SU1375143A3 - Способ получени полимера,содержащего звень - О.СН(СН @ )СН @ СО- - Google Patents

Abstract

Изобретение позвол ет обеспечить получение полимера, содержащего звень  -О. СН(СНд)СН„СО - с пониженной кристалличностью и хрупкостью. Процесс ферментации продуцирующих поли- -оксимасл ную кислоту микроорганизмов в водной питательной среде ведут до полного ассимилировани  источника азота и/или фосфора, а затем в ферментационную среду ввод т 4 - 100 мас.% ассимилируемого источника углерода, культивирование продолжают до накоплени  продуцентом 20-70мас.% получаемого полимера. В качестве ас- сими.пируемого источника углерода используют кислоты: пропионовую или изомасл ную, или акриловую, или 3-ок- снпропионовую, или 3-хлорпропионовую, или 2-оксимасл ную или их водорастворимые соли щелочных металлов. Анализ полученных полимеров, выделенных из клеток бактерий, показьшает снижение зоны эндотерм плавлени , что указьша- ет на снижение кристалличности и хрупкости полимера. 2 з.п.ф.,3 табл. (Л Од сл 4: оо

Description

и

. Изобретение относитс  к биотехнологии и касаетс  получени  термопластичного полиэфира повтор ющейс  структуры О. СН(СН,з)СН2СО - (1), который быстро кристаллизуетс  до относительно высокого уровн  (пор дка 70% или более) и представл ет собой поли -гидроксимасл ну1о кислоту (РНВ) Цель изобретени  повышение термопластичности полимера за счет понижени  его кристалл1танссти и хрупкое-

ТИо

Способ закгаочаетс  в следующем.

В качестве микроорганизмов, продуцирующих поли--р -оксимасл ную кислоту , используют кулрзтуры, способные а.ссрмилировать кислоту или ее соль. Предпочтительными  вл ютс  штаммы или мутанты бактерий Alcaligenes eutrophus №№ КС IB 11600, NCI В 11599s NCIB 11598, NClB 11597, ATCC 17699 и штаммы бактер1ет Nocardia salmonicolor №№ ATCC 19149 и ATCC 21243.

I

Ферментацию провод т таким образом , чтобы сухой вес полиэфирсодержа- щих клеток составл л не менее 5 г/л водной среды. Чтобы получить,, например ,, 10 г/л РНВ--содержащих клеток с содержанием РНВ пор дка 40 мас,%, количество питательных веществ, подаваемых в ферментер дл  ограничени  роста клеток, устанавливают из расчета по ддерлсани  роста б г/л клеток,, не содержащих РНВ. Напримерj если используют азот в качестве ограничиваю™ щего рост питательного вещества, то содержание азота в свободных от РНВ бактериальных клетках должно соста:в- л ть 8-15 мас,%, прг-гчем требуемое количество ассш-п-шируемого азота должно составл ть О,, 5-0,9 г/л, например 0,6 1,2 г ионов аммони  на 1 литр.

Подход щие кислоты-субстраты долж- ны быть растворимы в воде и поэтому могут добавл тьс  как таковые или в виде водно-растворимой соли щелочного металла. Предпочтительными  вл ютс  пропионова  и изомасл на  кислоты гидрокси-замещенныЁ производные этих кислот и масл ной кислоты например 3-хлорпропионова , З-гидроксипропио- нова 5 а также ненасьщенные кислоты или их гадо-замещенные, такие как акрилова , метакрилова , 2-хлорпропи- онова  кислоты. Используемые кислоты должны давать начало не только повтор ющимс  звень м (I), когда ку,льтиви-

рование провод т в состо нии ограничени  роста.

Полимер образуетс  в виде гранул внутри клеток микроорганизма. Клетки, содержащие полимер, могут быть использованы в качестве формовочного полимера . Желательно отдел ть полимер от клеток путем их расщеплени  с после- дующей экстракцией подход щим растворителем ,

Вьщеленный полимер имеет молекул рную массу от 100 000 и выше 200 000.

При нормальном метаболизме субст рата, например пропионата, последний превращаетс  в сугсдинат, который да- . ет начало ацетил СоА путем окислени  элемента трикарбоновой кислоты, ТСА, цикла Кребса, в щавелевоуксусную кислоту с последующим декарбоксилирова- нием. При декарбоксилированик щавеле- воуксусной кислоты обе концевые кислотные группы удал ютс  в виде окиси углерода Следовательно, если пропионат, имеющий атом углерода в

карбоксильной группе, который радиоактивно мечен5 т. е, 1-С -пропнонаТд подаетс  к клеткам то превращение его в ацетил Со А будет осуществл ть- с  с одновременной потерей радиоак-

1-1

СО,

Любое внедрегтивности в виде ov., ние, С в должно быть р езуль- татом превращени  пропионил СоА в р П Щроксивалерил СоА и последующей полшчеризации ,1

П р и м е р 1в Мутант Alcaligenes eutrophus NCIB 11599 выращивают в аэробных услови х в 5-литровом периодическом ферментереS содержащем сре- ды следующего состава на 1 л деиони- зированной воды;

Глюкоза

(NH)2SO

MgSO,-7H О

HjPO(,lM)

FeSO . 7Н ,,0 Следы элементов

г 2,0 г 0,8 г 0,45 г 1 2 мл 1 5 мг 24 мл

Раствор микроэлементов:

CuSO

0,02 0,1 OJ 2,6

ZnSO,

MnSO

СаС1.2Н,,0

При достижении концентрации кле ток 4,5 г/л5 т,е, по истощении ассимилируемого источника азота, в среду внос т 1 г/л пропионата натри , со держащего 1-С -пропионат, совместно с глюкозой и ферментацию продолжают

в течение 5 мин. Клетки отдел ют фильтрацией и полимер экстрагируют хлороформом. Меченый углерод обнаруживают исключительно в хлороформном растворе. Это указьшает на то, что меченые концевые атомы углерода не тер ютс  в виде двуокиси углерода. Следовательно, некоторое количество пропионата внедрилось в полимер, от- личный от ацетил СоА,

Содержание полимера в клетках 60% Т.пл. 122°С, Зона зндотермы плавлени  51 Джгч ,

Пример 2. Мутант Alcaligenes eutrophus NCI В 11599 выращивают в ус лови х аэрации при рН и 34°С в 5-литровом ферментере периодического действи , содержащем 4000 г-ш водной среды, содержащей на л деионизиро- ванной воды: .

(Шр,, г

MgSO 7Н О 0,8 г

0,45 г

12 мл 1 5 мл

Раствор микроэлементов по

примеру 1) 24 мл

Глюкозу добавл ют со скоростью 8 г/ч. Количество ассимилируемого азо , та в среде достаточно дл  образовани  26 г/л несодержащих клеток поли- й-гидроксимасл ной кислоты (РНВ),

Через 40 ч клетки отдел ют центри фугированием, сушат вымораживанием и экстрагируют хлороформом,

Содержание полимера в клетках 70% Т.пл. 91°С. Зона эндотермы плавлени  127 Дж-ч .

П р и м е р 3, Процесс ведут как в примере 2 за исключением того что при достижении концентрации клеток 34 г/л в ферментационную среду добавл ют пропионовую кислоту вместо глю- козы со скоростью 2 г/ч. Количество полимера в клетках 70%.

KjSOj, HjPO FeSO .7Н О

П р и м е р 4. Процесс ведут как в примере 3 за исключением того что в момент достижени  концентрации клеток 28 г/л в ферментационную среду вместо глюкозы со скоростью 2 г/ч добавл ют изомасл нзпо кислоту в виде раствора, содержащего 150 г/л кислоты Ферментацию ведут до достижени  концентрации клеток 26 г/л РНВ с добавлением глюкозы.

Содержание полимера в клетках 50%,

-

о

0

5

0

5

П р и м е р 5. Процесс ведут как в примере 4 за исключением того, что при достижении концентрации клеток 30 г/л в ферментационную среду подают 4 г 3-хлорп.ропионовой кислоты в концентрации 50 г/л и продолжают ферментацию в течение 7 ч при посто нном добавлении глюкозы со скоростью 6,8 г/ч.

Количество полимера в клетках 35%. П р и м е р 6. Способ осуществл ют согласно примеру 2 за исключением того , что при достижении концентрации клеток 31 г вместо глюкозы в среду в течение 5 ч добавл ют акриловую кислоту со скоростью 4 г/ч с концентрацией 100 г/л.

Содержание полимера в клетках 25%. Б полученных полимерах определ ют количество сомономерных звеньев гид ролизом и газовой хроматографией методом .

Молекул рные массы полимеров определ ют методом гельпроникаемой хроматографии о

Полученные результаты представлены в табл Л

Приме р 7. В 5-литровый ферг- ментер зэ,грзпкают 3 л среды следующего состава на 1 л деионизированной воды: (NH),SO,6,2 г

Н,(1,Ш) 1,5 мл MgSO г .THgO 15 мг Раствор микроэлементов (как в

примере 1) . 36 мл Ферментер инокулируют выдержанной в течение 48 ч во встр хиваемой колбе культурой мутанта Alcaligenes eutrophus NCIB 11599, а затем добавл ют 5 г/л глюкозы. Ферментацию про- вод т аэробно при и регулируемой величине рН 6,8 автоматически с помощью добавлени  9;1 объем/объем смеси 4м КОН и 4М NaOH. Количество фосфора достаточно дл  поддержани  8 г/л РНВ клеток свободных от полимера о

Когда вс  глюкоза утилизировалась (на этой стадии концентраци  клеток около 2,5 г/л), добавл ют пропионовую кислоту в виде раствора, содержащего 300 г/л пропионовой кислоты, со скоростью 0,-8 г/ч в течение 54 ч. j

Затем клетки собирают, полимер экстрагируют хлороформом, и анали-

зируют. Получают следующие результа ты: конечна  концентраци  клеток 20 г/л; содержание полимера 60% по весу.

Полимер содержит 60 моль % бета- оксибутиратных звеньев и 40 моль % бета-оксивалератньк звеньев (т.е., где R этил).

Примере. Мутант Alcaligenes eutrophus NC1B 11599 выращивают при аэробном культивировании при рН 6,8 и 34°С в 5-литровом ферментере, содержащем 4000 мл водной среды, имеющей следующий состав на один литр деионизированной воды:

Глюкоза17 г

(NH) 80 . 4 г

MgSO 7Н О 0,8 г

HjPO (1,Ш) 12 мл

FeSO 15 мг

Раствор микроэлементов (как

в примере 1) 36 мл

Величину рН поддерживают на уров- не 6,8 с помощью автоматического добавлени  смесей 9:1 объем/обьем 4 М гидроокиси кали  и 4 М гидроокиси натри . Данное добавление смеси КОН/ NaOH дл  регулировани  рН служит так- же дл  снабжени  среды дл  культивировани  калием и натрием.

Количество ассимилируемого азота (обеспечиваемое применением 4 г/л сульфата аммони ) бьшо достаточным дл  поддержани  около 6,5 г/л РНВ ; клеток свободных от полимера.

Так как дл  получени  6,5 г/л клеток полимера требуетс  16 г/л глюкозы , присутствующее количество глюко- зы бьшо достаточным дл  обеспечени  небольшого избытка углерода.. С помощью регулировани  концентрации остаточной глюкозы, а также следов давлени  растворенного кислорода получа- ют  сное указание того, когда системе становитс  недостаточно ассимилируемого азота. На этой стадии начинают подачу 3-оксипропионовой кислоты в двух экспериментах и 2-окси-масл ной

кислоты в третьем эксперименте.

I

После завершени  добавлени  кислоты клетки собирают с помощью центрифугировани  . Образец центрифугирован- ных клеток сушат замораживанием и полимер экстрагируют хлороформом. Полимер анализируют с помощью технологи-

0

5 о

,

Q 5

5

5

ческих приемов газова  хроматографи / масс-спектроскопи  (ГХМС).

Результаты представлены в табл.2. Примеры 9-13. В каждом примере 250 мл встр хиваемой колбы загружают 50 мл водной среды, содержащей на 1 л деионизированной воды: Глюкоза10 г

,1,9 г

NaH.,56 г

(NH),8 г

MgSO 7Н О0,2 г

FeCl бНТ)0,001 г

Раствор микроэлементов (как в примере 1) 1 мл Величина рН водной среды 7,0. Колбу инокулируют Nocardia salmonico- lor и осуществл ют вьфащивание при вращающемс  (гироскопическом) встр хивании при в течение 24 ч. Полученную в результате суспензию затем центрифугируют. Массу клеток, полученную в результате центрифугировани , затем повторно суспендируют в 50 мл водной среды, идентичной ( среде, указанной выше, за исключением того, что 10 г/л глюкозы замен ют 1 г/л кислоты, а 1,8 г/л сульфата аммони  не внос т. Повторно суспендированные клетки встр хивают в течение 24 ч при 30°С, а затем суспензию клеток центрифугирзтот. Центрифугированную лепешку или таблетку клеток промьшают дважды метанолом и анализируют на содержание полимера. Полимер анализируют с помощью газовой хроматографии/масс-спектроскопии. Результаты представлены в табл.3. Более высокие содержани  полимера могли быть получены при добавлении дополнительного количества кислоты после культивировани  повторно суспендированных клеток в течение 24 ч и продолжении культивировани .

П р и М е р 14. Мутант A.eutro- phus ClB 1 1599 выращивают путем аэроб-| ного культивировани  при рН 6,8 и 34°С в 5-литровом порционном ферменI

тёре, содержащем от 3500 до 4000 мл водной среды, содержащей на один литр деионизированной воды: Глюкоза18 г

(NH), г

MgSO 7Н,0 0,8 г (1,1М) 12 мл FeSO 7Н,0 15 мг

713

Раствор следовых

элементов, тех же,

что в примере 1 36 мл

рН регулируют на уровне 6,8 путем автоматического добавлени  9:1 об./об смесей 4 М хлористого кали  и 4 М едкого натри ..Это добавление смеси KOH/NaOH регулировани  рН служит дл  подачи в ростовую среду кали  и нат- ри .

Количество ассимилируемого азота обеспечивают 4 г/л сульфата акмокк  достаточным дл  поддержани  всего примерно 6,5 г/л свободных от поли- меров клеток НВ.

Поскольку дл  получени  6,5 г/л свободных от полимера клеток требуетс  примерно 16 г/л глюкозы, количества присутствующей глюкозы достаточно дл  обеспечени  небольшого избытка углерода.

Когда концентраци  клеток достигает 8,0 г/л в течение 4,5 ч добавл ют 1 г/л 2-оксимасл ной кислоты, а затем клетки собирают путем центрифугировани . Пробу этих клеток высушивают замораживанием и с помощью хлороформа экстрагируют полимер. Содержание полимера в клетках 24%. Тем пература плавлени  174 С, зона эндо-термы плавлени  ПО Дж-г .

Пример 15. В этом примере водна  среда и услови  ферментации, т.е. рН, температура те же самые, что и в примере 14, за тем исключе нием, что концентраци  глюкозы составл ет 16 г/л и используют лабораторный ферментер непрерывного действи  с рабочим объемом 2 л (приблизи- тельно). Непрерывные услови  культивировани  -устанавливают путем непре- рьшной подачи в ферментер водной среды и непрерьтного удалени  соответствующего количества среды из фермен- тара, обеспечива  среднее врем  пре- .бьшани  12,5 ч (т,е. скорость разведени  0,08 ч М« Затем ввод т 3-гид- роксипропионаэую кислоту в количестве 4,4 г на литр водной среды.

После достижени  стабильного состо ни  содержание остаточной глюкозы составл ет 0,6 г/л, остаточна  концентраци  ассимилируемого азота меньше I мг/л и концентраци  клеток составл ет примерно 10 г/л.

Полимер собирают из удаленной из ферментера среды путем центрифугировани , сушки замораживанием и экст

5

0

5 О

О 5 Q

5

5

438

ракции посредством хлороформа. Содержание полимера в клетках 33%. Т.пл. . Зона эндотермы плавлени  106 Дж г

П р и М е р 16. Повторили пример 15 за тем исключением, что скорости питани  регулируют так, чтобы среднее врем  пребьшани  составл ло 11,8 ч (т.е. скорость разведени  0,095 ч ), и добавл ют 3-гидрокси- пропионовой кислоты в количестве 2,8 г/л.

После достижени  стабильного состо ни  остаточное содержание глюкозы 0,3 г/л, остаточна  концентраци  ассимилируемого азота составл ет меньше 1 мг/л, а концентраци  клеток составл ет примерно 9 г/л.

Содержание полимера в клетках 28%. Т.пло 166°С, зона зндотермы плавлени  i 00 Дж г

Анализ определ ет температуру стекловани  аморфной фазы. Зоны эндо- терм плавлени  указьшают на относительную степень кристалличности.

Полимеры из примеров А, В, и С были подвергнуты анализу  дерной магнитно-резонансной спеггтроскопией С. Поведение полимеров при плавлении определ ют путем дифференциальной калориметрии со сканированием (DSC) на отожженных образцах, полученных путем формовки сжатием при 190°С.

Полученные полимеры после отжига обладали значительно меньшей степенью кристалличности, чем контроль- ньш сополимер из примера 2.

Claims (3)

1. Способ получени  полимера, содержащего звень  - 0,CH(CHJCH,CO-, путем культивировани  микроорганизма, способного продуцировать поли-р-окси- масл ную кислоту, в водной питательной среде, содержащей в течение всего периода культивировани  или его части органическую кислоту, или ее производное в качестве ассимилируемого источника углерода и ассимилируемые источники азота и фосфора, отличающийс  тем, что, с целью повышени  термопластичности за счет понижени  его кристалличности и хрупкости , культивирование ведут до полного ассимилировани  источника азота и/или фосфора, а затем процесс про- при использовании от 4 до

913751

100 мас.% ассимилируемого источника ,углерода в виде глюкозы или пропионо- вой, или изомасл ной,-ИЛИ акриловой или 3-оксипропионовоЙ4 или 3-хлорпро- - пионовой, или 2-оксимасл ной кислоты, или их водорастворимых солей щелочных металлов,до накоплени  продуцентом от 20 до 70 мас.% получаемого полимера.10

2. Способ ПОП.1, о тличаю- щ и и с   тем,.что процесс культивировани  после ассимил ции азота

310

и/или фосфора ведут при использовании в качестве источника углерода смеси глюкозы и одной из вьшеуказан- ных органических кислот или ее соли при содержании в смеси данной кислоты или соли 4-75 мас.%,

3. Способ поп.1,отличаю- щ и и с   тем, что процесс культивировани  до полной ассимил ции азота и/или фосфора ведут при использовании глюкозы в качестве источника углерода.

ч

Таблица 1

Нет

Пропионова 

Изомасл на 

3 Хлорпропи- онова 

Акрилова 

О

27

30

2 0,6

.6,5

Кислота

З-Оксипро- пионова 

2-Оксимасл - на 

Таблица 2

этил и водород , в обоих случа х

этил

11

19149 19149 21243 21243 21243

Изомасл на 

2-Хлорпропионова 

Пропионова 

Изомасл на 

2-Хлорпропионова 

Примечание. - бета- чэксибутиратные единицы;

З-НУ - бета-оксивалератные единицы.

137514312 Таблица 3