JP2918286B2 - 共重合体の製法 - Google Patents

共重合体の製法

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、３−ヒドロキシブチレートモノマー単位
（以下HBと称す）と３−ヒドロキシバレレート単位（以
下HVと称す）との共重合体の製法、ならびにその方法に
使用するための微生物に関する。
HBのホモポリマー（ポリヒドロキシブチレートとして
知られるものであり、以下PHBと称す）は、種々の微生
物、主に細菌によつて、微生物細胞内に顆粒の形のエネ
ルギー貯蔵物質として蓄積される。類似のHVのホモポリ
マーであるPHVは今までに単離されなかつた。
そのような細胞から抽出されるPHBは、下記の繰返し
構造： −Ｏ・CH（CH3）・CH2・CO− の熱可塑性ポリエステルであり、比較的高レベル、例え
ば70％またはそれ以上のオーダーのレベルまで結晶化す
る。この結晶化挙動は、PHBが例えば成形用材料として
使用されるべき場合には、不利となることが多い。
PHBの結晶化は、その重合体鎖中に非類似のモノマー
の単位を導入することにより改変しうることが知られて
いる。また微生物をある種の酸類、及びアルコール類の
存在下にある種の条件下で培養することにより、ある割
合のコモノマー単位が重合体鎖中へ導入されて、共重合
体を生成させうることも公知である。
ここに「コモノマー」とは、共重合体中に存在する、
HBモノマー単位でないモノマー単位を指称するものとす
る。
ここに「共重合体（あるいはコポリマー）」は、コモ
ノマー単位とHBモノマー単位とを含む共重合体（コポリ
マー）を指称するものとする。
本発明は以下の理論に拘束されるものではないが、そ
のような共重合体に至る代謝経路は下記の通りであると
考えられる。
ここに CoA・SHは、エステル化されていない補酵素Ａであ
り； CH3・CO・Ｓ・CoAは、補酵素Ａのアセチルチオエステ
ルであり、より普通には「アセチルCoA」と称され； NADPは、酸化された状態にあるニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチドホスフエートであり； そして NADPH2は、還元されたNADPである。
微生物によるPHBの生合成における第１過程は、アセ
チルCoAの合成であると信じられる。これは、例えばCoA
及びアセテートから、あるいはピルベートの酸化的脱カ
ルボキシル化によつて生成されうる。ピルベートはカル
ボヒドレート類の代謝生成物であり、あるいはオキサロ
アセテートの脱カルボキシル化によつて生成されうる。
この後者は、ある数のトリカルボン酸（TCA）サイクル
（クレブス:Krebsサイクルと称されることもある）であ
る。
かくして、アセチルCoA源としてアセテートを用いる
と、PHBは下記諸反応を伴なう代謝経路によつて生成さ
れる： ここに、 CH3・CO・CH2・CO・Ｓ・CoAは、アセトアセチルCoAで
あり； CH3・CHOH・CH2・CO・Ｓ・CoAは、３−ヒドロキシブ
チリルCoAであり；そして −Ｏ・CH（CH3）・CH2・CO−は重合体中の繰返し単位
である。
かくして、上記反応４は、生長している重合体鎖に対
して−Ｏ・CH（CH3）−CH2・CO−を付加する。
使用される酵素の特異性の不足の故に、例えばプロピ
オン酸を用いての、対応する経路は下記の諸反応からな
ると考えられる： ここに、 CH3・CH2・CO・Ｓ・CoAは、ピロピオニルCoAであり； CH3・CH2・CO・CH2・CO・Ｓ・CoAは、３−ケトバレリ
ルCoAであり； CH3・CH2・CHOH・CH2・CO・Ｓ・CoAは、３−ヒドロキ
シバレリルCoAであり；そして −Ｏ・CH（C2H5）・CH2・CO−は重合体中の繰返し単
位である。
かくして反応4aは、生成しつつある重合体鎖に対して
−Ｏ・CH（C2H5）・CH2・CO−を付加する。
HBモノマー単位を種々のコモノマー単位と共に含むあ
る種の共重合体は、そのような共重合体を生産する方法
と一緒に文献に開示されている。
かくして、エチレン性不飽和の存在を指示するといわ
れる赤外吸収バンドを示す共重合体は、「Applied Micr
obiology」12（1964年）の第301〜304頁にデイビス（Da
vis）によつて発表されている。デイビスによつて、HB
モノマー単位及び３−ヒドロキシ−２−ブテノエートコ
モノマー単位、すなわち式 −Ｏ・Ｃ（CH3）＝CH・CO− のコモノマー単位、を含む共重合体であると言われてい
るこれらの共重合体は、ｎ−ブタンでノカルジア（Noca
rdia）を培養することにより作られた。
またウオーレン（Wallen）等は「Environmental Scie
nce and Technology」６（1972）第161〜164頁及び８
（1974）第576〜579頁において、活性汚泥から単離さ
れ、HBモノマー単位とHVコモノマー単位とを1:5の比で
含み、（繰返し洗浄された後に）97〜100℃で溶融する
共重合体を記載している。従つてこの共重合体は約17％
のHBモノマー単位を含む。マーチエスソールト（Marche
ssault）等は、「IUPAC Macro Florence 1980 Internat
ional Symposium on Macromolecules Preprints）２（1
980）第272〜275頁において、この共重合体の研究を報
告しており、これが主としてHVコモノマー単位を含んで
いたことを確認した。
米国特許第3275610号明細書には、特定の微生物、特
にノカルジア・サルモニカラー（Nocardia salmonicolo
r）を、４個の炭素原子を含むカルボン酸（基質）で培
養することによりポリエステルを微生物学的に生産する
ことを記載している。
EP−Ｂ−0052459及びEP−Ｂ−69497号明細書には、特
定の微生物、特にアルカリゲネス・ユウトロトフス（Al
caligines eutrophus）突然変異株NCIB 11599を、適当
な基質で培養することにより多数のポリエステルを製造
することが記載されている（ここにNCIB及びNCIMBと
は、英国アバーデイーン AB2 1RY、マチヤードライブ、
23Stのザ・ナシヨナル・コレクシヨン・オブ・インダス
トリアル・アンド・マリン・バクテリアLtd.の略称であ
る）。ある種の炭素含有化合物は、そのような特定の炭
素含有化合物から微生物がコモノマー単位を合成し蓄積
することができないので、基質中に含めるのに適当でな
いと述べられている。これらの炭素含有化合物として
は、ギ酸、酢酸、スクシン酸、乳酸等及びグルコースが
ある。それらの微生物がグルコース上で増殖しうるこ
と、そして炭素含有化合物がグルコースのみからなる基
質上で重合体及び共重合体蓄積条件下で培養される場合
には、PHBのみが生成、蓄積されること、が示されてい
る。
同様に、EP−Ａ−20442号明細書には、奇数個の炭素
原子を有する第１アルコール（ただしメタノールを除
く）上でアルカリゲネス・ユウトロフス突然変異体NCIB
12080を培養することによるHB及びHVの共重合体の微生
物学的製法が記載されている。
ドイ（Doi）等は「Applied Microbiology and Biotec
hnology」28（1988）第330〜340頁において、アルカリ
ゲネス・ユウトロフスATCC 17699及びアルカリゲネス・
ユウトロフスNCIB 11599を、炭素含有化合物がグルコー
ス、酢酸または酪酸のみからなる基質上で培養すると、
PHBのみが生成、蓄積されたことを示している。さらに
は、ドイ等は、ある微生物が共重合体を生成、蓄積する
ためには、基質が、コモノマーの構造に匹敵しうる構造
の炭素含有化合物を含まなければならないことを示して
いる。
PHB蓄積性細菌を、エネルギー及び炭素源を含む適当
な基質からなる培地中で好気培養すると、細菌は、生殖
のための必須要求物の一つまたはそれ以上が用い尽され
るまで、生殖する。かかる細菌の生殖を以下「生長」と
称する。ある必須生長要求物の用尽時には、さらなる生
長は、たとえあつたとしても、極めて限定された程度に
生じるにすぎず、基質が用い尽されないことを条件とし
て、PHBがその細菌によつて蓄積されうる。
若干の細菌では、１種またはそれ以上の必須生長要求
物の制限のようなPHB誘起制限のない場合さえ、細菌の
生長が起つている間にPHBも蓄積されうる。しかしPHBを
構成的に生産する細菌の場合を除き、そのようにして蓄
積されるPHBの量は一般的に少なく、典型的には生長細
胞の10重量％未満である。従つて、回分式培養で生殖さ
れる場合に、PHBを構成的に生成しない細菌は、生長の
ための必須要求物の一つまたはそれ以上が用い尽される
に至るまでPHBを全くまたはほとんど蓄積することなく
生長し、用尽後に細菌はPHBを合成する。
共重合体を生成させるには、共重合体が蓄積される期
間の少なくとも一分部中にコモノマー単位を生じさせう
る成分を含む基質を与える必要がある。従つて前述のよ
うにHBモノマー単位とHVコモノマー単位との共重合体を
生成させるには、HVコモノマー単位を合成しうる成分を
含む基質上で細菌を培養する必要がある。
共重合体に少なくともHVコモノマー単位を生じさせる
成分を、ここでは基質のHV成分と称することにする。
従来は、そのようなHV成分としては、グルコースのよ
うな糖；ギ酸、酢酸、酪酸、乳酸及びスクシン酸のよう
な酸；あるいは、細菌によつて、生長制限条件下であつ
ても、例えばアセチルCoAまたはTCAサイクルの一員へ向
かわせる経路によつて優先的に代謝され、それによつて
細菌を実質上PHBの生産に制限するようになりうる炭素
源；は排除されていた。我々は、ある種の選定された菌
株を、HBモノマー単位とHVコモノマー単位とからなる共
重合体を生成させるような重合体蓄積条件下で培養する
ことができ、その際の基質を資化性炭素化合物からなる
ようにし、その資化性炭素化合物を、公知PHB蓄積細菌
によつてPHBにのみに代謝されうる化合物とすることを
発見した。
また我々は、選定された細菌を利用しての、そのよう
な共重合体の製造のための一般的な微生物学的方法を提
供しうることも発見した。
HVコモノマー含量を、事実上PHVホモポリマーが生成
されうるように変動させうることも発見した。
従つて我々は、下記の共重合体合成法を提供する。
HBモノマー単位及びHVコモノマー単位を含む共重合体
の合成方法であつて：この方法がコリイネバクテリウム
・ジオキシダンス（Corynebacterium dioxydans）ATCC
21766、コリイネバクテリウム・ヒドロカルボキシダン
ス（Corynebacterium hydrocarboxydans）ATCC 21767、
ノルカルジア・ルシダ（Norcardia lucida）NCIB 1098
0、ロードコツカス・エスピー（Rhodococcus sp.）ATCC
19070及びロードコツカス・エスピー（Rhodococcus s
p.）NCIMB 40126からなる群より選択された少なくとも
１つの細菌の特性を有する細菌を、増殖制限条件下で、
HV成分を含む基質を含有する水性培地中で好気培養する
ことからなり、かつそのHV成分が、アルカリゲネス・ユ
ウトロフス（Alcaligenes eutrophus）NCIB 11599によ
つて代謝されてPHBとなりうる資化性炭素化合物であ
る、ことを特徴とする上記共重合体合成方法。
（ATCCは、米国メリーランド20852、ロツクビレ、123
01パークローンドライブの「ジ・アメリカン・タイプ・
カルチヤー・コレクシヨン」の略称である。） 使用される培養条件、例えばHV成分、細菌の菌株、に
応じて、共重合体中のHVコモノマー単位の数が変動され
うる。普通、共重合体中のHVコモノマー単位の数は共重
合体中のHBモノマー単位及びHVコモノマー単位の合計数
の少なくとも５モル％、好ましくは少なくとも50モル
％、殊に60〜98モル％、特に70〜95モル％である。特定
の培養条件の下では、例えばHV成分がバレリアン酸また
はその誘導であるときには、HBモノマー単位が検出され
ないことがあり、その場合に共重合体は実質上HVホモポ
リマーであり、このようなものは従来得られなかつた。
さらには、基質中にその他のコモノマー成分を含める
ことにより、生成共重合体は、HVコモノマー以外のコモ
ノマーをも含みうる。特定的には、基質中に４−ヒドロ
キシブチレート、ヘキサノン酸または５−クロロバレリ
アン酸を含ませると、共重合体中に４−ヒドロキシブチ
レート、４−ヒドロキシヘキサノエート、及び５−ヒド
ロキシバレレートのコモノマーが含まれるようになる。
本発明方法は、コリイネバクテリウム・ジオキシダン
スATCC 21766、コリイネバクテリウム・ヒドロカルボキ
シダンスATCC 21767、ノルカルジア・ルシダNCIB 1098
0、ロードコツカス・エスピーATCC 19070及びロードコ
ツカス・エスピーNCIMB 40126の菌株から選択された少
なくとも１つの菌株を利用する。殊に本発明方法はロー
ドコツカス・エスピーNCIMB 40126菌株を利用する。
上記の好ましい菌株に類似した特性を有するその他の
菌株は、本発明の方法において使用しうる。それらの他
の菌株は、これらの望ましい特性を固有的にもつている
ことがあり、あるいは所望の特性を具備する菌株から必
要な遺伝子情報を移行させることによりこれらの所望の
特性を有するようになつてもよい。PHBの生産及び蓄積
に必要とされる遺伝子情報を細菌の菌株同志の間で移行
させることは、シユーバート（Schubert）等によつて
「Journal of Bacteriology」12（1988）第5837〜5847
頁に、そしてスラツター（Slater）等によつても「Jour
nal of Bacteriology」10（1988）第4431〜4436頁に記
載されている。水性培地中のHV成分の濃度は、好ましく
は0.1〜25g/、殊に５〜10g/である。HV成分は、グ
ルコースまたはフルクトースのような糖、あるいは、酢
酸、乳酸、酪酸またはスクシン酸、これらの塩、エステ
ル、無水物、アミド、ハライド等、あるいは誘導体であ
つてよい。
HV成分として使用するのに適当な化合物の混合物、例
えば糖蜜中に見られる混合物あるいはその誘導体も使用
できる。
炭素含有基質及び酸素に加えて、細菌の増殖のために
は種々の栄養が必要とされる。これらの栄養は、通常、
容易に資化されうる形態で、普通は水溶性塩の形で存在
する下記の元素からなる：窒素、リン、硫黄、カリウ
ム、ナトリウム、マグネシウム、カルシウム及び鉄、な
らびに痕跡量のマンガン、亜鉛及び銅である。
培養の少なくとも一部が、生長のためには必須要求物
であるが共重合体の蓄積のためには必須ではない物の制
限の条件下で実施されるのが好ましい。殊に、栄養の一
またはそれ以上の供給を制限するのが好ましい。制限す
るのに最も実際的な元素は、窒素、リン、あるいは余り
好ましくはないがマグネシウム、硫黄またはカリウムで
ある。窒素は、好適にはアンモニウム塩の形で、他方リ
ンは好適にはホスフエートの形で供給されうる。
窒素制限を採用する場合、基質が窒素を含まないのが
好ましく、従つてHV成分として使用しうる前記の酸のア
ミド誘導体は、余り好ましくないHV成分である。資化性
窒素の必要量は、蓄積共重合体の重量を差引いた細胞の
所望重量の約10〜15重量％である。細菌の培養は、非増
殖制限（制限無し）条件下でその細菌のために慣用され
てきている温度、pH、通気度等の条件下で実施しうる。
同様に、栄養（細菌の生長を制限するために用いられる
栄養以外のもの）の使用量は、その細菌の生長のために
通常用いられる量である。
細菌の培養は、好ましくは二段階プロセスからなる。
その第１段階において、易資化性炭素化合物、例えばグ
ルコースからなる基質上で非生長制限条件下で、ある特
定の乾燥重量（１当り）値まで生長されるのが好まし
い。第２段階における基質は少なくともその一部がHV成
分であり、そして少なくとも一つの生長必須栄養が、生
長制限条件を発生させるように、制限されている。
培養は、回分法として実施することができ、かくして
重合体蓄積が、生長のためには必要とされるが重合体蓄
積のためには必要とされない栄養の量の低減につれて、
起こるようにすることができる。
あるいは、連続法として培養を実施することもでき、
この場合に細菌の培養が行なわれている容器から培養液
の流れを、連続式または半連続式に取り出す。容器から
取り出される流れは、使用済水性培地（廃液）中に細菌
細胞を含んでいる。その廃液は残留量の栄養及び基質か
らなる。容器を去る流れの流量は、その容器への新鮮水
性培地の添加速度に対応する。容器へ供給される新鮮水
性培地は共重合体の蓄積を支持するのに足りる量の栄養
及び基質を含む。容器に供給され、細菌の生長を制限す
るのに用いられる栄養の量は、容器から取り出される使
用済水性培地（廃液）中に当該栄養が全くまたはほとん
ど存在しなくなるような量であるのが好ましい。さらに
は、使用済水性培地を少なくともさらに１つの好気培養
段階（回分式、あるいは好ましくは連続式または半連続
式）へ供給し、そこで新しいHV成分含有基質をその使用
済水性培地へ添加することにより、追加の共重合体蓄積
を引き起すのが好ましい。栄養及び基質の濃度は、第１
の培養段階を つた後の使用済水性培地において、プロ
セス全体の最適操作が維持されるように、調節できる。
別法として、細菌の培養は、一段階プロセスとして実
施することもできる。このプロセスにおいては、共重合
体蓄積が、生長のためには必要とされるが共重合体蓄積
のためには必要とされない栄養の量を制限することによ
り誘起され、容器中で水性培地の滞留時間は、制限栄養
の用尽を生じさせるように、そしてまた共重合体の蓄積
を生じさせるように充分に長くされる。
単段階または多段階プロセスのいずれにおいても、回
分式または連続もしくは半連続式のいずれにおいても、
HV成分は、共重合体蓄積中の基質中に存在する唯一の炭
素源であつてよく、あるいはその他の資化性炭素源と混
在していてよい。
HV成分は共重合体蓄積段階の一部の期間にのみ基質中
に存在してもよい。
本発明のもう一つの態様によれば、ロードコツカス・
エスピー菌株NCIMB 40216、ならびにそれから誘導され
る突然変異株及び変異株の純粋な培養物が提供される。
ロードコツカス・エスピー菌株NCIMB 40126はブダペ
スト条約の条項及び要件の下に、1989年３月24日に寄託
された。
ロードコツカス・エスピー菌株NCIMB 40126ならびに
それから誘導された有用な突然変異株及び変異株は、下
記の分類学的記載によつて特徴付けられる。ここにこの
菌株ならびにそれから誘導された突然変異株及び変異株
が、グルコースからなる基質上で増殖しうること、そし
てグルコースを資化性炭素源を用いて重合体蓄積条件下
でHBモノマー単位及びHVコモノマー単位からなる共重合
体を蓄積しうることは、他から明瞭に区別される特徴で
ある。
ロードコツカス・エスピーNCIMB 40126 形態 グラム陰性、0.6〜1.2μｍ×3.0〜9.5μｍの概略寸法
の不動性桿。
胞子形成せず。
細胞分岐及び球状形が認められる。
コロニイ形態（Lab m栄養寒天）−円形であり、平
滑、全緑、淡ピンクないしオレンジ色コロニイ。
５〜９のpHで増殖。
温度 至適温度 30〜35℃ 特性 下記からの酸 グルコース ＋ フルクトート ＋ マンニトール ＋ キシロース − ラクトース − スクロース − デンプン − マルトース − ガラクトース − マンノース − アラビノース − セルロース − 単独炭素源での生長 ラクテート ＋ スクシネート ＋ フルクトース ＋ グルコース ＋ サイトレート ＋ アセテート ＋ スクロース − キシロース − ラクトース − グリセロール − その他 カタラーゼ ＋ NO3 -→NO2 - − ゼラチン安定性 ゼラチン液化なし リトマスミルク アルカリ性 BCPミルク アルカリ性 インドール − H2S ＋ メチルレッド − アセチルメチルカルビノール − NH3 − 本発明の方法を以下の実施例により例示説明する。
実施例 1. ロードコツカス・エスピーNCIMB 40126の出発培養物
は、「ブレイン・ハート・インフユージヨン」（Oxoid
製：以下「BHI」と称す）中で増殖させた。
この出発培養物1mlを用いて200mlのKR培地に接種し
た。この培地は下記組成（蒸留水１リツトル当り）であ
つた。
MgSO4・7H2O 0.4 （ｇ） FeSO4・7H2O 0.025（ｇ） （NH4）2SO4 7.0 （ｇ） K2HPO4 7.6 （ｇ） NaH2PO4 6.24 （ｇ） 痕跡溶液 10.0 （ml） グルコース 10.0 （ｇ） 痕跡（栄養物）溶液は、下記の組成（蒸留水１リツト
ル当り）を有した。
MgSO4・4H2O 0.406（ｇ） ZnSO4・7H2O 0.440（ｇ） CuSO4・5H2O 0.078（ｇ） CaCl2・2H2O 7.340（ｇ） 細菌はpH7.0及び30℃において24時間、好気（振とう
フラスコ）回分培養した。24時間後、細菌を遠心分離で
採取し、洗浄し、そして硫酸アンモニウムを含ましいKR
培地200ml中へ移した。
細菌を、重合体蓄積がなされるように24時間培養し
た。次いで細菌を遠心分離によつて採取し、洗浄し、凍
結乾燥し、そして重合体含量を、ホール（全）細胞のメ
タノリシスで生成されるメチル−３−ヒドロキシ酸類の
ガスクロマトグラフイによつて、測定した。
分析は、全部で12.8重量／重量％の共重合体が存在
し、そのうちの70モル％がHVコモノマー単位であること
を示した。
２回の繰返し実験を行ない、その際グルコースを炭素
化合物として維持した。各々の場合に、共重合体が生成
された。一方の場合には22.8重量／重量％の共重合体が
生成し、他方では21重量／重量％の共重合体が生成し
た。各場合に存在したHVモノマー単位の量は、それぞれ
80モル％及び75モル％であつた。
実施例 2. 実施例１を繰返したが、資化性炭素化合物としてグル
コースの代りに糖蜜を、KR培地１当り同じ重量で用い
た。
生成された共重合体の分析は、4.3％（重／重）の共
重合体が存在し、その59モル％がHVコモノマー単位であ
ることを示した。
実施例 3. 実施例１を繰返したが、資化性炭素化合物としてグル
コースの代りに酢酸ナトリウムを、KR培地１当り同じ
重量で用いた。
生成された共重合体の分析は、25％（重／重）の共重
合体が存在し、その70モル％がHVコモノマー単位である
ことを示した。
実施例 4. 実施例１を繰返したが、資化性炭素化合物としてグル
コースの代りに乳酸ナトリウムを、KR培地１当り同じ
重量で用いた。
生成された共重合体の分析は、11.2％（重／重）の共
重合体が存在し、その80モル％がHVコモノマー単位であ
ることを示した。
実施例 5. 実施例１を繰返したが、資化性炭素化合物としてグル
コースの代りにスクシン酸ナトリウムを、KR培地１当
り同じ重量で用いた。
生成された共重合体の分析は、4.1％（重／重）の共
重合体が存在し、その92モル％がHVコモノマー単位であ
ることを示した。
実施例 6. 実施例１を繰返したが、資化性炭素化合物としてグル
コースの代りにフルクトースを、KR培地１当り同じ重
量で用いた。
生成された共重合体の分析は、12.4％（重／重）の共
重合体が存在し、その80モル％がHVコモノマー単位であ
ることを示した。
実施例 7. 実施例１を繰返したが、ロードコツカス・エスピーNC
IMB 40126の代りにコリイネバクテリウム・ジオキシダ
ンスATCC 21766を用いた。
生成された共重合体の分析は、12.8％（重／重）の共
重合体が存在し、その70モル％がHVコモノマー単位であ
ることを示した。
実施例 8. 実施例１を繰返したがロードコツカス・エスピーNCIM
B 40126の代りにロードコツカス・エスピーATCC 19070
を用いた。
生成された共重合体の分析は、14.3％（重／重）の共
重合体が存在し、その49モル％がHVコモノマー単位であ
ることを示した。
実施例 9. 実施例３を繰返したがロードコツカス・エスピーNCIM
B 40126の代りにノルカルジア・ルシダNCIB 10980を用
いた。
生成された共重合体の分析は、19.8％（重／重）の共
重合体が存在し、その49モル％がHVコモノマー単位であ
ることを示した。
実施例 10. 実施例３を繰返したがロードコツカス・エスピーNCIM
B 40126の代りにコリイネバクテリウム・ヒドロカルボ
キシダンスATCC 21767を用いた。
生成された共重合体の分析は、21.1％（重／重）の共
重合体が存在し、その42モル％がHVコモノマー単位であ
ることを示した。
実施例 11. 資化性炭素化合物が従来のHV成分である基質で培養さ
れたときに、ロードコツカス・エスピーNCIMB 40126がH
Vコモノマー含有重合体を生産、蓄積する能力を、実施
例１を繰返すことによつて確認した。この際に生長制限
段階中に、実施例１のグルコースの代りにバレリアン酸
を用いた。
生成された共重合体の分析は、53.0％（重／重）の共
重合体が存在し、その98モル％がHVコモノマー単位であ
ることを示した。
実施例 12. 資化性炭素化合物がグルコースであり、かつ非HVコモ
ノマーを与えるように利用されうる成分であるような基
質で培養されたときに、ロードコツカス・エスピーNCIM
B 40126が、HVコモノマー以外のコモノマーを含む重合
体を生産、蓄積する能力を実施例１を繰返すことにより
確認した。しかしその際に、生長制限段階中に、実施例
１のグルコースの代りに４−ヒドロキシ酪酸ナトリウム
（1g/）を用いた。
生成した共重合体の分析は、16.6％（重／重）の共重
合体が存在し、その63モル％がHVコモノマー単位で、13
モル％が４−ヒドロキシブチレートコモノマー単位であ
ることを示した。
実施例 13. 実施例12を繰返したが、４−ヒドロキシ酪酸ナトリウ
ムの代りにヘキサノン酸を用いた（1g/）。
生成された共重合体の分析は、21.7％（重／重）の共
重合体が存在し、その44モル％がHVコモノマー単位で、
17モル％が３−ヒドロキシヘキサノエートコモノマー単
位であることを示した。
実施例 14. 実施例12を繰返したが、４−ヒドロキシ酪酸ナトリウ
ムの代りに５−クロロバレリアン酸を用いた（1g/
）。
生成された共重合体の分析は、25.0％（重／重）の共
重合体が存在し、その59モル％がHVコモノマー単位で、
10モル％が５−ヒドロキシバレレートコモノマー単位で
あることを示した。
実施例 15. ロードコツカス・エスピーNCIMB 40126の出発培養物
は、「ヌトリエント・ブロス（Nutrient Broth）」（Ox
oid製：以下MBと称す）中で増殖させた。
この出発培養物6mlを用いて600mlのNB培地に接種し、
細菌を30℃で24時間好気培養（振とうフラスコ）した。
24時間後、実施例１のようにして細菌を採取し、唯一
の炭素源としてバレリアン酸（5g/）を含む無窒素KR
培地（pH7.0）へ移した。30℃で振とうしつつ、さらに2
4時間のインキユベーシヨンの後に、細菌を実施例１の
ように採取し、分析した。
生成重合体の分析は、60％（重／重）の重合体が存在
したが、検出可能なHBモノマー単位が存在しないこと、
すなわち重合体が実質上HVホモポリマーであることを示
した。
この実施例は実施例11に類似しており、両者間の主た
る相異は、実施例11における細菌が、非生長制限下でグ
ルコース上で増殖されたプロセスの第１段階中に少割合
のPHBを蓄積しえたが、この実施例においてはそのよう
なグルコースがプロセスの初期段階中に存在しなかつた
ことである。
実施例１〜15の結果を次表にまとめて示す。
多数の比較実験において、コリイネバクテリウムの他
の多くの菌株を、グルコース上での増殖及び共重合体の
蓄積について実験した。使用した菌株はいずれもグルコ
ース上で生長できなかつたので、菌株の培養は初期にBH
I上で確立され、しかる後にそれらを非生長条件下のグ
ルコース含有基質へ移した。結果は下記の通りであつ
た。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 7/62 Ｃ１２Ｒ 1:365） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 ジオフリー・ウィリアム・ヘイウッド イギリス国エイチユー12・８ピーディ ー，ハル，ヘンドン，コンステイブル・ ガース ８ (72)発明者 デービッド・バイロム イギリス国ティーエス７・０ジェイジェ イ，クリーヴランド，ミドルスバラ，ナ ンソープ，ムーア・パーク 27 (56)参考文献 Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ， Ｖ ｏｌ．７，Ｎｏ．４，ｐ．421−427 （1974) Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖ ｏｌ．６，Ｎｏ．３，ｐ．248−255 （1974) Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，Ｖｏ ｌ．11，Ｎｏ．３，ｐ．490−493 （1978) Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅ ｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ：Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｅｄｉｔｉｏｎ, Ｖｏｌ．17，ｐ．1877−1881（1979) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12P 7/62 C12N 1/20 C08G 63/06 ＣＡ（ＳＴＮ)

Claims (7)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】HBモノマー単位及びHVコモノマー単位を含
    む共重合体の合成方法であって： この方法がコリイネバクテリウム・ジオキシダンス（Co
    rynebacterium dioxydans）ATCC21766、コリイネバクテ
    リウム・ヒドロカルボキシダンス（Corynebacterium hy
    drocarboxydans）ATCC21767、ノルカルジア・ルシダ（N
    orcardia lucida）NCIB10980、ロードコツカス・エスピ
    ー（Rhodococcus sp.）ATCC19070及びロードコツカス・
    エスピー（Rhodococcus sp.）NCIMB40126からなる群よ
    り選択された少なくとも１つの細菌を、増殖制限条件下
    で、HV成分を含む基質を含有する水性培地中で好気培養
    することからなり、かつそのHV成分が、アルカリゲネス
    ・ユウトロフス（Alcaligenes eutrophus）NCIB11599に
    よつて代謝されてPHBとなりうる資化性炭素化合物であ
    る、ことを特徴とする上記共重合体合成方法。
  2. 【請求項２】共重合体中のHVコモノマー単位の数が少な
    くとも５モル％である請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】HV成分がグルコース、フルクトース、酢
    酸、乳酸、酪酸、スクシン酸、糖蜜及びそれらの誘導体
    からなる群より選択される請求項１または２記載の方
    法。
  4. 【請求項４】PHVホモポリマーの合成方法であって： この方法がコリイネバクテリウム・ジオキシダンスATCC
    21766、コリイネバクテリウム・ヒドロカルボキシダン
    スATCC21767、ノルカルジア・ルシダNCIB10980、ロード
    コツカス・エスピーATCC19070及びロードコツカス・エ
    スピーNCIMB40126からなる群より選択された少なくとも
    １つの細菌の特性を有する細菌を、増殖制限条件下で、
    HV成分を含む基質を含有する水性培地中で好気培養する
    ことからなり、かつそのHV成分がバレリアン酸またはそ
    の誘導体であることを特徴とする上記PHVホモポリマー
    合成方法。
  5. 【請求項５】細菌がコリイネバクテリウム・ジオキシダ
    ンスATCC21766、コリイネバクテリウム・ヒドロカルボ
    キシダンスATCC21767、ノルカルジア・ルシダNCIB1098
    0、ロードコツカス・エスピーATCC19070及びロードコツ
    カス・エスピーNCIMB40126からなる群の少なくとも一員
    である請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
  6. 【請求項６】細菌がロードコツカス・エスピーNCIMB401
    26である請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
  7. 【請求項７】HVモノマー単位を含む重合体を合成し得る
    ロードコツカス・エスピーNCIMB40126、ならびにそれか
    ら誘導された突然変異体及び変異体の、純粋培養物。
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