JP4790912B2

JP4790912B2 - ポリヒドロキシアルカノエートを精製するための方法

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Publication number: JP4790912B2
Application number: JP2000616375A
Authority: JP
Inventors: ダニエルホロウィッツ，
Original assignee: メタボリックス，インコーポレイテッド
Priority date: 1999-05-12
Filing date: 2000-05-12
Publication date: 2011-10-12
Anticipated expiration: 2020-05-12
Also published as: CA2373131C; DE60019098T2; WO2000068409A1; ES2239004T3; JP2002543794A; AU4844000A; CA2373131A1; US20020058316A1; AU750835B2; DE60019098D1; EP1175499B1; ATE292188T1; EP1175499A1; US6340580B1

Description

【０００１】
（発明の背景）
本発明は、一般に、微生物バイオマスまたは植物バイオマスからポリヒドロキシアルカノエート（「ＰＨＡ」）を回収するための方法に関する。ＰＨＡ生合成経路のより改善された理解は、有意な量のＰＨＡを生成するために、微生物（天然および組み換えの両方）、ならびに植物細胞の使用を可能にした。しかし、有用なレベルの品質および純度での、これらの生物学的供給源物質からのＰＨＡの効率的かつ費用効果的回収の開発における、困難さが残る。バイオマスからのＰＨＡの単離および精製のための以前の方法は、例えば、水性経路および有機溶媒経路を含んでいた。
【０００２】
例えば、Ｂｙｒｏｍの米国特許第５，３６４，７７８号は、ＰＨＡを含むバイオマスは、ＰＨＡが一般に不溶性である水性スラリーとして維持される水性の方法を開示する。このスラリーは、消化、分解、またはそうでなければ非ＰＨＡバイオマスを水溶性にするために設計された種々の処理に供される。次いで、この可溶化されたバイオマスは、遠心分離、濾過、または他の手段によってスラリーから除去される。しかし、水性ベースの経路は、一般に、特定の不利な点を有し、特に大規模処理に適用される場合にである。これらの不利な点の例には、以下が挙げられる；（ａ）有効な精製が、より困難になる。なぜなら、多くの不純物（可溶化処理のために有用ないくつかの界面活性剤を含む）は、、ＰＨＡ粒子の表面にきつく吸着されるからである；（ｂ）多くの容積（すなわち、大量）の洗浄水が、プロセスによって必要とされ得、使用ずみ洗浄水およびそれに付随する処理の困難さを生じる；（ｃ）高純度のＰＨＡを得るために、複数の可溶化処理を必要とされ得る；（ｄ）水ベースのＰＨＡスラリーの乾燥は、時間浪費であり、そして経費がかかり得る；（ｅ）ＰＨＡ粒子は、濾過膜、遠心分離器、および他のプロセス装置の広範な汚損を引き起こし得る；ならびに（ｆ）可溶化処理は、有効であるために、費用のかかる試薬および長いプロセス時間および高温を必要とし得る。
【０００３】
有機溶媒ベースの方法のプロセスの例は、Ｌａｆｆｅｒｔｙらの米国特許第４，１０１，５３３号およびＯｈｌｅｙｅｒの同第５，４２２，２５７号に開示される。これらの方法において、バイオマスに含まれるＰＨＡのための有機溶媒は、バイオマスと混合され、ＰＨＡの溶解を生じる。次いで、ＰＨＡを含む有機溶液は、濾過、遠心分離、または他の手段によって、残る不溶性のバイオマスから分離される。次いで、有機溶液をＰＨＡを回収するために脱溶媒化（ｄｅｓｏｌｖｅｎｔｉｚｅ）する。これらの有機溶媒経路は、水性経路と関連する不利な点と類似する不利な点を被り、これらの不利な点は、以下を含む：（ａ）比較的大量の溶媒が、バイオマスからＰＨＡを完全に抽出するために必要とされる；（ｂ）バイオマスは、溶媒抽出の前に乾燥される必要があり得、これは、費用がかさみ、そして時間を浪費し得る；そして（ｃ）溶媒は、ＰＨＡとともに不純物（例えば、脂質または他の疎水性生物学的物質）を同時抽出し得、満足できる純度のＰＨＡを得るために、さらなる抽出の処理を必要とする。ＰＨＡ含有バイオマスからＰＨＡを回収するための、改善された、より費用効果的なプロセスを開発することは、有利である。
【０００４】
従って、本発明の目的は、より単純で比較的に迅速であり水性溶媒および／または有機溶媒をより効率的に使用し、そして従来のプロセスより純粋なＰＨＡをおそらく得るプロセスを使用して、ＰＨＡ含有バイオマスからＰＨＡを回収する方法を提供することである。
【０００５】
本発明の別の目的は、工業用スケールでの製造プロセスにおいて経済的に使用され得るプロセスを使用して、ＰＨＡ含有バイオマスからＰＨＡを回収する方法を提供することである。
【０００６】
（発明の要旨）
ＰＨＡを含むバイオマスからＰＨＡを単離および精製するための方法が提供される。この方法は、バイオマスを細胞を除去するための濾過プロセスに同時に供しつつ、少なくとも１つの溶媒を使用してバイオマスからＰＨＡを抽出する工程を包含する。この方法の好ましい実施形態において、ＰＨＡを含むバイオマス（例えば、発酵プロセスから得られる微生物細胞の水性スラリー）は、ＰＨＡを得るために、有機溶媒を使用してディアフィルトレーションによって直接抽出される。
【０００７】
好ましいディアフィルトレーションプロセスにおいて、ＰＨＡを含む微生物細胞の水性スラリーは、濾過膜を通して再循環され、ここで、この膜は、個々の細胞またはスラリー内に存在し得る細胞の凝集体を拒絶するほど十分に小さな細孔サイズを有する。濾過膜からの液体の流出は、濾過膜を横切って、圧力低下が存在するような条件下で起こる。液体が、バイオマススラリーから次第に除去されるにつれて、有機溶媒、好ましくは、ＰＨＡについての溶媒でもある水混和性溶媒が、バイオマススラリーに添加される。この溶媒添加は、バイオマススリラーの体積を維持するために、フィルターを通る液体浸透の速度に近い速度でなされなくてはならない。スラリー中の有機溶媒の濃度が増加するにつれて、水に不溶性の種々の不純物が溶媒−水混合物に溶解するようになり、そしてフィルター膜を通過する。有機溶媒濃度が特定のレベルに達すると、ＰＨＡは、可溶性になり、そして濾過膜を通って流れる。次いで、ＰＨＡを含む濾液を、ポリマーを回収するために、脱溶媒化した。
【０００８】
この方法は、以下の利点を有する：（ａ）溶媒抽出の前に、バイオマスを乾燥する必要が一般にない；（ｂ）単一プロセスで比較的純粋なＰＨＡを得るために、他の不純物からＰＨＡを分画することが容易に可能である。なぜなら、バイオマスは、溶媒濃度の勾配に供されるからである；（ｃ）バイオマスからＰＨＡを抽出し、そして精製する全プロセスは、最小のプロセス段階および装置を使用して達成され得る；ならびに（ｄ）この方法は、特に、バイオマススラリーが、比較的濃縮され、そしてディアフィルトレーションが、一定体積ディアフィルトレーションで行われる場合、効率的に溶媒を使用する。さらに、揮発性有機溶媒を使用することによって、ＰＨＡ溶液を脱溶媒化し、そしてディアフィルトレーションプロセスにおいて生成される濾液から溶媒を回収および再利用することは、比較的容易である
（発明の詳細な説明）
ＰＨＡを含むバイオマスからポリヒドロキシアルカノエート（「ＰＨＡ」）を単離および精製するための方法が開発されてきた。この方法は、同時にバイオマスを、細胞を取り除くために濾過プロセスに供しながら、少なくとも１つの溶媒を使用してバイオマスからＰＨＡを抽出する工程を包含する。
【０００９】
（Ｉ．ＰＨＡ含有バイオマス）
バイオマス物質は、ＰＨＡ生成植物またはＰＨＡ生成微生物由来である。
【００１０】
（ポリマー組成物）
本明細書中で使用される場合、「ポリヒドロキシアルカノエート」および「ＰＨＡ」は、以下の式Ｉの１つ以上の単位、例えば、１０と１００，０００との間、好ましくは１００と３０，０００との間の単位を含むポリマーをいう：
−ＯＣＲ¹Ｒ²（ＣＲ³Ｒ⁴）_nＣＯ−；
ここで、ｎは、例えば、１と１５との間の整数であり、好ましい実施形態において、１と４との間の整数であり；そして
ここで、Ｒ^l、Ｒ²、Ｒ³、およびＲ⁴は、独立して、以下であり得る：炭化水素基（長鎖炭化水素基を含む）；ハロ置換基およびヒドロキシ置換基；ヒドロキシ基；ハロゲン基；窒素置換基；酸素置換基；および／または水素原子。
【００１１】
本明細書中で使用される場合、式−（ＣＲ³Ｒ⁴）_n−は、以下の式を含むように定義される：
−ＣＲ³Ｒ⁴−（ここで、ｎ＝１）；
−ＣＲ³Ｒ⁴ＣＲ³’Ｒ⁴’−（ここで、ｎ＝２）；および
−ＣＲ³Ｒ⁴ＣＲ³’Ｒ⁴’ＣＲ³”Ｒ⁴”−（ここで、ｎ＝３）；
ここで、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ³’、Ｒ⁴’、Ｒ³”、およびＲ⁴”は、独立して、以下であり得る：炭化水素基（長鎖炭化水素基を含む）；ハロ置換基およびヒドロキシ置換基；ヒドロキシ基；ハロゲン基；窒素置換基；酸素置換基；および／または水素原子。従って、式Ｉは、以下から誘導される単位を含む：２−ヒドロキシ酸（ｎ＝０）、３−ヒドロキシ酸（ｎ＝１）、４−ヒドロキシ酸（ｎ＝２）、および５−ヒドロキシ酸（ｎ＝３）、ならびに６−ヒドロキシ酸（ｎ＝４）。
【００１２】
これらの単位は、ホモポリマーにおいて同じであり得るか、または例えば、コポリマーまたはターポリマーにおいて、より異なる単位であり得る。これらのポリマーは、代表的に、３００を超える分子量、例えば、３００と１０⁷との間の分子量、および好ましい実施形態において、１０，０００〜１０，０００，０００Ｄａｌｔｏｎの分子量を有する。
【００１３】
好ましいＰＨＡには、ポリ−３−ヒドロキシオクタノエート（ＰＨＯ）または他の微生物性ポリエステル（Ｃ６〜Ｃ１４ヒドロキシ酸のヒドロキシ酸を含む）。他の好ましいポリマーには、以下が挙げられる：ポリ−３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３ヒドロキシバレレート、ポリ−３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシプロピオネート、ポリ−３ヒドロキシブチレート−ｃｏ−４−ヒドロキシブチレート、ポリ−３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−４−ヒドロキシバレレート、ポリ−３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサノエート、ポリ−３ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシオクタノエート、ポリ−４−ヒドロキシブチレート、ポリ−３−ヒドロキシプロピオネート、ポリ−４−ヒドロキシバレレート。
【００１４】
（ＰＨＡ含有バイオマスの供給源）
ＰＨＡバイオマスは、代表的に、発酵プロセス（ここで、生物学的供給源は、ＰＨＡを天然に生成するか、または培養条件および供給原料の操作、または微生物によってＰＨＡを生成するように誘導され得る微生物である）から生成されるか、または植物または植物部分（これらは、それらがＰＨＡを生成するように遺伝操作されている）において生成される。
【００１５】
（（ｉ）微生物供給源）
天然にポリヒドロキシアルカノエートを生成する微生物からＰＨＡポリマーを生成するために使用され得る方法は、Ｈｏｌｍｅｓの米国特許第４，９１０，１４５号；Ｂｒａｕｎｅｇｇら，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６５：１２７−１６１（１９９８）に記載されている。
【００１６】
天然または遺伝子操作された生物においてＰＨＡを生成するための方法は、Ｍａｄｉｓｏｎ＆Ｈｕｉｓｍａｎ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６３：１−５３（１９９９）；Ｃｈｏｉ＆Ｌｅｅ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５１：１３−２１（１９９９）；Ｗｉｔｈｏｌｔ＆Ｋｅｓｓｌｅｒ，ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：２７９−２８５（１９９９）；Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｐｅｏｐｌｅｓ，ＣＨＥＭＴＥＣＨ，２６：３８−４４（１９９６）：ＰｅｏｐｌｅｓおよびＳｉｎｓｋｅｙの米国特許第５，２４５，０２３号；同第５，２５０，４３０号；同第５，４８０，７９４号；同第５，５１２，６６９号；同第５，５３４，４３２号；ならびにＨｕｂｂｓらの米国特許第５，５６３，２３９号に記載される。Ｓｈｉｏｔａｎｉらの米国特許第５，２９２，８６０号は、ＰＨＡコポリマーであるポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサノエート）の製造を記載する。Ｎａｙｌｏｒの米国特許第５，８７１，８９０号は、植物油供給原料に対してＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｅｕｔｒｏｐｈｕｓを発酵させることによるＰＨＡの製造を記載する。
【００１７】
（（ｉｉ）植物供給源）
ＰＨＡは、本質的に任意の植物のタイプから回収され得、この植物は、ＰＨＡの生成に対して多くの利点を提供するトランスジェニック植物を含む。ＰＨＡの生成のためのトランスジェニック作物植物は、当該分野で利用可能な方法を使用して得られ得る。（Ｕ．Ｓ．５，２４５，０２３およびＵ．Ｓ．５，２５０，４３０；Ｕ．Ｓ．５，５０２，２７３；Ｕ．Ｓ．５，５３４，４３２；Ｕ．Ｓ．５，６０２，３２１；Ｕ．Ｓ．５，６１０，０４１；ＰＣＴＷＯ，９１００９１７，ＷＯ９２１９７４７，ＷＯ９３０２１８７，ＷＯ９３０２１９４およびＷＯ９４１２０１４；Ｐｏｉｒｉｅｒら，１９９２Ｓｃｉｅｎｃｅ２５６：５２０−２３，ｖａｎｄｅｒＬｅｉｊおよびＷｉｔｈｏｌｔ，１９９５，Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４１（補遺）：２２２−３８；ＮａｗｒａｔｈおよびＰｏｉｒｉｅｒ，１９９６，ＴｈｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；ＳｙｍｐｏｓｉｕｍｏｎＢａｃｔｅｒｉａｌＰｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅｓ，Ｅｇｇｉｎｋら編、ＤａｖｏｓＳｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，Ａｕｇｕｓｔ１８−２３に示される；ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＰｅｏｐｌｅｓ，１９９６，ＣＨＥＭＴＥＣＨ２６：３８−４４）。トランスジェニック植物作物は、石油化学誘導プラスティックと競合する価格および規模の両方でＰＨＡポリマーを生成し得る。トランスジェニック植物誘導ＰＨＡポリマーまたはそれらの誘導体は、商業的に有用な形態で植物バイオマスから処理および分離され得る。植物作物におけるＰＨＡの位置は、植物からのＰＨＡの収量を最大にするために変化され得る。例えば、植物は、単子葉植物または双子葉植物であり得、そして適切な植物供給源物質は、根、茎、葉、花、果実および種子から誘導され得る。
【００１８】
ＰＨＡは、以下のような植物から誘導される植物バイオマスから単離され得る：ダイズ、ワタ、ココナツ、ラッカセイ、アブラナ、ヒマワリの種子、オリーブ、ヤシ、ゴマの種子、アマの種子、トウゴマ、ベニバナの種子、タバコ、サトウキビ、スイッチグラス（ｓｗｉｔｈｃｈｇｒａｓｓ）、およびジャガイモ。ＰＨＡポリマーに加えて、種子作物植物における植物油は、処理の間に、単離および回収され得、Ｍｅｔａｂｏｌｉｘ，Ｉｎｃ．のＰＣＴＷＯ９７／１５６８１および米国特許出願第０８／５４８，８４０号に記載される。植物バイオマスを処理するためのこの方法は、単離される特定のＰＨＡポリマーまたは誘導体の特性に基づいて、そして植物作物のタイプおよび抽出される植物成分に基づいて、変更され得る。
【００１９】
（ＩＩＩ．バイオマスからのＰＨＡ回収のためのプロセス）
この方法は、同時にバイオマスを、細胞を除去するための濾過プロセスに供しながら、少なくとも１つの溶媒を使用してバイオマスからＰＨＡを抽出する工程を包含する。
【００２０】
（ディアフィルトレーション（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ））
この方法の好ましい実施形態において、ＰＨＡを含むバイオマス（例えば、発酵プロセスから得られた微生物細胞の水性スラリー）を、水性希釈剤の代わりに有機溶媒を使用する代表的なディアフィルトレーションプロセスの改変により直接抽出する。標準的なディアフィルトレーションプロセスは、当該分野で周知であり、そして例えばＺｅｍａｎおよびＺｙｄｎｅｙ（ＭｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎａｎｄＵｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮｅｗＹｏｒｋ、３９１−９６頁（１９９６）によって記載される。この改変されたプロセスの間、有機溶媒の濃度が増加するにつれて、ＰＨＡは溶解され、そして集められる溶離液中に現れる。次いでＰＨＡを、ＰＨＡを回収するための標準的な手順（非溶媒中での沈澱、溶媒エバポレーションまたはストリッピングを含む）により溶離液から回収する。この溶媒含有溶離液を残し、そして蒸留または当該分野で周知の他の技術により溶媒を回収する。
【００２１】
この方法の好ましい実施形態において、ＰＨＡを含むバイオマス（例えば、発酵プロセスから得られた微生物細胞の水性スラリー）を、有機溶媒を使用するディアフィルトレーションにより直接抽出して、ＰＨＡを得る。
【００２２】
この方法は、以下のような利点を有する：（ａ）一般的に、溶媒抽出の前にバイオマスを乾燥する必要がないこと；（ｂ）バイオマスが溶媒濃度の勾配に供されるので、他の不純物からＰＨＡを分画して比較的純粋なＰＨＡを単一のプロセスで得ることが容易に可能であること；（ｃ）バイオマスからＰＨＡを抽出および精製するプロセス全体が、最小限のプロセス段階および装置を使用して達成され得ること；ならびに（ｄ）特にバイオマススラリーが比較的濃縮されている場合およびディアフィルトレーションが一定のスラリー体積で行われる（「一定体積ディアフィルトレーション」）場合、この方法は効率的に溶媒を使用するということ。さらに、揮発性の有機溶媒を使用することにより、ＰＨＡ溶液を脱溶媒化すること、およびその溶媒を、ディアフィルトレーションプロセスにおいて生成された濾液から回収および再使用することは、比較的容易である。
【００２３】
好ましいディアフィルトレーションプロセスにおいて、ＰＨＡを含む微生物細胞水性スラリーを濾過膜を通して再循環させ、ここでこの膜は、個々の細胞またはスラリー中に存在し得るような細胞の凝集体を拒絶するのに十分小さい細孔サイズを有する。濾過膜からの液体、水溶液であり得る濾液、水溶液／混和性溶媒混合物、または溶媒の流出が、濾過膜を横切る圧力低下が存在する条件下で起こる。液体が段々とバイオマススラリーから除去されるにつれて、有機溶媒（好ましくは、ＰＨＡの溶媒でもある水混和性溶媒）はバイオマススラリーに添加される。溶媒添加は、バイオマススラリーの体積を維持するために、およそフィルターを通る液体浸透の速度に近い速度でなされるべきである。スラリー中の有機溶媒の濃度が増加するにつれて、水に不溶性の種々の不純物が溶媒−水混合物中に溶解されるようになり、そしてフィルター膜を通過する。有機溶媒濃度が、特定のレベルに達する場合、ＰＨＡは可溶性になり、そして濾過膜を通って流れる。次いでＰＨＡを含む濾液は、ポリマーを回収するために脱溶媒化される。
【００２４】
（有機溶媒および溶媒回収）
バイオマスからＰＨＡを抽出するために適切な溶媒は、ＰＨＡを抽出し得る任意の水混和性溶媒である。例えば、Ｎｏｄａへの米国特許第５，８２１，２９９号および同第５，９４２，５９７号；Ｋｕｒｄｉｋａｒへの米国特許第６，０４３，０６３号；ならびにＭｅｔａｂｏｌｉｘ，ＩｎｃへのＰＣＴＷＯ９７／１５６８１に記載されるように、異なるＰＨＡポリマー組成物を抽出するためにどの溶媒が適切かは、当該分野で周知である。
【００２５】
Ｃ６〜Ｃ１４の長さのヒドロキシ酸を含む、ＰＨＡ類（例えば、ポリ−３−ヒドロキシオクタノエート（ＰＨＯ））または他の微生物ポリエステルのために好ましい有機溶媒は、アセトンである。アセトンはまた、ポリ−３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−４−ヒドロキシブチレートの抽出に適切である。他のケトンおよびアルコール（特にＣ２より上のアルコール）は、上記のように使用され得る。ＰＨＯについては、ポリエステルの可溶化は、典型的には水中の８５〜９８％（体積ベース）のアセトン濃度で起こる。
【００２６】
本明細書中に記載される方法において有用な有機溶媒としては、ハロゲン化溶媒および非ハロゲン化溶媒の両方が挙げられる。代表例としては、環式および非環式（直鎖および分枝）のＲ’−−ＯＨアルコール（ここでＲ’＝Ｃ₄〜Ｃ₁₀）、環式および非環式のＲ’’−−ＣＯＯＲ’’’エステル（ここでＲ’’＝ＨまたはＣ₁〜Ｃ₆かつＲ’’’＝Ｃ₁〜Ｃ₇）、環式および非環式のＲ’’−−ＣＯＯＲ’’’ エステル（ここでＲ’’＝ＨまたはＣ₁〜Ｃ₆かつＲ’’’＝Ｃ₁〜Ｃ₇、そしてＲ’’またはＲ’’’中の少なくとも１つの炭素が少なくとも１つの酸素で置換される）、環式および非環式のＲ¹−−ＣＯＮ−−（Ｒ²）₂アミド（ここでＲ¹＝ＨまたはＣ₁〜Ｃ₆かつＲ²＝Ｃ₁〜Ｃ₆）、ならびに環式および非環式のＲ³−−ＣＯ−Ｒ⁴ケトン（ここでＲ³＝ＨまたはＣ₁〜Ｃ₆かつＲ⁴＝Ｃ₁〜Ｃ₆）から選択される溶媒が挙げられる。
【００２７】
特定の例としては、以下が挙げられる：アセトン、酢酸ブチル、酢酸イソブチル、乳酸エチル、酢酸イソアミル、酢酸ベンジル、酢酸２−メトキシエチル、酢酸テトラヒドロフルフリル、プロピオン酸プロピル、プロピオン酸ブチル、プロピオン酸ペンチル、酪酸ブチル、イソ酪酸イソブチル、酪酸エチル、吉草酸エチル、吉草酸メチル、安息香酸ベンジル、安息香酸メチル、コハク酸ジメチル、グルタミン酸ジメチル、アジピン酸ジメチル、イソブチルアルコール、１−ブタノール、２−メチル−１−ブタノール、３−メチル−１−ブタノール、１−ペンタノール、３−ペンタノール、アミルアルコール、アリルアルコール、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール、シクロヘキサノール、２−エチルヘキサノール、テトラヒドロフルフリルアルコール、フルフリルアルコール、ベンジルアルコール、２−フラルデヒド（ｆｒａｌｄｅｈｙｄｅ）、メチルイソブチルケトン、メチルエチルケトン、ｇ−ブチロラクトン、メチルｎ−アミルケトン、５−メチル−２−ヘキサノン、エチルベンゼン、１，３−ジメトキシベンゼン、クメン、ベンズアルデヒド、１，２−プロパンジオール、１，２−ジアミノプロパン、エチレングリコールジエチルエーテル、１，２，３−トリメチルベンゼン、１，２，４−トリメチルベンゼン、１，３−ジオキサン、１，４−ジオキサン、１−ニトロプロパン、トルエン−２，４−ジイソシアネート、酢酸、アクリル酸、無水酢酸、α−メチルスチレン、アセトフェノン、トルエン、二酢酸エチレングリコール、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミドおよびプロピレンカーボネート。
【００２８】
使用され得る溶媒としては、塩素化有機溶媒（例えば、クロロホルム、塩化メチレン、ジクロロエタン、トリクロロエタン、テトラクロロエタンおよびジクロロアセテート）を含む溶媒または溶媒混合物が挙げられる。例えば、炭化水素安定化クロロホルムが使用され得る。使用され得る微生物供給源からＰＨＡ類を抽出するために使用されてきた他の溶媒としては、アルキルカーボネート（たとえば、プロピレンカーボネートおよびエチレンカーボネート）、トリフルオロエタノール、無水酢酸、ジメチルホルムアミド、アセト酢酸エチル、トリオレイン、トルエン、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、ピリジン、ヒドロキシ酸および３つより多くの炭素原子を有するアルコール、ならびにそれらの混合物が挙げられる。
【００２９】
溶媒回収は、当業者に周知のプロセスにより実行され得、このプロセスとしては、蒸留、または水と混和性でない第２の溶媒もしくは溶媒混合物中への抽出およびそれに続く蒸留による分離が挙げられる。
【００３０】
（溶離液または濾液からのＰＨＡの回収）
一旦ポリマーが濾液または溶離液中に現れると、ポリマーを溶媒から回収すること、およびまた溶媒を回収することが必要である。これを行う技術はまた、当該分野で周知であり、そしてこれらの技術としては、溶媒ストリッピングまたはエバポレーション、蒸気ストリッピングまたは非溶媒を用いる溶媒沈澱が挙げられる。
【００３１】
本明細書中に記載される組成物および方法は、以下の非限定的な実施例を参照してさらに理解される。
【００３２】
（実施例１：ＰＨＡ含有微生物バイオマスの代表的製造）
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種細菌を、以下のように発酵させ、ＰＨＡを生成する。オクタン酸（ｐｒｉｆｒａｃ２９０１）を、ＵｎｉｃｈｅｍａＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｃｈｉｃａｇｏ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ（全てのほかの化学物質は試薬グレードであった）から入手した。培地Ａは、脱イオン水および以下を含んだ（最終体積１Ｌあたり）：オクタン酸（２．１６ｇ）、ＮａＮＨ₄ＨＰＯ₄（３．８ｇ）、Ｋ₂ＨＰＯ₄（５．７ｇ）、ＫＨ₂ＰＯ₄（３．７ｇ）、ＭｇＳＯ₄（０．１２ｇ）、ＣａＣｌ₂（２０ｍｇ）、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ（４０ｍｇ）、ＭｎＳＯ₄・Ｈ₂Ｏ（１０ｍｇ）、ＣｏＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ（４．５ｍｇ）、ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ（２ｍｇ）、Ｎａ₂ＭｏＯ₄・２Ｈ₂Ｏ（２ｍｇ）、ＣｕＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ（１ｍｇ）、Ａｌ₂（ＳＯ₄）３・１６Ｈ₂Ｏ（１．３ｍｇ）、Ｈ₃ＢＯ₄（４６５μｇ）、ＮｉＳＯ₄・６Ｈ₂Ｏ（１８０μｇ）、トウモロコシ浸漬液（ｃｏｒｎｓｔｅｅｐｌｉｑｕｏｒ）（Ｓｉｇｍａ、０．５ｍＬ）。オクタン酸を除く全ての成分を、加熱（１２１．５℃）または濾過により滅菌し、そして無菌で容器に移した。ｐＨを６．７に調節し、そしてその値に全ての発酵を通して維持した（±０．１ｐＨ単位）。ｐＨ制御を３０％（ｗｔ／ｗｔ）水性アンモニアおよび８５％（ｗｔ／ｗｔ）リン酸を使用して実施し、これらを必要な場合自動ｐＨコントローラーを介して添加した。消泡剤（ＩｎｓｐｅｃＧｒｏｕｐ，Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ．ＵＫから入手したＢｒｅｏｘＦＭＴ３０）を必要な場合発酵の間に添加した。
【００３３】
この培養に以下のように代謝（［ＤＯ］）コントロール下、規定された培地用量を与えた。各規定された培地用量は、別々の添加ポートを通して培地に同時に添加される３つの副用量からなった。副用量番号１は、オクタン酸（最初の培地体積１Ｌあたり１．４６ｇ）からなり；副用量番号２は、３０％（ｗｔ／ｗｔ）水性アンモニア（最初の培地体積１Ｌあたり０．３６ｇ）からなり；副用量番号３は、０．３ＭＭｇＳＯ₄（最初の培地体積１Ｌあたり０．４ｍＬ）からなった。単一の規定された培地用量を発酵槽に与えるために必要とされる時間は、約２分であった。各規定された培地用量は、約１．３ｇ／の総固体を生成するために充分な栄養物を与えた。
【００３４】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａを凍結培地中で貯蔵し、そして１．５％寒天プレート（培地Ａ）上で増殖させた。凍結培地を解凍し、プレートし、そして４８時間３０℃で増殖させた。次いで、単一のコロニーを再プレートし、そして２４時間３０℃で増殖させた。次いで単一のコロニーを選択し、そして液体培地Ａ（１Ｌ）中に移し、そして振盪器で３０℃にて２４時間増殖させた。次いでこの種培地を規定された培地Ａ（６０Ｌ）を含む１５０Ｌの発酵槽中に３０℃で移した。この発酵槽は、単一の［ＤＯ］プロープおよびｐＨプローブを備えた。この培地を３０℃で、攪拌（インペラー速度１５０〜６００ｒｐｍ）および３ｐｓｉ（２０．７ＭＰａ）のヘッド圧力で空気を通気（６０Ｌ／分）しながら、発酵させた。攪拌速度を発酵の過程で徐々に増加した。溶解酸素濃度を連続的にモニターし、そして測定された［ＤＯ］の持続した（＞１０秒）、有意な（普通の（ｐｒｅｖａｉｌｉｎｇ）ベースラインを超えて＞１０％の飽和率（ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ）増加）、各々の増加に応じて、規定された培地用量を与えた。発酵の最初の８〜９時間の間、［ＤＯ］は、１００％から約０％に飽和率が一様に低下した。その後、［ＤＯ］は、約０％飽和率のベースライン条件で持続した。攪拌および通気速度を［ＤＯ］＝１％飽和率に対するこれらの範囲内になるように制御した。１０％飽和率を超える［ＤＯ］の持続した増加は、炭素源の枯渇の結果であるとみなされ、そして規定された培地用量の自動添加を開始させた。各用量の添加は、［ＤＯ］を減少させてベースライン条件に戻す。しかし、フィードバック機構は、［ＤＯ］がゆっくりと１０％飽和率より下に戻る場合には、複数の規定された培地用量の添加を妨げる。合計２４の規定された用量が、２１時間の発酵の過程で与えられた。
【００３５】
上記の発酵の完了の直後に、この培地を６４０Ｌの規定された培地Ａを含む１５００Ｌの発酵槽内に無菌で移した。この発酵槽は単一の［ＤＯ］プローブおよびｐＨプローブならびに質量分析排ガス分析機を備えていた。発酵を、上記と同様の条件下で、３０℃の温度で、攪拌（インペラー速度６０〜２１０ｒｐｍ）しながら、そして３ｐｓｉ（２０．７ＭＰａ）のヘッド圧力で空気を通気（６００〜９５０Ｌ／分）しながら実施した。接種後、［ＤＯ］は迅速に（３時間以内）０％飽和率近くまで低下した。攪拌および通気速度を、［ＤＯ］＝１％飽和率に維持するように上記の範囲内に制御した。この発酵を４１時間続けた。
【００３６】
最終培地は、６６．３％がＰＨＡである１１６．７ｇ／Ｌの乾燥固体を含む７５０Ｌからなった。このＰＨＡは、以下のモノマー組成を有していた：Ｒ−３−ヒドロキシヘキサン酸（１０％）、Ｒ−３−ヒドロキシオクタン酸（８８％）、Ｒ−３−ヒドロキシデカン酸（２％）。単離されたポリマーは、Ｍ_w＝１１５，０００；Ｍ_n＝７０，０００（ＣＨＣｌ₃でのＧＰＣ）；Ｔ_m＝５０℃；およびＴ_g＝−３８℃を示した。
【００３７】
（実施例２：微生物バイオマスからのＰＨＡの回収）
ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）を含む細胞スラリーを、以下のように処理して、精製されたポリマーを得た。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．細菌の細胞を、実施例１に記載のように、主にオクタン酸およびデカン酸（Ｃ８１０ＦａｔｔｙＡｃｉｄ，Ｐｒｏｃｔｅｒ＆Ｇａｍｂｌｅ、組成５６％Ｃ８，３９％Ｃ１０、残りは他の脂肪酸）を含む市販の混合物上で発酵させた。最初のスラリー（５Ｌ）（これは約１３％（ｗｔ／ｗｔ）の懸濁された固体を含む）を４０００ｇで２０分間遠心分離した。ペレット画分をその元々の体積になるまで脱イオン水に再懸濁し、次いで同一の条件下で再遠心分離した。次いで、ペレット画分を元々の体積になるまでアセトンに再懸濁した。次いで、細胞材料、水およびアセトン（総固体＝１２．８％（ｗｔ／ｗｔ））を含むこのスラリーを、以下に記載される実験装置を使用して処理した。
【００３８】
実験用微細濾過装置は、０．６ＭＰａのヘッド圧に対して少なくとも１５Ｌ／分の流速が可能な、防爆の、可変速度の、偏心スクリューポンプ（Ａｌｌｗｅｉｌｅｒ）；ステンレス鋼およびポリプロピレンの配管回路；およびアルミナセラミックの管状微細濾過要素（Ｕ．Ｓ．ＦｉｌｔｅｒＭｅｍｂｒａｌｏｘＩＴＩ−７０，０．５μｍの名目上カットオフ、０．００５５ｍ²の膜面積）を含むハウジングを備えていた。さらに、この装置は、圧力ゲージ、温度プローブ、圧力調節のためのボール弁、および２０Ｌの被覆スラリータンクを備えていた。調節可能な供給ポンプを介するアセトンの連続的な添加により、スラリータンク中の液体レベルをほぼ一定に維持した。操作の間、スラリーを約１５Ｌ／分の横断流および０．３〜０．６ＭＰａの平均膜透過圧で、管状セラミック膜を通して連続的に循環させた。膜透過流速は、８〜３０ｍＬ／分（９０〜３３０Ｌ／ｍ²／時間）の範囲であった。この系の温度を、ポンプ頭部に取付けられたグリコール／水冷却ジャケットにより２０〜３２℃に維持した。浸透液の連続的除去および純粋なアセトンの連続的添加の結果として、スラリー中のアセトンの濃度は、操作を通して増加した。
【００３９】
アセトン／水含有浸透液を、一連の画分で集めた。スラリー中の水に対するアセトンの比が約９：１（ｗｔ／ｗｔ）の臨界値を超える場合、ＰＨＡコポリマーは、可溶になり、そしてセラミック膜を通過した。浸透液中のポリマーの濃度は、５．８％（ｗｔ／ｗｔ）で最高になった。この浸透液を、固体の濃度が＜０．１％（ｗｔ／ｗｔ）になるまで集めた。ＰＨＡを含有する画分を合わせて（１４Ｌ）、そしてこのポリマーを１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の脱イオン水の添加により沈殿させた。濾過濃縮物は、アセトン、水、および本質的にＰＨＡの無い細胞屑を含んでいた。
【００４０】
本発明の改変物および変形物は、上述の詳細な説明から当業者に明らかである。このような改変物および変形物は、上記の特許請求の範囲内であることを意図される。

Claims

ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）を含むバイオマス由来のＰＨＡを単離および精製するための方法であって、該方法は、以下：
少なくとも１つの水混和性有機溶媒を使用して、該バイオマスからＰＨＡを抽出し、同時に、該バイオマスを、細胞を取り除くために濾過プロセスに供する工程を包含し、
前記バイオマスが水性スラリーとして提供され、
液体が段々と前記バイオマスの水性スラリーから除去されるにつれて、前記少なくとも１つの水混和性有機溶媒が前記バイオマスの水性スラリーに添加される
ことを含み、
前記少なくとも１つの水混和性有機溶媒が、環式および非環式（直鎖および分枝）のＲ’−ＯＨアルコール（ここでＲ’＝Ｃ ₄ 〜Ｃ ₁₀ ）、環式および非環式のＲ’’−ＣＯＯＲ’’’エステル（ここでＲ’’＝ＨまたはＣ ₁ 〜Ｃ ₆ かつＲ’’’＝Ｃ ₁ 〜Ｃ ₇ ）、環式および非環式のＲ’’−ＣＯＯＲ’’’
エステル（ここでＲ’’＝ＨまたはＣ ₁ 〜Ｃ ₆ かつＲ’’’＝Ｃ ₁ 〜Ｃ ₇ 、そしてＲ’’またはＲ’’’中の少なくとも１つの炭素が少なくとも１つの酸素で置換される）、環式および非環式のＲ ¹ −ＣＯＮ−（Ｒ ² ） ₂ アミド（ここでＲ ¹ ＝ＨまたはＣ ₁ 〜Ｃ ₆ かつＲ ² ＝Ｃ ₁ 〜Ｃ ₆ ）、ならびに環式および非環式のＲ ³ −ＣＯ−Ｒ ⁴ ケトン（ここでＲ ³ ＝ＨまたはＣ ₁ 〜Ｃ ₆ かつＲ ⁴ ＝Ｃ ₁ 〜Ｃ ₆ ）からなる群から選択される
ことを特徴とする、方法。
前記濾過プロセスが、ディアフィルトレーションを含む、請求項１に記載の方法。
前記ディアフィルトレーションが、一定のスラリー体積で実施される、請求項２に記載の方法。
前記バイオマスが、微生物供給源由来である、請求項１に記載の方法。
前記バイオマスが、植物または植物部分由来である、請求項１に記載の方法。
前記植物が、脂肪種子植物である、請求項５に記載の方法。
前記水混和性有機溶媒が、アセトンである、請求項１に記載の方法。
請求項１に記載の方法であって、前記水性スラリーおよび前記水混和性有機溶媒は溶媒−水混合物を形成し、該方法は、該溶媒−水混合物中の有機溶媒の濃度を徐々に増加させる工程を、さらに包含する、方法。
請求項８に記載の方法であって、該方法は、フィルター膜を備えるディアフィルトレーションユニットで実施され、ここで、前記水混和性有機溶媒の濃度を増加させて、前記バイオマス中の水に不溶性である不純物を前記溶媒−水混合物に溶解させ、そして該フィルター膜を通過させる、方法。
請求項９に記載の方法であって、ここで、前記水混和性有機溶媒の濃度を増加させて、前記ＰＨＡを前記溶媒−水混合物に溶解させ、そして前記フィルター膜を通過させて、ＰＨＡ濾液を形成する、方法。
請求項１０に記載の方法であって、該方法が、前記ＰＨＡ濾液から前記溶媒を除去して、前記ＰＨＡを回収する工程を、さらに包含する、方法。