JPH0484890A - 共重合体の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はり、−３−ヒドロキシブチレート　（以下Ｂ成
分　と記す）およびＤ−３−ヒドロキシバリレート（以
下　Ｖ成分　と記す）を含有する共重合体の製造法に関
し、さらに詳細には、■成分の割合が０〜５０モル％以
上の広い範囲内の任意の値である共重合体を大量に製造
する方法に関するものである。

［従来の技術］ ポリ−３−ヒドロキシブチレート　（以下ＰＨＢと記す
こともある。）は、エネルギー貯蔵物質として数多くの
微生物の菌体内に生成、蓄積され、優れた生物分解性と
生体適合性とを示す熱可塑性高分子であることから、環
境を保全する“クリーン”プラスチックとして注目され
、手術糸や骨折固定用材などの医用材料および医薬や農
薬を徐々に放出する徐放性システムなどの多方面への応
用が長年にわたり期待されてきた。特に近年、合成プラ
スチックが環境汚染や資源循環の観点から深刻な問題と
なるに至り、ＰＨＢは石油に依存しないバイオポリマー
として注目されている。

しかしながら、ＰＨＢは耐衝撃性に劣るという物性上の
問題とともに、生産コストが高いことなどから、工業的
生産が見送られてきた。

近時、Ｂ成分およびＶ成分を含有する共重合体およびそ
の製造法について、研究、開発がなされ、たとえば、特
開昭５７−１５０３９３号公報および特開昭５９−２２
０１９２号公報にそれぞれ記載されている。

これらの公報における共重合体の製造法は、従来のＰＨ
Ｂの製造法におけると同様に、前段では菌体を増殖させ
、後段では窒素またはリンを制限して微生物を培養して
、共重合体を製造するものである。

前者では、後段の培養において基質として、たきえは、
プロピオン酸およびイソ−酪酸を使用することにより、
Ｂ１１１ｉ分９９．９〜５０モル％と、たとえば、■成
分のような他のエステル成分０．１〜５０モル％とを含
む共重合体を製造するとの記載がある。

一方、後者では、後段の培養において、ＰＨＢ抽出後の
廃園体の細胞物質からの炭素を利用して、少なくとも４
０モル％のＢ成分と他のエステル成分とを含む共重合体
を製造するとの定性的な記載がある。

しかしながら、これらの発明では、前段で菌体を増殖さ
せ、後段で窒素もしくはリンの制御下で培養して共重合
体を蓄積させるものであるために、共重合体を蓄積させ
る後段の培養の前に菌体を分離、洗浄等を行う必要があ
り、大量の培養には適さないものであった。

一方、本発明者らは、さきに、Ｂ成分とＶ成分とを含む
共重合体において、■成分が５０モル％以上の共重合体
とその製造法を発明して、日本特許出願した（特開昭６
３−２６９９８９　、特開平１−６９６２２号）。しか
しながら、これらの発明ではＶ成分を５０〜９５％の範
囲で任意に制御できるものの、前述の特開昭５７−１５
０３９３号公報および特開昭５９−２２０１９２号と同
様に、前段で菌体を増殖させ、後段で窒素もしくはリン
の制御下で培養して共重合体を蓄積させるものであるた
めに、大量の培養には適さないものであった。

［発明が解決しようとする問題点］ 本発明者らは、■成分の割合が０〜５０モル％以上の広
い範囲内の任意の値である共重合体を大量に製造するの
に適する方法を鋭意研究し、本発明に到達した。

［問題点を解決するための手段、作用］本発明者らは、
窒素もしくはリンを制限することなく、■成分の割合が
０〜５０モル％以上の広い範囲内の任意の値である共重
合体を大量に製造する方法を鋭意検討した結果、菌体を
増殖させる工程において、吉草酸を炭素源の一部または
全部とする培地で培養することにより、−段の培養で、
菌体の増殖と同時に、該菌体内にＤ−３−ヒドロキシブ
チレートおよびＤ−３−ヒドロキシバリレートを含有す
る共重合体を生成蓄積させることができることを見いだ
した。

すなわち、本発明は、ＰＨＢ生産能を有する微生物を、
（１）吉草酸もしくはその誘導体またはこれらの塩、ま
たは（２）（イ）吉草酸もしくはその誘導体またはこれ
らの塩と、（ロ）ｎ−酪酸もしくはその誘導体またはこ
れらの塩との混合物を炭素源とする培地で培養し、菌体
の増殖と同時に、該菌体内にＤ−３−ヒドロキシブチレ
ートとＤ−３−ヒドロキシバリレートを含有する共重合
体を生成、蓄積させることを特徴とする共重合体の製造
法である。

本発明において、共重合体に含有されるＢ成分およびＶ
成分は、それぞれ次の式で示される。

すなわち、 Ｂａ分：　　−ＱＣ）Ｉ（ＣＨ３）Ｃｌ１２ＣＯ■成分
：　　−０ＣＲ（Ｃ２Ｈ５）ＣＨ２ＣＯ本発明で使用さ
れる微生物は、ＰＨＢ生産能を有する微生物であればよ
く、特に制限はないが、実用上は、たとえば、アルカリ
ゲネス　フェカリス　（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｆａ
ｅｃａｌｉｓ）　、アルカリゲネスルーランデイイ（Ａ
ｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｒｕｈｌａｎｄｉｉ）アルカリ
ゲネス　ラタス　（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　１ａｔｕ
ｓ）アルカリゲネス　アクアマリヌス　（Ａｌｃａｌｉ
ｇｅｎ６Ｓａｑｕａｍａｒｉｎｕｓ）　　およびアルカ
リゲネス　ユウトロフス　（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　
ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）などが使用される。

これらの菌種に属する菌株の代表例として、アルカリゲ
ネス　フェカリスＡＴＣＣ８７５０、アルカリゲネス　
ルーランディイＡＴＣＣ１５７４９、アルカリゲネス　
ラタスＡＴＣＣ２９７１２、アルカリゲネス　アクアマ
リヌスＡＴＣＣ１４４００ならびにアルカリゲネス　ユ
ウトロフスＨ−１６ＡＴＣＣ１７６９９およびこのＨ−
１６株の突然変異株であるアルカリゲネス　ユウトロフ
スＮＩ：ＩＢ　１１５９７　　、同ＮＣｌＢ１１５９８
　、同ＮＣＩＢ　１１５９９　、同ＮＣＩＢ　１１６０
０などを挙げることができる。これらのうち、アルカリ
ゲネス　ユウトロフスＨ−１６ＡＴＣＣ１７６９９およ
びアルカリゲネス　ユウトロフスＮＣＩＢ　１１５９９
が、実用上、特に好ましい。

アルカリ土類金属に属するこれらの微生物の菌学的性質
は、たとえば、”ＢＥＲＧＥＹ’Ｓ　ＭＡＮＵＡＬ　Ｏ
ＦＤＥＴＢＲＭＩＮＡＴＩＶＥ　ＢＡＣＴＥＲＩＯＬＯ
ＧＹ：　Ｅｉｇｈｔｈ　Ｅｄｉｔｉｏｎ。

Ｔｈｅ　Ｗｉｌｌｉａｍｓ　＆　Ｗｉｌｋｉｎｓ　Ｃｏ
ｍｐａｎｙ／Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ”に、また、アルカリ
ゲネス　ユウトロフスＨ−１６の菌学的性質は、たとえ
ば、”Ｊ、Ｇｅｎ９Ｍ１ｃｒｏｂｉｏ１．、１１５、１
８５−１９２　（１９７９）”にそれぞれ記載されてい
る。

これらの微生物は、通常の培養条件で種母培養が行われ
た後、本培養が行われる。

本培養において使用される培地としては、（１）吉草酸
もしくはその誘導体またはこれらの塩、または（２）（
イ）吉草酸もしくはその誘導体またはこれらの塩と、（
ロ）ｎ−酪酸もしくはその誘導体またはこれらの塩との
混合物を炭素源とする以外は特に制限はない。

窒素源として、たとえば、アンモニア、アンモニウム塩
、硝酸塩などの無機窒素化合物および／または、たとえ
ば、尿素、コーン・ステイープ・リカー、カゼイン、ペ
プトン、酵母エキス、肉エキスなどの有機窒素化合物、
また、無機成分として、たとえば、カルシウム塩、ナト
リウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、リン酸塩、マ
ンガン塩、亜鉛塩、鉄塩、銅塩、モリブデン塩、コバル
ト塩、ニッケル塩、クロム塩、ホウ素化合物およびヨウ
素化合物などからそれぞれ選択されたものを含有する培
地が好適に用いられる。また、必要に応じて、ビタミン
類なども使用される。

炭素源は、高濃度に含有させると菌体の増殖を阻害する
ので、本培養開始時には２〜３０ｇ／（ｌ程度、好まし
くは、５〜１０ｇ／ｌ程度とするのが好ましい。また、
炭素源の消費にともなって逐次あるいは連続的に炭素源
を添加することにより、菌体濃度を高めることができる
と同時に共重合体の収量を高めることができる。

窒素源は必要量を初期に添加しておいてもよく、また、
炭素源を逐次あるいは連続的に添加する場合には、炭素
源と窒素源の比率を一定に保った混合液を用いて、炭素
源の添加と同時に窒素源を添加する方法をとっても良い
。混合液の炭素源と窒素源の比率は、３：１〜１５：１
程度が好ましい。

培養条件としては、温度は、たとえば、２０〜４０℃程
度、好ましくは２５〜３５℃程度とされ、また、ｐＨは
、たとえば、６〜１０程度、好ましくは６．５〜９．５
程度とされる。このような条件下で好気的に培養される
。

吉草酸およびその誘導体は、一般式 ％式％］［） （ただし、式中、Ｘは、水素原子、ハロゲン原子もしく
は、ヒドロキシ基、Ｙは、水素原子、ハロゲン原子、ヒ
ドロキシ基もしくはアルキル基を示す。）で表され、こ
の誘導体の代表例として、４−クロロ吉草酸、４−ヒド
ロキシ吉草酸、４−メチル吉草酸、４−エチル吉草酸、
５−ヒドロキシ吉草酸および５−クロロ吉草酸などが挙
げられる。吉草酸およびその誘導体のそれぞれの塩の代
表例としてナトリウム塩およびカリウム塩などがある。

ｎ−酪酸およびその誘導体は、一般式 ％式％［ （ただし、式中、Ｘは、水素原子、ハロゲン原子もしく
は、ヒドロキシ基、Ｙは、水素原子、ハロゲン原子、ヒ
ドロキシ基もしくはアルキル基を示す。）で表され、こ
の誘導体の代表例として、４−クロロ−ｎ−醋酸および
４−ヒドロキシ−ｎ　−酪酸などが挙げられる。ｎ−酪
酸およびその誘導体のそれぞれの塩の代表例よしてす）
　ＩＪウム塩およびカリウム塩などがある。

なお、培地中において、吉草酸類の割合を太きくするほ
ど、また、ｎ−酪酸の割合を小さくするほど、共重合体
のＶｔＬ分のモル比を大きくすることができる。

このようにして培養して得られた培養液から、ろ過ある
いは遠心分離などの通常の固液分離手段によって菌体を
回収し、この菌体を洗浄、乾燥して乾燥菌体を得、また
は、湿潤菌体から、常法により、生成された共重合体を
、たとえば、クロロホルムのような有機溶剤で抽出し、
この抽出液に、たとえば、ヘキサンのような貧溶媒を加
えて、共重合体を沈澱させ、沈澱を回収し、乾燥させる
ことにより共重合体を製造することができる。

Ｕ実施例コ 以下、実施例によりさらに具体的に本発明を説明するが
、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１ アルカリゲネス　ユウトロフス　ＮＣＩＢ　１７６９９
を使用して共重合体を製造した。

すなわち、 ５００ｍ　ｌの坂ロフラスコに、ポリペプトン　１ｗｔ
％、酵母エキス　１ｗｔ％、肉エキス　０．５ｗｔ％、
フルクトース　１ｗｔ％、塩化ナトリウム　０．５ｗｔ
％、ｐＨ７，０から成る培地１００ｍ１を入れ、これに
アルカリゲネス　ユウトロフス　ＮＣＩＢ　１７６９９
　　を接種し、３０℃で２０時間培養した。

前記の培養液を、つぎの組成を有する培地１１を仕込ん
だ３０Ａジヤーフアーメンタに接種した。

０．５Ｍ　　　リン酸二水素カリウム　　　１５ｍｆ！
０、２５Ｍ　　リン酸水素二ナトリウム　１２４ｍ１ミ
ネラル溶液本　　　　　　　　　　　１ｄ炭素源本＊　
　　　　　　　　　　　　３．５ｇ（Ｎ）１４）２８０
４０．５　ｇ 本　ミネラル溶液 ＣｏＣ２１１９，Ｏｍｇ ＦｅＣ３９，７ｍｇ ＣａＣ２７，８ｍｇ Ｎ＋ｃ　２　１１８．Ｏｍｇ ＣｒＣ２６２，２ｍｇ Ｃａ５０４１５６．４ｍｇ を０．ｌＮ−Ｈ［：１　１βに溶解 木本　炭素源として吉草酸を使用した。

これらを脱イオン水ＩＩ２に溶解させｐｌを７．５に調
整した。

３０℃で培養を行い、仕込み栄養源が消費されたのち、
炭素源と窒素源の混合液（Ｃ／Ｎ比＝７＝１）を、約１
ｇ／Ａの速度で連続添加し、２８時間培養を継続した。

培養液より遠心分離で菌体を回収し、蒸留水で洗浄し、
凍結乾燥して、６．３ｇの乾燥菌体を得た。

乾燥菌体を、熱クロロホルムで５時間処理して、共重合
体を抽出し、この抽出液にヘキサンを加えて共重合体を
沈澱させ、この沈澱を乾燥して、３．０ｇの共重合体を
得た。

この共重合体を、ガスクロマトグラフィーで組成分析を
行うと、Ｂ成分４５モル％、■成分５５モル％であった
。

実施例２ 炭素源として吉草酸とｎ−酪酸をモル 比で１：１に混合したものを用いて、実施例１と同様に
して培養し、１６．８ｇの乾燥菌体を得た。

この乾燥菌体を、実施例１と同様に処理して、９．７ｇ
の共重合体を得た。

この共重合体のＢｌｌＪＥ分は７２モル％、■成分は２
８モル％であった。

実施例３ 炭素源として吉草酸とｎ−酪酸をモル 比で１：２に混合したものを用いて、実施例１と同様に
して培養し、８．０ｇの乾燥菌体を得た。

この乾燥菌体を、実施例１と同様に処理して、４．９ｇ
の共重合体を得た。

この共重合体のＢｍ分は８１モル％、■成分は１９モル
％であった。

［発明の効果］ 本発明の製造法によって、■成分の割合が０〜５０モル
％以上の広い範囲内の任意の値である共重合体を、窒素
及びリンの存在下で培養しても蓄積できるため、共重合
体の大量生産を効率よく行うことができるようになる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ポリ−３−ヒドロキシブチレート生産能を有する微生物
   を、 （１）吉草酸もしくはその誘導体またはこれらの塩、 または（２）（イ）吉草酸もしくはその誘導体またはこ
   れらの塩と、 （ロ）ｎ−酪酸もしくはその誘導体またはこれらの塩と
   の混合物を炭素源とする培地で培養し、菌体の増殖と同
   時に、該菌体内にＤ−３−ヒドロキシブチレートおよび
   Ｄ−３−ヒドロキシバリレートを含有する共重合体を生
   成蓄積させることを特徴とする共重合体の製造法