KR100223341B1 - 공중합체 생산방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 하이드록시발레이트와 하이드록시부티레이트 단량체 단위로 구성된 공중합체를 더욱 효율적으로 생산하는 미생물학적 방법 및 이러한 방법에 이용하는 신규의 박테리아 예를 들어 Alcaligenes eutrophus NCIMB 40124에 관한 것이다.

Description

공중합체 생산방법.
본 발명은 3-하이드록시부티레이트(HB) 단량체 단위 및 3-하이드록시발레이트(HV) 단량체 단위로 구성된 공중합체를 미생물학적으로 생산하는 방법 및 이러한 미생물학적 방법에 사용하는 데 적당한 신규의 미생물에 관한 것이다.
폴리하이드록시부티레이트(PHB)로서 공지된 HB 단량체 단위의 단일중합는 여러 미생물, 주로 박테리아에 의해 미생물 세포 내 과립으로서의 에너지 저장 물질로서 축적된다.
이러한 세포로부터 추출된 PHB는 예를 들어 70% 이상의 비교적 높은 수준까지 결정화하는 다음 반복 구조식으로 된 열가소성 폴리에스테르이다.
-O. CH(CH3).CH2CO-
이러한 결정화 특성은 상기 중합체가 예를 들어 성형 물질로서 사용될 때 종종 불리하다.
PHB의 결정화는 다른 단량체 단위를 상기 중합체 사슬 내에 함침시켜 공중합체를 형성시키므로써 변형될 수 있음이 공지되었다. 일정한 조건하 혹종의 산과 알콜의 존재에서 혹종의 미생물을 배양시킴에 의해 HB 단량체 단위와 소량 비율의 다른 단위로 구성된 공중합체를 생산할 수 있다.
에틸렌성 불포화를 표시하는 적외선 밴드를 나타내는 중합체가 Davis에 의해 Applied Microbiology 12 (1964) 301-304 페이지에 기재되어 있다. Davis에 의해 3-하이드록시부티레이트 단위 및 3-하이드록시-2-부테노에이트 단위, 즉 다음 구조식의 단위를 함유하는 공중합체라고 언급된 이들 공중합체는 Nocardia를 n-부탄에서 배양시킴에 의해 제조되었다.
-O.C(CH3)=CH.CO-
Wallen과 그의 동료에 의한 Environmental Science and Technology 6 (1972) 161-164페이지 및 8 (1974) 576-579페이지에, 97-100℃에서 용융하고 (반복 세척 후에) 활성화된 슬러지(sludge)로 부터 분리되며 1:5 비율로 3-하이드록시부티레이트 단위와 3-하이드록시발레이트 단위, 즉 -O.CH(C2H5).CH2.CO- 단위를 함유하는 중합체가 기재되어 있다.
Marchessault와 그의 동료는 IUPAC Macro Florence 1980 International Symposium on Macromolecules Preprints 2 (1980) 272-275페이지에 상기 중합체에 관한 연구 사항을 기록했으며 이것이 주로 3-하이도록시발레이트 단위를 함유함을 확인하였다.
혹종의 미생물, 특히 Nocardia salmonicolor를 C4를 함유하는 카복실산에서 배양시킴에 의해 폴리에스테르를 미생물학적으로 생산하는 방법이 미합중국 특허 제 3275610호에 기재되어 있다.
혹종의 미생물, 특히 Alcaligenes eutrophus 돌연변이체 NCIB 11599를 적당한 기질 상에서 배양시킴에 의해 여러 폴리에스테르를 미생물학적으로 생산하는 방법이 유럽 특허 제 0069497호에 기재되어 있다.
메탄올을 제외하고 홀수의 탄소원자를 갖는 1차 알콜상에서 Alcaligenes eutrophus 돌연변이체 NCIB 12080을 배양시킴에 의해 HB와 HV의 공중합체를 미생물학적으로 생산하는 방법이 공고된 유럽 특허 출원 제 0204442호에 기재되어 있다.
공중합체를 생산하기 위해, 공중합체가 축적되는 기간중 최소 부분동안에 다른 단량체 단위를 제공할 수 있는 성분을 포함한 기질, 즉 에너지원과 탄소원을 제공하는 것이 필요하다고 공지되었다. 그러므로, 예를 들어 HB 단량체 단위와 HV 단량체 단위로 구성된 공중합체를 생산하기 위해, HV를 합성할 수 있는 성분, 예를 들어 프로피온산을 포함한 기질상에서 상기 박테리아를 배양시킬 필요가 있다.
상기 공중합체 내의 HV 단량체 단위를 제공하는 성분은 본원에서 기질의 HV 성분으로서 언급된다.
공지된 박테리아내 PHB 생산과 축적을 유도하기 위해 일반적으로 특정 배양조건이 필요하다. 이러한 특정 배양 조건은 또한 공중합체 생산과 축적을 유도하는데 필요하다.
공지된 혹종의 박테리아는 PHB를 구조적으로 생산하는데, 즉 PHB를 생산 및 축적하기 위해 특정 조건하에서 배양시킬 필요가 없다. 그러나, 상기된 특정 배양조건이 이용되지 않으면, PHB를 구조적으로 생산하는 공지의 균주들이 공중합체가 생성 및 축적되지 않도록 HV 성분을 대사시킬 수 있다.
또한, 공중합체의 생산 및 축적이 공지의 박테리아에서 유도되도록 특정 배양조건을 이용할때, 단지 소량 비율의 HV 성분이 박테리아에 의해 HV 단량체 단위로 전환된다.
그러므로, HV 성분은 단량체가 아닌 물질을 제공할 수 있거나 또는 HV 성분이 중합체 축적 단계 동안에 유일한 기질이라면 이것은 공중합체에 함침시키기 위한 HB 단량체 단위를 합성하는데 사용될 수 있다. HB 단량체 단위를 합성하기 위한 HV 성분의 대사가 HV 성분의 1/2 미만이 필요한 HV 단량체 단위로 전환되는 정도까지 일어나 HV 단량체 단위의 비율이 낮은 공중합체가 생산될 수 있다.
적어도 약간의 HV 성분이 필요한 HV 단량체 단위로 전환되고 필요한 비율의 HV 단량체 단위가 공중합체에 존재하도록 하기 위해, 과량의 HV 성분을 박테리아에 제공할 필요가 있다.
비교적 가격이 비싼 HV 성분과 관련된 낮은 전환효율로 인해 HB/HV 공중합체 생산방법에 비용이 많이 들게 된다.
또한, 기질내에 HV 성분이 상기와 같이 과량으로 존재하므로써, 박테리아를 배양하는 데 요구되는 잠재적 유해 환경이 형성된다는 점에서 공중합체 합성에 대한 통상적인 미생물학적 방법에 심각한 문제점이 있다.
HV 성분이 HB 단량체 단위로 전환하는 데 대한 주된 대사 경로를 확인하고 이러한 경로가 실질적으로 제거된 박테리아 균주를 제공함에 의해, HV 성분의 HV 단량체 단위로의 높은 전환효율로 공중합체가 합성되는 방법을 고안하는 것이 가능하다.
따라서, 증식을 제한하지 않는 조건하 HV 성분으로 구성된 기질상에서 배양시킬때 많이 증식할 수 있는 PHB 축적 박테리아를 이용해 HB와 HV 단량체 단위로 구성된 공중합체를 미생물학적으로 생산하는 방법이 제공되는 데, 이러한 방법은 박테리아의 공중합체 합성 및 축적을 돕는 증식제한 조건하에서 배지 1ℓ당 필요한 중량의 건조 세포로 수성 배지내에서 박테리아를 배양하고 그후에 공중합체를 함유한 박테리아를 회수하는 것으로 구성되며 상기 배지는 HV 성분을 함유한 수용성의 동화가능한 탄소 및 HB 성분을 함유한 수용성의 동화가능한 탄소로 구성된 기질을 포함한다.
상기 방법에서 박테리아를 배양시킬 조건들, 즉 온도, pH, 폭기, 필수 영양물질들은 PHB 축적 과정에 일반적으로 사용된 것들과 유사하다.
박테리아 증식에 필요한 이러한 필수 영양물질은 보통 수용성 염으로서 쉽사리 동화가능한 형태로 존재하는 다음 원소들, 즉 미량의 망간, 아연 및 구리와 함께 질소, 인, 황, 칼륨, 나트륨, 마그네슘, 칼슘 및 철을 포함한다.
배양중 최소 부분이 증식제한 조건, 즉, 증식에 필수적인 요구물을 제한하지만 공중합체의 축적을 제한하지 않는 조건하에서 행해진다. 이러한 증식제한 조건하에서 박테리아가 단일중합체를 생산 및 축적하는 경향이 피해지며 중합체를 함유하는 HV의 생산 및 축적이 유도된다. 박테리아에 대한 산소 공급을 제한하므로써 공중합체 축적을 유도하는 것이 가능할 수 있지만, 하나 이상의 필수 영양물질 공급을 제한하는 것이 바람직하다. 가장 실질적으로 제한되는 원소는 질소, 인 또는 덜 바람직하게 마그네슘, 황 또는 칼륨이다. 질소는 편리하게 암모늄 염 형태로 공급될 수 있으며 인은 편리하게 인산염으로서 공급될 수 있다.
질소가 제한될 경우, 바람직하게 기질에 질소가 없게 되어 HV 성분의 아미드 유도체가 덜 바람직하다. 동화가능한 질소의 필요향은 축적된 공중합체의 중량보다 적게, 필요한 세포량의 약 10-15 중량 %이다.
인이 제한될 경우도 상기와 유사하다.
박테리아 배양은 바람직하게 상기 공중합체를 함유하는 세포의 건조중량이 최소한 30g.1-1, 바람직하게 최소한 80g.1-1, 특히 최소한 120g.1-1이도록 행해진다.
사용한 박테리아는 기질에 존재하는 HV 성분을 HV 단량체 단위로 효과적으로 전환시킬 수 있다. 특히 이러한 박테리아는 HV 성분을 45몰 % 이상, 특히 최소한 60몰 %, 더욱 특히 70-80몰 %, 더욱 유리하게는 80-90몰 %의 효율로 HV 단량체 단위로 전환시킬 수 있다.
바람직하게, 특정 박테리아를 배양시키기 위한 조건들은 전환 효율을 최대화하는 것들이다.
박테리아 배양은 바람직하게 2단계 과정으로 행해진다. 첫번째 단계에서 박테리아는 증식을 제한하지 않는 조건하의 탄수화물 예를 들어 글루코스 같은 쉽게 동화가능한 기질에서 리터당 일정한 건조 중량까지 바람직하게 증식된다. 두번째 단계에서 기질은 적어도 부분적으로 HV 성분이며 증식 제한 조건이 되도록 증식에 필요한 최소한 하나의 영양물이 제한된다.
배양은 회분식 방법으로 행해질 수 있어서 중합체 축적이 증식에 필요한 영양물의 양으로서 일어날 것이지만 중합체 축적이 감소되지 않을 것이다.
또한, 배양은 연속식 또는 반연속식에 기초해 박테리아를 배양시키는 용기로부터 배양물 스트림을 제거하는 연속식 방법으로 실행될 수 있다. 용기로부터 제거한 스트림은 수성의 소모 배지내 박테리아 세포를 함유한다. 수성의 소모배지는 잔류량의 영양물과 기질을 함유한다. 용기로부터 제거되는 스트림의 유속은 용기에다 새로운 수성 배지를 부가하는 속도에 상응한다. 용기에 공급된 새로운 수성 배지는 공중합체를 축적하기에 충분한 양의 영양물과 기질을 함유한다. 바람직하게는용기에 공그보디어 박테리아 증식을 제한하는데 사용된 영양물의 양은 용기로부터 제거한 수성 소모 배지내에 이 영양물이 약간 존재하거나 전혀 존재하지않도록 하는 양이다.
또한, 수성의 소모 배지가 회분식 또는 바람직하게는 연속식 또는 반연속식 방법하에서 최소한 하나의 또다른 폭기 배양 단계에 공급되는 것이 바람직한데, 여기서 새로운 HV 성분을 함유하는 기질을 수성의 소모 배지에 부가하므로써 부가적인 공중합체 축적을 활발하게 한다. 전반적인 과정의 최적 실행을 유지하기위해 첫번째 배양 단계후에 수성의 소모 배지내 영양물과 기질의 양을 조절할 수 있다.
또한, 박테리아 배양은 단일 단계 방법으로서 행해질 수 있다. 공중합체 축적에 필요하지않지만 증식에는 필요한 영양물의 양을 제한하므로써 공중합체 축적이 유도되는 방법에서, 용기내 수성 배지의 체류 시간은 제한 영양물이 소모되고 공중합체가 축적되도록 충분히 길다.
단단계나 다단계 방법, 또는 회분식 또는 반연속식 또는 연속식 방법에서, HV 성분은 전체 공중합체 축적 단계 또는 일부분의 공중합체 축적 단계동안 유일한 탄소원으로서 기질내에 존재할 수 있거나 또는 기타 동화가능한 탄소원과 혼합될 수 있다.
수성 배지내 HV 성분의 농도는 예를 들어 원하는 공중합체 비율, 원하는 공중합체내 HV 단량체 단위의 비율 및 상기 방법이 회분식인지 연속식인지와 같은 여러가지 요인에 따라 달라진다. 상기 사용한 박테리아가 높은 전환 효율로 공중합체를 합성 및 축적할 수 있으므로, 상기 방법에 대한 배지 내 HV 성분의 농도는 비교적 낮다. 일반적으로, 박테리아를 회수할 때의 HV 성분의 농도는 바람직하게 0.1-25, 특히 5-10g.1-1이다.
HV 성분은 프로판올, 프로피온산 또는 이것의 염, 에스테르, 무수물, 아미드 또는 할라이드일 수 있다.
HV 성분으로 사용하기에 적당한 화합물들의 혼합물이 사용될 수 있다.
배양된 박테리아가 더 이상 HV 성분을 상당한 정도까지 아세틸 CoA로 대사시킬 수 없기 때문에 HV 성분을 HV 단량체 단위로 많이 전환시키는 것이 가능하다고 믿어진다.
다음과 같은 이론에 해당하기를 바라지 않더라도, HB 단량체 단위와 HV 단량체 단위로 구성된 상기 공중합체를 생성하는 대사 경로는 다음과 같으며 여기서 CoA.SH는 에스테르화되지 않은 코엔자임 A이고, CH3.CO.S.CoA는 코엔자임 A의 아세틸 티오에스테르이고 더욱 일반적으로 아세틸 CoA이며, NADP는 산화된 상태의 니코틴아미드 아데닌 디누클레오타이드 포스페이트이고, NADPH2는 환원된 NADP이다.
미생물에 의한 PHB 생합성에서 첫번째 단계가 아세틸 CoA의 합성임이 믿어진다. 이것을 예를 들어 CoA와 아세테이트로부터 형성되거나 또는 탄수화물의 해당(glycolysis) 생성물이거나 옥살로아세테이트의 탈카복실화로 만들어질 수 있는 피루베이트의 탈카복실화에 의해 형성될 수 있으며, 상기 후자 물질은 크렙스(Krebs) 회로로서 공지된 트리카복실산(TCA) 회로 중 하나의 물질이다.
그러므로 아세틸 CoA의 소스(source)로서 아세테이트를 이용해, PHB는 다음 반응들을 포함하는 대사경로에 의해 생성된다.
1. CH3.CO.O-+CoA.SH--티오키나제 -- CH3.CO.S.CoA+OH-
2. 2CH3.CO.S.CoA -- B-케토티올라제 -- CH3.CO.CH2.CO.S.CoA+CoA.SH
3. CH3.CO.CH2.CO.S.CoA+NADPH2--환원효소 --CH3.CHOH.CH2.CO.S.CoA+NADP
4. CH3.CHOH.CH2.CO.S.CoA -- 중합효소 -- -O.CH(CH3).CH2.CO- + CoA.SH
반응식중, CH3.CO.CH2.CO.S.CoA는 아세토아세틸 CoA, CH3.CHOH.CH2.CO.S.CoA는 3-하이드록시부티릴 CoA, 및 -O.CH(CH3).CH2.CO-는 중합체내 반복 단위임.
그러므로 반응식 4는 -O.CH(CH3).CH2.CO-를 증대하는 중합체 사슬에 부가하는 것이다.
포함된 효소의 특이성이 부족하므로, 예를 들어 프로피온산을 갖는 당해 경로가 다음과 같은 것이라 여겨진다.
1a. CH3.CH2.Co.O- + CoA.SH --티오키나제 -- CH3.CH2.CO.S.CoA + OH-
2a. CH3.CH2.CO.S.CoA --B 케토티올라제 -- CH3.CH2.CO.CH2.CO.S.CoA +CoA.SH
3a. NADPH2+ CH3.CH2.CO.CH2.CO.S.CoA --환원효소 -- NADP + CH3.CH2.CHOH.CH2.CO.S.CoA
4a. CH3.CH2.CHOH.CH2.CO.S.CoA --중합효소 -- -O.CH(C2H5).CH2.CO-+ CoA.SH
반응식중, CH3.CH2.CO.S.CoA는 프로피오닐 CoA, CH3.CH2.CO.CH2.CO.S.CoA는 3-케토발레릴 CoA, CH3.CH2.CHOH.CH2.CO.S.CoA는 3-하이드록시발레릴 CoA, 및 -O.CH(C2H5).CH2.CO-는 중합체내 반복 단위임.
그러므로 반응식 4a는 -O.CH(C2H5).CH2.CO-를 증대하는 중합체 사슬에 부가하는 것이다.
상기된 바와 같이 HB 단량체 단위의 합성에서의 중간산물중 하나는 그 자체가 HV 합성의 중간산물이므로, 기질이 HV 성분뿐 아니라 필요한 HB 단량체 중간산물, 즉 HB 중간산물, 즉 HB 성분으로 대사가능한 탄소원을 포함하는 것이 바람직하다. 그러므로 HB 및 HV 합성에 대한 성분들의 기질내 상대량을 조절하므로써 여러가지 비율의 HB 및 HV 단량체 단위를 함유하는 공중합체를 얻는 것이 가능하다.
본 발명의 방법에 사용하는데 적당한 박테리아는 PHB를 축적하는 균주인 Alcaligenes eutrophus를 돌연변이시키고 결과의 돌연변이체를 스크리닝(screening) 및 선별함에 의해 생성될 수 있다.
따라서, 순수 배양물로서 Alcaligenes eutrophus NCIMB 40124 균주 및 이것의 돌연변이체와 변종이 제공된다. Alcaligenes eutrophus NCIMB 40124 균주는 부다페스트 조약에 따라 1989년 3월 24일 영국, 애버딘 에이비9 8디쥐, 135 애비 로드, 피오 박스 31에 소재하는 National Collections of Industrial and Marine Bacteria Ltd(NCIMB)에 기탁되었다.
Alcaligenes eutrophus NCIMB 40124 균주 및 유용한 이것의 돌연변이체와 변종은 다음과 같은 분류학상의 설명으로 특징될 수 있다. 상기 균주 및 이것의 돌연변이체와 변종은 모균주(parent strain)인 NCIB 12080과 유사한 방법으로 PHB를 생산 및 축적할 수 있고, HB 및 HV 단량체 단위를 함유하는 공중합체를 HV 단량체로의 HV 성분의 높은 전환효율로 생산 및 축적할 수 있으며, 아세테이트로 구성된 기질상에서 증식하지만 프로피도네이트로 구성된 기질상에서 증식하지 않는다. 이러한 증식, 비증식 및 중합체 축적 특성들이 존재하는 Alcaligenes eutrophus 균주들과 신규의 Alcaligenes eutrophus 균주들을 구별짓는다. 상기 언급된 증식/비증식 특성을 평가하는 것은 증식을 제한하지않는 조건하 테스트에 사용된 물질, 즉 아세테이트 또는 프로피오네이트에 의해 기본적으로 제공되었던 탄소 함량을 지닌 기질에서 행해졌다.
(Alcaligenes eutrophus NCIMB 40124에 대한 설명)
(형태)
대략 0.8㎛ × 6.0㎛ 크기의 그람 음성(gram negative)인 운동성 막대형.
세포내 과립의 증거.
포자를 형성하지 않음.
위상차 현미경하에서 때때로 서브폴라 플라겔라(subpolar flagella)가 관찰됨.
콜로니(colony) 형태(Lab 8 영양 아가) - 상기 미생물은 둥글고 규칙적이며 불투명하고 매끈하며 흰색의 볼록한 콜로니 형태임. 3일 후에 직경은 약 2mm였음.
(온도)
5℃에서 증식하지 못했음.
37℃에서 증식했음.
45℃에서 증식하지 않았음.
(특성)
카탈라제 +
코박스 옥시다제 +
O-F 글루코스 매우 약하게 산화
피오시아닌 -
형광물질 -
L-아르기닌 CSU -
베타인 CSU -
글루코스 CSU +
락테이트 CSU +
아세테이트 CSU +
CSU 아라비노스 -
메소-이노시틀 -
크실로스 -
기체 글루코스 -
ONPG -
아르기닌 몰러(moller) -
라이신 몰러 -
오르니틴 몰러 -
NO3 -내지 NO2 --
NO3내지 N237℃에서
DNA ase -
젤라틴 안정성 -
젤라틴 플래이트 -
카제인 -
전분 -
달걀의 레시틴 -
달걀의 리파제 -
NH3약간 양성
인돌 -
H2S -
투윈(Tween) 80 +
우레아제 +
메탄올 상에서 5 또는 14일에 증식하지 않았음.
프로판 -1-올상에서 5 또는 14일에 증식하지 않았음.
아세테이트상에서 3일에 증식했음.
페니실린 G 및 스트레토마이신에 대한 내성.
클로르암페니콜, 테트라시클린, 폴리믹신 B 및 노보비오신(약간)에 대해 민감함.
본 발명에 따른 Alcaligenes eutrophus 균주는 예를 들어 삭제를 일으키는 삽입된 트랜스포슨(transposon)의 삭제, 에탄 메탄 설포네이트 같은 변이유발소를 이용한 화학적 돌연변이유발 및 시험관내 조작과 연속적인 재조합으로 인한 돌연변이를 포함해서 트랜스포슨 돌연변이유발과 같은 여러가지 방법으로 생성될 수 있다.
Alcaligenes eutrophus NCIMB 40124 균주를 다음 방법으로 제조했다.
모(parent) 배양물은 부다페스트 조약에 따라 National Collection of Industrial and Marine Ltd로부터 입수가능한 Alcaligenes eutrophus CIMB 12080이었다.
상기 모배양물을 무기염 배지와 1% 글루코스내에서 600nm에서 측정한 광밀도가 0.9가 되도록 증식시켰다. 증식된 이러한 배양물의 샘플(10ml)을 9cm의 유리 페트리 접시에 옮긴 다음 99.9%를죽이기에 충분한 조사량으로 UV 선을 조사시켰다.
이렇게 조사된 배양물을 무기염 배지와 1% 글루코스가 들어있는 플래스크에 옮기고 30℃의 어두운 곳에서 약 16시간 동안 인큐베이팅시켰다. 다음에 10ml의 인큐베이팅한 배양물을 무기염 배지, 0.075% 소듐 프로피오네이트 및 800㎍.ml-1D - 시클로세린이 들어있는 플래스크에 옮겼다. 다음에 플래스크내의 내용물을 30℃에서 약 16 시간 동안 인큐베이팅시켰다.
다음에 배양물을 원심분리하고 결과의 펠릿을 살균 증류수에 재현탁시켰다.
이러한 현탁액을 계단 희석법(serial dilution)으로 희석하여 이러한 희석액으로부터 0.1ml 부분을 1% 글루코스를 함유한 무기염 아가상에 놓았다. 다음에 이 플래이트를 인큐베이팅시키고 결과의 콜로니를 0.075% 프로피오네이트를 함유한 무기염 아가상에 다시 놓았다.
글루코스 아가 플래이트에서는 증식할 수 있지만 프로피오네이트 아가 플래이트에서는 증식할 수 없었던 콜로니들을 확인했다. 이들 콜로니를 더 관찰하기 위해 선별하였다.
선별된 돌연변이체의 콜로니를 탄소원으로서 글루코스나 아세테이트를 이용해 증식하는 이들의 능력 : 프로피오네이트에서 증식하지않은 이들의 능력 : 및 질소제한 조건하에서 글루코스와 프로피오네이트를 공급할 때 HB 단량체와 HV 단량체 단위로 구성된 공중합체를 생산 및 축적하는 이들의 능력에 대해 스크리닝하였다.
상기 기술된 과정에 따라 생산된 하나의 균주는 Alcaligenes eutrophus NCIMB 40124이다.
본 발명의 방법은 다음 실시예로 설명된다.
[실시예 1]
pH가 약 7이고 (암모니아를 부가하여 조절함) (g.1-1)로 표시된 다음 성분들을 함유한 수성 배지를 제조하였다.
MgSO4.7H2O 2.2
K2SO43.0
Na2SO40.18
FeSO4.7H2O 0.18
글루코스 13.0
미량 원소 3.0(mls)
인산 6.5(mls, 1.1M)
3ℓ의 상기 배지가 들어있는 발효조에다 Alcaligenes eutrophus NCIMB 40124의 출발 배양물을 접종시켰다.
배지의 포스페이트 함량이 한정될때까지 상기 접종된 배지를 30℃에서 24시간 동안 인큐베이팅시켰다.
다음에 글루코스와 프로피온산을 각각 10g.시간-1및 3.3g.시간-1의 속도로 48시간 동안 발효조에 공급하였다.
상기 공중합체를 함유한 세포를 회수하고 동결건조시키며 중합체 함량과 조성물에 대해 분석하였다.
[실시예 2]
글루코스 및 프로피온산의 공급 속도가 각각 6.4g.시간-1및 0.7g.시간-1이었던 것을 제외하고 실시예 1을 반복했다.
[비교 실시예 3]
Alcaligenes eutrophus NCIMB 40124 균주 대신에 Alcaligenes eutrophus NCIB 12080 균주를 사용했던 것을 제외하고 실시예 1을 반복했다.
[비교 실시예 4]
Alcaligenes eutrophus NCIMB 40124 균주 대신에 Alcaligenes eutrophus NCIB 12080 균주를 사용했던 것을 제외하고 실시예 2를 반복하였다.
실시예 1-4의 결과는 다음과 같다.
[표 1]
그러므로 본 발명에 따른 박테리아를 이용한 본 발명의 방법으로써 HV 성분이 HV 단량체 단위로 전환하는 효율이 상당히 증가할 수 있음을 알 수 있다.

Claims (7)

  1. (i)기본적으로 HV 성분으로 이루어진 기질로 비 증식제한 조건 하에서 배양시킬 경우 유의성있는 증식이 불가능하고 HV 성분이 HB 단량체 단위로 전환되는 주된 대사경로가 실질적으로 제거된 알칼리진스 속 PHB 축적 박테리아를, HB/HV 공중합체를 합성 및 축적을 유도하는 증식제한 조건 하에서 배양시키는 단계로서, 상기 PHB 축적 박테리아는 수용성의 동화가능 탄소를 함유한 HB 성분 및 수용성의 동화가능 탄소를 함유한 HV 성분을 함유하는 기질이 존재하는 수성 배지 내에서, 배지 ℓ당 최소한 30g/ℓ의 건조세포로 배양되는 단계, 및
    (ii)상기 공중합체를 함유하는 박테리아를 회수하는 단계를 포함하는, HV 성분의 HB/HV 공중합체로의 전환 효율을 향상시킬 수 있도록, HB 및 HV 단량체를 포함하는 공중합체를 미생물학적으로 생산하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 박테리아가 기질재 존재하는 HV 성분의 45% 이상을 HV 단량체 단위로 전환시킬 수 있는 방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 수성배지 내 HV 성분의 농도를 조절하여 공중합체 내의 HV 단량체 단위를 목적하는 퍼센트(%)로 얻는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, HV 성분이 프로판올, 프로피온산, 또는 이들의 동화가능한 유도체인 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 박테리아 배양이 2단계 공정을 포함하는 방법으로서, 제 1단계에서는 증식을 제한하지 않는 조건하에서 쉽게 대사가능한 기질로 ℓ 당 필요한 건조 중량까지 박테리아를 증식시키고, 제 2단계에서는 기질이 최소한 부분적으로 HV 성분이고, 증식에 요구되는 하나 이상의 영양분을 제한시켜 증식 제한 조건이 존재하도록 하는 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 동화가능한 질소 및/또는 인의 유효량을 제한하여 증식제한 조건이 되도록 하는 방법.
  7. 기본적으로 HV 성분이 제공된 수용성 탄소 성분을 함유한 기질로 비 증식제한 조건 하에서 배양시킬 경우 유의성 있는 증식이 불가능한 알칼리진스 유트로퍼스(Alcaligenes eutrophus) 균주 NCIMB 40124.
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