JPH057492A

JPH057492A - 共重合体の製造法

Info

Publication number: JPH057492A
Application number: JP3257030A
Authority: JP
Inventors: Tsuneo Yamane; 恒夫山根; Shunsaku Ueda; 俊策上田; Shigeki Imagawa; 茂樹今川; Yoshiharu Tokunaga; 義晴徳永; Toraichi Tawara; 寅一田原; Hiroyuki Yasaka; 博幸家坂; Sadaji Uragami; 貞治浦上
Original assignee: Mitsubishi Gas Chemical Co Inc
Current assignee: Mitsubishi Gas Chemical Co Inc
Priority date: 1990-09-14
Filing date: 1991-09-09
Publication date: 1993-01-19

Abstract

(57)【要約】【構成】ポリ−３−ヒドロキシブチレートを生産する能
力を有する細菌を、前段で該細菌を主として増殖させ、
後段で該細菌が利用することの出来る炭素源と３〜７の
第一アルコールとの混合物に接触させることにより、菌
体内にＤ−３−ヒドロキシブチレートおよびＤ−３−ヒ
ドロキシバリレートからなる共重合体を合成蓄積させ
る。【効果】Ｄ−３−ヒドロキシブチレートおよびＤ−３−
ヒドロキシバリレートからなる共重合体を大量かつ安価
に生産することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はＤ−３−ヒドロキシブチ
レート（以下Ｂ成分と記す）およびＤ−３−ヒドロキシ
バリレート（以下Ｖ成分と記す）を含有する共重合体の
製造法に関するものである。

【０００２】

【従来技術、発明が解決しようとする課題】ポリ−３−
ヒドロキシブチレート（以下ＰＨＢと記す）は、エネル
ギー貯蔵物質として数多くの微生物の菌体内に生成、蓄
積され、優れた生物分解性と生体適合性とを示す熱可塑
性高分子であることから、環境を保全する“クリーン”
プラスチックとして注目され、手術糸や骨折固定用材な
どの医用材料および医薬や農薬を徐々に放出する除放性
システムなどの多方面への応用が永年にわたり期待され
てきた。特に、近年、合成プラスチックが環境汚染や資
源環境の観点から深刻な社会問題になるに至り、ＰＨＢ
は石油に依存しないバイオポリマーとして注目されてい
る。しかしながら、ＰＨＢは、融点が熱分解温度に近
く、かつ脆いという欠点から実用化は困難である。

【０００３】そこで、これらの問題を解決すべく検討が
行われ、融点が低下し、軟らかくなり加工性が改善され
たＢ成分とＶ成分を含有する共重合体およびその製造法
が報告されている（特開昭５７−１５０９３公報、特開
昭５９−２２０１９２公報、特開昭６３−２６９９８９
公報、特開平１−６９６２２公報）。これらの公報に
は、Alcaligenes eutrophus の菌体を窒素あるいはリ
ンを制限するなどの方法による増殖制限条件下で、グル
コース−プロピオン酸、グルコース−イソ酪酸、グルコ
ース−吉草酸との混合物に接触させることにより共重合
体を製造する方法が記載されているが、これらの方法は
生産コストが高いなど工業的生産には不十分である。

【０００４】そこで本発明者らは、Ｂ成分とＶ成分を含
有する共重合体をより安定に、大量にかつ安価に製造す
る方法を鋭意研究し、本発明に到達した。

【０００５】

【課題を解決するための手段、作用】本発明者らは、Ｐ
ＨＢを生産する能力を有する細菌を用いて、Ｂ成分とＶ
成分を含有する共重合体を蓄積させる方法を鋭意検討し
たところ、これらの細菌を増殖制限条件下で当該細菌が
エネルギー源とすることの出来る炭素源と炭素数３〜７
の第一アルコールとの混合物または炭素数３〜７の第一
アルコールに接触させることにより菌体中にＢ成分とＶ
成分を含有する共重合体を蓄積させることが出来ること
を見いだし、本発明を完成した。

【０００６】すなわち、本発明はＰＨＢを生産する能力
を有する細菌を前段では、該菌体を主として増殖させ、
後段では増殖制限条件下にて当該細菌がエネルギー源と
することの出来る炭素源と炭素数３〜７の第一アルコー
ルとの混合物または炭素数３〜７の第一アルコールに接
触させることにより、該菌体中にＤ−３−ヒドロキシブ
チレートおよびＤ−３−ヒドロキシバリレートを含有す
る共重合体を合成蓄積させ、この共重合体を当該菌体か
ら取得することを特徴とする共重合体の製造法である。
本発明において、共重合体に含有されるＢ成分およびＶ
成分は、それぞれ次の式で示される。すなわち、Ｂ成分： −OCH(CH₃)CH₂CO − Ｖ成分： −OCH(C₂H₅)CH₂CO−

【０００７】本発明に使用される細菌は、ＰＨＢを生産
する能力を有する細菌であればよく、たとえば、シュー
ドモナス（Pseudomonas ）属、アルカリゲネス（Alcali
genes ）属、アチオロージウム（Athiorhodium）属、ア
ゾトバクター（Azotobacter）属、スピルリウム（Spiri
llum ）属、メチロバクテリウム（Methylobacterum）
属、ハイホミクロビウム（Hyphomicrobium）属、アンシ
ロバクター（Ancylobacter）属、キサントバクター（Xa
nthobacter）属、パラコッカス（Paracoccus）属、リゾ
ビウム（Rhizobium ）属、ブラディリゾビウム（Bradyr
hizobium）属、バチルス（ Bacillus）属、ノカルディ
ア（Nocardia）属、コリネバクテリウム（Corynebacter
ium ) 属、ロドコッカス（Rhodococcus ）属、アゾトバ
クター（Azotobacter ）属などが数多く存在する。代表
的な菌種としては、シュードモナスプチダ、シュード
モナスレモイグネイ、シュードモナスオレオボラン
ス、シュードモナスファシリス、アルカリゲネスユウ
トロファス、アルカリゲネスファセカリス、アルカリ
ゲネスルーランティ、アルカリゲネスラツス、アル
カリゲネスアクアマリヌス、アゾトバクタークロオ
コッカス、アゾトバクタービネランディ、メチロバク
テリウムエクストルクエンス、メチロバクテリウム
オルガノフィラム、メチロバクテリウムメソフィリカ
ム、メチロバクテリウムロウディナム、メチロバクテ
リウムラジオトレランス、メチロバクテリウムフジ
サワエンシス、メチロバクテリウムロオディシアナ
ム、メチロバクテリウムザットマニィ、ハイホミクロ
ビウムブルガレ、ハイホミクロビウムアエスティア
リイ、ハイホミクロビウムホーランディカム、ハイホ
ミクロビウムファシリス、ハイホミクロビウムザバ
ルジニィ、ハイホミクロビウムメチロボラム、アンシ
ロバクターアキュアティクス、キサントバクターオ
ートトロフィカス、キサントバクターフラバス、パラ
コッカスデニトリフィカンス、パラコッカスアルカ
リフィラス、パラコッカスアミノフィラス、パラコッ
カスアミノボランス、パラコッカスコクリー、リゾ
ビウムメリロティ、リゾビウムレグニノサラム、ブ
ラディリゾビウムジャポニィカム、バチルスメガテ
リウム、ノカルディアルシダ、コリネバクテリウム
ジオキシダンス、コリネバクテリウムヒドロカルボキ
ダンス、アゾトバクタークロオコッカム、アゾトバク
タービネランディーなどがある。

【０００８】本発明において、共重合体を含む菌体は、
主として菌体を製造することを目的とする第一工程（前
段）と、主として共重合体を菌体内に生成蓄積させるこ
とを目的とする第二工程（後段）との２工程により得る
ことが出来る。第一工程（前段）の菌体の製造は、細
菌を増殖させるための通常の培養法で行われ、使用する
細菌が増殖し得る培地および培養条件が用いられる。培
地として用いる炭素源としては、使用する細菌が資化し
うる物質であれば特に制限はないが、グルコース、シュ
ークロース、などの糖類、グリセロール、ソルビトー
ル、マンニトール等の糖アルコール、コハク酸、クエン
酸、酢酸などの有機酸、エタノール、メタノール、プロ
パノールなどのアルコール類、酵母エキス、糖蜜、コー
ンスチープリカー、麦芽エキスなどの炭素化合物および
有機窒素を含有する天然物質を用いることが出来る。窒
素源としては、使用する細菌が資化しうる物質であれば
特に制限はなく、アンモニア、尿素、硝酸あるいは酵母
エキス、麦芽エキス、などの有機窒素含有物が用いられ
る。その他、リン酸塩、カリウム塩、ナトリウム塩、硝
酸塩およびマグネシウム、鉄、カルシウム、亜鉛、マン
ガン、コバルト、銅、モリブデン等の金属塩が用いられ
る。培養条件は、使用する細菌により異なるが、一般的
には、温度は２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃
が、又、ｐＨは、６〜１０、好ましくは６．５〜９．５
が用いられる。このような条件で好気的に培養される
が、そのために空気、酸素を通気しかつ、酸素を培養液
に有効に溶け込ませるために必要に応じて攪拌する。一
般的には培養液中の溶存酸素濃度は１ｐｐｍ以上が好ま
しい。これらの条件をはずして培養した場合には、細菌
の増殖は相対的に悪くなるが、これらの条件をはずして
培養することを妨げない。

【０００９】第一工程で、細菌を培養し、菌体を得た
後、第二工程に移行する。第二工程では、細菌の増殖を
抑制する条件下で当該細菌がエネルギー源とすることの
出来る炭素源と炭素数３〜７の第一アルコールを添加
し、菌体中に共重合体を合成蓄積させる。細菌の増殖を
抑制する方法としては、培養液中の窒素、リン酸などの
炭素源以外の培地成分を制限する方法が用いられる。そ
のためには、第一工程で用いる培地を定め、炭素源を十
分供給し、温度、pHを調節しながら培養を行い、炭素源
以外の培地成分の欠乏により細菌の増殖が低下し、さら
に停止した後に、第二工程に移行する方法が用いられ
る。あるいは、第一工程の培養液から細菌菌体を、濾過
あるいは固液分離手段により菌体を分離し回収し、この
菌体を新たな培地に懸濁し、第二工程を行う方法があ
る。いずれの方法においても第二工程の培地組成を除く
培養条件は、第一工程の培養条件と同一でよく、又、細
菌によっては異ならせてもよい。第二工程に用いる当該
細菌がエネルギー源とすることの出来る炭素源として
は、第一工程で用いる炭素源と同一のもののほかに、た
とえ細菌が資化し増殖できない炭素源でも細菌がエネル
ギー源として利用できる炭素源であれば用いることが出
来る。第二工程に用いる炭素数３〜７の第一アルコール
としては、ｎ−プロパノール、ｎ−アミルアルコール
（ｎ−ペンチルアルコール）などおよびそれらの誘導体
がある。

【００１０】使用する細菌が、この炭素数３〜７の第一
アルコールをエネルギー源として利用できる場合は、炭
素源として炭素数３〜７の第一アルコールのみを用いる
こともできる。また、エネルギー源とすることの出来る
炭素源および炭素数３〜７の第一アルコールの使用量
は、共重合体を菌体内に生成蓄積させることが出来る量
であればよく、使用する細菌及び共重合体のＢ成分とＶ
成分の所望のモル比等により異なるが、それらの合計の
濃度として、培養液１Ｌあたり0.1 〜20ｇ程度、好まし
くは0.2 〜10ｇ程度とされる。

【００１１】なお、エネルギー源として、利用できる炭
素源と炭素数３〜７の第一アルコールの割合を変化させ
ることにより、共重合体中のＢ成分とＶ成分のモル比を
任意に変化させることが可能であり、一般的に炭素数３
〜７の第一アルコールの割合を高めることによりＶ成分
のモル比を大きくすることが出来る。共重合体を含む菌
体から共重合体を取得する方法としては、クロロホル
ム、ジクロロホルム、次亜鉛素酸ソーダ等による溶媒抽
出法あるいは、酵素による菌体の分解法など従来の方法
が用いられる。

【００１２】

【実施例】本発明を実施例により具体的に説明する。な
お、本発明は、これらの実施例に限定されるものではな
い。実施例１メチロバクテリウムフジサワエンス NCIB 12417、パ
ラコッカスデニトリフィカンス ATCC 17441 、アルカ
リゲネスユウトロファス ATCC 17687 、アルカリゲネ
スユウトロファスNCIB 11597 およびシュードモナス
レモイグネイATCC 17989 を用いて共重合体の合成を
行った。第一工程純水１L 当り、ポリペプトン 5ｇ、酵母エキス 5ｇ、グ
ルコース 5ｇを溶解し、pHが7.0 に調整された液50 mL
を坂口フラスコに入れ、120 ℃で20分間殺菌し、これを
培地とした。これに、前記と同様な培地を用いて30℃で
24時間前培養した各菌株の培養液をそれぞれ１容量％接
種し、30℃で往復振とう培養を２日間行った。培養液を
10,000 ×ｇで10分間遠心分離し、菌体を集菌した。

【００１３】第二工程純水１L 当り、K₂HPO₄ 1.6g 、Na₂HPO₄ 2.4g、MgSO₄・
7H₂O 0.2g 、CuSO₄・5H₂O 0.3 mg 、MnCl₂・ 4H₂O 3m
g、FeC₆H₅O₂・ XH₂O 18mg 、CaCl₂・ 2H₂O 18mg、ZnSO₄
・ 7H₂O 3mgを溶解し、pHが7.2 に調節され、120 ℃で20
分間殺菌した溶液25 mL づつを用いて、前段培養で得ら
れた菌体を各々２回洗浄し、さらに各々の菌体をそれぞ
れ上記組成の溶液50 mL に懸濁し、これにｎ−アミルア
ルコール0.15 mL （0.3 容量％）を添加し、30℃で往復
振とう培養を行った。後段培養を50時間行った後、遠心
分離機で集菌した後、2回純水で洗浄した後、菌体を60
℃で乾燥した。約40mgの乾燥菌体をスクリューキャップ
付き試験管に入れ、クロロホルム１mL、内部標準入りメ
タノール−硫酸溶液（内部標準：安息香酸184mg ／100
mL、硫酸3.5 容量％）１mLを加え、120 ℃で90分間加熱
処理し、菌体に含まれるポリマーの分解およびメチルエ
ステル化を行った。反応終了後純水を0.5 mL加え、激し
く攪拌した後、遠心分離を行い有機層を得た。この有機
層をガスクロマトグラフィーで分析することにより、Ｂ
成分含量およびＶ成分含量を求め、その合計から共重合
体の含量さらに共重合体中のＶ成分の割合を算出した。
また、第二工程の培養終了時の培養液に含まれるｎ−ア
ミルアルコール濃度およびpHを調べた。結果を表１に示
す。

【００１４】ガスクロマトグラフィー分析条件島津ガスクロGC-7AG カラム：Reoplex 400 chromosorb G AW-DMCS 10% （60〜80 mesh ）カラム濃度：160 ℃ 入口濃度：250 ℃

【００１５】

【表１】菌株共重合体含量Ｖ成分の割合培養終了後の培養液（重量％）（モル％）残存基質^{* *} ｐＨ（重量％）Ａ^* 12.3 2.4 0.12 5.0 Ｂ^* 8.7 76.4 0.14 5.0 Ｃ^* 15.0 77.5 0.0 6.7 Ｄ^* 16.8 29.9 0.0 6.7 Ｅ^* 3.2 0 0.22 6.8 ＊Ａ：メチロバクテリウムフジサワエンシス NCIB
12417 Ｂ：パラコッカスデニトリフィカンス ATCC 17441 Ｃ：アルカリゲナスユウトロファス ATCC 17697 Ｄ：アルカリゲナスユウトロファス NCIB 11597 Ｅ：シュードモナスレモイグネイ ATCC 17989 ＊＊ｎ−アミルアルコール

【００１６】実施例２第二工程におけるｎ−アミルアルコールの添加量を以下
のように変更した以外は、実施例１と同様にして共重合
体の合成を行った。ｎ−アミルアルコールを0.025 mL
（0.05容量％）を添加し、30℃で往復振とう培養を50時
間行った。12時間、25時間および37時間後に、培養液中
に含まれるｎ−アミルアルコール濃度を測定し、0.05容
量％になるようにｎ−アミルアルコールを添加した。な
お、各培養におけるｎ−アミルアルコールの添加量は、
メチロバクテリウムフジサワエンス NCIB 12417 の場
合、25時間後0.01 mL 、37時間後に0.005 mL、パラコッ
カスデニトリフィカンス ATCC17441 およびアルカリ
ゲネスユウトロファス ATCC 17697 の場合12時間、25
時間、37時間後にそれぞれ0.025 mL、アルカリゲネス
ユウトロファス NCIB 11597 の場合、12時間、25時間お
よび37時間後にそれぞれ0.015 mL、およびシュードモナ
スレモイグネイATCC 17989 の場合、37時間後に0.01
mL であった。結果を表２に示す。

【００１７】

【表２】表２菌株基質添^{* *} 共重合Ｖ成分培養終了後の培養液加総量体含量の割合残存基質^{* *} ｐＨ（容量％）（重量％）（モル％）（容量％）Ａ^* 0.08 9.2 9.7 0.05 6.6 Ｂ^* 0.20 24.2 88.1 0.0 6.6 Ｃ^* 0.20 12.8 56.9 0.02 6.7 Ｄ^* 0.14 7.0 47.9 0.05 6.6 Ｅ^* 0.07 46.8 59.8 0.03 6.7 ＊Ａ：メチロバクテリウムフジサワエンシス NCIB
12417 Ｂ：パラコッカスデニトリフィカンス ATCC 17441 Ｃ：アルカリゲナスユウトロファス ATCC 17697 Ｄ：アルカリゲナスユウトロファス NCIB 11597 Ｅ：シュードモナスレモイグネイ ATCC 17989 ＊＊いずれもｎ−アミルアルコール

【００１８】実施例３第二工程における炭素源としてグルコース0.25ｇ（0.5
重量％）およびｎ−アミルアルコール0.15 mL, 0.3容量
％）を添加した以外は、実施例１と同様にして共重合体
の合成を行った。結果を表３に示す。

【００１９】

【表３】表３菌株共重合Ｖ成分培養終了後の培養液体含量の割合ｎ−アミルグルコ−スｐＨ（重量％）（モル％）アルコール（重量％）（容量％）Ａ^* 12.4 0.6 0.0 0.37 4.7 Ｂ^* 13.3 74.1 0.13 0.43 5.0 Ｃ^* 9.9 62.2 0.01 0.20 5.5 Ｄ^* 1.2 31.8 0.24 0.03 6.6 Ｅ^* 35.6 48.2 0.23 0.26 6.7 ＊Ａ：メチロバクテリウムフジサワエンシス NCIB
12417 Ｂ：パラコッカスデニトリフィカンス ATCC 17441 Ｃ：アルカリゲナスユウトロファス ATCC 17697 Ｄ：アルカリゲナスユウトロファス NCIB 11597 Ｅ：シュードモナスレモイグネイ ATCC 17989

【００２０】実施例４第二工程におけるｎ−アミルアルコールの添加量を以下
のように変更した以外は、実施例３と同様にして共重合
体の合成を行った。グルコース0.25ｇ（0.5 重量％）お
よびｎ−アミルアルコールを0.025 （0.05容量％）を添
加し、30℃で往復振とう培養を50時間行った。12時間、
25時間および37時間後に、培養液中に含まれるｎ−アミ
ルアルコール濃度を測定し、0.05容量％になるようにｎ
−アミルアルコールを添加した。なお、各培養における
n −アミルアルコールの添加量は、メチロバクテリウム
フジサワエンシス NCIB 12417の場合、25時間後に0.
01 mL および37時間後に0.005 mL、パラコッカスデニ
トリフィカンス ATCC 17441の場合、12時間後、25時間
後および37時間後にそれぞれ0.025 mL、アルカリゲネス
ユウトロファス NCIB 17697 の場合、12時間に0.015
mL、25時間および37時間後にそれぞれ0.025 mL、アグカ
リゲネスユウトロファス NCIB 11597の場合、12時間
後に0.005 mL、25時間後および37時間後にそれぞれ0.01
5 mL、およびシュードモナスレモイグネイ ATCC 1798
9 の場合、37時間後に0.015 mLであった。結果を表４に
示す。

【００２１】

【表４】表４菌株ｎ−アミル共重合Ｖ成分培養終了後の培養液アルコール体含量の割合ｎ−アミルグルコ−スｐＨ添加総量（重量％）（モル％）アルコール（重量％）（容量％）（容量％）Ａ^* 0.08 12.0 12.0 0.05 0.46 6.6 Ｂ^* 0.20 34.1 50.1 0.0 0.26 6.0 Ｃ^* 0.18 12.1 55.9 0.0 0.19 5.1 Ｄ^* 0.12 16.8 29.9 0.05 0.09 6.6 Ｅ^* 0.08 17.4 47.4 0.04 0.23 6.7 ＊Ａ：メチロバクテリウムフジサワエンシス NCIB
12417 Ｂ：パラコッカスデニトリフィカンス ATCC 17441 Ｃ：アルカリゲナスユウトロファス ATCC 17697 Ｄ：アルカリゲナスユウトロファス NCIB 11597 Ｅ：シュードモナスレモイグネイ ATCC 17989

【００２２】実施例５アルカリゲネスユウトロファス NCIB 11597 およびシ
ュードモナスレモイグネイ ATCC 17989 を用いて共重
合体の合成を行った。第二工程においてｎ−アミルアル
コールの添加量を0.025 ｍＬ（0.05容量％）とした以外
は、実施例３と同様にして共重合体の合成を行った。結
果を表５に示す。

【００２３】

【表５】表５菌株共重合体含量Ｈ成分の割合（重量％）（モル％）Ｄ^* 33.4 15 Ｅ^* 36.8 26 ＊Ｄ：アルカリゲナスユウトロファス NCIB 11597 Ｅ：シュードモナスレモイグネイ ATCC 17989

【００２４】実施例６アルカリゲネスユートロファス ATCC 17697 を用いて
共重合体の合成を行った。第二工程でのｎ−アミルアル
コールの濃度の影響を調べた。第一工程は、実施例３と
同様に行い、第二工程はｎ−アミルアルコール濃度とし
て0 、0.05、0.1 、0.2 、0.3 、0.4 、0.5 容量％とし
た以外は、実施例３と同様に行い共重合体を合成した。
なお、第二工程培養終了後の培養液のpHも調べた。結果
を表６に示す。

【００２５】

【表６】表６ｎ−アミルアルコール共重合体含量Ｖ成分の割合培養終了後のｐＨ添加量（容量％）（重量％）（モル％） 0 0.9 0 6.7 0.05 1.4 58 6.6 0.1 4.9 60 6.6 0.2 11.4 64 6.5 0.3 17.5 68 6.6 0.4 4.8 90 6.5 0.5 1.0 51 5.7

【００２６】実施例７メチロバクテリウムエクストルクエンスＫ（微工研
寄第8395）（この菌株は、プロトモナスエクストル
クエンスとして寄託されているが、インターナショナル
・ジャーナル・オブ・システマティック・バクテリオロ
ジー、第35巻、第209 頁、1985年によりプロトモナス
エクストルクエンスは、メチロバクテリウムエクスト
ルクエンスに変更になったため、メチロバクテリウム
エクストルクエンスと記す）を用いて共合体の合成を行
った。

【００２７】第二工程における炭素源としてグルコー
ス0.25ｇ（0.5 重量％）およびｎ−アミルアルコール0.
025 mL（0.05容量％）2 回（最初および培養25時間
後）、フラクトース0.25ｇ（0.5 重量％）およびｎ−
アミルアルコール0.025mL（0.05容量％）、シューク
ロース 0.25 ｇ（0.5 重量％）およびｎ−アミルアルコ
ール0.025 mL（0.05容量％）をそれぞれ用いた以外は、
実施例３と同様に行った。結果を表７に示す。

【００２８】

【表７】表７炭素源共重合体含量Ｖ成分の割合培養終了後のｐＨ（重量％）（モル％） ^* 13.3 78.6 5.5 ^* 31.6 43.0 5.9 ^* 8.7 82.3 5.7 ^* 13.4 58.6 4.6 ＊実施例７の文章中に記載

【００２９】実施例８パラコッカスデニトリフィカンス ATCC 17441を用い
て共重合体の合成を行った。第二工程における炭素源と
してグルコース0.25ｇ（0.5 重量％）およびｎ−アミ
ルアルコール0.025 mL（0.05容量％）２回（最初および
培養25時間後）フラクトース0.25ｇ（0.5 重量％）お
よびｎ−アミルアルコール0.025 mL（0.05容量％）シ
ュークロース0.25ｇ（0.5 重量％）およびｎ−アミルア
ルコール0.025 mL（0.05容量％）をそれぞれ用いた以外
は、実施例３と同様に行った。結果を表８に示す。

【００３０】

【表８】表８炭素源共重合体含量Ｖ成分の割合培養終了後のｐＨ（重量％）（モル比） ^* 49.1 47.1 6.5 ^* 40.9 68.1 6.5 ^* 49.8 43.5 6.4 ＊実施例８の文章中に記載

【００３１】実施例９メチロバクテリウムエクストルクエンスＫ（微工研
寄第8395）、メチロバクテリウムオルガノフィラム A
TCC 27886 、メチロバクテリウムフジサワエンス NCI
B 12417 、ハイホミクロビウムメチロボラム IFO 141
80、キサントバクターオートトロフィカス DSM 432お
よびパラコッカスデニトリフィカンスATCC 17441を用
いて共重合体の合成を行った。

【００３２】第一工程純粋１L 当り、(NH₄)₂SO₄ 3.0g、KH₂PO₄ 1.4g 、Na₂HPO
₄ 3.0g、MgSO₄・7H₂O 0.2g 、酵母エキス 0.2ｇ、NaHC
O₃ 0.3g 、CuSO₄・ 5H₂O0.3mg、ZnSO₄・ 7H₂O、MnCl₂・
4H₂O 3mg 、FeC₆H₅O₂・ XH₂O 18mg 、CaCl₂・ 2H₂O 18
mg 、ZnSO₄・ 7H₂O 3mgおよびメタノール10 mL を溶解
し、pHが7.2 に調整された液50 mL を坂口フラスコに入
れ、120 ℃で20分間殺菌し、これを培地とした。これに
前記と同様な培地を用いて30℃で3 日間前培養した各菌
株の培養液をそれぞれ１容量％接種し、30℃で往復振と
う培養を2 日間行った。培養液を10,000×ｇで10分間遠
心分離し、菌体を集菌した。第二工程純水１L 当り、K₂HPO₄ 1.6g 、Na₂HPO₄ 2.4g、MgSO₄・
7H₂O 0.2g 、CuSO₄・ 5H₂O 0.3 mg 、MnCl₂・ 4H₂O 3m
g、FeC₆H₅O₂・ XH₂O 18mg 、CaCl₂・ 2H₂O 18mg 、ZnSO
₄・ 7H₂O 3mgを溶解し、pHが7.2 に調節され、120 ℃で
20分間殺菌した溶液25 mL づつを用いて、第一工程で得
られた菌体を各々2 回洗浄し、さらに各々の菌体をそれ
ぞれ上記組成の溶液50ｍＬに懸濁し、これにメタノール
0.15ｍＬ（0.3容量％）およびｎ−アミルアルコール0.0
25 mL（0.05容量％）を添加し、30℃で往復振とう培養
を行った。振とう培養を25時間行った後、再度メタノー
ル0.15mL およびｎ−アミルアルコール 0.025 mLを添
加し、さらに25時間往復振とう培養を行った。第二工程
の培養を50時間行った後、菌体中に含まれる共重合体の
含量さらに共重合体中のＶ成分の割合を実施例１と同様
な方法で求めた。また、第二工程終了後の培養液のpHも
調べた。結果を表９に示す。

【００３３】

【表９】表９菌株共重合体含量Ｖ成分の割合培養終了後のｐＨ（重量％）（モル％）Ａ 17.7 38 6.7 Ｂ 53.2 71 6.6 Ｆ 29.7 32 5.8 Ｇ 7.5 17 5.0 Ｈ 12.5 3 4.1 Ｉ 16.2 12 6.5 ＊Ａ：メチロバクテリウムフジサワエンシス NCIB
12417 Ｂ：パラコッカスデニトリフィカンス ATCC 17441 Ｆ：メチロバクテリウムエクストロクエンスＫ（微
工研寄第8395）Ｇ：メチロバクテリウムオルガノフィラム ATCC 278
86 Ｈ：ハイホミクロビウムメチロボラム IFO 14180 Ｉ：キサントバクターオートトロフィカス DSM 432

【００３４】実施例１０メチロバクテリウムエクストルクエンスＫを用い
て、共重合体の合成を行った。第二工程でのｎ−アミル
アルコール添加量の影響を調べた。第一工程は、実施例
１と同様に行い、第二工程は、ｎ−アミルアルコール濃
度として、0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10容量％と
し、25時間後に再度同量のｎ−アミルアルコールを添加
した以外は、実施例１と同様に行い共重合体を合成し
た。結果を表１０に示す。

【００３５】

【表１０】表１０ｎ−アミルアルコール共重合体含量Ｖ成分の割合培養終了後のｐＨ濃度（容量％）（重量％）（モル％） 0 24.4 0 6.8 0.02 17.4 3 6.5 0.04 23.5 33 6.6 0.06 29.7 32 5.8 0.08 28.7 37 5.3 0.10 25.9 29 4.9

【００３６】実施例１１メチロバクテリウムエクストルクエンスＫを用いて
共重合体の合成を行った。第一工程純粋１L 当り、(NH₄)₂SO₄ 3.0g、K₂HPO₄ 1.4g 、Na₂HPO
₄ 3.0g、MgSO₄・ 7H₂O0.2g 、酵母エキス 0.2g 、CuSO
₄・ 5H₂O 0.5mg、MnCl₂・ 4H₂O 5mg、FeC₆H₅O₂・ XH₂O 3
0mg 、CaCl₂・2H₂O 30mg 、ZnSO₄・ 7H₂O 5mgおよびメ
タノール12mLを溶解し、pHが7.2 に調整された液200 L
を１L 容三角フラスコに入れ、120 ℃で20分間殺菌し、
これを培地とした。これに前記と同様な培地を用いて30
℃で３日間前培養した当該細菌の培養液を１容量％接種
し、30℃で回転振とう培養を54時間行い、対数増殖期が
終了した後、培養液を10,000 Xgで10分間遠心分離し、
菌体を集菌した。

【００３７】第二工程純水１L 当り、K₂HPO₄ 1.6g 、Na₂HPO₄ 2.4g、MgSO₄・
7H₂O 0.2g 、(NH₄)₂SO₄ 0.8g、CuSO₄・ 5H₂O 0.3 mg 、
MnCl₂・ 4H₂O 3mg、FeC₆H₅O₂・ XH₂O 18mg 、CaCl₂・ 2H
₂O 18mg 、ZnSO₄・ 7H₂O 3mgを溶解し、pHが7.2 に調節
され、120 ℃で20分間殺菌した溶液100 mLを用いて、第
一工程で得られた菌体を2 回洗浄し、さらに上記組成の
溶液200 mLに懸濁し、これにｎ−アミルアルコールを1g
（0.5 重量％）およびメタノールを1g（0.5 重量％）添
加し、30℃で回転振とう培養を48時間行った。培養期間
中にメタノール濃度を測度し、0.25重量％以下になった
場合、メタノールを1g（0.25重量％相当）添加した。な
お、途中の添加回数は、3回であった。培養終了後、菌
体中に含まれる共重合体、Ｂ成分およびＶ成分の含量お
よび共重合体中のＶ成分の割合を実施例１と同様な方法
で求めた。その結果、共重合体の含量は31.5重量％、Ｂ
成分の含量は14.1重量％、Ｖ成分の含量は17.4重量％で
あり、共重合体中のＶ成分の割合は、51モル％であっ
た。

【００３８】

【発明の効果】本発明によりＤ−３−ヒドロキシブチレ
ートおよびＤ−３−ヒドロキシバリレートからなる共重
合体を大量かつ安価に生産することが出来る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 7/62 Ｃ１２Ｒ 1:065） (Ｃ１２Ｐ 7/62 Ｃ１２Ｒ 1:41） (Ｃ１２Ｐ 7/62 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｐ 7/62 Ｃ１２Ｒ 1:365） (Ｃ１２Ｐ 7/62 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 7/62 Ｃ１２Ｒ 1:37） (72)発明者徳永義晴新潟県新潟市太夫浜字新割182番地三菱瓦斯化学株式会社新潟研究所内 (72)発明者田原寅一新潟県新潟市太夫浜字新割182番地三菱瓦斯化学株式会社新潟研究所内 (72)発明者家坂博幸新潟県新潟市太夫浜字新割182番地三菱瓦斯化学株式会社新潟研究所内 (72)発明者浦上貞治東京都千代田区丸の内二丁目５番２号三菱瓦斯化学株式会社本社内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ポリ−３−ヒドロキシブチレートを生産す
る能力を有する細菌を、前段で該菌体を主として増殖さ
せ、後段で該細菌がエネルギー源とすることの出来る炭
素源と炭素数３〜７の第一アルコールとの混合物または
炭素数３〜７の第一アルコールに接触させることによ
り、該菌体内にＤ−３−ヒドロキシブチレートおよびＤ
−３−ヒドロキシバリレートからなる共重合体を合成蓄
積させ、この共重合体を当該菌体から取得することを特
徴とする共重合体の製造法。
【請求項２】後段で用いる炭素数３〜７の第一アルコー
ルとしてｎ−アミルアルコールもしくはその誘導体を用
いることを特徴とする請求項１に記載の方法。