酸 0.1％及び５-フェニル吉
草酸 0.1％を含有するＭ９培地１Lに再懸濁し、同様に
振とうして菌体に３-ヒドロキシノナン酸、３-ヒドロキ
シヘプタン酸、３-ヒドロキシ吉草酸、及び３-ヒドロキ
シ-５-フェノキシ吉草酸をユニットとして含むＰＨＡを
蓄積させた。40時間後、ＰＨＡ蓄積菌体を遠心分離によ
って収穫し、以下の処理を行なった。

【００４９】６:対照:更に遠心分離後メタノールで洗浄
し、凍結乾燥して秤量した後クロロホルムで 60℃、24
時間抽出操作を行ない、抽出液をろ過、濃縮後、メタノ
ールで最沈殿させ、減圧乾燥して対照ポリマーを得た。

【００５０】７: 31％過酸化水素水(三菱瓦斯化学社
製；JIＳＫ-8230)を 40ｍL添加し、80℃で１時間処理
を行った。

【００５１】８: 懸濁液を蒸留水で 50ｍLにメスア
ップし、フレンチプレス(大岳製作所社製:フレンチプレ
ス 5501)を行った後、４℃、29400ｍ/s²(3000Ｇ)で 30
分間遠心分離を行った。その後更に蒸留水 40ｍLを加
え、４℃、29400ｍ/s²(3000Ｇ)で30分間遠心分離を行っ
て洗浄した。

【００５２】９: ３と同様の操作を行った後、沈殿
部分を 10ｍLの蒸留水に懸濁し、31％過酸化水素水を 4
0ｍL添加し、80℃で１時間処理を行った。

【００５３】番号７から９は、遠心分離(４℃、29400ｍ
/s²(3000Ｇ)で 30分間)し、更に再度後蒸留水 40ｍLを
加え良く攪拌した後同条件で２回遠心分離し、沈殿物を
凍結乾燥して秤量した。

【００５４】これらの試料を実施例１と同様にクロロホ
ルム抽出し、回収率及び純度を求めた。結果を表３に示
す。

【００５５】

【表３】

【００５６】回収率はそれほど変わらず、純度はフレン
チプレス処理とその後の過酸化水素処理を行った試料
(９)が最も良好であった。

【００５７】得られたＰＨＢは、ゲルパーミエーション
クロマトグラフイー(ＧＰＣ；東ソーＨＬＣ-8020、カラ
ム:ポリマーラボラトリーＰＬgelＭIＸＥＤ-Ｃ(５μ
ｍ)、溶媒:クロロホルム、ポリスチレン換算)により分
子量を測定した。結果を表４に示す

【００５８】

【表４】

【００５９】各試料の分子量の差は殆ど見受けられなか
った。

【００６０】

【発明の効果】本発明の方法により、微生物等の生体細
胞内に蓄積されたポリヒドロキシアルカン酸を、簡便な
方法で、且つ本来の分子量をほぼ保ったままで、高い回
収率で回収することが可能となった。

フロントページの続き (72)発明者鈴木智博東京都大田区下丸子３丁目30番２号キヤノン株式会社内 (72)発明者本間務東京都大田区下丸子３丁目30番２号キヤノン株式会社内 (72)発明者野本毅東京都大田区下丸子３丁目30番２号キヤノン株式会社内 (72)発明者須川悦子東京都大田区下丸子３丁目30番２号キヤノン株式会社内 (72)発明者矢野哲哉東京都大田区下丸子３丁目30番２号キヤノン株式会社内Ｆターム(参考） 4B064 AD83 CA01 CA02 CE02 CE20 DA01 DA16

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】生体細胞からのポリ-３-ヒドロキシアル
カン酸の回収方法において、ポリ-３-ヒドロキシアルカン酸を含有する生体細胞を破
砕して破砕物を得る工程と、該破砕物を水溶性画分と水不溶性画分とに分離する工程
と、該水不溶性画分を酸化剤で処理する工程とを含むことを
特徴とする生体細胞からのポリ-３-ヒドロキシアルカン
酸の回収方法。
【請求項２】該生体細胞を破砕する工程を超音波破砕
法、ホモジナイザー法、圧力破砕法、ビーズ衝撃法、摩
砕法、擂潰法、凍結融解法のいずれかの方法で行う請求
項１に記載の方法。
【請求項３】該酸化剤が過酸化化合物である請求項１
または２に記載の方法。
【請求項４】該過酸化化合物が、過酸化水素、過炭酸
ナトリウムのいずれかである請求項３に記載の方法。
【請求項５】該酸化剤中の該過酸化水素の濃度が３.
０％から３１.０％の範囲である請求項４に記載の方
法。
【請求項６】該酸化剤中の該過炭酸ナトリウムの濃度
が５.０％から２０.０％の範囲である請求項４に記載の
方法。
【請求項７】該酸化剤で処理する処理温度が８０℃か
ら１００℃の範囲である請求項５または６のいずれかに
記載の方法。
【請求項８】該酸化剤が次亜塩素酸ナトリウムである
請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】該酸化剤中の該次亜塩素酸ナトリウムの
濃度が４％(有効塩素濃度約１.７％)から６％(有効塩素
濃度約２.５％)である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】次亜塩素酸ナトリウムで処理する処理温
度が０℃から１０℃である請求項９に記載の方法。